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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E CITOTÓXICO ASSOCIADO A QUEIMA ARTESANAL DA CASTANHA DE CAJU
NO MUNICÍPIO DE JOÃO CÂMARA-RN.
MARCOS FELIPE DE OLIVEIRA GALVÃO
NATAL – RN 2011
MARCOS FELIPE DE OLIVEIRA GALVÃO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E CITOTÓXICO ASSOCIADO A QUEIMA ARTESANAL DA CASTANHA DE CAJU
NO MUNICÍPIO DE JOÃO CÂMARA-RN.
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Orientadora: Profª. Drª. Silvia Regina
Batistuzzo de Medeiros
NATAL – RN 2011
Seção de Informação e Referência
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Galvão, Marcos Felipe de Oliveira.
Avaliação do potencial genotóxico e citotóxico associado a queima artesanal da
castanha de caju no Município de João Câmara. / Marcos Felipe de Oliveira Galvão–
Natal, RN, 2011.
116 f. ; il.
Orientador: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de
Biociências. Departamento de Bioquímica. Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica.
1. Risco ocupacional – Dissertação. 2. Queima de biomassa – Dissertação. 3.
Castanha de caju – Dissertação. 4. Material particulado – Dissertação. 5.
Genotoxicidade – Dissertação. 6. Micronúcleo – Dissertação. I. Medeiros, Silvia
Regina Batistuzzo de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 504.5
Dedico essa dissertação aos meus pais, Alfredo Galvão Neto e Tereza
Cristina de Oliveira pelo empenho e dedicação no meu processo de formação
e construção do caráter e a minha avó Paula Frassinetti de Oliveira por
despertar em mim a importância da educação como ferramenta de
transformação.
AGRADECIMENTOS
Confesso que escrever os agradecimentos foi uma das etapas mais
prazerosas desta longa caminhada, por exigir apenas do meu coração para
demonstrar toda a minha gratidão, que dá sentido ao passado, traz paz para o hoje,
e cria uma visão para o amanhã. Venho aqui agradecer aqueles que contribuíram
direta e indiretamente para a conclusão desse trabalho.
Agradeço:
A Deus, que me concedeu a dádiva da vida e ter me dado a força necessária
para continuar trilhando minhas conquistas.
Aos meus pais, por terem me apoiado em todos estes anos, ensinando-me,
principalmente, a importância da construção e coerência do caráter, valores éticos e
cuidado com o próximo, que são características que um homem digno deve sempre
ter.
A minha mãe, Tereza Cristina de Oliveira, pelo cuidado, carinho e atenção.
Tenho cada vez mais certeza de que nossas divergências só nos aproximam e o
que sempre prevaleceu é o sentimento mais puro da maternidade.
Ao meu pai, Alfredo Galvão Neto, sei que é na nossa eterna cumplicidade que
são amenizadas as nossas dificuldades e provações. Me fez entender que a
distância física não é obstáculo para a perpetuação do sentimento que temos um
pelo outro, sinto em cada momento a sua forte presença em meu coração, meu
maior e eterno ídolo. Tenho forte na memória as suas palavras: “a maior herança
que um pai pode deixar para um filho é a educação, esta ninguém poderá tirar de
você”.
A minha avó materna Paula Frassinetti de Oliveira pela sensatez, dignidade e
força de vontade com a qual exerce o papel de matriarca, cuidando de todos da
família. Nunca esquecerei as diversas palavras de incentivo e motivação para com
os meus estudos, exaltando a importância deles em minha vida. A minha avó
paterna Raimy de Moura Galvão pelo carinho e preocupação comigo, seu bom
humor me contagia.
A minhas tias Ana Cláudia e Cláudia Adriana por acreditarem no meu
potencial, sempre me motivando.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq,
Edital 18/2006, pelo apoio financeiro a este projeto de pesquisa.
A minha orientadora, Profa Dra Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros, pela
oportunidade, confiança, ensinamentos e orientação. Minha mais profunda
admiração e respeito pela genialidade como pesquisadora e, simplicidade como
pessoa.
Ao meu grande amigo Thiago de Melo Cabral pelo apoio incondicional a
realização deste trabalho, pelos conselhos e palavras de incentivo, estimulando
minhas descobertas. Foram meses e meses saindo de casa à meia noite para
chegar na Comunidade do Amarelão à 80 km de distância, no horário de início da
queima da castanha de caju (02:00), dirigido em carro particular por estradas
perigosas e de barro, muitas vezes encharcada, dormindo dentro do carro em meio
a melodia dos seus intermináveis roncos, não foi fácil. Mas a amizade e
companheirismo construído ao longo deste período superou qualquer dificuldade.
Aos moradores da comunidade do Amarelão, em especial a família do casal
Sr. Emanoel e Dona Noêmia que nos recebeu com tanta atenção e empenho em
suas palhoças.
Ao meu irmão Túlio Madson sempre disposto a ajudar e incentivar quando eu
mais preciso. Aos demais irmãos Isabelle Cristina, Thayanne Gabriele, Mayana
Camila e Thales Pessoa.
A família Cabral, Tarcisio Cabral, Maria Eunice, Thiago Cabral, Marcelly
Cabral e Marcelo Cabral, podem ter certeza que o padrão e princípios de família que
eu aprendi com vocês irei guardar para o resto de minha vida. Não tem uma única
vez em que entrei na casa de vocês e não tenha me sentido como mais um filho. A
Jonny de Freitas, me faltam palavras para descrever a genialidade desse rapaz, sua
amizade é fundamental em minha vida. Aos agregados da família e amigos do poker
Rodrigo Noronha e Suellen Moraes, Diogo Dantas e Gersica Dantas.
A Jana Dara e Angélica Leal por me mostrar o real valor de uma verdadeira
amizade construída com muito carinho ao longo dessa jornada. Jana Dara quantas
vezes esteve me apoiando nos momentos mais difíceis de minha vida, quantas
lágrimas compartilhadas, quantos conselhos que eu nunca segui. Agradeço muito ao
mestrado por ter nos aproximado e aflorado esse sentimento que tenho por vocês e
que guardarei com muito carinho. A todos os demais amigos da turma de 2009.1 do
Mestrado em Bioquímica, Luciana Rabelo, Diego, Dayse Santos, Dayse Cunha,
Leonardo Nobre, Ruth, Renata, e Rafael.
Aos queridos amigos do Laboratório de Mutagênese Ambiental – LAMA,
certamente não teria lugar mais apropriado para o desenvolvimento deste trabalho.
As inesquecíveis tardes de trabalho regadas a diversão e descontração jamais serão
esquecidas.
Aos amigos da “velha guarda”: Givanilson Brito, hilário e companheiro,
Jefferson Barbosa e Edson Caio, sensatos e competentes, Maria Beatriz, sempre de
bem com a vida, Daniel Andrade, Alexandre Endres, Lucila Egito e Luciana
Fentanes. A Nilmara de Oliveira Alves (ou simplesmente Nilmarete) que fez presente
em todos os momentos deste trabalho, você não tem idéia do quanto suas palavras,
incentivo e carinho foram importantes, sua simplicidade e honestidade são minhas
referências. A Anuska Garcia, irreverência em pessoa, sempre com as palavras
certas na hora certa, sou grato pelas milhares de risadas seguidas de conselhos
preciosos que você me proporcionou. A Deborah Afonso, desculpe pelas vezes que
te chamei de vovó, mas toda a sua maturidade e espírito de vida sempre me
encantou. A Carol Corado, exemplo de uma pessoa perspicaz e amiga. A Caio
Graco pelas previsões, desmistificando alguns mitos. Natália Barbosa, sempre
atenciosa, principalmente ao trazer empadinhas direto de João Pessoa. Joana
Cristina, Isabella Tanus, Luíza Xavier, Thais Pimentel Guilermo, Mayara, Richelly
Dantas e Ana Flávia.
A todos os amigos do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica – LBMG.
A Fábio Duarte, vulgo Fabão, pelo carinho e momentos de irreverência, chefe dos
“pintas”. A Tatiana Pereira, sua breve passagem pela laboratório demonstrou o
quanto você é especial e transforma os lugares em que passa. Amanda Larissa e
Ana Rafaela o carinho e amizade de vocês é um presente que guardo com muito
carinho e sei que a perpetuação desta amizade é uma constante cada vez mais
certa. Ana Helena, Abí Jack, Daniel Chaves, Daniele Maria, Delanne Sena, Fabrícia
Lima, Fabíola Marques, Fernanda, Francinaldo, Juliana Alves, Julliane Tâmara,
Larissa Medeiros, Leonam Coutinho, Sthephanie Nassif e Thayse Azevedo.
Aos meus velhos e fiéis amigos, não sei o que seria de mim sem o apoio
incondicional, vocês são a força motriz que rege todas as minhas conquistas. Me
sinto muito querido em saber que tenho amizades pautadas na cumplicidade,
fidelidade e respeito: Joel Giuseppin, Camila Joice, Camila Saraiva, Camila
Santiago, Engel Medeiros, João Carlos, Alamanda Araújo, Monalyza Roberta, Paula
Beatriz, Pedro Vitor Rabelo, Iraktan Ramos, Amaury Duarte, Edgard Maranhão,
Clara Carvalho, Aline Mendonça, Daniela Vieira, Juliana Mendonça, Ana Paula
Fulco, Jailson Sousa, Katrine Cavalcanti, Ana Guedes, Carina Vasconcelos e
Larissa Galvão. A Ana Carolina pelo aprendizado de vida.
A Eloísa Teixeira Berreza que foi um anjo de olhos verdes que Deus mandou
para me iluminar nesta reta final do mestrado. Companheirismo, atenção, cuidado e
cumplicidade que me encantou de forma muito encorajadora. Jamais irei esquecer
as vezes em que limpou as minhas lágrimas, nunca deixando de acreditar em mim,
ressaltando meus princípios e capacidade.
Aos meus grande amigos da família Harper, Felipe Neto e Daniel Braz, tenho
certeza que o companheirismo e encanto desta bela amizade irá perdura por muito
tempo. A Maria Fernandes, Rebecca Guimarães, Jovilma Soares, Raphaella Martins,
Priscila Coelho, Larissa Chamberlain, Emilia Teixeira e Milton Duarte, amigos que
vieram na hora e dose certa.
Ter começado a escrever estes agradecimentos na mais bela praia do Brasil,
Barra do Cunhaú - RN, local cuja a minha história de vida está registrada e
testemunhada em cada grão de areia, em meio a muitas lágrimas, por ter
relembrado dos momentos de felicidade com as pessoas que estarão para sempre
guardadas no meu coração, me faz lembrar o quanto eu sou feliz por simplesmente
fazer o que eu gosto. Obrigado a todos que entendem os meus momentos de euforia
acompanhados de entusiasmo, alegria e bom humor, mas principalmente os
momentos de silêncio.
“Ninguém é digno do pódio se não usar suas
derrotas para alcançá-lo. Ninguém é digno da
sabedoria se não usar suas lágrimas para cultivá-la.
Ninguém terá prazer no estrelato se desprezar a beleza
das coisas simples no anonimato. Pois nelas se
escondem os segredos da felicidade.”
Augusto Cury
RESUMO
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de castanha de caju e apesar da importância social e econômica, sua produção ainda é realizada de forma artesanal. Um dos maiores problemas da cadeia produtiva do caju são as condições nas quais ocorre a queima artesanal da castanha para se obter a amêndoa. No presente estudo foi realizado um biomonitoramento do potencial genotóxico e avaliação da citotoxicidade associada aos elementos oriundos da queima artesanal da castanha de caju no município de João Câmara - RN, semi-árido brasileiro. Para a avaliação genotóxica foi utilizado o bioensaio de micronúcleo (MN) em Tradescantia pallida. Além disso, foi realizado um comparativo quanto a sensibilidade da T. pallida frente ao clone KU-20 e outros biomarcadores de danos no DNA, tais como as pontes nucleoplasmáticas (PNP) e fragmentos nucleares (FN) foram quantificados. A avaliação citotóxica se deu pelo ensaio MTT e método de exclusão por tripan blue. As concentrações de material particulado (MP1,0, MP2,5, MP10) e black carbon (BC) foram determinadas e a composição inorgânica do MP2.5 definida pela técnica de fluorescência de raios-X. Foram definidos dois pontos testes: Comunidade do Amarelão (local de queima da castanha de caju) e Fazenda Santa Luzia (sem influência da atividade). Os valores médios obtidos para o MP2,5 (Jan - 2124,2 µg/m3; Mai – 1022,2 µg/m3; Set – 1291,9 µg/m3) e BC (Jan 363,6 µg/m3; Mai 70 µg/m3; Set 69,4 µg/m3), bem como a concentração dos elementos Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Se, Br e Pb obtidos no Amarelão foram significativamente maiores que na Fazenda Sta. Luzia. Os testes de genotoxicidade com T. pallida indicaram um aumento de 2-7 vezes maior na frequência de MN para o Amarelão. Os outros biomarcadores também apresentaram sua frequência aumentada. Além disso, verificou-se uma correlação negativa entre a freqüência de MN, PNP e FN com a precipitação pluviométrica. As concentrações de 200 µg/mL e 400 µg/mL do MP2,5 em suspensão foram citotóxicas para as células MRC-5. O conjunto dos resultados indicaram genotoxicidade e citotoxicidade para a comunidade do Amarelão, sendo as altas concentrações de MP2,5 um dos prováveis contribuintes para esse efeito, principalmente pela elevada presença de metais de transição, sobretudo Fe, Ni, Cu, Cr e Zn, que potencialmente causam lesões no DNA. Outras alterações nucleares, como PNP e FN podem ser utilizadas como biomarcadores efetivos de danos no DNA em tétrades de T. pallida. Os conjunto dos resultados possibilitaram a identificação de um problema ocupacional grave, com sérios riscos aos trabalhadores que exercem a atividade. Diante disto, a adoção de medidas preventivas e de melhores práticas, são de fundamental importância para o desenvolvimento sustentável da atividade e melhoria na qualidade de vida dos trabalhadores. Palavras-chave: Risco ocupacional, Queima de biomassa, Castanha de caju, Material particulado, Genotoxicidade, Micronúcleo.
