Universidade Federal de Juiz de ForaFaculdade de Farmácia

Departamento Farmacêutico

Garantia de QualidadeProfessora Célia Hitomi

Produção e Controle de Qualidade de Antibióticos

Alexandre PóvoaFelipe Vargas

Israel FortunatoJordana Abreu

INTRODUÇÃO

Até antes do século passado, o homem se depara com minúsculos

indivíduos os quais, até então,consideravam-se um tanto quanto invencíveis,

sem passível poder de cura. Estes indivíduos , conhecidos hoje em dia como

Microorganismos, acompanham nossa evolução durante toda a história da

humanidade.

Com o desenvolvimento da sociedade, de iniciativas sociais e de

saneamento e de combate à alta taxa de mortalidade relacionado ao período

da evolução histórica, o homem passa a se interessar e tentar combater o

agente causador dessas enfermidades. Neste breve trabalho, abordaremos um

dos principais agente causadores de calamidades e complicações hospitalares

observadas nos dias de hoje, as Bactérias.

A Descoberta.

Alexander Fleming nasceu em Lochfield, no sudoeste da Escócia, e

estudou medicina na Universidade de Londres. Concluindo o curso em 1906,

começa a pesquisar, em seguida, substâncias com potencial bactericida que

não fossem tóxicas ao organismo humano. Trabalhou como médico

microbiologista no Hospital de St. Mary, Londres, até o começo da Primeira

Guerra Mundial. Durante a guerra foi médico militar nas frentes de batalha da

França e ficou impressionado pela grande mortalidade nos hospitais de

campanha causada pelas feridas de arma de fogo que resultavam em

gangrena gasosa. Finalizada a guerra, regressou ao Hospital St. Mary onde

buscou intensamente um novo anti-séptico que evitasse a dura agonia

provocada pelas infecções durante a guerra

Os dois descobrimentos de Fleming ocorreram nos anos 20 e ainda que

tenham sido acidentais demonstram a grande capacidade de observação e

intuição deste médico britânico. O descobrimento da lisozima ocorreu depois

que o muco de seu nariz, procedente de um espirro, caísse sobre uma placa de

cultura onde cresciam colônias bacterianas. Alguns dias mais tarde notou que

as bactérias haviam sido destruídas no local onde se havia depositado o fluido

nasal.

Ele chegou à descoberta da penicilina e de suas propriedades antibióticas

em 1928, ao observar uma cultura de bactérias do tipo estafilococo e o

desenvolvimento do mofo a seu redor, onde as bactérias circulam livres. O

laboratório de Fleming estava habitualmente bagunçado, o que resultou em

uma grande vantagem para sua segunda importante descoberta.

Em Setembro de 1928, Fleming estava realizando vários experimentos

em seu laboratório e ao inspecionar suas culturas antigas antes de destruí-las

notou que a colônia de um fungo havia crescido espontaneamente, como um

contaminante, numa das placas de Petri semeadas com Staphylococcus

aureus. Fleming observou outras placas e comprovou que as colônias

bacterianas que se encontravam ao redor do fungo (mais tarde identificado

como Penicillium notatum) eram transparentes devido a uma lise bacteriana. A

lise significava a morte das bactérias, e no caso, das bactérias patogênicas

(Staphylococcus aureus) crescidas na placa.

A produção industrial começou nos Estados Unidos (EUA) no início da II

Guerra Mundial. Fleming, Florey e Chain recebem junto o Nobel de

Fisiologia/Medicina de 1945.

Os Antibióticos

Antibiótico é nome genérico dado a uma substância que tem capacidade de

interagir com micro-organismos unicelulares ou com seres pluricelulares que

causam infeções no organismo. Os antibióticos interferem com os micro-

organismos, matando-os ou inibindo seu metabolismo e/ou sua reprodução,

permitindo ao sistema imunológico combatê-los com maior eficácia.

O termo antibiótico tem sido utilizado de modo mais restrito para indicar

substâncias que atingem bactérias, embora possa ser utilizado em sentido

mais amplo (contra fungos, por exemplo). Ele pode ser bactericida, quando tem

efeito letal sobre a bactéria ou bacteriostático, se interrompe a sua reprodução

ou inibe seu metabolismo

Desde sua descoberta, os antibióticos foram amplamente utilizados,

reduzindo gradativamente a mortalidade global por infecções bacterianas

propriamente ditas, complicações cirúrgicas, ferimentos abertos e outras

enfermidades. Suas aplicações são variadas e seu universo muito extenso.

