Produção de Antibióticos

� Produtos do metabolismo secundário� Inibem processo de crescimento de outros

� Importância Económica� 2000 toneladas/ano� 600 milhões de € (preço corrente a granel)

Apontamento Histórico

� 1929 – descoberta da Penicilina� 1961 – 513 antibióticos� Actualmente – cerca de 8000� Líquenes, algas, animais, plantas

(+3000 substâncias com actividade antibiótica)

� 123 são produzidos por fermentação� + 50 são produzidos como compostos semisintéticos

� 3 são completamente sintéticos (cloranfenicol)

Porque razão ocorre a produção destas substâncias?

� Significado ecológico?

� Papel regulador durante a diferenciação?

(funcionando como agentes inibidores temporários)

Grupos microbianos que produzem antibióticos

1600Fungos

4600Actinomicetas

950Bactérias diferentes de Actinomicetas

Nº de antibióticosGrupo taxonómico

Ex: Bacillus sp.

Streptomyces

Classificação de antibióticos

� Segundo:

- espectro antimicrobiano- mecanismos de acção- estirpe produtora- forma de biossintese- estrutura química

Classificação de acordo com estrutura química

FosfomicinaAlifáticos

CloranfenicolAromáticos

CiclohexamideDerivados aliciclícos

MonensinaHeterociclicos com oxigénio

PolioxinasHeterociclicos com azoto

Penicilinaa.a. e peptidos

TetraciclinaQuinonas

EritromicinaLactonas macrocíclicas

EstreptomicinaContém carbohidratos

Aplicações:

� Agentes terapêuticos� Antitumorais (citoestáticos)� Contra doenças das plantas� Preservantes de alimentos (ex:nisina contra

os clostridios)

� Estimulantes do crescimento animal� Ferramentas na bioquímica e biologia molecular

Antibioticos β-lactâmicos

� Penicilina� Descrita por Fleming 1929

� Estudos em 1940

� Aplicação clínica 1941

� Produzida por fungos (Penicillium, Aspergillus)

Antibioticos β-lactâmicos� Lábeis em meio ácido

� Inactivados pela hidrólise do anel β-lactâmico com penicilinase

� Baixa toxicidade

� Só 0,5 -2% dos pacientes desenvolve alergia

� Inibidores específicos da sintese de parede celular bacteriana (peptidoglucano)

Estrutura Química

O

6 5

N4

s

2

3

1 CH3

CH3

COO-]Na+,K+

RCON

N

Radical acile

Anel β-lactamico

Anel tiazolidinico

Acido 6-aminopenicilânico (6-APA)

� Se na fermentação não se adicionar precursores (os ácidos) da cadeia lateral � Penicilinas naturais

� Destes só a benzilpenicilina é útil terapeuticamente. As outras devem ser removidas durante a etapa de recuperação do produto

Processo comercial

� Penicilina G �actua contra Gram +Streptococcus pyogenes, Bacillusanthracis, Treponema pallidum

� Penicilina V �menos activa

Penicilinas semi sintéticas

� > estabilidade� > resistência à β-lactamase� > actividade antimicrobiana

Biossintese e regulação

� L- cisteína� L- valina

A sintese de Penicilina é afectada pela [fosfato] e sofre repressão catabólicapor glucose

β-lactamico-tiazolidinico

Biossintese e regulação

� L- cisteína� L- valina� Ácido α-aminoadípico

Condensação num tripéptidoδ- (L- α- aminoadipil)cisteinilvalina

O tripéptido é ciclizado e forma-se a isopenicilina-Nprimeiro composto com actividade microbiana

Desenvolvimento de EstirpesObjectivos: �rendimento� Eficiência na recuperação do produto

� Original – P. notatum� 1943 – P. chrysogenum NRRL 1951� Por mutagenese – estirpe WisQ176

Linha de culturas Wisconsin(adoptada pela maior parte dos fabricantes)

� Screening de mutantes� Agentes mutagénicos

� Utilização da tecnologia do DNA recombinante

+ recentementeNitritosAgentes alquilantes

Até anos 60 Raios xRadiações de λ curto

Método de Produção

� Método aeróbio com velocidade de absorção volumétrica de Oxigénio de 0,4-0,8 mM/L.min

� Faixa de temperatura 25-27ºC

� Reactores agitados, com arejamento operados em “Fed-batch”(alimentação continua de várias substâncias a uma fermentação descontinua)

Vantagens da operação “Fed-Batch”

� Condições de fermentação em estado quase estacionário

� Cultura em estado viável

� 1) operar o fermentador evitando repressão catabólica

� 2) operar abaixo dos níveis de inibição/toxicidade por substâncias essenciais à biossintese (fonte de N e precursor)

� 3) � duração da fase de crescimento

� 4) Prolongar a duração da fermentação (manter biomassa viável + tempo)

� 5) Operar a [biomassa] elevada e constante

� 6) Repor água evaporada com o arejamento da cultura

Inóculo Fase de crescimento40hTd=6 h

Fase real de produçãoDe Penicilina

Alimentando o meio com diferentes componentesA fase de produção podeEstender-se até120-160h

Esporos liofilizados(óptimo 5x103/ml)Formação de agregados“pellets”

Produção de Penicilina

Produção de Penicilina

� Meio de cultivo típico –MelaçoGorduras animaisÁgua de milhoFarinha de sojaExtracto de leveduraSoro de leiteLactose

Fonte de azoto

Fonte de azoto adicional

Fonte de carbono

� Vários tampões� pH constante = 6,5� Ác. fenil-acético é adicionado como precursor (Penicilina G)

� Ác. fenoxi-acético e adicionado como precursor (Penicilina V)

� Fermentação continua � problemas devido à instabilidade das estirpes

� Enzimas imobilizadas � para produção das penicilinas semi sintéticas.

� Método enzimático melhor que o químico + barato, - poluente.

Isolamento da Penicilina do caldo fermentadoExtracção

Caldo fermentado Arrefecido abaixo de 10ºC

+ 0,5-1% de formol

Inactivação dos microrganismosPrevenção da degradação porβ-lactamases

Obtenção de solvente rico do qual seExtrai o antibiótico

1

2

3

1 - Filtro rotativo (extractor continuo)

� O caldo é filtrado, o filtrado é lavado, � a extracção faz-se com solventes imiscíveis (acetato de butilo)

� Extracção feita em contracorrente� Extractores contínuos de vários andares

2- Extractor Decantador

� Extracção directa do caldo fermentado para o solvente (acetato de butilo)

� Como há turvação é necessário um clarificador (tipo separador liquido-liquido)

3- Combinação sistema de membranas com extractor continuo

� É o mais usado

Cristalização

� O acetato de butilo é descorado com carvão activado � (removido por filtração)

� Adiciona-se bicarbonato de potássio� Formação de 2 fases (orgânica e aquosa)� Adição de butanol à fase aquosa� Destilação� Os cristais de Penicilina potássica retidos no evaporador-cristalizador seguem uma via de filtração, lavagem e secagem.

Produção de Estreptomicina