ABSTRACT
The Brazil is the third largest producer of cashew nuts in the world. Despite the social and economic importance of the cashew nut, its production is still carried out artisanally. One of the main problems encountered in the cashew production chain are the conditions under which the roasting of the nut occurs to obtain the kernel from the shell. In the present study was conducted a biomonitoring of the genotoxic and cytotoxicity effects associated with the elements from the cashew nut roasting in João Câmara - RN, semi-arid region of Brazil. To assess the genotoxic was used the bioassay of micronucleus (MN) in Tradescantia pallida. In addition, it was performed a comparative between the Tradescantia pallida and KU-20 and other biomarkers of DNA damage, such as the nucleoplasmic bridges (NBP) and nuclear fragments (NF) were quantified. The levels of particulate matter (PM1.0, PM2.5, PM10) and black carbon (BC) were also measured and the inorganic chemical composition of the PM2.5 collected was determined using X-ray fluorescence spectrometry analysis and the assessment of the cytotoxicity by MTT assay and exclusion method by trypan blue. . For this purpose, were chosen: the Amarelão community – where the roasting occurs and the Santa Luzia farm – an area without influence of this process. The mean value of PM2.5 (Jan 2124.2 µg/m3; May 1022.2 µg/m3; Sep 1291.9 µg/m3) and BC (Jan 363.6 µg/m3; May 70.0 µg/m3; Sep 69.4 µg/m3) as well as the concentration of the elements Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Se, Br and Pb obtained at Amarelão was significantly higher than at Santa Luzia farm. The genotoxicity tests with T. pallida indicated a significant increase in the number of MN, NBP and NF and it was found a negative correlation between the frequency of these biomarkers and the rainfall. The concentrations of 200 µg/mL and 400 µg/mL of PM2.5 were cytotoxic to MRC-5 cells. All together, the results indicated genotoxicity and citotoxicity for the community of Amarelão, and the high rates of PM2.5 considered a potential contributor to this effect, mainly by the high presence of transition metals, especially Fe, Ni, Cu, Cr and Zn, these elements have the potential to cause DNA damage. Other nuclear alterations, such as the NPBs and NFs may be used as effective biomarkers of DNA damage in tetrads of Tradescantia pallida. The results of this study enabled the identification of a serious occupational problem. Accordingly, preventative measures and better practices should be adopted to improve both the activity and the quality of life of the population. These measures are of fundamental importance for the sustainable development of this activity. Key words: Occupational risk, Biomass burning, Cashew nut roasting, Particulate matter, Genotoxicity, micronuclei.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A - Distribuição do MP nas vias aéreas. O MP ≥ 10 µm é retido entre o
nariz e a boca. MP 10 µm ultrapassa a laringe e penetra na traquéia e brônquios. MP
2,5 µm e MP 0,1 µm chega aos alvéolos pulmonares. B - Partículas finas e
ultrafinas fagocitadas pelos alvéolos pulmonares e desencadeando um processo
inflamatório........................................................................................................... 23
Figura 2. Modelo hierárquico de estresse oxidativo ............................................ 25
Figura 3. (A-E) Processo de queima da castanha de caju na comunidade do
Amarelão, João Câmara - RN; (F) Quebra da castanha para obtenção da amêndoa
............................................................................................................................. 34
Figura 4. (A) Esquema do processo de formação do micronúcleo (origem
clastogênica e aneugênica); (B) e ponte nucleoplasmática ................................ 39
Figura 5. Tradescantia pallida (Rose) D.R. Hunt var. purpúrea........................... 40
Figura 6. Localização dos pontos de exposição das mudas de T. pallida e do clone
KU-20 e amostragens do material particulado. A seta acima indica a direção
dominante dos ventos na região. ......................................................................... 45
Figura 7. (A e C) Medição de MP1,0, MP2,5 e MP10 na comunidade do Amarelão com
o auxílio do amostrador portátil “DUSTRAK” aerossol monitor; (B e D) Medição de
MP2,5 e BC realizada com o equipamento portátil “Mini-Sampler”........................ 47
Figura 8. A - Floreiras contendo os diferentes componentes utilizados na
preparação do solo. B - Casa de vegetação onde foi realizada a propagação das
mudas antes do período experimental. C - Mudas prontas para serem levadas para
os locais de exposição.............. ........................................................................... 50
Figura 9. Esquema da preparação citológica. ..................................................... 51
Figura 10. Filtros de policarbonato usado no amostrador Mini-sampler após
campanha de exposição nos três pontos teste. A - Corresponde ao filtro exposto na
comunidade do Amarelão; B - Corresponde ao ponto Fazenda Sta. Luzia. ........ 57
Figura 11. Índice pluviométrico para a cidade de João Câmara - RN no ano de 2007,
período em que foi realizado as medições de MP1,0, MP2,5 e MP10 com o amostrador
portátil “DUSTTRAK™ Aerossol Monitor”............................................................. 60
Figura 12. Índice pluviométrico para a cidade de João Câmara - RN entre os meses
de agosto/2008 e setembro/2009, período em que foi realizado o biomonitoramento
e as amostragens de MP2,5 com o amostrador portátil “Mini-Sampler”................. 60
Figura 13. Tétrades de Tradescantia pallida coradas com acetato de carmim a 2% e
visualizadas em microscopia óptica com um aumento de 400 X. A e D – Morfologia
de tétrades sem alterações nucleares; B, C e E – Tétrades com a presença de um
micronúcleo; F – Tétrade com dois micronúcleos. (As setas apontam os
micronúcleos).. ..................................................................................................... 61
Figura 14. Comparativo da frequência média de MN in situ em inflorescências de
Tradescantia pallida frente ao clone KU-20 para o mês de novembro/2008 na
fazenda Sta. Luzia, UFRN e Comunidade do Amarelão.. .................................... 62
Figura 15. Frequência média de MN in situ em tétrades de T. pallida expostas na
comunidade do Amarelão e a concentração média de MP2,5 para os meses de
janeiro, maio e setembro de 2009. ....................................................................... 64
Figura 16. Biomonitoramento in situ da frequência média de MN em tétrades de T.
pallida para a Comunidade do Amarelão e Fazenda Sta. Luzia e precipitação
pluviométrica mensal para o mesmo período em análise. ................................... 66
Figura 17. Diagrama de dispersão para o índice de MN com relação a precipitação
pluviométrica para o mesmo período de coleta das inflorescências de T. pallida.
Correlação negativa franca para a Fazenda (r = -0,41) e negativa moderada para o
Amarelão (r = -0,58). ............................................................................................ 67
Figura 18. Ensaio de viabilidade celular pelo método de exclusão por azul de tripan,
utilizando as cinco concentrações do extrato inorgânico obtido do MP2,5 coletado na
comunidade do Amarelão..................................................................................... 69
Figura 19. Ensaio de citotoxicidade celular pelo método MTT, utilizando as sete
concentrações do extrato inorgânico obtido do MP2,5 coletado na comunidade do
Amarelão.............................................................................................................. 69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Padrões nacionais de qualidade do ar estabelecidos pelo CONAMA,
Resolução nº 03 de 28/06/90. .............................................................................. 28
Tabela 2. Critérios para episódios agudos de poluição do ar estabelecidos pelo
CONAMA, Resolução nº 03 de 28/06/90.............................................................. 29
Tabela 3. Quantificação do MP1,0, MP2,5 e MP10 para os dois pontos testes no mês
de maio de 2007, utilizando o amostrador portátil “DUSTTRAK™ Aerossol Monitor”,
assim como os limites de qualidade do ar estabelecidos pelo CONAMA, USEPA e
OMS. .................................................................................................................... 56
Tabela 4. Quantificação do MP2,5 e black carbon para os dois pontos testes no mês
de janeiro do ano de 2009, utilizando o amostrador portátil “Mini-Sampler” da
Harvard................................................................................................................. 58
Tabela 5. Composição elementar dos componentes retidos nos filtros de
policarbonato amostrados pelo Mini-Sampler na Fazenda Santa Luzia e Comunidade
do Amarelão nos meses de janeiro, maio e setembro de 2009............................ 59
Tabela 6. Frequência mensal de micronúcleos e respectivos desvio-padrão (D.P.)
em inflorescências de T. pallida amostradas em cada ponto teste, durante o período
de julho de 2008 a setembro de 2009 e o número de tétrades analisadas. ......... 63
Tabela 7. Matriz de correlação entre a frequência de micronúcleos (MNs), pontes
nucleoplasmáticas (PNP), fragmentos nucleares (FN) e pluviometria para a
Comunidade do Amarelão e Fazenda Sta. Luzia. ................................................ 68
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
ACGIH American Conference of Govermental Industrial Hygienists
BC Black Carbon
BNL-4430 Clone de Tradescantia desenvolvido no Brookhaven National
Laboratory
CAT Catalase
CAP Concentrated Ambient Particles
CBMN Cytokinesis-Block Micronucleous Assay
CEN European Standardization Committee
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
DMEM Dulbeccos Minimal Essential Medium
DPOC Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FN Fragmento nuclearF
FPG Formamidopirimidina DNA Glicosilase
FRX Fluorescência de Raios-X
GLP Gás Liquefeito de Petróleo
HPAs Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IPCS International Programme on Chemical Safety
ISO International Organization for Standardization
KU-20 Clone de Tradescantia desenvolvido na Universidade de Kyoto
LCC Líquido da Castanha de Caju
MN Micronúcleo
MP Material Particulado
MP0,1 Material Particulado com granulometria menor ou igual a 0,1 µm
MP2,5 Material Particulado com granulometria menor ou igual a 2,5 µm
MP10 Material Particulado com granulometria menor ou igual a 10 µm
MRC-5 Estirpe de células diplóides de pulmão de feto humano
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazoL-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NAAQS National Ambient Air Quality Standards
NOx Óxidos de nitrogênio
NR-9 Norma Regulamentadora 9 (Programa de Prevenção dos Riscos
Ambientais – PPRA)
NR-15 Norma Regulamentadora 15 (Atividades e Operações Insalubres)
OH• Radical hidroxila
OMS Organização Mundial da Saúde
PED Partículas de Exaustão do Diesel
PEG Partículas de Exaustão da Gasolina
PIB Produto Interno Bruto
PNP Ponte nucleoplasmática
PTS Partículas Totais em Suspensão
SEDEC Secretaria de Estado do Desenvolvimento Econômico do Rio Grande
do Norte
SOD Superóxido Dismutase
T. pallida Tradescantia pallida
LEO Limites de Exposição Ocupacional
Trad-MCN Teste de micronúcleo em Tradescantia
TVL Threshold Limit Values
UFP Ultrafine Particles
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
US EPA United States Environmental Protection Agency
WHO World Health Organization
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................21
1.1 Poluição atmosférica........................................................................................21
1.1.1 Material Particulado (MP) ......................................................................22
1.1.2 Black carbon (BC)..................................................................................26
1.2 Legislação ambiental e ocupacional aplicável ao material particulado ............27
1.3 Queima de biomassa.......................................................................................31
1.3.1 Queima da castanha de caju no Rio Grande do Norte ..........................31
1.4 Testes de genotoxicidade................................................................................35
1.4.1 Vegetais como bioindicadores da poluição atmosférica ........................36
1.4.2 Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN).............................37
1.4.2.1 Utilização da Tradescantia pallida no Trad-MCN............................40
1.5 Testes de citotoxicidade ..................................................................................41
1.6 Objetivos..........................................................................................................42
2. JUSTIFICATIVA DO TRABALHO ........................................................................43
3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................44
3.1 Área de estudo ................................................................................................44
3.2 Quantificação do material particulado com o uso de amostradores ................45
3.2.1. Amostrador DUSTTRAK™ Aerossol Monitor (MP1,0, MP2,5 e MP10) .....45
3.2.2. Amostrador Mini-Sampler (MP2,5) .........................................................46
3.3 Análise da composição do material particulado acumulado nos filtros de
policarbonato .........................................................................................................47
3.3.1. Determinação Gravimétrica de Massa..................................................48
3.3.2. Análise de Reflectância ........................................................................48
3.3.3. Análise de Fluorescência de raios-X ....................................................48
3.4 Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN).......................................49
3.4.1 Cultivo e exposição das mudas .............................................................49
3.4.2 Coleta das inflorescências.....................................................................50
3.4.3 Preparação citológica ............................................................................51
3.4.4 Análise citogenética...............................................................................51
3.5 Extração do MP2,5 retido nos filtros..................................................................52
3.6 Bioensaios com cultura de células...................................................................52
3.6.1. Cultura de células .................................................................................52
3.6.2 Viabilidade celular..................................................................................53
3.6.3 Citotoxicidade celular.............................................................................53
3.7 Análise estatística............................................................................................54
4. RESULTADOS......................................................................................................55
4.1 Quantificação do material particulado com o uso de amostradores ................55
4.1.1. Amostrador DUSTTRAK™ Aerossol Monitor (MP1,0, MP2,5 e MP10) .....55
4.1.2. Amostrador Mini-Sampler (MP2,5) .........................................................56
4.2 Análise da composição elementar do material particulado acumulado nos
filtros de policarbonato...........................................................................................58
4.3 Parâmetros pluviométricos ..............................................................................60
4.4 Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN).......................................61
4.4.1. Índice de micronúcleos em T. pallida x MP2,5 .......................................64
4.4.2. Índice de micronúcleos em T. pallida x pluviometria.............................65
4.4.3. Correlação entre os biomarcadores de dano ao DNA ..........................67
4.5 Viabilidade Celular...........................................................................................68
4.6 Citotoxicidade Celular ......................................................................................69
5. DISCUSSÃO .........................................................................................................70
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................78
REFERÊNCIAS.........................................................................................................79
APÊNDICE................................................................................................................99
INTRODUÇÃO
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 Poluição atmosférica
A poluição atmosférica representa um dos maiores problemas da atualidade,
podendo causar sérios danos ao meio ambiente e, de forma mais preocupante, ao
ser humano. É possível observar que, ao longo dos últimos anos, vem crescendo a
preocupação da população acerca dos possíveis efeitos adversos à saúde causados
pela exposição à poluentes atmosféricos. Esta preocupação, porém, não é um fato
recente. Os efeitos nocivos da poluição do ar vêm sendo mais claramente
documentados desde a primeira metade do século passado, durante episódios de
alta concentração de poluentes como os observados no Vale Meuse, na Bélgica em
1930; em Donora, na Pensilvania em 1948; e em Londres, Inglaterra, no inverno de
1952 (FIRKET, 1931; CIOCCO & THOMPSON, 1961; GOUVEIA et al., 2003).
De acordo com a Resolução do Conselho Nacional do Meio Ambiente
(CONAMA) nº 03, de 28/06/1990 considera-se poluente atmosférico “qualquer forma
de matéria ou energia com intensidade e em quantidade, concentração, tempo ou
características em desacordo com os níveis estabelecidos, e que tornem ou possam
tornar o ar impróprio, nocivo ou ofensivo à saúde, inconveniente ao bem-estar
público, danosos aos materiais, à fauna e à flora ou prejudicial à segurança, ao uso
e gozo da propriedade e às atividades normais da comunidade”.
Existem diversas maneiras de classificar os poluentes atmosféricos. Estes
podem ser classificados quanto ao tipo de fonte de emissão (natural ou antrópica,
móvel ou estacionária), quanto a sua formação (primário ou secundário), estado
físico (particulado, gases e vapores) e composição química (orgânicos ou
inorgânicos).
São exemplos de fontes naturais de poluentes atmosféricos as emissões de
gases provocadas por erupções vulcânicas, decomposição de vegetais e animais,
tempestades de areia (haboob), ressuspensão de poeira do solo pelos ventos,
formação de gás metano em pântanos, aerossóis marinhos, a formação de ozônio
devido a descargas elétricas na atmosfera, os incêndios naturais em florestas e os
pólens de plantas. Dentre as fontes antrópicas de poluição do ar destacam-se os
diversos processos e operações industriais, a queima de combustível para fins de
INTRODUÇÃO
22
transporte, queimadas na agricultura, incineração de lixo, produtos voláteis,
equipamentos de refrigeração e ar condicionado, e sprays (GODISH, 1997;
ALMEIDA, 1999).
Os poluentes primários são aqueles emitidos diretamente no ar. Já os
poluentes secundários são aqueles que se formam por meio de reações químicas
que ocorrem entre os poluentes primários e componentes naturais da atmosfera (ex.
radiação solar). Dentre os poluentes primários estão o monóxido de carbono (CO),
material particulado (MP), black carbon (BC), dióxido de enxofre (SO2), óxidos de
nitrogênio (NOx) e hidrocarbonetos (HC). Na atmosfera, os componentes primários
podem interagir com os diversos componentes nela existente formando os
componentes secundários, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido sulfúrico
(H2SO4), ácido nítrico (HNO3), hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e
ozônio (O3) (WHO, 2005).
1.1.1 Material Particulado (MP)
Sob a denominação geral de material particulado (MP) se encontra um
conjunto de poluentes que se mantém suspenso na atmosfera devido ao seu
pequeno tamanho aerodinâmico. O MP representa uma complexa mistura de
substâncias orgânicas e inorgânicas, onde as partículas do aerossol atmosférico
podem variar quanto ao tamanho em mais do que quatro ordens de grandeza, desde
pequenos agrupamentos contendo algumas moléculas em gotículas até partículas
de poeira com tamanho de até dezenas de mícrons. O tamanho das partículas está
diretamente associado ao seu potencial para causar problemas à saúde, sendo que,
quanto menores, maiores os efeitos provocados (US EPA, 2004; WHO, 2005).
A composição química do MP é bastante variada, e vai depender
principalmente da sua fonte de emissão. Os principais componentes do MP são os
compostos orgânicos adsorvidos, que podem ser voláteis ou semivoláteis (HPAs,
nitro-HPAs, quinonas); os metais de transição (ferro, níquel, cobre, zinco, vanádio);
íons (sulfato, nitrato); gases reativos (ozônio, peróxidos, aldeídos); material de
origem biológica (endotoxinas, bactérias esporulantes, polén) e minerais (quartzo,
amianto, poeira de solo) (VALAVANIDIS et al., 2008). As partículas originadas da
combustão de matéria orgânica apresentam um núcleo de carbono elementar que é
INTRODUÇÃO
23
revestido com uma camada de produtos químicos, incluindo os hidrocarbonetos
orgânicos, metais, nitratos e sulfatos. Todos estes componentes desempenham um
papel importante na toxicidade atribuída ao MP (NEL, 2005).
De forma geral o MP é divido de acordo com o seu diâmetro aerodinâmico em
fração grossa (partículas maiores que 2,5 µm), fina (partículas menores que 2,5 µm -
MP2,5) e ultrafina (partículas menores que 0,1 µm - MP0,1). A fração particulada
grossa, quando inalada, fica retida nas vias respiratórias superiores pelo mecanismo
mucociliar. No entanto, as frações particuladas fina e ultrafina, quando inaladas,
podem atingir as vias aéreas inferiores, chegando aos alvéolos pulmonares, onde
podem exercer seu potencial tóxico sobre as células alveolares, como macrófagos,
neutrófilos e células epiteliais. Além disso, algumas partículas podem transpor a
barreira epitelial alveolar, cair na circulação sanguínea e desencadearem efeitos
sistêmicos (DONALDSON et al., 2001; CORMIER et al., 2006) (Figura 1).