As principais classes de antibióticos estão resumidas no Esquema abaixo:

Inibidores Síntese da Parede Celular Bacteriana

A parede celular é um envoltório de proteção que reveste a membrana

celular bacteriana. Os antibióticos que agem sobre a síntese da parede celular

atuam produzindo uma parede com defeitos estruturais atuando sobre o

processo de replicação celular, e mostram-se seletivos, isto é, atuam apenas

sobre a bactéria e não sobre o hospedeiro pois as células dos mamíferos

nãopossuem parede celular.Neste grupo incluem-se as penicilinas e todos os

membros do grupo que possuam anel penicilâmico ou núcleos semelhante as

este, como o cefalosporínico (cefalosporinas, vancomicinas, ciclosserinas,

bacitracinas e ristocitina). As penicilinas e cefalosporinas, em sua maioria, são

mais ativas sobre Gram negativos que em Gram positivos, pois existem

diferenças químicas significativas na composição química da parede celular

destes germes, contudo existem exceções.Inclui também a vancomicina.

Afetam a Membrana Celular Bacteriana

A membrana possui a função de formar a parede celular, obstáculo à

entrada d’água, contém lipídios e proteínas carreadores de substâncias

necessárias à célula, além de possuir enzimas importantes ao metabolismo

celular. Qualquer interrupção destas funções da membrana causará danos à

célula.Estes antibióticos intervém no processo de respiração celular, inibindo a

fosforilação oxida-tiva e causam desorganização da membrana celular.

Bloqueiam a Síntese Protéica (translação)

Para que haja reprodução bacteriana é indispensável que ocorra, de modo

repetitivo, a união de aminoácidos que constituirão as inúmeras moléculas de

proteínas microbianas. Estas proteínas microbianas têm função estrutural e

enzimática.

  A bactéria contém, no seu cromossomo, toda a informação genética

necessária à produção de enzimas que atuam na síntese de RNA (síntese

protéica). A interrupção, em qualquer ponto desta cadeia por bloqueio de

alguma função, susta o crescimento. Haverá, portanto, detenção do

crescimento e eliminação da célula bacteriana. Incluem: cloranfenicol,

tetraciclinas, macrolídeos (eritromicina, claritromicina e azitromicina) e

clindamicina.

Impedem a Replicação Cromossômica

Algumas drogas atuam inibindo a síntese (metabolismo) dos ácidos

nucléicos.Podem atuar no DNA parasitário, inibir a síntese do RNA, inibir o

ácido tetrahidrofólico ,alterar a estrutura do ácidos nucléicos parasitários, ou

reduzir a formação de nucleotídeos.

Enfoque acadêmico:

Neste estudo, para fins didáticos, iremos abordar com mais detalhes

apenas os Antibióticos chamados Beta Lactâmicos (Penicilinas e

Cefalosporinas), pois seus métodos de produção são bem descritos e de fácil

produção e acesso.

Penicilinas são antimicrobianos betalactâmicos, de origem natural ou

sintética, que, em conjunto, cobrem o tratamento específico da maioria das

infecções correntes. São bactericidas. Distribuem-se amplamente no

organismo, exceto no sistema nervoso central, exceto quando as meninges

estão inflamadas. Apresentam baixa toxicidade em doses terapêuticas e têm

possibilidade de uso em gravidez e lactação. Sua desvantagem é a indução de

reações de hipersensibilidade. No Brasil, investigar a história de alergia prévia

às Penicilinas é a forma mais eficaz para se prevenir a ocorrência de graves

reações de hipersensibilidade. Incluíram-se na Rename representantes de

quase todos os subgrupos das Penicilinas. Os principais antibióticos comerciais

desta classe são:

Amoxicilina é aminopenicilina de amplo espectro, com rápida absorção

digestiva, atingindo pico sérico mais alto e com menor latência. Ao contrário da

ampicilina, a absorção não é afetada pela presença de alimentos no estômago.

Além do tratamento de inúmeras infecções causadas por microorganismos

suscetíveis, também é o medicamento de escolha para profilaxia oral de

endocardite bacteriana.

Amoxicilina + clavulanato de potássio é associação que aumenta o

espectro, porque o ácido clavulânico inibe a betalactamase, enzima bacteriana

que cinde o anel betalactâmico, inativando a penicilina. A associação reduz a

resistência microbiana, ampliando o espectro de ação. Para não ser usada

abusivamente e por ter maior custo, ficou restrita para combate a infecções

causadas por bactérias resistentes a amoxicilina, especialmente Haemophilus

influenzae e Moraxella catarrhalis.

Ampicilina é aminopenicilina de amplo espectro, selecionada em forma

injetável para constituir uma alternativa ao uso de cefalosporinas de terceira

geração em infecções hospitalares por bacilos Gram-negativos aeróbios

multirresistentes. Não há sentido em usar a forma oral porque amoxicilina tem

absorção oral muito mais completa, atingindo mais rapidamente o pico sérico.

Benzilpenicilina ou penicilina G aparece em forma cristalina (sal

potássico) que é uma solução pura para uso intravenoso. Sua associação com

procaína e benzatina apresenta-se como suspensão para uso intramuscular,

tendo duração de ação de 18-24 horas e 28 dias, respectivamente. A penicilina

G é suscetível à inativação causada por betalactamases bacterianas. Também

sofre inativação por ácido gástrico, o que determina o uso injetável.

Oxacilina sódica, sendo uma isoxazolilpenicilina, é resistente à

penicilinase, podendo ser usada em infecções por estafilococos a ela

sensíveis. Mesmo a ela pode surgir resistência adquirida, especialmente com

estafilococos meticilina (MRSA) ou oxacilina (ORSA) resistentes. Infecções por

S. aureus ou S. epidermidis com essa característica têm que ser tratadas com

outras alternativas.

Cefalosporinas constituem outro grupo de antibióticos beta lactâmicos,

usualmente classificado em gerações, de acordo com o momento em que

foram sintetizados, apresentando diferenças de espectro decorrentes de

modificações nas cadeias laterais da estrutura básica que contém o anel 7-

amino-cefalosporânico. São agentes bactericidas, com o mesmo mecanismo

de ação das penicilinas. Apresentam baixa toxicidade, podendo ser usadas em

gravidez e lactação. Reações alérgicas são similares às das penicilinas, porém

ocorrem com menor freqüência (5% dos casos). Por isso, são substitutivos

destas em pacientes com reações de hipersensibilidade tardias. Ao contrário,

devem ser evitadas nos que têm história de reações imediatas graves, como

angioedema e anafilaxia. Outra característica consiste em serem ativas contra

S. aureus produtores de penicilinase (MRSA).

Cada categoria de Cefalosporinas apresenta predominante atividade

antimicrobiana contra determinadas bactérias. Assim, as de primeira geração

são as mais ativas contra cocos aeróbios Gram positivos (estreptococos do

grupo B, S. viridans) e atuam contra Staphylococcus aureus oxacilina-

resistentes. Não têm atividade anaerobicida significativa.

Dentre elas selecionaram-se cefalexina (oral), cefalotina (injetável) e

cefazolina (injetável) com a finalidade de limitar o abuso de Cefalosporinas de

largo espectro em infecções que podem ser debeladas com os representantes

de primeira geração. Vantagens adicionais são baixo custo e retardo no

desenvolvimento de resistência bacteriana. As de segunda geração têm maior

eficácia contra Microorganismos aeróbios Gram negativos e anaeróbios. No

entanto, são fortes indutoras de betalactamases e já sofrem resistência de

Bacteroides fragilis. Por essa razão, não precisam ser selecionadas, pois

metronidazol e gentamicina são alternativas cabíveis.

Os agentes de terceira geração apresentam maior atividade contra

aeróbios Gram negativos multirresistentes e pseudomonas. Ceftriaxona tem a

vantagem de duração mais longa que permite uma administração diária.

Cefotaxima é indicada em lactentes porque tem excreção extra-hepática que

prescinde da maturidade do fígado. Ceftazidima é considerada agente

pseudomonicida. Cefepima, agente de terceira ou quarta geração conforme

diferentes autores têm espectro similar ao de Cefalosporinas de terceira

geração e a mesma eficácia clínica de ceftazidima contra Pseudomonas

aeruginosa, por isso não sendo selecionada. O uso desmedido de cefepima e

ceftazidima em hospitais induz resistência bacteriana e seleciona

enterorococos resistentes à vancomicina, não responsivos à terapia em curso.