Figura 1. A - Distribuição do MP nas vias aéreas. O MP ≥ 10 µm é retido entre o nariz e a
boca. MP 10 µm ultrapassa a laringe e penetra na traquéia e brônquios. MP 2,5 µm e
MP 0,1 µm chega aos alvéolos pulmonares. B - Partículas finas e ultrafinas fagocitadas nos
alvéolos pulmonares e desencadeando um processo inflamatório. Figura original
(DONALDSON et al., 2001; CORMIER et al., 2006).
Outra classificação para o material particulado adotada pela comunidade da
saúde ocupacional é feita conforme o seu acesso nas diversas partes do sistema
respiratório. Esta classificação foi adotatada a partir de 1993 pela American
Conference of Govermental Industrial Hygienists (ACGIH), pela International
Organization for Standardization (ISO) e pelo European Standardization Committee
(CEN). As partículas são divididas em: partículas inaláveis, torácicas e respiráveis.
AA)) BB))
INTRODUÇÃO
24
As partículas inaláveis são definidas como a fração em massa das partículas
totais em suspensão que são inaladas através da boca e nariz. Essa fração
depende, principalmente, da velocidade e direção do movimento do ar próximo à
cabeça, taxa de respiração (inspirações por minuto) e volume de respiração
(mL inspirado). As partículas torácicas são o conjunto de partículas que atravessam
a laringe e alcançam as vias aéreas dos pulmões e as regiões de troca de ar dos
pulmões. As partículas respiráveis são o subconjunto de partículas torácicas que
estão mais suscetíveis a alcançar as regiões de troca de ar dos pulmões, os
alvéolos pulmonares (US EPA, 2004 apud RESENDE, 2007).
O principal efeito pulmonar do MP tem sido associado ao processo de
inflamação nas vias aéreas inferiores, o que pode levar à exacerbação da asma e
bronquite crônica, obstrução das vias aéreas e diminuição das trocas gasosas. O
MP também pode interferir na remoção e inativação de bactérias pelo tecido
pulmonar (NEL, 2005).
O processo de inflamação evidenciado na exposição celular ao MP muitas
vezes é associado com a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). A
presença de metais de transição, tais como: o cobre, vanádio, cromo, níquel,
cobalto, ferro e hidrocarbonetos orgânicos pró-oxidantes, como os HPAs e quinonas
associados ao particulado fino e ultrafino favorecem a formação das EROs,
aumentando a capacidade oxidativa destas partículas (NEL, 2005). Além disto,
quando comparado com o particulado grosso, as partículas finas e ultrafinas, numa
mesma concentração, apresentam uma área de superfície maior, o que lhes permite
interagir com um número maior de estruturas celulares e agregar uma quantidade
maior de metais de transição e hidrocarbonetos (DREHER et al., 1997; DICK et al.,
2003; GWINN, et al., 2006). Diferenças no tamanho e composição química do MP
foram relacionadas à sua capacidade de absorção pelos diferentes sistemas
celulares e indução de estresse oxidativo (BROWN et al., 2001; KREYLING et al.,
2002; DICK et al., 2003).
O Radical hidroxila (OH•) é uma das EROs com o maior potencial oxidante, e
sua geração, mediada por metais de transição, é uma das principais hipóteses para
a toxicidade atribuída ao MP. Uma vez que o material particulado pode conter uma
grande variedade de metais, a produção de OH• mediada por metais de transição,
depende da quantidade de cada metal no particulado e suas interações
(VALAVANIDIS et al., 2000; VIDRIO et al., 2008). Estudos in vitro e in vivo utilizando
INTRODUÇÃO
25
partículas ambientais concentradas e particulado ultrafino com composição química
definida e em tamanhos diferentes, mostraram que a produção de EROs é um fator
importante que contribui para a inflamação e à toxicidade do MP (GWINN, et al.,
2006).
A geração de EROs induzida pelo particulado fino e ultrafino, leva ao estresse
oxidativo e ativação de vias de sinalização e apoptose, que são considerados novos
insights no desenvolvimento de doenças pulmonares e cardiovasculares. Esta
relação foi ilustrada em um modelo de estresse oxidativo hierárquico que apresentou
a correlação entre estresse oxidativo e alterações correspondentes as respostas
celulares induzidas por partículas ultrafinas (Figura 2) (NEL et al., 2006).
Os efeitos sobre a saúde decorrentes da exposição por curtos e longos
períodos ao MP têm sido associados a infecções respiratórias agudas em crianças,
doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), pneumoconiose, tuberculose pulmonar
(ARBEX et al., 2004), comprometimento do sistema cardiovascular (DOCKERY,
2001; PARK et al., 2005), desenvolvimento e/ou agravo da arteriosclerose (SUWA et
al., 2002; HOFFMANN et al., 2007; ARAUJO et al., 2008), irritação ocular (SAXENA
et al., 2003), alterações no sistema reprodutor feminino (ŜRÁM et al., 1999;
MOHALLEM et al., 2005; VERAS et al., 2008), alterações no sistema reprodutor
Figura 2. Modelo hierárquico de estresse oxidativo. Baixo nível de estresse oxidativo (estágio 1), enzimas antioxidantes da fase II são induzidas pela ativação transcricional dos elementos de resposta antioxidante. Nível intermediário de estresse oxidativo (estágio 2), a ativação de MAPK e cascatas de NF-kB induz reações pró-inflamatórios. Alto nível de estresse oxidativo (estágio 3), perturbações na permeabilidade mitocondrial e disfunções na transferência de elétrons resultam no processo de apoptose celular ou necrose. Modelo adaptado de Nel et al. (2006).
INTRODUÇÃO
26
masculino (ŜRÁM et al., 1999; LICHTENFELS et al., 2007), além da mortalidade
intra-uterina (PEREIRA et al., 1998), neonatal e pós-neonatal (THURSTON, 2000) e
mortalidade cardiorrespiratória (LÓPEZ-VILLARRUBIA et al., 2010).
Num estudo realizado por Pope et al. (2002) nos Estados Unidos com
500.000 pessoas revelou que um acréscimo de 10 µg/m3 nos níveis de MP2,5 na
atmosfera urbana de diversas cidades americanas foi associado ao aumento de 6%
nas taxas de doenças cardiopulmonares e 8% nas taxas de câncer pulmonar.
Somado a isto, diversos estudos associam a exposição ao MP por um longo período
com o desenvolvimento de câncer no pulmão (BEESON et al., 1998; POPE et al.,
2002; VINEIS et al., 2005).
1.1.2 Black carbon (BC)
O aerossol “Black carbon” (BC), também conhecido como carbono elementar,
é um dos mais importantes constituintes do material particulado. O BC é
essencialmente um poluente primário emitido durante combustão incompleta de
biomassa ou combustíveis fósseis e representa a fração do particulado de maior
eficiência na absorção de radiação solar de comprimento de onda curta, o que
influencia de forma definitiva no balanço radioativo da atmosfera e
consequentemente nas condições climáticas. Em regiões urbanas, grandes
concentrações de BC levam à redução da visibilidade. Os aerossóis BC são o
segundo maior contribuinte para o aquecimento global, depois do CO2 e na frente do
CH4 em termos de sua força radiativa direta (JACOBSON, 2001; VIIDANOJA et al.,
2002).
Além dos efeitos no aquecimento global, vários estudos correlacionam os
níveis de BC aos efeitos na saúde humana, principalmente com a elevação na
pressão arterial (MORDUKHOVICH et al., 2009) e com o aumento de
hospitalizações causadas pelo risco de infarto do miocárdio e pneumonia
(ZANOBETTI & SCHWARTZ, 2006).
INTRODUÇÃO
27
1.2 Legislação ambiental e ocupacional aplicável ao material particulado
No Brasil, a resolução nº 03 de 28 de junho de 1990, do Conselho Nacional
do Meio Ambiente (CONAMA, 1990) estabelece como limite de padrões de
qualidade do ar para o material particulado utilizando apenas a sua concentração
total. Entretanto, um aspecto importante na avaliação do risco à saúde e relevância
ambiental das partículas em suspensão é a caracterização de espécies químicas
tóxicas a elas associadas, mesmo que a legislação não determine o seu
monitoramento.
Em todo o mundo, agências oficiais e organizações não governamentais
avaliam a qualidade do meio ambiente através do desenvolvimento de metodologias,
legislação apropriada e monitoramento contínuo dos poluentes, tal como a Agência
de Proteção Ambiental Norte-Americana (Environmental Protection Agency, EPA) e
Organização Mundial da Saúde (OMS). No Brasil os padrões de qualidade do ar são
estabelecidos pelo CONAMA, com a determinação da concentração de partículas
totais em suspensão (PTS), partículas inaláveis (MP10), dióxido de enxofre (SO2),
monóxido de carbono (CO), ozônio (O3) e óxidos de nitrogênio (NOx), conforme
Tabela 1 (CONAMA, 1990).
A Resolução 03/90 do CONAMA estabelece dois tipos de padrões de
qualidade do ar: os primários e os secundários. O primeiro refere-se às
concentrações de poluentes que, ultrapassadas, poderão afetar a saúde da
população. Podem ser entendidos como níveis máximos toleráveis de concentração
de poluentes atmosféricos, constituindo-se em metas de curto e médio prazo. Já os
padrões secundários de qualidade do ar são as concentrações de poluentes
atmosféricos abaixo das quais se prevê o mínimo efeito adverso sobre o bem estar
da população, assim como o mínimo dano à fauna e à flora, aos materiais e ao meio
ambiente em geral. Podem ser entendidos como níveis desejados de concentração
de poluentes, constituindo-se em meta de longo prazo (CONAMA, 1990).
INTRODUÇÃO
28
Tabela 1. Padrões nacionais de qualidade do ar estabelecidos pelo
CONAMA, Resolução nº 03 de 28/06/90.
1 - Não deve ser excedido mais que uma vez ao ano. 2 - Média geométrica anual. 3 - Média aritmética anual.
Nesta mesma resolução, em seu artigo 5º, o CONAMA trata dos critérios para
elaboração de plano de emergência, definindo como episódio crítico de poluição do
ar a presença de altas concentrações de poluentes na atmosfera, em curto período
de tempo, resultante de condições meteorológicas desfavoráveis à dispersão dos
poluentes, Tabela 2.
Poluente Tempo de Amostragem
Padrão Primário
µg/m³
Padrão Secundário
µg/m³
Método de Medição
partículas totais
em suspensão (PTS) 24 horas1
MGA2 240 80
150 60
amostrador de grandes volumes
partículas inaláveis
(MP10) 24 horas1
MAA3 150 50
150 50
separação inercial/filtração
fumaça 24 horas1 MAA3
150 60
100 40 refletância
dióxido de enxofre
(SO2) 24 horas1
MAA3 365 80
100 40 pararosanilina
dióxido de nitrogênio
(NO2) 1 hora1 MAA3
320 100
190 100
quimiluminescência
monóxido de carbono 1 hora1
8 horas1
40.000
10.000
40.000
10.000
infravermelho não dispersivo
Ozônio (O3) 1 hora1 160 160 quimiluminescência
INTRODUÇÃO
29
Tabela 2. Critérios para episódios agudos de poluição do ar
estabelecidos pelo CONAMA, Resolução nº 03 de 28/06/90.
Parâmetros Atenção Alerta Emergência
partículas totais em suspensão (PTS)
(µg/m3) - 24h 375 625 875
partículas inaláveis (MP10)
(µg/m3) - 24h 250 420 500
fumaça
(µg/m3) - 24h 250 420 500
dióxido de enxofre (SO2)
(µg/m3) - 24h 800 1.600 2.100
dióxido de nitrogênio (NO2)
(µg/m3) - 1h 1.130 2.260 3.000
monóxido de carbono (CO)
(ppm) - 8h 15 30 40
ozônio
(µg/m3) – 1h 400 800 1.000
Mais recentemente, a resolução nº 382, de 26 de dezembro de 2006, do
CONAMA estabeleceu os limites máximos de emissão de poluentes atmosféricos
para fontes fixas. Dentre as diversas fontes de poluição, o anexo 3 estabelece os
limites de emissão de poluentes atmosféricos gerados em processos de geração de
calor a partir da combustão do bagaço de cana-de-açúcar. Para as partículas totais
em suspensão, a resolução define o limite de 200 mg/Nm3 para uma potência
térmica nominal maior que 75 MW.
A legislação brasileira ainda não estabeleceu padrões para as partículas
respiráveis, com diâmetro inferior a 2,5 µm (MP2,5). Nos países em que o
monitoramento das emissões de poluentes é amparado por legislações mais
rigorosas, como nos Estados Unidos, os padrões para o MP2,5 foram estabelecidos
desde 1997 (EPA, 1999).
No ano de 2006 a Organização Mundial de Saúde (OMS) publicou novos
padrões de qualidade do ar para material particulado. Os valores limite são
sugestões a serem adotadas pelos países, baseadas em pesquisas de diversas
instituições mundiais sobre os efeitos nocivos do MP à saúde humana. São
estabelecidos padrões para MP10 e MP2,5 para concentração média anual de
20 µg/m3 e 10 µg/m3, respectivamente e concentração em 24 horas de exposição
para MP10 e MP2,5 de 50 µg/m3 e 25 µg/m3, respectivamente. Os padrões de
INTRODUÇÃO
30
qualidade do ar norte-americanos (NAAQS - National Ambient Air Quality Standards)
adotados pela USEPA para MP10 e MP2,5 para a concentração média anual são de
50 µg/m3 e 15 µg/m3, respectivamente e para concentração em 24 horas de
exposição para MP10 e MP2,5 de 150 µg/m3 e 65 µg/m3.
Para auxiliar no gerenciamento e controle dos riscos ocupacionais, de modo a
garantir a saúde dos trabalhadores, os órgãos técnicos e agências reguladoras têm
estabelecido os limites de exposição ocupacional.
Os limites de exposição ocupacional (LEO) são considerados padrões de
referência importantes para o controle dos ambientes de trabalho e tomada de
decisão com relação à melhoria destes controles, a fim de prevenir as doenças
ocupacionais. Os danos à saúde que são considerados incluem aqueles nos quais
possa haver redução da expectativa de vida, comprometimento de alguma função
fisiológica, redução da capacidade de resistência a outras substâncias tóxicas ou à
instalação de doenças, ou ainda, que tragam efeitos adversos à reprodução ou ao
processo de desenvolvimento do ser humano. Contudo, é possível que nem todos
os danos tenham sido considerados quando do estabelecimento dos LEOs. (ACGIH,
2005 apud REBELO, 2007).
Na legislação brasileira estes limites foram adotados com a denominação de
Limites de Tolerância e estão expressos na Norma Regulamentadora 15 (NR-15) do
Ministério do Trabalho e Emprego – que trata das Atividades e Operações
Insalubres (BRASIL, 1991). Na ausência destes, são remetidos aos padrões
internacionais estabelecidos pela American Conference of Govermental Industrial
Hygienists (ACGIH), conforme o item 9.3.5.1.a da Norma Regulamentadora 9 (NR-9)
– Programa de Prevenção de Riscos Ambientais (PPRA) ou àqueles que venham a
ser estabelecidos em negociação coletiva, desde que com critérios técnico-legais
mais rigorosos do que os limites de tolerância já estabelecidos (BRASIL, 1994).
A legislação Brasileira, através da NR-15 - Anexo nº 11 (Agentes químicos
cuja insalubridade é caracterizada por limite de tolerância e inspeção no local de
trabalho), estabelece os limites de tolerância válidos para jornadas de trabalho de
até 48 horas semanais para diversos compostos químicos, tais como: acetaldeído,
ácido clorídrico, brometo de etila, clorofórmio, formaldeído, dióxido de carbono,
dióxido de enxofre, dióxido de nitrogênio, entre outros. O Anexo nº 12, a NR-15, trata
dos limites de tolerância para poeiras minerais, estabelecendo os LEOs para apenas
três tipos de particulados minerais: o asbesto, também conhecido como amianto; o
INTRODUÇÃO
31
manganês e seus derivados e a sílica livre cristalizada, na forma de quartzo, não
contemplando demais fontes de emissão de material particulado (BRASIL, 1991).
Mesmo que não tenha sido estabelecido um TVL - Threshold Limit Values -
(Limites de Exposição, da ACGIH) para as partículas insolúveis ou pouco solúveis, a
ACGIH ressalta que, mesmo biologicamente inerte, podem causar efeitos adversos
à saúde. Por isto, recomenda que as concentrações no ambiente de trabalho devam
ser mantidas abaixo de 3 mg/m3, para partículas respiráveis, e 10 mg/m3 para
partículas inaláveis, até que um TLV seja estabelecido para a substância em
particular (ACGIH, 2005).