Cefalexina é usada no tratamento de infecções de pele e tecidos moles

causadas por Microorganismos sensíveis em pacientes ambulatoriais que

desejam a comodidade da via oral, ou naqueles que apresentam

hipersensibilidade tardia às penicilinas. Embora outras Cefalosporinas orais

tenham igual eficácia, cefalexina tem menor custo. Também é recomendada

para profilaxia oral de endocardite bacteriana em pacientes hipersensíveis às

penicilinas. Em revisão sistemática de 20 estudos (n = 2.042), encontraram-se

dois em que cefalexina foi comparada a cefdinir no tratamento de infecção de

pele, sendo os resultados similares. Em 10 estudos (n = 1.052), cefalexina

mostrou eficácia consistente em todos eles. Em 3 ensaios (n = 197), cefalexina

foi superior a outros fármacos e, em 5 (n = 608), teve menos taxa de sucesso

do que outros antibióticos. Em profilaxia, dois estudos mostraram menores

taxas de infecção após cefalexina, em comparação a placebo e ausência de

uso. Em um estudo (n = 50), cefalexina não foi significativamente diferente do

não-uso profilático.

Cefazolina é usada na profilaxia de infecções após cirurgias limpas ou

limpocontaminadas (cesarianas histerectomias e correção de fraturas

fechadas, por exemplo). Quando comparada a outros antibacterianos

(levofloxacino, ciprofloxacino, ceftriaxona, teicoplanina etc.), não mostra

diferença significativa na maioria das comparações. Como tem meia-vida mais

longa que a da cefalotina, permite uma só administração intra-operatória em

procedimentos que duram até 4 horas. Apresenta eficácia microbiológica,

segurança e custo adequado, fazendo com que seja o fármaco de escolha em

50% dos protocolos americanos. Deve ser reservada para a quimioprofilaxia

para diminuir a possibilidade de resistência microbiana a ela. Assim, as

infecções hospitalares sensíveis a Cefalosporinas de primeira geração devem

ser tratadas com cefalotina, estratégia que se justifica pela minimização da

seleção de organismos resistentes.

Cefalotina serve para tratamento das infecções de pele e de tecidos

moles causadas por bactérias Gram positivas e negativas. Seu uso ficou

restrito ao tratamento de infecções hospitalares por microorganismos

susceptíveis para preservar o emprego de cefazolina para quimioprofilaxia

cirúrgica.

Cefotaxima é cefalosporina de terceira geração, com uso restrito para

tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes em neonatos,

porque não interfere com o metabolismo da bilirrubina, mesmo numa fase de

imaturidade dos sistemas hepáticos de biotransformação.

Ceftazidima é cefalosporina de terceira geração, com uso restrito para

tratamento de infecções causadas por pseudomonas e enterobacteriáceas

multirresistentes. Como pseudomonicida foi selecionada em função de menor

custo em comparação com piperacilina/tazobactam e igual eficácia em relação

à cefepima. Quando se associam ceftazidima e um aminoglicosídeo, a eficácia

é similar à de piperacilina/tazobactam.

Ceftriaxona é cefalosporina de terceira geração, com uso restrito para

tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes e (ou)

tratamento empírico de meningites. Uso restrito para tratamento em dose única

de infecções por Neisseria gonorrhoeae.

PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS

Produção de penicilinas 

As penicilinas são produzidas por muitos fungos, particularmente espécies de

Penicillium e Apergillus, mostrando-se eficazes contra numerosas bactérias gram-positivas. 

Os antibióticos β-lactâmicos causam rompimento gradativo das células bacterianas,

pois são inibidores específicos da síntese da parede celular. Um ponto adicional de ataque

dos antibióticos β–lactâmicos parece envolver a síntese de fosfolipídios, a nível molecular.

A) Estrutura química  

A estrutura básica das penicilinas é o ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), que consiste

em um anel tiazolidínico com um anel -lactâmico condensado. 

Se a fermentação da penicilina é conduzida sem a adição de precursores da cadeia

lateral, produzem-se as penicilinas naturais. Adicionado-se como precursor o ácido

fenoxiacético conduziremos à formação de penicilina V. Utilizando ácido fenilacético, será

produzida penicilina G. Estes dois últimos tipos constituem a escolha para a síntese

comercial.

B) Desenvolvimento de cepas  

O uso da tecnologia do DNA recombinante para aumentar a formação de enzimas que

sejam passos limitantes, mediante a amplificação gênica ou melhora da transcrição, pode

contribuir para a otimização da síntese.