1.3 Queima de biomassa
A queima de biomassa (qualquer matéria de origem animal ou vegetal
utilizada como fonte de energia) em ambientes internos e externos é utilizada desde
a pré-história para produção de energia e representa uma das importantes fontes
antropogênicas de poluição atmosférica. Cerca de 80% da combustão de biomassa
ocorre nos trópicos e ela representa a maior fonte de produção de gases tóxicos,
material particulado e gases do efeito estufa no planeta, influencia a química e a
física atmosférica, produz espécies químicas que mudam significativamente o pH da
água da chuva e afeta o balanço térmico da atmosfera pela interferência na
quantidade de radiação solar refletida para o espaço (ARBEX et al., 2004).
1.3.1 Queima da castanha de caju no Rio Grande do Norte
Em geral, o tema das condições de vida, trabalho, saúde e doença dos
trabalhadores rurais no Brasil evocam estereótipos, e entre eles a associação com
atividades rudimentares, trabalhadores empobrecidos, socialmente marginalizados e
intoxicados pelos agrotóxicos. Entretanto, apesar da veracidade e dessa realidade
ser ainda muito frequente, é necessário romper com o reducionismo e conhecer
melhor o problema, na perspectiva da mudança desse quadro (DIAS, 2006).
As atividades econômicas desenvolvidas no meio rural têm raízes profundas
na história brasileira. Apesar do intenso processo de industrialização promovido
pelas políticas públicas a partir de meados dos anos 40, do século passado e da
INTRODUÇÃO
32
acelerada migração rural-urbana que acompanhou esse processo, a produção e
atividades rurais têm grande importância no país, contribuindo ainda hoje com uma
fatia expressiva do Produto Interno Bruto (PIB) brasileiro (DIAS, 2006).
O semi-árido brasileiro é uma das regiões mais pobres do Brasil, sendo
caracterizada por períodos de fortes secas, os quais flagelam milhares de
nordestinos com a falta de água. A falta de água, e consequentemente a ausência
de emprego e renda, tornam parte da população permissiva a qualquer atividade
que possa ser desenvolvida durante o ano inteiro promovendo o sustento das
famílias. Nesse contexto, o beneficiamento artesanal da castanha de caju é uma
alternativa socialmente e financeiramente viável, pois além de poder ser
desenvolvida por todos os membros de uma família, é um produto facilmente
comercializável. Em geral, a atividade pode ser desenvolvida durante o ano inteiro,
onde mesmo nos períodos de seca, a castanha produzida no período de safra pode
ser acondicionada e processada durante a entressafra. Contudo, a falta de
assistência aos trabalhadores, a informalidade da atividade e a falta de
conhecimento da sociedade em geral sobre as condições em que é desenvolvido o
beneficiamento da castanha de caju inibem qualquer forma de controle dos
potenciais efeitos lesivos a saúde associada ao trabalho.
Segundo o censo agropecuário do IBGE/2008 o estado do Rio Grande do
Norte ocupa a terceira colocação na produção nacional de castanha de caju, ficando
atrás dos estados do Ceará e Piauí. A produtividade média do estado gira em torno
de 42.593 toneladas de castanha numa área cultivada de 116.685 ha. Segundo
dados fornecidos pela Secretaria de Estado do Desenvolvimento Econômico do Rio
Grande do Norte (SEDEC/RN), entre os anos de 2006 a 2009, a castanha de caju foi
o segundo produto mais exportado pelo estado, com um volume médio anual de
exportação em torno de 43,05 milhões de dólares, ficando a frente de produtos como
o camarão, petróleo, álcool, açúcar e sal. Contudo, um dos maiores problemas da
cadeia produtiva do caju são as condições na qual ocorre a queima da castanha
para se obter a amêndoa (subproduto de maior valor) (Figura 3A-E).
A combustão gerada a partir da queima da castanha libera o líquido da
castanha de caju (LCC), um óleo fenólico caustico que é bastante inflamável e que
libera novos gases poluentes na atmosfera. O LCC contém uma grande quantidade
de derivados de naftoquinonas (GÓMEZ-CARAVACA et al., 2010). As naftoquinonas
promovem efeitos citotóxicos sobre vários organismos, incluindo uma grande
INTRODUÇÃO
33
variedade de bactérias, algas e dermatófitos (MAHONEY et al., 2000;
MONTENEGRO et al., 2010). O processo de combustão do LCC aumenta o
conteúdo total de fenóis e diminui as proantocianidinas (CHANDRASEKARA e
SHAHIDI, 2011).
A fumaça gerada durante a queima da castanha possui altas concentrações
de MP, que é inalada diariamente por grupos familiares que participam do processo
de queima por um período que pode exceder 9 horas diárias. O processo de queima
da castanha de caju é iniciado às 2:00 h da manhã e continua, na maioria dos casos,
até as 11:00 h, com o resto do dia para finalizar o processo. Além da queima
propriamente dita, existe o contato direto através da pele principalmente das mãos
dos beneficiadores, já que após assar a castanha a mesma necessita ser quebrada
para se obter a amêndoa (Figura 3F).
A última fase deste processo consiste na remoção do epicarpo e mesocarpo
que envolve a amêndoa da castanha de caju, para que esta possa ser embalada e
comercializada.
INTRODUÇÃO
34
Os indicativos de danos à saúde gerados pela atividade da queima da
castanha de caju demandam estudos toxicológicos amplos, fazendo-se necessária à
identificação tanto dos principais agentes químicos envolvidos no processo, bem
como os efeitos das misturas in situ em organismos monitores expostos como
plantas e o próprio homem. As possíveis genotoxinas oriundas da queima de
matéria orgânica podem causar graves consequências nos organismos.
Comumente, agentes genotóxicos podem acarretar perda de gametas, diminuição
CC
EE FF
DD
BB
Figura 3. (A-E) Processo de queima da castanha de caju na comunidade do Amarelão, João Câmara - RN; (F) Quebra da castanha para obtenção da amêndoa. Fotos: Marcos Felipe
AA
INTRODUÇÃO
35
do sucesso reprodutivo, desenvolvimento anormal, câncer e mutações letais
(mortalidade de embriões) (DIEKMANN et al., 2004).
1.4 Testes de genotoxicidade
Em um sentido mais amplo, refere-se à indução de genotoxicidade para todos
os tipos de danos na molécula do DNA. Agentes que interagem com o DNA e/ou
seus componentes celulares associados (por exemplo, o fuso mitótico) ou com
enzimas como as topoisomerases e helicases são designados genotóxicos. Efeitos
genotóxicos incluem a formação de adutos de DNA, quebras na dupla fita do DNA,
tais como os micronúcleos, síntese não programada de DNA, trocas de cromátides
irmãs (SCE), entre outros. Devido à grande variedade de possíveis eventos
genéticos que podem ser examinados, não há atualmente nenhum teste para
detectar o espectro completo dos diferentes “endpoints” abrangidos pela
genotoxicidade induzida. No entanto, baterias de testes têm sido desenvolvidas para
avaliar efeitos nos principais “endpoints” de danos genéticos associados com
doenças humanas: mutações gênicas (substituições de base, deleções e inserções)
e mutações cromossômicas (aberrações cromossômicas estruturais e numéricas)
(DEARFIELD et al., 2002).
Mutação é definida como uma alteração permanente na sequência
nucleotídica de um organismo. A mutação pode se manifestar como uma alteração
hereditária em células germinativas, contribuindo para diversas doenças genéticas
e/ou em células somáticas que podem desencadear diversos estados patológicos,
incluindo o câncer e processos crônico-degenerativos, tais como as doenças
cardíacas coronárias. Elas podem ser expressas ao nível gênico ou cromossômico.
Embora existam diferenças no metabolismo, reparo do DNA, e outros processos
fisiológicos afetando na mutagênese química, a universalidade do DNA e do código
genético fornece uma base racional para a utilização de vários sistemas de testes
não-humanos para prever a mutagenicidade intrínseca das substâncias químicas
(DEARFIELD et al., 2002).
Os ensaios de genotoxicidade ao contrário das análises químicas permitem
detectar os efeitos combinados dos vários compostos presentes em uma amostra,
incluindo efeitos sinérgicos e antagônicos, levando a uma caracterização mais
abrangente das amostras a serem analisadas (HELMA et al., 1996).
INTRODUÇÃO
36
Atualmente, diversos organismos têm sido usados na avaliação da
genotoxicidade de diferentes fontes de poluição atmosférica. Dentre os vários
organismos utilizados, estão as bactérias, utilizadas no teste de Ames pelo método
direto e com microsuspensão, e o teste de Kado, com as diferentes linhagens de
Salmonella typhimurium (BRITS et al., 2004; UMBUZEIRO et al., 2008); líquens
(ARAS et al., 2010); vegetais superiores, tais como: Allium cepa, Tradescantia
pallida e Nicotiana tabacum (CARVALHO-OLIVEIRA et al., 2005; SAVÓIA et al.,
2009; VILLARINI et al., 2009); aves (SICOLO et al., 2010); roedores (ESPINOSA-
REYES et al., 2010); cachorro (KIMURA et al., 2010) e humanos (KOEHLER et al.,
2010).
1.4.1 Vegetais como bioindicadores da poluição atmosférica
O biomonitoramento, principalmente no que diz respeito a organismos
expostos a poluentes (bioindicadores), utilizando parâmetros biológicos
(biomarcadores), propicia promissoras ferramentas para a identificação de poluentes
capazes de causar dano à saúde humana e ao ambiente (DA SILVA et al., 2003;
HINTON et al., 2005). A utilização de bioindicadores vegetais de genotoxicidade
representa uma alternativa eficiente, rápida e de baixo custo para avaliar o potencial
genotóxico de agentes contaminantes ambientais.
Os poluentes atmosféricos são absorvidos pelos vegetais, em geral, através
dos estômatos, que são poros existentes na superfície das folhas que permitem as
trocas gasosas entre a planta e o meio ambiente. No entanto, alguns poluentes são
absorvidos, em menor quantidade, pela superfície radicular (MANNING & FEDER,
1980; FARMER, 1993; FREEDMAN, 1995).
As alterações causadas pelos poluentes atmosféricos nas plantas mais
citadas na literatura são: variações na expressão de algumas enzimas (ANTONIELLI
et al., 1997; PASQUALINI et al., 2003), alterações genéticas (BATALHA et al., 1999;
GUIMARÃES et al., 2000; CARRERAS et al., 2006; PRAJAPATI e TRIPATHI, 2008;
SAVÓIA et al., 2009), alterações quantitativas e qualitativas de metabólitos, aumento
na concentração de hormônios vegetais relacionados ao estresse (DIJAK &
ORMROD 1982), aumento ou diminuição da respiração, distúrbios na fotossíntese
(KOLB & MATYSSEK, 2001; GEROSA et al., 2003) e alterações na abertura e no
fechamento estomático (SCHAUB et al., 2005). Consequentemente estas alterações
INTRODUÇÃO
37
levam à sintomas como clorose e necrose em tecidos e órgãos, que podem evoluir,
levando o vegetal à morte (MANNING & FEDER, 1980).
1.4.2 Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN)
Estudos sobre o genoma da Tradescantia iniciaram-se com os trabalhos
pioneiros de Sax & Edmonds (1933), quando foram descritas as várias fases do
desenvolvimento do micrósporo, determinando os períodos e ritmo dos eventos
meióticos. Observações importantes foram feitas sobre os efeitos de raios-X nos
micrósporos de Tradescantia (SAX & EDMONDS, 1933; HUSTED, 1936; RILEY,
1936), inclusive com a constatação de que as alterações cromossômicas variam de
forma dose-dependente (RICK, 1940). Além disso, determinou-se que cromossomos
meióticos eram mais suscetíveis a quebras que cromossomos mitóticos; e mais
importante, que cromossomos em divisão eram ao menos dez vezes mais
susceptíveis que aqueles em repouso (SAX & EDMONDS, 1933). Os conceitos de
temporalidade e sensibilidade que emergiram desses estudos tornaram-se
extremamente importantes na seleção de bioindicadores para mutagênese, uma vez
que a sincronia no desenvolvimento celular e precisão nos períodos de recuperação
após os tratamentos mostraram-se dois fatores decisivos para a performance dos
bioensaios (RODRIGUES, 1999).
O bioensaio de micronúcleo em tétrades de Tradescantia (Trad-MCN) é um
dos testes mais utilizados em estudos de genética toxicológica, podendo ser
realizado com as inflorescências da Tradescantia pallida ou dos clones de
Tradescantia, entre eles os principais são: o BNL-4430 desenvolvido no Brookhaven
National Laboratory, Estados Unidos, um híbrido gerado pelo cruzamento da
T. hisutiflora Bush x T. subacaulis Bush (MA et al., 1994) e o clone KU-20
selecionado na Universidade de Kyoto, Japão.
O teste Trad-MCN baseia-se na contagem de micronúcleos que são
pequenas massas nucleares que surgem nas células em divisão e são derivados de
quebras cromossômicas (quando sua origem clastogênica) e/ou cromossomos
inteiros (origem aneugênica) delimitados por uma membrana nuclear e separados do
núcleo principal (Figura 4A). Os micronúcleos, quando compostos por fragmentos de
cromossomos (clastogênicos), podem resultar da quebra direta na dupla fita do
INTRODUÇÃO
38
DNA, conversão de quebra simples fita em quebra dupla fita após a replicação
celular ou inibição da síntese do DNA. Já os micronúcleos formados por
cromossomos inteiros (aneugênicos) são basicamente formados por defeitos no
mecanismo de segregação cromossômica, tais como deficiências no controle de
genes do ciclo celular, falhas no fuso mitótico, cinetócoro, ou outras partes do
aparelho mitótico, ruptura mecânica ou hipometilação de DNA centromérico
(MATEUCA, et al., 2006).
No Trad-MCN os micronúcleos são visualizados na fase de tétrade jovem,
final do processo de meiose em Tradescantia. A frequência de micronúcleos tem
sido utilizada para avaliar o grau de dano mutagênico ao qual as células
germinativas (tétrades) desta planta são expostas, indicando a atividade mutagênica
da substância em exposição (MA, 1981; RODRIGUES et al., 1997; MISÍK et al.,
2011). Apesar de não existir relatos e nem trabalhos publicados que avaliam outros
tipos de alterações nucleares utilizando a Tradescantia, que não o micronúcleo, tais
como pontes nucleoplasmáticas, fragmentos nucleares e brotamento nuclear, estas
alterações foram quantificadas no presente estudo.
As pontes nucleoplasmáticas (PNP) ocorrem quando os centrômeros dos
cromossomos dicêntricos ou cromátides são puxadas para os pólos opostos da
célula durante a anáfase, formando uma ponte que conecta um núcleo ao outro
(Figura 4B) (FENECH, 2002a). Trabalhos publicados por Gisselsson et al. (2000,
2001a, 2001b), utilizando cultura primária de tumores sólidos, confirmaram que: (a)
as pontes nucleoplasmáticas, os micronúcleos e brotamentos nucleares são
características comuns de uma ampla variedade de células cancerosas, e (b) a
grande maioria (71-86%) dessas estruturas nucleares anormais são provenientes de
cromossomos dicêntricos instáveis ou cromossomos em anel. Portanto, a morfologia
nuclear anormal representada pela presença das pontes nucleoplasmáticas,
micronúcleos e brotamentos nucleares é um importante indicativo da instabilidade
genômica característica de alguns tumores (FENECH, 2002a).
INTRODUÇÃO
39
Com o objetivo de avaliar a sensibilidade, eficiência e confiabilidade do
bioensaio Trad-MCN quatro produtos químicos codificados (N-metil-N-nitrosourea,
azida de sódio, hidrazida maléica e azido glicerol) foram testados em cinco
laboratórios independentes de quatro países diferentes. O estudo foi realizado sob a
supervisão do IPCS - International Programme on Chemical Safety e todos os
laboratórios participantes utilizaram um protocolo padrão para o bioensaio. Os
resultados obtidos por todos os laboratórios, embora não fossem iguais, foram
bastantes confluentes. Os dados deste estudo sugerem que o Trad-MCN é bastante
sensível e confiável, qualificado-o para o monitoramento de poluentes ambientais
(MA et al., 1994).
Um estudo realizado por Mariani et al. (2009) na cidade de São José dos
Campos - SP mostrou que o bioensaio Trad-MCN pode ser utilizado como uma
importante ferramenta na avaliação dos riscos à saúde humana impostos pelos
poluentes atmosféricos. Neste estudo os autores encontraram uma associação
significativa entre a frequência de micronúcleos em Tradescantia pallida e as taxas
de mortalidade devido a doenças cardiovasculares e câncer.