Para este fim, é necessário construir um banco de genes para P.chrysogenum

através de screening para o conhecimento de dados precisos acerca de biossíntese e

sistemas vetor-hóspede

C) Processos de fermentação

A penicilina G e a penicilina V são produzidas utilizando processos submersos em

fermentadores de 40.000 - 200.000 litros, a fim de garantir uma aeração efetiva. A faixa de

temperatura ótima é de 25 - 27ºC, e o pH é mantido a 6,5. O meio deve ainda conter fontes

de carbono como a lactose, nutrientes e precursores.

Os esporos são inoculados na concentração de 5.103/m3. Na fermentação típica de

penicilina há uma fase de crescimento de aproximadamente 40 horas, com um tempo de

duplicação de 6 horas, durante o qual se forma a maior parte da massa celular. 

Alimentando o meio com diferentes componentes, a fase de produção pode estender-

se até 120-160 horas.  O sistema de “enche e retira” pode ser utilizado para aumentar a

eficiência do processo. Nesse processo, 20-40% do conteúdo da fermentação é retirado e

alimentado novamente com solução fresca de nutrientes. Recomenda-se repetir no máximo

dez vezes.

Produção de cefalosporinas 

As cefalosporinas são extraídas de culturas de Cephalosporium acremonium. São

avaliadas não só devido à sua baixa toxidade, mas também devido ao fato de que são

antibióticos de amplo espectro, comparáveis em ação à ampicilina. 

A)Desenvolvimento de cepas 

O desenvolvimento de cepas tem sido realizado com a cepa original de Brotzu,

C.acremonium, utilizando mutação, seleção e técnicas parassexuais. Tem-se isolado

mutantes com metabolismo resistente ao enxofre, por possuírem maior produção.

As técnicas de fusão de protoplastos têm sido combinadas com reprodução

parassexual para desenvolver um mapa completo dos genes de biossíntese de

cefalosporina.

B)Processos de produção 

A fermentação das cefalospirinas é similar à da pelicilina. Seus meios de cultivo são

mais complexos, podendo constituir-se de líquido de maceração de milho, extrato de carne,

sacarose, glicose e acetato de amônio

Sua produção requer maior velocidade de aeração, e sua fase de produção dura entre

48 e 160 horas. Pode ser produzida também por expansão do anel da penicilina.

CONTROLE DE QUALIDADE

1.Ensaio microbiológico de antibióticos pelo método de difusão em Agar,

utilizando cilindros

Determinase   a   potência   ou   atividade   de   um   produto   contendo   antibiótico  

comparando   a dose que inibe o crescimento de um microorganismo   susceptível   em   rela-

ção   à   dose   de   uma   substância   padrão  ou preparação   biológica  de  referencia  do

antibiótico  que  produz  inibição   similar.

2.Unidade internacional e preparação padrão

Unidade Internacional é a atividade específica contida em uma quantidade (massa) de

Padrão Biológico Internacional ou Preparação de Referência Biológica Internacional. A

quantidade equivalente de unidades para uso internacional é estabelecida, sempre que

necessário, pela Organização Mundial da Saúde.

Substâncias Químicas de Referência Internacional não apresentam unidades de

atividade biológica definidas. Quando são necessários ensaios biológicos, a potência desses

produtos é em termos de massa equivalente à da substância pura.

O número de unidades, ou a massa equivalente da substância pura, em microgramas,

contidos em 1 mg de substância antibiótica, está indicado na monografia de cada um dos

produtos inscritos na Farmacopeia.

Para os ensaios microbiológicos registrados na Farmacopeia, Preparações Padrão

(Padrões Primários) são os Padrões Internacionais e Preparações de Referência

estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde e pela Farmacopeia Europeia ou os

Padrões e Preparações de Referência brasileiros. Outras preparações adequadas, de uso

internacional corrente, nas quais a potência tenha sido determinada em relação às

preparações padrão da Organização Mundial da Saúde, possuem valor legal idêntico.

Recomenda-se que sejam preparados e empregados padrões de trabalho

(secundários); todavia, é imprescindível que a potência tenha sido determinada por número

adequado de ensaios comparativos em relação a um padrão primário ou farmacopeico,

validados por análise estatística apropriada e que os dados e resultados sejam arquivados à

disposição da fiscalização competente por prazo idêntico ao da validade dos produtos

ensaiados.

Para o ensaio de lotes de substâncias antibióticas para as quais existam Preparações

Padrão nacionais, referendadas por organizações internacionais, é obrigatório o uso dessas

preparações.

3.Soluções

Solução 1 (tampão fosfato de potássio a 1%, estéril. pH 6,0)

Solução 2 (tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, pH 8,0)

Solução 3 (tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, pH 4,5)

Solução 4 (tampão fosfato de potássio a 10%, estéril, pH 6,0)

Solução 5 (tampão fosfato de potássio 0,2 M, estéril, pH 10,5)

Solução 6 (ácido clorídrico metanólico 0,1 M)

Solução 7 (solução de álcool isopropílico a 80%)

Solução 8 (tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, pH 7,0)

4.Meios de cultura

Podem ser empregados meios de cultura desidratados, disponíveis no comércio que, ao

serem reconstituídos com água purificada, conforme as especificações do fabricante,

possuem a mesma composição que o meio produzido com os ingredientes individualmente

indicados para sua obtenção.

5.Preparação do inoculo

Micro-organismos recomendados

• Staphylococcus aureus (ATCC 6538p) • Micrococcus luteus (ATCC 7468) • Kocuria

rhizophila (ATCC 9341) • Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) • Saccharomyces

cerevisiae (ATCC 9763)

• Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617) • Bacilius cereus var. mycoides (ATCC 11778)

• Bacillus subtilis (ATCC 6633) • Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) • Escherichia coli

(ATCC 10536) • Enterococcus hirae (ATCC 10541) • Micrococcus luteus (ATCC 10240) •

Microsporum gypseum (ATCC 14683) • Saccharomyces cerevisiae (ATCC 2601) •

Micrococcus luteus (ATCC 14452) • Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619) •

Mycobacterium smegmatis (ATCC 607)

Com a finalidade de indicação, foram listados os micro- organismos disponíveis na

ATCC. Os mesmos micro- organismos podem, também, ser obtidos de outras fontes: INCQS,

CIP, NBRC, NCIMB, NCPF, NCTC, NCYC, IMI e IP. A correspondência entre os micro-

organismos e os endereços das entidades que os fornecem encontram-se indicadas em

Micro-organismos empregados em testes e ensaios

6.Dessecação de substâncias antibióticas

Utilizar para dessecação dos padrões, os procedimentos indicados na Farmacopeia

5ed., e recomendados de acordo com as informações descritas nas Tabelas 2 em 5.5.3.3.1 e

5.5.3.3.2 da mesma Farmacopeia

7.Procedimento

Para cada antibiótico relacionado na Tabela 1, verificar o meio de cultura (conforme a

relação dos meios de cultura), a quantidade de meio a ser usada na camada base e na

camada inoculada e o micro-organismo de ensaio. O volume de inóculo a ser adicionado a

cada 100 mL de meio de cultura deve ser determinado experimentalmente.

Entretanto, como referência inicial, sugere-se quantidade de inóculo a ser adicionada

por 100 mL de meio.

Preparar a camada base por meio da adição de quantidade apropriada de ágar fundido

nas placas de Petri as quais devem ser, especialmente selecionadas, ter fundo plano, possuir

dimensões de 20 x 100 mm e tampa de material apropriado. Distribuir o ágar uniformemente

nas placas, que devem ser colocadas em superfície nivelada para que a camada de meio

tenha profundidade uniforme. Colocar a tampa de cada placa ao lado dessa; se for utilizada

tampa não porosa, deixá-la levemente entreaberta para evitar o acúmulo de umidade

condensada a partir da camada de ágar quente. Após o endurecimento do ágar, tampar as

placas. Para preparar a camada inoculada - superfície, adicionar o volume de inóculo

determinado para a quantidade apropriada de meio de cultura que tenha sido fundido e

resfriado entre 46 oC e 48 oC. Agitar o frasco, por rotação, para obter suspensão homogênea

e adicionar a quantidade indicada do meio inoculado em cada placa de Petri, contendo a

camada base não inoculada. Espalhar uniformemente a camada, tampar as placas e permitir

o seu endurecimento sobre superfície plana. Após o endurecimento do meio, colocar seis

cilindros de aço inoxidável, com diâmetro externo de 8 mm ± 0,1 mm, diâmetro interno de 6

mm ± 0,1 mm e comprimento de 10 mm ± 0,1 mm, sobre a superfície do ágar inoculado, de

maneira que formem entre si ângulo de 60o e com raio de 2,8 cm. Também, podem ser

utilizados cilindros confeccionados em vidro, porcelana ou alumínio e esterilizados nas

condições já descritas. Em lugar dos cilindros, podem ser perfurados, no meio, com furador

estéril, poços de 5 a 8 mm de diâmetro. Podem, ainda, ser usados discos de papel,

confeccionados com papel de qualidade apropriada ou moldes de aço inoxidável. Quando

são usados discos de papel, estes devem ser estéreis.