Uma vantagem adicional do Trad-MCN é o curto período de exposição
necessário para se completar um teste, de apenas 6 horas, seguidas de uma
Figura 4. (A) Esquema do processo de formação do micronúcleo (origem clastogênica e aneugênica); (B) e ponte nucleoplasmática. Adaptado de Fenech et al. (2007).
AGENTES CLASTOGÊNICOS E ANEUGÊNICOS
Célula com MN
Célula com MN
Célula com
MN
Formação da ponte nucleoplasmática
AA))
BB))
INTRODUÇÃO
40
recuperação de 24 horas para permitir que as células submetidas aos tratamentos
na fase de prófase atinjam o estágio de tétrade, apropriado para contagem de
micronúcleos (RODRIGUES, 1999). Por outro lado, várias limitações do bioensaio
têm sido apresentadas. O teste obviamente oferece apenas um índice relativo de
danos genéticos. Translocações, inversões e outros tipos de rearranjos nos
cromossomos e cromátides não são revelados como micronúcleos,
consequentemente passam sem serem detectados pelo bioensaio (MA, 1981).
1.4.2.1 Utilização da Tradescantia pallida no Trad-MCN
A fim de desenvolver um ensaio mais adequado às condições ambientais
comumente encontradas no Brasil, vários trabalhos tem voltado a atenção para uma
planta pertencente a família das Comelináceas, a Tradescantia pallida (Rose) Hunt.
var. purpurea Boom. Esta espécie é tetraplóide, nativa da região da América do
Norte e Central (México e Honduras), do tipo herbácea, com folhas roxas e
pubescentes. Nos últimos anos a Tradescantia pallida tem sido amplamente utilizada
em todo o Brasil, em bioensaios de mutagenicidade, pela facilidade de propagação e
cultivo da planta durante todo o ano, o que permite a realização dos ensaios o ano
inteiro, por apresentar fácil adaptação a diferentes ambientes, se desenvolvendo
tanto em estufa quanto em condições experimentais severas, por apresentar notável
resistência a parasitas e insetos, e principalmente por ser sensível a compostos
mutagênicos (SUYAMA et al., 2002).
Figura 5. Tradescantia pallida (Rose) D.R. Hunt var. purpúrea. Foto: Marcos Felipe
INTRODUÇÃO
41
CLASSE - Liliopsida
ORDEM - Commelinales
FAMÍLIA - Commelinaceae
GÊNERO - Tradescantia
ESPÉCIE – Tradescantia pallida
Diversos trabalhos na literatura demonstram a sensibilidade da
Tradescantia pallida frente a poluentes atmosféricos in situ (BATALHA et al., 1999;
GUIMARÃES et al., 2000; CARRERAS et al., 2006; PRAJAPATI e TRIPATHI, 2008;
MARIANI et al., 2009; MEIRELES et al., 2009; SAVÓIA et al., 2009; SISENANDO
et al., 2011), testes com poluentes atmosféricos em laboratório (CARVALHO-
OLIVEIRA et al., 2005; ALVES et al., 2011), lodo de esgoto tratado (MIELLI et al.,
2009), produtos químicos (ALVES et al., 2008), depósitos radioativos (LEAL et al.,
2008) e sensibilidade ao ozônio (LIMA et al., 2009). Neste sentido, o
biomonitoramento nas comunidades envolvidas com a queima da castanha de caju,
utilizando a Tradescantia pallida, representa uma importante ferramenta na
avaliação do risco inerente ao beneficiamento artesanal da castanha de caju.
1.5 Testes de citotoxicidade
Vários métodos in vitro, para avaliar a toxicidade de poluentes atmosféricos,
foram padronizados utilizando-se diferentes culturas celulares. Estes testes de
citotoxicidade consistem em colocar a amostra em contato com uma cultura de
células de mamíferos, verificando-se as alterações celulares por diferentes
mecanismos, entre os quais a incorporação de corantes vitais, inibição do
crescimento celular ou atividade enzimática.
O parâmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade é a viabilidade celular,
que pode ser evidenciada com auxilio de corantes como o azul de trypan, trata-se de
uma substância capaz de penetrar apenas em células mortas, uma vez que as
membranas celulares são extremamente seletivas, fazendo com que elas
apresentem a coloração azul característica ao serem analisadas com o auxílio de
microscópio óptico (YIP E AUERSPER, 1972).
Outro parâmetro comumente utilizado na avaliação da citotoxicidade é a
atividade enzimática pelo teste colorimétrico MTT como descrito por Mosmann em
INTRODUÇÃO
42
1983. Esse teste é usado como um método indireto para monitorar a atividade
metabólica celular após a exposição ao material teste.
1.6 Objetivos
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os
constituintes e o potencial genotóxico e citotóxico associado aos elementos oriundos
da queima de castanha de caju no município de João Câmara - RN, sendo
realizado:
a) A quantificação da concentração de material particulado e black carbon no
local de queima de castanha de caju com o uso de amostradores ativos;
b) Análise da composição elementar do material particulado acumulado em
filtros de policarbonato com auxílio da técnica de fluorescência de raio X;
c) Um biomonitoramento utilizando o bioensaio de micronúcleo em tétrades
de Tradescantia pallida (Trad-MCN). Além de avaliar a mutagenicidade, o
biomonitoramento objetivou explorar a contribuição específica das condições
climáticas no potencial mutagênico atribuído a queima da castanha e avaliar a
correlação do micronúcleo em T. pallida com outros biomarcadores de dano no
DNA, tais como pontes nucleoplasmáticas e fragmentos nucleares;
d) Avaliar a sensibilidade da espécie Tradescantia pallida frente ao clone de
Tradescantia KU-20 utilizando o Trad-MCN;
e) Extração dos compostos retidos nos filtros de policarbonato para execução
de ensaios utilizando a linhagem celular MRC-5, tais como:
- Método de exclusão trypan blue
- Ensaio de citotoxicidade pelo método MTT
JUSTIFICATIVA DO TRABALHO 43
2. JUSTIFICATIVA DO TRABALHO
A geração de informações qualificadas sobre os efeitos da poluição é um
requisito fundamental para a elaboração de políticas públicas que visam a melhoria
da qualidade de vida da população. O Brasil, como um dos maiores produtores de
alimentos do planeta possui problemas ambientais com impacto à saúde humana,
que são característicos das suas regiões agropecuárias, e que demandam pesquisa
básica e aplicada. Devido a sua extensão continental, e a enorme disparidade social
existente em diferentes localidades do país, cidades de pequeno porte e
desprovidas de centros de pesquisa são desfavorecidas devido a falta de logística
na investigação de problemas locais. Tais problemas podem atingir uma parte
significativa tanto de sua população quanto daquela vivente nas proximidades das
fontes poluidoras.
A poluição atmosférica tem sido associada a diversos efeitos deletérios a
saúde, como o agravamento e desenvolvimento de doenças respiratórias,
cardiovasculares e até neoplasias. É muito antiga a observação de que a exposição
dos seres humanos a determinadas substâncias presentes no meio ambiente ou no
seu local de trabalho pode levar ao desenvolvimento de câncer (LOUREIRO et al.
2002). Se esse fator de risco tem contribuído para esses ônus na saúde, então é
preponderante entender os seus mecanismos de geração, exposição ao homem,
promoção e associação de doenças.
A cultura do caju tem na castanha sua maior rentabilidade. A real
possibilidade de expansão da atividade no estado do Rio Grande do Norte indica um
cenário cada vez maior de lucro e pessoas envolvidas com a atividade. Estudos
como o proposto é de fundamental importância para a sociedade, pois poderá
identificar problemas e propor medidas preventivas e de melhores práticas,
objetivando melhoria tanto para a atividade como para o aumento da qualidade de
vida da população.
MATERAIS E MÉTODOS
44
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Área de estudo
O município de João Câmara localiza-se, em sua sede, a 05°32’15” de
latitude sul e 35°49’11” de longitude oeste, abrangendo uma área total de
714,95 km². Inserido na mesorregião Agreste Potiguar, é caracterizado pelo clima
quente e semi-árido, com estação chuvosa entre os meses de março a julho. A
temperatura média anual gira em torno de 24,7 ºC, com umidade relativa média
anual de 70%. Segundo dados do IBGE/2007 sua população estimada é de 30.423
habitantes.
Para quantificar a concentração de MP, bem como os efeitos genotóxicos e
citotóxicos ocasionados pelo processo de queima da castanha de caju, foram
definidas duas regiões distintas: A comunidade do Amarelão, situada no perímetro
rural do município de João Câmara - RN (05°30'51.81"S; 35°54'17.13”O), local onde
ocorre intensa queima da castanha de caju e Fazenda Santa Luzia (05°33'6.72"S;
35°46'10.75"O), situada próxima à região de queima da castanha de caju,
aproximadamente 13 quilômetros de distância, portanto com as mesma condições
ambientais, porém sem a influência da atividade. A figura 6 mostra a localização dos
dois pontos amostrais, assim como a direção predominante do vento para a região.
De acordo com a representação, o ponto definido como controle negativo (Fazenda
Santa Luzia) não sofre influência direta dos poluentes oriundos da comunidade do
Amarelão.
MATERAIS E MÉTODOS
45
3.2 Quantificação do material particulado com o uso de amostradores
3.2.1. Amostrador DUSTTRAK™ Aerossol Monitor (MP1,0, MP2,5 e
MP10)
A primeira coleta foi realizada em maio de 2007, e para quantificar a
concentração de MP1,0, MP2,5 e MP10 foi utilizado o amostrador portátil
“DUSTTRAK™ Aerossol Monitor” (Modelo 8520 – TSI Inc.) desenvolvido pela Escola
de Saúde Pública da Universidade de Harvard. Esse equipamento tem um sensor
(laser photometer - 90° light scattering, laser diode) que realiza medições da
concentração em massa de material particulado no ar, o qual é aspirado do meio
ambiente por uma bomba interna. O aparelho possui capacidade de realizar
medições em um espectro muito amplo, que varia de 0,001 mg/m3 a 100 mg/m3,
com precisão de ± 0,1%. O registro das informações é realizado a cada minuto de
Figura 6. Localização dos pontos de exposição das mudas de T. pallida e do clone KU-20 e amostragens do material particulado. A seta acima indica a direção dominante dos ventos na região.
pontosComunidade do AmarelãoFazenda Santa Luzia
latitude05°30'51.81“05°33'6.72“
longitude35°54'17.13”35°46'10.75“
legenda:
MATERAIS E MÉTODOS
46
forma automática na memória do próprio equipamento, que foi devidamente
posicionado nos três pontos testes a uma altura média de 1,65 m, que corresponde
aproximadamente a altura em que os trabalhadores que participam do processo de
beneficiamento da castanha de caju respiram (Figura 7 A e 7 C).
3.2.2. Amostrador Mini-Sampler (MP2,5)
Para a segunda coleta foi utilizado o equipamento portátil “Mini-Sampler” da
Harvard, que remove o MP2,5 da atmosfera e deposita em filtros de policarbonato de
37 mm. Estes filtros podem ser utilizados para quantificar e caracterizar físico-
quimicamente os elementos nele retidos, bem como a realização de ensaios
toxicológicos ex situ. O equipamento é composto basicamente por uma sonda e um
gabinete. A sonda se comunica com o meio externo por uma entrada de ar, e com o
gabinete por meio de uma mangueira de látex. A sonda é o elemento responsável
por selecionar o tamanho aerodinâmico do material particulado que será acumulado
no filtro posicionado na própria sonda. O gabinete possui uma bomba de vácuo, um
horímetro e um medidor de pressão. A bomba de vácuo é responsável pelo fluxo de
ar, o qual foi regulado para um fluxo de 1,8 lpm. O horímetro auxilia no registro de
tempo de exposição, e o medidor de pressão permite verificar eventuais momentos
de saturação do filtro.
As coletas de MP2,5 foram realizadas nos meses de janeiro, maio e setembro
de 2009, nos dois pontos teste (Figura 7 B e 7 D). Para cada campanha foram
utilizados 10 filtros em cada ponto, totalizando 30 filtros por campanha, e 90 filtros
para as três campanhas realizadas.
Tanto nas coletas realizadas com o amostrador “DUSTTRAK™ Aerossol
Monitor” como nas coletas com o amostrador “Mini-Sampler” os dados climatológicos
(índice pluviométrico) referentes aos períodos de coleta foram cedidos pelo setor de
meteorologia da Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte
(EMPARN).
MATERAIS E MÉTODOS
47
3.3 Análise da composição do material particulado acumulado nos filtros
de policarbonato
Os filtros de policarbonato foram submetidos a vários testes na Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, com o objetivo de caracterizar o material
particulado acumulado. Os parâmetros analisados foram: concentração de material
particulado na fração respirável (MP2,5), black carbon e composição elementar.
A concentração do material particulado foi determinada com auxílio da análise
gravimétrica, a determinação das concentrações de carbono elementar (“Black
Carbon” - BC) pela técnica de reflectância de luz e a análise elementar foi realizada
com a técnica de fluorescência de Raio-X.
AA BB
CC DD
Figura 7. (A e C) Medições de MP1,0, MP2,5 e MP10 na comunidade do Amarelão com o auxílio do amostrador portátil “DUSTRAK” aerossol monitor. (B e D) Medições de MP2,5 e BC realizada com o equipamento portátil “Mini-Sampler”. Fotos: Marcos Felipe e Thiago Cabral.
MATERAIS E MÉTODOS
48
3.3.1. Determinação Gravimétrica de Massa
Todos os filtros amostrados foram submetidos à análise gravimétrica, sendo
pesados antes e depois da amostragem em uma balança eletrônica de precisão
nominal de 1 µg. Neste procedimento, antes da pesagem, os filtros foram
submetidos a ação de fontes de 210Po a fim de serem descarregados
eletrostaticamente.
3.3.2. Análise de Reflectância
Para determinação das concentrações de carbono elementar (“Black Carbon”
- BC) presentes nas amostras, foi utilizada a técnica de reflectância de luz induzida
pelo particulado, com um o auxílio de um Reflectômetro, marca “Diffusion Systems
Ltd.” modelo “Smoke Stain Reflectometer-Model 43” (YAMASOE et al., 2000). Os
dados obtidos por esse equipamento foram resultado da absorção de luz pelo
particulado depositado no filtro. A fração do particulado que é absorvedora de
radiação (gerada por uma lâmpada de Tungstênio) é classificada como BC,
constituído em boa parte pelo carbono elementar.
A técnica de reflectância consiste na incidência de luz de uma lâmpada de
Tungstênio no filtro amostrado, o qual reflete uma intensidade inversamente
proporcional à quantidade de BC presente. Como as partículas de BC são boas
absorvedoras de luz, quanto maior a sua presença, menor a intensidade de luz
refletida pelo filtro e menor a detectada pelo fotosensor.
3.3.3. Análise de Fluorescência de raios-X
As amostras de material particulado foram analisadas para a determinação da
composição elementar pela técnica de fluorescência de raios-X (FRX). A
fluorescência de raios-X é uma técnica que permite a análise qualitativa e
quantitativa da amostra, e desse modo, é possível estabelecer a proporção em que
cada elemento se encontra. Nessa técnica todos os elementos da amostra são
excitados ao mesmo tempo e o detector de energia dispersiva, juntamente com um
analisador multicanal é usado para simultaneamente detectar a radiação
fluorescente emitida da amostra e separar as diferentes energias de radiação
MATERAIS E MÉTODOS
49
característica de cada elemento presente. O procedimento ocorre de modo que em
uma câmara de vácuo o feixe atinge a amostra de aerossol, colidindo com os
átomos desta e removendo os elétrons das camadas eletrônicas mais internas. As
vacâncias nestas camadas são preenchidas por elétrons de camadas mais externas,
e nessa transferência ocorre liberação de energia característica de cada elemento, a
qual é emitida como raios-X, possibilitando a identificação química do elemento
(JOHANSSON et al., 1988). Assim, na análise de FRX têm-se três fases: 1°
excitação dos elementos que constituem a amostra; 2 ° dispersão dos raios-X
característicos emitidos pela amostra; 3° detecção dos raios emitidos pela amostra
após excitação. No presente estudo os elementos identificados foram: Al, Si, P, S,
Cl, K, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Se, Br, e Pb.
3.4 Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN)
3.4.1 Cultivo e exposição das mudas
As mudas de T. pallida e do clone KU-20 utilizadas no biomonitoramento
foram cedidas pelo Laboratório de Poluição Atmosférica (LPAE) da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo e foram propagadas a partir de uma única
muda. Essa homogeneidade genética teve como objetivo evitar diferenças na
sensibilidade dos biomonitores frente a possíveis compostos genotóxicos, devido a
variações genéticas individuais.
As mudas de T. pallida foram propagadas e cultivadas em 30 floreiras
plásticas com 50 cm de comprimento por 17 cm de altura. Já para o clone KU-20, as
mudas foram propagadas em 21 vasos plásticos de material reciclado com 20 cm de
diâmetro por 20 cm de profundidade. Para ambas, foi utilizado uma mistura de solo
padronizada a fim de que possíveis variações no tipo de solo e/ou deficiências
quanto a disponibilidade de nutrientes não venham a comprometer a avaliação de
genotoxicidade. A mistura de solo utilizada foi composta por: duas partes de terra
vegetal, uma parte do substrato Eucatex® Plantmax HT, uma parte de vermiculita
fina e uma parte de húmus de minhoca (2:1:1:1 v/v) (Figura 8 A). Todas as floreiras
foram mantidas numa casa de vegetação com condições de temperatura e umidade
constantes (30 ± 2 ºC e 70%, Figura 8 B-C), sendo regadas com água destilada
MATERAIS E MÉTODOS
50
diariamente, tanto no período de propagação como nos períodos de aclimatação e
exposição. Após três meses de cultivo em casa de vegetação os vasos e floreiras
foram transferidos para os dois pontos teste. O período de aclimatação das mudas
nestes pontos foi de dois meses. Para garantir a qualidade da água destilada
utilizada para regar as mudas foi realizada uma análise química dos metais
presentes (Apêndice 2). Além disto, nenhum pesticida foi aplicado sobre ou próximo
às plantas durante o período de propagação ou exposição.
O período de exposição das mudas decorreu de julho de 2008 à setembro de
2009, a fim de combinar e explorar a contribuição específica das condições
climáticas no potencial genotóxico atribuído a queima artesanal da castanha caju.
3.4.2 Coleta das inflorescências
Após o período de adaptação das mudas, cerca de 30 inflorescências jovens
foram coletadas em tubos tipo falcon e fixadas em solução de ácido acético 45% e
álcool etílico 70% (1:3 v/v) por 48 horas, em seguida preservadas em álcool etílico
100%, conforme adaptação do protocolo estabelecido por MA et al. (1981, 1994). As
Figura 8. A - Floreiras contendo os diferentes componentes utilizados na preparação do solo. B - Casa de vegetação onde foi realizada a propagação das mudas antes do período experimental. C - Mudas prontas para serem levadas para os locais de exposição. Fotos: Marcos Felipe
AA
BB CC
MATERAIS E MÉTODOS
51
inflorescências coletadas permaneceram sob refrigeração por um período máximo
de até seis meses.
3.4.3 Preparação citológica
A preparação citológica, tanto para a T. pallida quanto para o clone KU-20,
incluiu inicialmente a escolha do botão floral apropriado contendo o estágio de
tétrade. Com o auxilio de uma pinça e uma agulha, os botões florais foram abertos e
as anteras maceradas, em seguida foi acrescentado o corante acetato de carmim a
2% sobre uma lâmina de microscopia (26 x 76 mm). Após o posicionamento da
lamínula a lâmina foi rapidamente aquecida a aproximadamente 80ºC para melhor
fixação do corante e pressionada entre folhas de papel absorvente para remover o
excesso de corante e garantir com que as tétrades posicionassem todas num
mesmo plano de visualização (Figura 9).
3.4.4 Análise citogenética
A análise citogenética consistiu na contagem do número de micronúcleos
(MN) presentes num grupo aleatório de 300 tétrades por lâmina. Além da avaliação
da frequencia média de MN, outras alterações nucleares, tais como as pontes
Figura 9. Esquema da preparação citológica. Adaptado de Ma (1981).
MATERAIS E MÉTODOS
52
nucleoplasmáticas (PNP) e os fragmentos nucleares (FN) foram quantificadas neste
estudo. A contagem foi realizada em microscopia óptica (Microscópio Olympus,
modelo: CX31RBSFA) com aumento de 400 X. O presente trabalho de
biomonitoramento contemplou um total de, no mínimo, 10 lâminas e 3000 tétrades
analisadas mensalmente para cada ponto teste, identificando os MN e PNP de
acordo com os critérios propostos por Fenech et al (2003) para linfócitos humanos,
uma vez que não possui critérios estabelecidos para identificação de MN e PNP em
tétrades de Tradescantia.
3.5 Extração do MP2,5 retido nos filtros
Os filtros de policarbonato (Isopore™, 0.8 µm, 37 mm, Millipore, USA)
utilizados na coleta do material particulado foram submetido ao processo de
extração dos compostos solúveis em água. Estes filtros, quando submetidos a
vibrações em ultra-som liberam a totalidade das partículas nele retidas, permitindo a
obtenção de suspensões de material particulado em meio líquido com concentração
conhecida. O particulado coletado nos filtros de policarbonato foi extraído a partir do
processo de ultra-som em água deionizada Milli-Q, em três ciclos de sonicação de
30 minutos cada. Para os ensaios celulares foi utilizado as concentrações de:
6,25 µg/mL, 12,5 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL e 400 µg/mL.
Os filtros brancos (não expostos) foram submetidos ao mesmo processo de extração
dos demais filtros.
3.6 Bioensaios com cultura de células
3.6.1. Cultura de células
Para os ensaios biológicos com cultura de células foi utilizado a linhagem
MRC-5 que foi desenvolvida em setembro de 1966 e deriva do tecido pulmonar de
um feto masculino humano normal, de 14 semanas de gestação, removido de uma
mulher de 27 anos por razões psiquiátricas e com histórico de familiares
geneticamente normais e nenhum sinal de doença neoplásica. A morfologia da
célula é do tipo fibroblasto com cariótipo 46 XY. A partir da cultura seriada desse
MATERAIS E MÉTODOS
53
tecido formou-se um banco celular com 481 ampolas mantidas em nitrogênio líquido
(JACOBS et al., 1970). As células foram cultivadas sob a forma de monocamadas
em meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), acrescido de 10% de
soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 U/mL estreptomicina em garrafas e
mantidas em atmosfera úmida com 5% de CO2 a temperatura de 37 ºC.
As células MRC-5 foram tratadas em diferentes concentrações dos extratos
obtidos do MP2.5 coletado na Comunidade do Amarelão, semeando 7 x 104 de
células em placas de cultura na presença de tais extratos e incubadas a 37ºC em
atmosfera úmida com 5% de CO2 até o recobrimento da superfície. Os controles
negativos consistiram em células crescidas em meio DMEM sobre placa de cultura
com o extrato dos filtros branco. Após o período de incubação, as células foram
tripsinizadas para desagregarem da superfície e então centrifugadas por 5 mim a
1500 rpm. O precipitado de células foi ressuspendido em meio DMEM e coletado
para os bioensaios.
3.6.2 Viabilidade celular
A viabilidade celular foi medida utilizando o método de exclusão por
coloração, no qual é utilizado o corante azul de tripan.
As células foram tratadas por 24 horas, em seguida foram tripsinizadas e
transferidas para microtubos e adicionado 10 µl de azul de tripan (0,4 %) numa
proporção de 1:1 (v/v).
O crescimento populacional relativo foi estimado pela porcentagem de células
viáveis nas culturas submetidas ao particulado extraído dos filtros, comparadas às
células cultivadas na ausência do particulado.
3.6.3 Citotoxicidade celular
A avaliação da citotoxicidade e da proliferação celular foi realizada através do
teste colorimétrico MTT como descrito por Mosmann em 1983 com algumas
modificações. O princípio do método consiste na absorção do sal MTT (brometo de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) que é transformado pela desidrogenase
MATERAIS E MÉTODOS
54
mitocondrial em formazana. O produto, acumulado dentro da célula, é extraído
através da adição de um solvente apropriado, de maneira que a quantidade de
formazana produzida é diretamente proporcional a atividade celular.
A solução de MTT a 1 mg/mL foi preparada pela dissolução do sal em meio
D-MEM pobre, sem a adição de soro fetal bovino e antibiótico e sem fenol. Após o
tratamento das células por 24 horas numa placa de 24 poços, 500 µl da solução de
MTT foi adicionado em cada amostra. Após 4 horas de incubação a 37ºC em
atmosfera úmida com 5% de CO2, o meio foi retirado e 500 µl da solução
solubilizadora, DMSO, foi adicionada para lisar as células e dissolver os cristais de
formazana. A placa foi mantida sob agitação constante durante cinco minutos no
escuro. Posteriormente, 100 µL do sobrenadante resultante foram transferidos para
uma placa de 96 poços e a densidade ótica foi medida em 570 nm de comprimento
de onda, utilizando o leitor de microplaca µQuant (Biotek, EUA), fornecendo a
diminuição da atividade mitocondrial.
A % de viabilidade celular = Absorbância do tratamento X 100
Absorbância do controle negativo
3.7 Análise estatística
Para verificar se os resultados obtidos apresentavam distribuição normal, foi
realizado o teste de Anderson-Darling com α = 0,05 (Dado normal quando P ≥ α).
Para o cálculo da tendência central da amostra foi realizado o cálculo de média para
todos os resultados e a dispersão foi verificada pelo cálculo do desvio padrão.Para
determinar as diferenças estatísticas entre os resultados (P < 0,05), os dados que
apresentaram uma distribuição normal foram submetidos a ANOVA e os que não
apresentaram distribuição normal ao teste Kruskal-Wallis. Os dados obtidos para
MN, NPB e NF foram submetidos ao teste de comparação múltipla de Dunnett’s para
analisar as diferenças significativas entre a comunidade do Amarelão e Fazenda
Santa Luzia. A correlação entre os biomarcadores de danos no DNA e precipitação
pluviométrica foi definida com base na matriz de correlação de Pearson. As análises
estatísticas foram obtidas com a utilização do Software Minitab 15 e do Microsoft
Excel®, 2007.
RESULTADOS
55
4. RESULTADOS
4.1 Quantificação do material particulado com o uso de amostradores
4.1.1. Amostrador DUSTTRAK™ Aerossol Monitor (MP1,0, MP2,5 e
MP10)
A Tabela 3 mostra os resultados mínimos, máximos e médios obtidos para as
medições de MP1,0, MP2,5 e MP10 realizadas em maio de 2007, com o auxilio do
amostrador portátil “DUSTTRAK™ Aerossol Monitor”, assim como, os limites de
qualidade do ar estabelecidos pela legislação brasileira (Conselho Nacional de Meio
Ambiente - CONAMA), Agência de Proteção Ambiental Norte-Americana (USEPA) e
Organização Mundial da Saúde (OMS). Vale salientar que a legislação brasileira
para critérios de poluição do ar, não contempla as partículas menores que 2,5 µm
(MP2,5).
A concentração média de MP2,5 dentre as seis medições realizadas na
comunidade do Amarelão foi de 2051 µg/m3. Este resultado difere significativamente
dos resultados obtidos na Fazenda Santa Luzia, de 6 µg/m3. Também foi encontrado
altas concentrações de MP1,0 e MP10 para a comunidade do Amarelão, 1002 µg/m3 e
1745 µg/m3 respectivamente (Tabela 3).
A concentração de MP10 para a comunidade do Amarelão excedeu o nível de
exposição definido como “estado de emergência” estabelecido pela Resolução Nº 03
de 28 de junho de 1990 do CONAMA (de 500 µg/m3 para partículas inaláveis, MP10).
RESULTADOS
56
Tabela 3. Quantificação do MP1,0, MP2,5 e MP10 para os dois pontos
testes no mês de maio de 2007, utilizando o amostrador portátil
“DUSTTRAK™ Aerossol Monitor”, assim como os limites de qualidade
do ar estabelecidos pelo CONAMA, USEPA e OMS.
a Corresponde aos valores de MP2,5 que diferiram significativamente; * Padrão Primário - são as concentrações de poluentes que, quando ultrapassadas, poderão afetar a saúde da população. ** Estado de Emergência - Nível de qualidade do ar considerado crítico pelo CONAMA (resolução 03/1990), indicando risco grave à saúde da população exposta.
4.1.2. Amostrador Mini-Sampler (MP2,5)
Na figura 10 é possível observar o aspecto dos filtros de policarbonato após a
realização de uma campanha de exposição (janeiro/2009). Na Figura 10 – A é
apresentado um filtro completamente saturado de MP2,5. Esse resultado foi obtido
após um curto período de exposição (≈ 3 h) na comunidade do Amarelão durante o
período de queima da castanha. Na Figura 10 – B é apresentado o filtro que foi
exposto Fazenda Sta. Luzia. Os resultados obtidos para os meses de janeiro, maio e
Local MP (µm)
Duração (d/hr/mim/s)
Mínima (µg/m3)
Máxima (µg/m3)
Média (µg/m3)
Fazenda 2,5 03:20:53:00 1,0 578,0 6,0
Amarelão 1,0 00:01:30:00 12,0 8731,0 1002,0
Amarelão 2,5 00:00:33:00 5,0 384,0 27,0a
Amarelão 2,5 00:00:26:00 17,0 15014,0 1040,0a
Amarelão 2,5 00:01:29:00 9,0 11580,0 1369,0a
Amarelão 2,5 00:02:59:00 8,0 12425,0 753,0a
Amarelão 2,5 00:00:39:00 65,0 4091,0 632,0a
Amarelão 2,5 00:02:20:00 52,0 49864,0 8489,0a
Amarelão 10 00:01:34:00 27,0 12196,0 1745,0
CONAMA 10 24 horas Padrão primário* 150,0
CONAMA 10 24 horas Emergência** 500,0
USEPA 2,5 24 horas - 65,0
USEPA 10 24 horas - 150,0
OMS 2,5 24 horas - 25,0
OMS 10 24 horas - 50,0
RESULTADOS
57
setembro de 2009 para a concentração de MP2,5 e Black Carbon (BC) estão
apresentados na Tabela 4.
Para as medições realizadas com o amostrador portátil “Mini-Sampler” a
concentração média de MP2,5 dentre as dez medições realizadas em cada mês na
comunidade do Amarelão foi de 2.124,2 µg/m3, 1.022,2 µg/m3 e 1.291,9 µg/m3 para
os meses de janeiro, maio e setembro de 2009, respectivamente. Enquanto que a
concentração média de BC foi de 363,6 2 µg/m3, 70,0 µg/m3 e 69,4 µg/m3, para
janeiro, maio e setembro/2009, respectivamente. Para os resultados obtidos para a
Fazenda a concentração média dente as dez medições de MP2,5 realizadas foi de
26,2 µg/m3, 21,1 µg/m3 e 29,4 µg/m3 para os meses de janeiro, maio e setembro de
2009, respectivamente. Para as medições de BC na Fazenda foram encontrados
0,4 µg/m3, 0,19 µg/m3 e 0,68 µg/m3 (Tabela 4).
Figura 10. Filtros de policarbonato usados no amostrador Mini-sampler após campanha de
exposição nos três pontos teste. A – Corresponde ao filtro exposto na comunidade do
Amarelão; B – Corresponde ao ponto Fazenda Sta. Luzia.
AA BB
RESULTADOS
58
Tabela 4. Quantificação do MP2,5 e black carbon para os dois pontos testes
no mês de janeiro do ano de 2009, utilizando o amostrador portátil “Mini-
Sampler” da Harvard.
4.2 Análise da composição elementar do material particulado acumulado
nos filtros de policarbonato
Para os elementos analisados (Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Ni,
Cu, Zn, Se, Br, e PB) foi encontrado um aumento em suas concentrações na
comunidade do Amarelão, quando comparado a Fazenda. (Tabela 5).
Período Ponto Amostral
MP (µm)
Duração (h/min)
Deposição (µg)
Concentração media de BC
(µg/m3)
Concentração média de MP2,5
(µg/m3)
Fazenda 2,5 239:20 682,70 0,4 26,2 Janeiro 2009
Amarelão 2,5 30:30 1.811,60 363,6 2.124,2
Fazenda 2,5 117:30 - 0,19 21,1 Maio 2009
Amarelão 2,5 11:70 - 70,0 1.022,2
Fazenda 2,5 115:90 - 0,68 29,4 Setembro
2009 Amarelão 2,5 14:60 - 69,4 1.291,9
RESULTADOS
59
Tabela 5. Composição elementar dos componentes retidos nos filtros de policarbonato amostrados pelo Mini-Sampler na Fazenda
Santa Luzia e Comunidade do Amarelão nos meses de janeiro, maio e setembro de 2009. Resultados expressos em ng/m3.