8.Preparação da solução padrão, da amostra e da curva padrão

A preparação das amostras dos antibióticos está indicada na respectiva monografia.

As concentrações do antibiótico utilizadas no ensaio devem estar em progressão

geométrica; por exemplo, pela preparação de séries de diluição na razão 2:1 ou outra

determinada experimentalmente desde que seja comprovada a relação linear entre o

logaritmo da concentração do antibiótico e o diâmetro do halo de inibição.

Na Tabela 2 está indicada para cada antibiótico, a preparação da solução padrão de

trabalho e da curva padrão, compreendendo:

a) condições de dessecação, conforme descrito no item Dessecação de substâncias

antibióticas (5.5.3.3);

b) solvente inicial para dissolução do antibiótico, caso seja necessário, e até qual

concentração é usado;

c) solução para diluição até a concentração de trabalho, conforme descrito em

Soluções;

d)concentração da solução de trabalho, expressa em peso, ou Unidades Internacionais

por mL de solução;

e) prazo de validade da solução padrão de trabalho sob refrigeração;

f) solução empregada para diluição da solução de trabalho, por ocasião da preparação

da curva padrão, conforme Soluções;

g) faixasdeconcentraçãosugeridas,empesoouUnidades Internacionais por mL, dentro

das quais podem ser encontradas as concentrações adequadas para a curva padrão.

9.Procedimento para delineaento de retas (3x3 ou 2x2)

Empregar, no ensaio, pelo menos seis placas de Petri. Dispor as soluções do padrão e

amostra, em cada placa, com 3 concentrações para ensaio 3 x 3 (baixa, média e alta) ou 2

concentrações para ensaio 2 x 2 (baixa e alta). As soluções devem ser distribuídas de tal

forma que as soluções da preparação padrão e amostra estejam alternadas na camada

inoculada (concentração alta e baixa) para evitar a sobreposição dos halos de inibição.

10.Procedmento para delineamento 5x1

Para a curva padrão, utilizar um total de 12 placas, 3 para a concentração média da

curva (P3) que é incluída em todas as placas. Em cada conjunto de 3 placas, utilizar 3

cilindros para a concentração média (P3) e alternar 3 cilindros para a concentração baixa

(P1) e assim sucessivamente com as demais soluções do padrão. Dessa maneira, obtém-se

36 halos de inibição para a concentração (P3) e 9 halos de inibição para cada uma das

outras quatro concentrações da curva.

Para cada amostra, empregar 3 placas, onde serão colocados 3 cilindros para a

concentração média do padrão (P3) e 3 com a solução da amostra preparada na mesma

concentração do padrão (A3).

Aplicar 0,2 mL das soluções nos cilindros ou nos moldes de aço inoxidável por meio de

pipeta ou outro instrumento calibrado. Quando for usado o sistema de poços, o volume de

líquido aplicado deve ser suficiente para enchê-los completamente.

Após realizar os procedimentos adequados para o delineamento escolhido, incubar as

placas na temperatura indicada, cuja variação não deverá exceder ± 0,5 °C, durante um

período de 16 a 18 horas. Em seguida, medir o diâmetro dos halos de inibição empregando

dispositivo adequado para medida, como paquímetro, ou projetor óptico que tenha precisão

de 0,1 mm ou menos.

Para alguns micro-organismos, o procedimento pode ser melhorado se as placas

preparadas permanecerem à temperatura ambiente por período de 30 minutos a 2 horas

antes da incubação, período em que ocorre a difusão do antibiótico para o meio.

Tabelas referidas presente em Farmacopeia Brasileira 5ed., 2010, pag 266 – 269.

(Tabelas 1 e 2).