Janeiro/2009 Maio/2009 Setembro/2009
Fazenda Amarelão Fazenda Amarelão Fazenda Amarelão
Al 73,97 ± 0,0 178,50 ± 117,69 97,56 ± 31,31 --- 11,30 ± 0,0 ---
Si 72,43 ± 21,90 279,71 ± 378,32 274,94 ± 113,93 8.339,02 ± 1233,04 179,49 ± 250,81 9.258,56 ± 12165,93
P 5,77 ± 0,81 10,12 ± 6,83 1,21 ± 0,0 1,33 ± 0,0 10,12 ± 0,0 121,51 ± 0,0
S 120,74 ± 37,95 1.023,24 ± 1118,12 75,67 ± 22,15 545,72 ± 222,98 199,38 ± 49,75 455,49 ± 179,03
Cl 301,77 ± 386,62 1.786,05 ± 1513,89 156,56 ± 43,70 424,04 ± 370,15 23,42 ± 4,71 608,08 ± 638,47
K 199,52 ± 133,46 1.427,42 ± 1179,43 124,35 ± 122,67 2.048,15 ± 1936,36 185,77 ± 59,17 2.348,70 ± 1992,44
Ca 114,22 ± 119,32 309,85 ± 303,53 56,28 ± 41,30 179,63 ± 155,61 14,92 ± 3,30 115,29 ± 72,23
Ti 1,35 ± 0,0 12,44 ± 0,0 --- --- 1,87 ± 1,39 7,76 ± 2,04
V --- 2,15 ± 0,0 0,19 ± 0,0 0,51 ± 0,21 0,44 ± 0,38 ---
Cr --- 59,70 ± 0,0 2,76 ± 0,0 --- 2,07 ± 2,10 52,37 ± 63,28
Mn 3,51 ± 1,97 11,62 ± 8,65 1,50 ± 0,0 6,33 ± 0,0 --- ---
Fe 10,22 ± 4,31 244,90 ± 52,95 13,39 ± 4,73 26,28 ± 24,24 2,81 ± 3,45 5,03 ± 1,18
Ni 3,86 ± 3,05 15,60 ± 9,12 4,48 ± 2,24 40,79 ± 15,11 1,43 ± 0,46 26,72 ± 10,12
Cu 21,93 ± 21,12 38,49 ± 14,11 32,66 ± 13,47 324,61 ± 269,71 1,64 ± 0,0 ---
Zn 18,97 ± 27,80 35,69 ± 21,71 24,85 ± 7,85 207,85 ± 182,89 4,85 ± 0,0 ---
Se 1,05 ± 0,0 7,60 ± 5,21 1,14 ± 0,0 1,25 ± 0,0 0,89 ± 1,15 4,85 ± 0,0
Br 0,18 ± 0,0 12,32 ± 0,0 4,61 ± 3,18 25,70 ± 17,54 2,45 ± 1,70 0,16 ± 0,0
Pb 1,69 ± 0,07 14,09 ± 7,04 2,04 ± 0,0 --- --- 60,62 ± 52,74
RESULTADOS
60
4.3 Parâmetros pluviométricos
Nas figuras 11 e 12 pode-se observar os índices pluviométricos para o ano de
2007, período em que foram realizadas as medições de MP1,0, MP2,5 e MP10 com o
amostrador portátil “DUSTTRAK™ Aerossol Monitor” e para o período de
agosto/2008 a setembro/2009, em que foi realizado o biomonitoramento e as
amostragens de MP2,5 com o amostrador portátil “Mini-Sampler”. Os dados foram
cedidos pelo setor de meteorologia da EMPARN.
Figura 12. Índice pluviométrico para a cidade de João Câmara - RN entre os meses de agosto/2008 e setembro/2009, período em que foi realizado o biomonitoramento e as amostragens de MP2,5 com o amostrador portátil “Mini-Sampler”.
Figura 11. Índice pluviométrico para a cidade de João Câmara - RN no ano de 2007, período em que foi realizado as medições de MP1,0, MP2,5 e MP10 com o amostrador portátil “DUSTTRAK™ Aerossol Monitor”.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
jan/07 fev/07 mar/07 abr/07 mai/07 jun/07 jul/07 ago/07 set/07 out/07 nov/07 dez/07
Pre
cip
itaç
ão p
luvi
om
étri
ca (
mm
)
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
ago/0
8
set/0
8
out/0
8
nov/0
8
dez/0
8
jan/0
9fe
v/09
mar
/09
abr/0
9
mai/
09
jun/0
9jul
/09
ago/0
9
set/0
9
Pre
cip
itaç
ão p
luvi
om
étri
ca (
mm
)
RESULTADOS
61
4.4 Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN)
No sentido de validar e efetivar o uso desta espécie nos testes de
genotoxicidade, foi realizado no mês de novembro de 2008 um comparativo com o
clone KU-20, quanto a sensibilidade à formação de micronúcleos (Figura 14). Além
dos pontos Fazenda Sta. Luzia e Comunidade do Amarelão foi adicionado um
terceiro ponto, a Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
(05°50'28.78"S; 35°12'6.85"O), zona urbana de Natal-RN.
A taxa de MN encontrados em T. pallida para os três pontos teste foi de:
3,59 ± 0,75 micronúcleos para Fazenda, 4,69 ± 1,07 micronúcleos na UFRN e
9,13 ± 1,30 micronúcleos na comunidade do Amarelão. Enquanto que para o clone
KU-20 foi de 5,20 ± 1,56 micronúcleos, 7,11 ± 2,77 micronúcleos e
12,89 ± 2,41 micronúcleos para Fazenda, UFRN e comunidade do Amarelão,
respectivamente. Os resultados estão expressos na figura 15.
Figura 13. Tétrades de Tradescantia pallida coradas com acetato de carmim a 2% e visualizadas em microscopia óptica com um aumento de 400 X. A, B, C e D – Morfologia de tétrades sem alterações nucleares; E, F e G – Tétrades com a presença de micronúcleos (MN); H e I – Tétrade apresentando uma ponte nucleoplasmática (PNP); J – Tétrade com a presença de um fragmento nuclear (FN), as setas apontam os MN, PNP e FN.
AA BB
DDCC
AA BB
DDCC
Fotos: Marcos Felipe
RESULTADOS
62
Pelos resultados acima descritos, tanto o clone KU-20 quanto a Tradescantia
pallida são efetivos na sensibilidade em gerar micronúcleos frente à poluentes
atmosféricos, tais como os oriundos da queima da castanha de caju.
A Tabela 6 mostra a frequência mensal de micronúcleos (MN), pontes
nucleoplasmáticas (PNP), fragmentos nucleares (FN) e respectivos desvio-padrão
(D.P.) em inflorescências de Tradescantia pallida amostradas na Comunidade do
Amarelão e Fazenda Santa Luzia, durante o período do biomonitoramento, assim
como, o número de tétrades analisadas para cada mês e em cada ponto.
Figura 14. Comparativo da frequência média de MN in situ em inflorescências de Tradescantia pallida frente ao clone KU-20 para o mês de novembro/2008 na fazenda Sta. Luzia, UFRN e Comunidade do Amarelão. (*) Estatisticamente significativo adotando um p < 0,01, pelo teste de Dunnett, utilizando a Fazenda Sta. Luzia como controle. (**) Significativo adotando um p < 0,05.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Tradescantia pallida Clone KU-20
MC
N/1
00 t
étra
des
Fazenda
UFRN
Amarelão
**
*
*
RESULTADOS
63
Tabela 6. Frequência mensal de micronúcleos (MN), pontes nucleoplasmáticas (PNP), fragmentos nucleares (FN) e respectivos desvio-padrão (D.P.)
em inflorescências de T. pallida amostradas na Comunidade do Amarelão e Fazenda Santa Luzia, durante o período de julho de 2008 a setembro de
2009, assim como o número de tétrades analisadas.
ª Período em que houve uma diminuição na queima da castanha de caju. * Estatisticamente significativo adotando um p < 0,05. ** Estatisticamente significativo adotando um p < 0,01. *** Estatisticamente significativo adotando um p < 0,0001. ns Não significativo
MN (%) ± D.P. PNP (%) ± D.P. FN (%) ± D.P. Número de tétrades analisadas Mês/ano
Fazenda Amarelão Fazenda Amarelão Fazenda Amarelão Fazenda Amarelão
07/2008ª 1,61 ± 0,95 3,75 ± 1,43*** ª 0,26 ± 0,19 0,56 ± 0,19*** 0,09 ± 015 0,18 ± 0,17ns 4200 6000
08/2008 1,66 ± 0,81 5,03 ± 1,49*** 0,30 ± 0,18 1,03 ± 0,27*** 0,10 ± 0,16 0,51 ± 0,27** 3000 3300
09/2008 2,23 ± 1,15 5,63 ± 1,74*** 0,50 ± 0,28 1,33 ± 0,49** 0,13 ± 0,23 0,93 ± 0,44*** 3000 3300
10/2008 1,33 ± 0,58 5,63 ± 2,76*** 0,26 ± 0,21 1,43 ± 0,38*** 0,06 ± 0,14 1,03 ± 0,33*** 3000 3000
11/2008 3,59 ± 0,75 9,13 ± 1,30*** 0,93 ± 0,37 2,06 ± 0,37*** 0,96 ± 0,33 1,93 ± 0,49*** 3000 3000
12/2008 2,99 ± 0,94 8,20 ± 1,14*** 0,86 ± 0,17 1,26 ± 0,64ns 0,36 ± 0,24 0,96 ± 0,42** 3000 3000
01/2009 1,26 ± 0,62 8,46 ± 2,32*** 0,13 ± 0,17 --- 0,03 ± 0,10 --- 3000 3000
02/2009 1,63 ± 0,69 6,76 ± 1,35*** 0,40 ± 0,43 1,16 ± 0,39** 0,06 ± 0,14 0,60 ± 0,49** 3000 3000
03/2009 1,69 ± 0,65 5,56 ± 0,54*** 0,46 ± 0,52 0,93 ± 0,66ns 0,06 ± 0,21 0,66 ± 0,31 3000 3000
04/2009 1,49 ± 0,42 5,43 ± 1,28*** 0,43 ± 0,62 0,90 ± 0,68ns 0,03 ± 0,10 0,20 ± 0,28ns 3000 3000
05/2009 1,46 ± 1,12 5,36 ± 2,02*** --- 0,80 ± 0,67 --- 0,20 ± 0,23 3000 3000
06/2009 1,86 ± 0,77 5,66 ± 1,06*** 0,50 ± 0,36 0,96 ± 0,71ns 0,16 ± 0,23 0,56 ± 0,41** 3000 3000
07/2009 1,93 ± 0,34 5,90 ± 1,42*** 0,53 ± 0,42 1,09 ± 0,59* 0,20 ± 0,17 0,85 ± 0,53** 3000 2100
08/2009 1,33 ± 0,47 5,66 ± 1,82*** 0,56 ± 0,27 1,06 ± 0,40** 0,10 ± 0,22 0,30 ± 0,36* 3000 3000
09/2009 1,26 ± 0,81 5,76 ± 2,83*** 0,50 ± 0,45 1,10 ± 0,52* 0,13 ± 0,17 0,43 ± 0,31** 3000 3000
RESULTADOS
64
Importante enfatizar a diminuição na frequência de MN na comunidade do
Amarelão para o mês de julho de 2008 (3,78 ± 1,41), período em que houve uma
redução na queima da castanha de caju em virtude de falta de abastecimento da
castanha de caju, in natura, vinda do município de Serra do Mel - RN. Para os
demais meses do biomonitoramento, cuja queima da castanha foi normatizada, a
frequência média de MN em T. pallida na comunidade do Amarelão foi de 2 a 7
vezes maior que a encontrada para a fazenda Sta. Luzia (controle negativo). Para
todos os meses analisados a frequência média de MN encontrados no Amarelão foi
significativamente superior (p < 0,0001) a da Fazenda.
Na análise das PNP, com exceção dos meses de 12/2008, 03/2009, 04/2009
e 06/2009, todos os outros meses analisados apresentaram um aumento
significativo na taxa de PNP, quando comparado o Amarelão com a Fazenda. Para a
análise dos FN, exceto nos meses de 07/2008 e 04/2009, os demais meses
analisados apresentaram um aumento significativo da taxa de FN no Amarelão
(Tabela 6).
4.4.1. Índice de micronúcleos em T. pallida x MP2,5
Ao analisar os dados de micronúcleos em T. pallida para a comunidade do
Amarelão nos meses de janeiro, maio e setembro de 2009 e a concentração média
de MP2,5 no mesmo período, podemos perceber uma correlação positiva significativa
(y = 0,0029x + 2,2139, R2 = 0,986) entre os dois parâmetros em questão (Figura 15).
Figura 15. Frequência média de MN in situ em tétrades de T. pallida expostas na comunidade do Amarelão e a concentração média de MP2,5 para os meses de janeiro, maio e setembro de 2009.
0
2
4
6
8
10
12
jan/09 mai/09 set/09
MN
/100
tétr
ades
0
500
1000
1500
2000
2500
MP
2,5
(µg
/m3)
MN - Amarelão
MP2,5 Amarelão
RESULTADOS
65
4.4.2. Índice de micronúcleos em T. pallida x pluviometria
Ao analisar os dados de micronúcleos em T. pallida e o índice pluviométrico
no mesmo período em que foi coletada as inflorescências, pode-se perceber uma
correlação negativa (r = -0,58; p < 0,02) entre a frequência de MN na comunidade do
Amarelão e a precipitação pluviométrica (Figura 17; Tabela 7). Ou seja, para os
meses mais chuvosos: março, abril, maio, junho e julho, foi verificado uma
diminuição na frequência de MN, para a comunidade do Amarelão. Já nos meses de
menor precipitação pluviométrica a frequência de MN no Amarelão aumentou
significativamente (p < 0,02). A mesma correlação negativa foi verificada para os
dados obtidos na Fazenda Santa Luzia, porém não significativa estatisticamente
(Figura 17; Tabela 7).
RESULTADOS
66
Figura 16. Biomonitoramento in situ da frequência média de MN em tétrades de T. pallida para a Comunidade do Amarelão e Fazenda Sta. Luzia e precipitação pluviométrica mensal para o mesmo período em análise. (*) Estatisticamente significativo adotando um p < 0,0001.
0
2
4
6
8
10
12
ago/08 set/08 out/08 nov/08 dez/08 jan/09 fev/09 mar/09 abr/09 mai/09 jun/09 jul/09 ago/09 set/09
MN
/100
tétr
ades
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
Pre
cip
itaçã
o p
luvi
om
étri
ca (m
m)
MN - Fazenda
MN - Amarelão
Precipitação
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
* *
*
RESULTADOS
67
Para melhor visualização da correlação observada, a frequência de
micronúcleos por ponto amostral e a precipitação pluviométrica também foi
representada graficamente na figura 18 pelo diagrama de dispersão.
4.4.3. Correlação entre os biomarcadores de dano ao DNA
Foi verificada uma forte correlação cruzada entre os três biomarcadores de
dano no DNA utilizados: MN, PNP e FN. Esta correlação positiva foi evidenciada
tanto para as frequências obtidas na comunidade do Amarelão,como para as obtidas
na Fazenda Sta. Luzia (Tabela 7).
Figura 17. Diagrama de dispersão para o índice de MN com relação a precipitação pluviométrica para o mesmo período de coleta das inflorescências de T. pallida. Correlação negativa franca para a Fazenda (r = -0,41) e negativa moderada para o Amarelão (r = -0,58).
y = -0,0093x + 7,2333
R2 = 0,3409r = - 0,58
y = -0,0034x + 2,1836
R2 = 0,1705r = - 0,41
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0
Precipitação pluviométrica (mm)
MC
N/1
00 t
étra
des
RESULTADOS
68
Tabela 7. Matriz de correlação entre a frequência de micronúcleos (MNs),
pontes nucleoplasmáticas (PNP), fragmentos nucleares (FN) e
pluviometria para a Comunidade do Amarelão e Fazenda Sta. Luzia.
Local Biomarcador Pluviometria MN FN
PNP p <0,002 <0,0003 <0,0001
r -0,76 0,82 0,93
FN p <0,01 <0,0007 --
r -0,67 0,79 --
MN p <0,02 -- --
Amarelão
r -0,58 -- --
PNP p Ns <0,0002 <0,0007
r -0,29 0,84 0,79
FN p Ns <0,0001 --
r -0,43 0,89 --
MN p Ns -- --
Fazenda
r -0,41 -- -- ns Não significativo
4.5 Viabilidade Celular
As células MRC-5 cultivadas em diferentes concentrações do material
inorgânico extraído dos filtros de MP2.5 coletados na comunidade do Amarelão,
assim como o controle negativo (somente meio de cultura) apresentaram viabilidade
celular ≥ 96% (Figura 18).
RESULTADOS
69
4.6 Citotoxicidade Celular
Para o ensaio de citotoxicidade celular foi utilizado, além do controle negativo,
os filtros brancos (não expostos). Sendo acrescentado duas concentrações do
material inorgânico extraído dos filtros de MP2.5 (200 µg/mL e 400 µg/mL). Tais
concentrações foram citotóxicas quando comparadas aos filtros brancos (Figura 19).