11.Ensaio iodométrico de antibióticos

Este ensaio iodométrico de antibiótico destina-se ao doseamento de fármacos

antibióticos penicilâmicos e de seus produtos farmacêuticos elaborados, para os quais a

titulação iodométrica é particularmente adequada.

12.Preparação da amostra

Dissolver quantidade adequada, exatamente pesada, da substância química de

referência (SQR), previamente dessecada, especificada na monografia individual, utilizando o

solvente descrito na Tabela 1 ou conforme descrito na monografia. Diluir, quantitativamente,

com o mesmo solvente, de modo a obter solução com concentração final conhecida,

especificada na Tabela 1 ou conforme descrito na monografia. Transferir 2,0 mL desta

solução para erlenmeyer de 250 mL com tampa.

13.Preparação da amostra

A menos que especificado de outra forma na monografia individual, dissolver

quantidade adequada, exatamente pesada, da amostra, utilizando o solvente descrito na

Tabela 1. Diluir, quantitativamente, com o mesmo solvente, de modo a obter solução com

concentração final conhecida, especificada na Tabela 1. Transferir 2,0 mL desta solução para

erlenmeyer de 250 mL com tampa.

14.Procedimento

Inativação e titulação

A cada erlenmeyer contendo, respectivamente, 2,0 mL das preparações padrão e

amostra, adicionar 2 mL de hidróxido de sódio 1,0 M, homogeneizar com movimentos

circulares e deixar em repouso por 15 minutos. Adicionar 2 mL de ácido clorídrico 1,2 M, 20,0

mL de iodo 0,005 M SV, tampar imediatamente e deixar em repouso por 15 minutos. Titular

com tiossulfato de sódio 0,01 M SV. Próximo ao ponto final da titulação, adicionar 3 gotas de

amido SI e prosseguir com a titulação até desaparecimento da cor azul.

15.Ensaio em branco

Adicionar 20,0 mL de iodo 0,005 M SV a cada erlenmeyer contendo 2,0 mL da

preparação padrão. Se a preparação padrão contiver amoxilina ou ampicilina, adicionar

imediatamente 0,1 mL de ácido clorídrico 1,2 M. Titular com tiossulfato de sódio 0,01 M SV.

Próximo ao ponto final da titulação, adicionar 3 gotas de amido SI e prosseguir com a

titulação até desaparecimento da cor azul. Proceder de forma similar para erlenmeyer

contendo 2,0 mL da preparação amostra.

16.Cálculos

Calcular o fator de equivalência (F), em microgramas ou Unidade, para cada mililitro de

tiossulfato de sódio 0,01 M SV consumido pela preparação padrão segundo a equação:

Em que:

Cp = concentração, em mg/mL, da substância química de referência na preparação

padrão; Pp = potência, em μg/mg ou Unidades/mg, da substância química de referência;

Vb = volume do titulante, em mL, consumido em Ensaio em branco; Vi = volume do

titulante, em mL, consumido em Inativação e titulação.

CONCLUSÃO

O controle de qualidade de medicamentos contendo antibióticos é de suma importância,

não apenas para aperfeiçoar e avaliar os processos de produção, mas principalmente para

assegurar os padrões de qualidade que garantem a eficácia e a segurança dos

medicamentos à população. Desta forma, a disponibilidade de metodologias analíticas

confiáveis, rápidas, e baixo custo são extremamente importantes. Para tanto, órgãos oficiais

como Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Farmacopéias (de diferentes

países) e o Food and Drug Administration (FDA - USA) determinam e orientam parâmetros a

serem adotados pelas indústrias farmacêuticas, principalmente, aqueles relacionados aos

métodos de análise necessários para o controle de qualidade das diferentes formulações.

REFERÊNCIAS

MORELL, V. "Resistência aos antibióticos: Estrada de Não Retorno." Science 278

(24 de outubro de 1997): 575-576.)

SUZANA, D. B. MALUHY, C. V.; COIMBRA, M. C.; Paulo Cilas Rubio - Biotecnologia -

Editora: Do Brasil 

LIMA, U. A.; AQUARONE, E. BORZANI W. SCHMIDELL, W. -Biotecnologia

industrial, volume 3 –editora Edgard Blucher – 1ªedição – 2001 - São Paulo.

PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A. Controle biológico de qualidade de

produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 2a. Ed. São Paulo: Atheneu

Editora São Paulo, 2010.

Farmacopéia Brasileira. 5a ed., Brasilia: Anvisa, 2010.