Figura 18. Ensaio de Viabilidade Celular pelo método de exclusão por azul de tripan, utilizando as cinco concentrações do extrato inorgânico obtido do MP2.5 coletado na comunidade do Amarelão.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6,25 12,5 25 50 100
Material Particulado (µg/mL)
Via
bil
idad
e (%
)
Figura 19. Ensaio de citotoxicidade celular pelo método MTT, utilizando as sete concentrações do extrato inorgânico obtido do MP2.5 coletado na comunidade do Amarelão. (*) Estatisticamente significativo pelo teste de Dunnett´s, adotando um p < 0,01 e os filtros brancos como controle negativo.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 Branco 6,25 12,5 25 50 100 200 400
Material Particulado (µg/mL)
Re
duç
ão
do
MT
T (
% d
o c
ontr
ole)
*
*
DISCUSSÃO
70
5. DISCUSSÃO
Para melhor entender quais os principais elementos presentes nos dois
pontos estudados foram realizadas medições de vários componentes: MP1,0, MP2,5,
MP10, BC, Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Se, Br, e Pb. A
presença de alguns compostos em altas concentrações são importantes indicadores
de exposição a poluentes ambientais.
Segundo a “USEPA” (1998) o maior percentual do material particulado
produzido, seja por combustão de produtos fósseis, seja por combustão de
biomassa, é formado por partículas menores que 2,5 µm de diâmetro aerodinâmico,
em uma proporção de aproximadamente 90%. Sendo assim, a segunda etapa de
medições do MP na comunidade do Amarelão e Fazenda Santa Luzia durante o ano
de 2009 (Tabela 4), caracterização dos compostos inorgânicos (Tabela 5) e
execução dos ensaios com cultura de células (Figura 18 e 19) foram realizados a
partir da coleta do MP2,5 retido nos filtros de policarbonato.
Os trabalhadores envolvidos no beneficiamento da castanha de caju estão
expostos a uma concentração de MP10 que excede o nível de exposição definido
como “estado de emergência” estabelecido pelo CONAMA (de 500 µg/m3 para
partículas inaláveis, ou seja, partículas com diâmetro menor que 10 µm). Todas as
medições de MP2,5 e MP10 realizadas na comunidade do Amarelão excederam os
limites diários estabelecidos pelo CONAMA, US EPA e OMS. Sendo assim, a
atividade, da maneira como é realizada atualmente, é caracterizada como um
problema ocupacional grave com sérios riscos a saúde dos trabalhadores envolvidos
no processo.
Num estudo realizado no leste da Índia, foi verificado que a concentração
média de MP10 e MP2,5 na residência de mulheres que utilizam a queima de
biomassa (madeira) como fonte de energia para cozinhar foi de 625 ± 150 µg/m3 e
312 ± 85 µg/m3, respectivamente. Enquanto que no grupo controle, mulheres que
utilizam o gás natural (GLP), a concentração foi de 129 ± 42 µg/m3 e 77 ± 29 µg/m3,
para MP10 e MP2,5, respectivamente. Os autores verificaram elevada presença de
MNs (ensaio CBMN), aumento de danos oxidativos (ensaio Cometa), aumento de
EROs e diminuição de enzimas antioxidantes (SOD). As medições de MP10 e MP2,5
DISCUSSÃO
71
na comunidade do Amarelão foram de três a seis vezes superiores as encontradas
por Mondal et al. (2010).
Num estudo realizado por Zelikoff et al. (2000, 2002a) na Universidade de
Nova York, vários ratos foram expostos a fumaça proveniente da queima de madeira
de carvalho por uma hora, numa concentração de 750 µg/m3, um pouco abaixo das
concentrações de MP encontradas na comunidade do Amarelão. Em seguida, os
mesmos ratos foram expostos ao Staphylococcus aureus, agente que causa
infecção respiratória grave, por instilação intratraqueal. Um grupo controle, não
exposto à fumaça também recebeu o mesmo tratamento. A bactéria mostrou-se
mais virulenta nos ratos expostos à fumaça e os autores sugeriram que a fumaça
suprime a atividade dos macrófagos (NAEHER et al., 2007).
O mesmo grupo realizou um estudo com ratos previamente infectados com
Streptococcus pneumoniae e expostos a uma concentração de MP2,5 um pouco
acima da estabelecida pela NAAQS (National Ambient Air Quality Standard) da
cidade de Nova York, Estados Unidos. Os resultados deste estudo demonstram que
uma única exposição por inalação do MP2,5 agravou a infecção gerada pela bactéria,
comprometendo o sistema de defesa imunológica dos animais expostos (ZELIKOFF
et al., 2000, 2002b). Outro estudo examinou os efeitos em ratos expostos à fumaça
gerada pela queima de madeira (Pinus edulis) no período de 4 e 12 semanas. A
fumaça gerou comprometimento da função pulmonar, inflamação crônica leve e
metaplasia de células escamosas na laringe de todos os grupos de ratos expostos
(TESFAIGZI et al., 2002).
O material particulado pode conter uma grande variedade de metais. Como
resultado disto, a produção de agentes oxidantes mediada por metais de transição,
vai depender da quantidade de cada metal (especialmente do ferro), assim como
suas interações. O Radical hidroxila (OH•) é uma das EROs com o maior potencial
oxidante, e sua geração, mediada por metais de transição, é uma das principais
hipóteses para a toxicidade atribuída ao MP (VALAVANIDIS et al., 2000; VIDRIO et
al., 2008).
Valavanidis et al. (2000) mostraram que as partículas totais em suspensão
(PTS), partículas de exaustão do diesel (PED) e partículas de exaustão da gasolina
(PEG) geram radicais hidroxila (OH•) na presença de pequenas concentrações de
peróxido de hidrogênio. A observação da geração de OH• frente à exposição ao MP
também foi documentada em estudos in vitro e in vivo com MP10, PED e outras
DISCUSSÃO
72
partículas inaláveis (cinzas, pó de carvão e sílica) (GHIO et al., 1992;
DUSSELDORP et al., 1995; HUANG et al., 1998). Outros trabalhos publicados
enfocam na formação de OH• mediada pela presença de metais de transição,
principalmente via reação de Fenton (KNAAPEN et al., 2002; ZHOU et al., 2003;
TURI et al., 2004; DEGUILLAUME et al., 2005).
Na reação de Fenton (Eq. 1) o ferro na forma reduzida (Fe+2) reage com o
peróxido de hidrogênio (H2O2) para produzir a forma oxidada do ferro (Fe+3) e o
radical hidroxila (OH•):
Fe+2 + O2 ↔ Fe+3 + O2-•
2O2-• + 2H+ → O2 + H2O2
Fe+2 + H2O2 → Fe+3 + OH- + OH• (Eq. 1)
Reações similares podem ocorrer com o Cu, Cr e Ni (STOHS & BAGCHI,
1995; VIDRIO et al., 2008). Neste sentido, a elevada presença de metais de
transição encontrados no MP2,5 coletado na comunidade do Amarelão, sobretudo Fe,
Ni, Cu, Cr e Zn, podem estar influenciando na genotoxicidade (Tabela 6) e
citotoxicidade celular (Figura 19) observada, um vez que esses elementos
apresentam o potencial de causar danos na molécula do DNA.
No entanto, o estabelecimento da relação de causalidade entre a exposição
química pelo MP e os danos à saúde dos trabalhadores envolvidos na queima da
castanha de caju deve ser bastante criteriosa, já que a maioria da exposição química
ocupacional e ambiental é dada por uma mistura complexa, e não de agentes
individualizados (AZEVEDO et al., 2004). Não devendo ser descartado a presença e
potencialidade dos compostos orgânicos voláteis, sobretudo os HPAs em gerar
danos na molécula do DNA.
Devido a alta sensibilidade o bioensaio de micronúcleo em Tradescantia tem
sido mundialmente utilizado em estudos de genotoxicidade (GRANT, 1994;
ČĖSNIENĖ et al., 2010; MISÍK et al., 2011). No entanto, em países de clima tropical
os clones de Tradescantia BNL-4430 e KU-20 não se desenvolvem bem nas
condições de elevada temperatura, umidade e precipitação destes países,
manifestando uma diminuição no seu crescimento e floração. Além disso, quando
mantidos por longos períodos em condições abertas os clones são fortemente
atacados por parasitas e insetos, inviabilizando a sua utilização em estudos de
DISCUSSÃO
73
biomonitoramento a médio e longo prazo (SUYAMA et al., 2002). Uma alternativa
mais adequada às condições ambientais encontradas no Brasil e em países tropicais
é a utilização da Tradescantia pallida.
Pelos dados obtidos no presente estudo a Tradescantia pallida demonstrou
ser tão sensível a poluentes atmosféricos quanto o clone KU-20, sobretudo os
oriundos da queima da castanha de caju. Tal resultado, somado aos diversos
trabalhos publicados na literatura que utilizam a Tradescantia pallida como
bioindicador de genotoxicidade (BATALHA et al., 1999; GUIMARÃES et al., 2000;
CARVALHO-OLIVEIRA et al., 2005; CARRERAS et al., 2006; ALVES et al., 2008;
LEAL et al., 2008; PRAJAPATI e TRIPATHI, 2008; LIMA et al., 2009; MARIANI et al.,
2009; MEIRELES et al., 2009; MIELLI et al., 2009; SAVÓIA et al., 2009;
SISENANDO et al., 2010; ALVES et al., 2011), validam tal espécie para o
biomonitoramento proposto.
Uma melhor compreensão do potencial tóxico e mutagênico da poluição
atmosférica exige que os testes toxicológicos in situ sejam realizados durante
diferentes estações do ano, com variações de temperatura, índice pluviométrico e
umidade relativa do ar, permitindo incluir essas variáveis na análise do potencial
mutagênico atribuído ao particulado. Um estudo realizado por Klumpp et al. (2004)
demonstrou a influência da temperatura e umidade relativa do ar no bioensaio
Trad-MCN. Sendo assim, o biomonitoramento realizado neste estudo contemplou o
período de julho de 2008 a setembro de 2009.
Savóia et al. (2009) ao realizarem um biomonitoramento com a T. pallida a fim
de avaliar o potencial clastogênico da poluição do ar em Santo André - SP,
verificaram a influência de fatores abióticos, tais como: umidade relativa do ar,
temperatura e precipitação pluviométrica com a formação de MN nas plantas
expostas. Assim como os dados obtidos por Savóia et al. (2009), o presente estudo
também observou uma relação inversa entre a taxa de MN e a precipitação
pluviométrica mensal.
A autora justifica a relação inversa observada chamando atenção para a
influência da disponibilidade de água na abertura e fechamento dos estômatos,
estes podem ser fechados sob baixa disponibilidade de água. Em tal situação, a
absorção de gases poluentes, que ocorre principalmente via estômatos, pode ser
restrita, o que iria mascarar a resposta de genotoxicidade frente ao poluente em
análise. No entanto, no presente estudo a justificativa apresentada não se aplica, já
DISCUSSÃO
74
que as mudas de T. pallida foram regadas diariamente com água destilada. A
justificativa mais plausível seria a de que na estação chuvosa os aerossóis em
suspensão na atmosfera são precipitados e sua concentração no ar é reduzida.
Sendo assim, as chuvas exercem um papel positivo como um agente de
autodepuração dos poluentes atmosféricos.
Um estudo realizado por Lara et al. (2005) com as emissões de aerossóis
durante a queima da cana de açúcar na cidade de Piracicaba – SP revelou uma
variação na concentração de alguns poluentes atmosféricos entre os períodos de
seca (baixa precipitação pluviométrica) e chuvoso (alta precipitação pluviométrica).
As concentrações médias de MP2,5, partículas grossas (2,5 µm < diâmetro < 10 µm),
black carbon e alguns elementos químicos (Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe,
Ni, Cu, Zn, Br, Pb) foram estatisticamente menores (p < 0,01) na estação chuvosa
que na estação seca.
Outro estudo realizado por Maenhaut et al. (2002) em Alta Floresta – MT com
a queima de biomassa em florestas tropicais verificou que a concentração média de
MP na estação de seca foi de 65 ± 55 µg/m3 para o particulado fino e 37 ± 25 µg/m3
para o particulado grosso. Já na estação chuvosa essas concentrações reduziram
para 9,9 ± 9,9 µg/m3 no particulado fino e 15,1 ± 9,9 µg/m3 para o particulado grosso.
As concentrações médias de BC e outros 38 elementos químicos também
diminuíram significativamente na estação chuvosa.
Apesar do número reduzido de amostragens do MP2,5 com relação aos
estudos acima descritos, no presente estudo também foi verificado uma correlação
negativa entre a concentração média de MP2,5 e a precipitação pluviométrica. Esta
redução nas concentrações de MP2,5 na estação chuvosa reduz a quantidade de
particulado captado pelas mudas de T. pallida em exposição e consequentemente
tem influência na diminuição de MN observada para esta estação (Figura 16 e 17).
Para todos os meses analisados, foi verificado uma frequência média de
micronúcleos em T. pallida na comunidade do Amarelão de 2 a 7 vezes maior que a
encontrada para a Fazenda Sta. Luzia (controle negativo), sendo esta diferença
estatisticamente significativa (p < 0,01) em todos os meses. No mês de julho de
2008 houve uma diminuição na frequência de MN (3,78 ± 1,41) na comunidade do
Amarelão em virtude da redução na queima da castanha de caju (Tabela 6).
Os resultados obtidos para a taxa de MN decorrente da queima de biomassa
pela castanha de caju na comunidade do Amarelão são superiores aos resultados
DISCUSSÃO
75
obtidos por diversos estudos que utilizam o Trad-MCN com o objetivo de avaliar a
genotoxicidade de diversas fontes de poluição, a citar: monitoramento de poluentes
de origem veicular, fábrica de produtos químicos industriais e incinerador na cidade
de Bratislava, Eslováquia (MISÍK et al., 2006); diversas áreas industriais na Europa,
tais como Barcelona, Espanha; Lyon, França e Klagenfurt, Áustria (KLUMPP et al.,
2006); combustão para aquecimento residencial e tráfego de automóveis na cidade
de Perugia, Itália (VILLARINI et al., 2009); poluentes atmosféricos urbanos em áreas
de intenso tráfico de veículos na cidade de Córdoba, Argentina (CARRERAS et al.,
2006); Barcelona e Valencia, Espanha; Düsseldorf e Stuttgart, Alemanha;
Copenhagen, Dinamarca; Edinburgh, Reino Unido (KLUMPP et al., 2006); Varanasi,
Índia (PRAJAPATI et al., 2008); São José dos Campos, Brasil (MARIANI et al.,
2009); Santo André, Brasil (SAVÓIA et al., 2009) e Feira de Santana, Brasil
(MEIRELES et al., 2009).
Apesar de não existir estudos que utilizam as PNP e FN como biomarcadores
de danos em tétrades de Tradescantia, este tipo de parâmetro avaliativo tem sido
utilizado em células humanas binucleadas, sobretudo linfócitos, e linhagens
celulares estabelecidas. O uso de PNP como biomarcador de danos no DNA foi
validado em células humanas WIL2-NS tratadas com peróxido de hidrogênio,
superóxido ou após a co-incubação com neutrófilos humanos ativados. A frequência
de PNP em células binucleadas aumentou de forma dose-dependente até 20 vezes
em relação ao controle. As PNP foram positivamente correlacionadas com a
frequência de MN nas mesmas células binucleadas (r > 0,82, p < 0,0001) (UMEGAKI
& FENECH, 2000).
Num estudo realizado com cultura de linfócitos humanos foi observado a inter-
relação entre MN, PNP e brotamento nuclear, numa tentativa de validar o uso
desses biomarcadores e determinar de forma mais abrangente o impacto da
deficiência do ácido fólico em vários aspectos da estabilidade genômica. Foi
observado que tanto a frequência de MN como as frequências de PNP e brotamento
nuclear foram negativamente correlacionadas com as doses de ácido fólico,
sugerindo que os fragmentos cromossomicos (MN), o rearranjo do cromossômico
(PNP) e a amplificação de gênica (brotamentos nucleares) são induzidos pela
deficiência de ácido fólico. Também foi observado uma forte correlação cruzada
entre a frequência de MN, PNP e brotamento nuclear (r = 0,75 a 0,77; p < 0,001)
(FENECH & CROTT, 2002b).
DISCUSSÃO
76
Os resultados obtidos para a comunidade do Amarelão também evidenciaram
uma correlação positiva entre a frequência de MN e os demais biomarcadores
utilizados na avaliação da genotoxicidade, as PNP (r = 0,82; p < 0,0003) e os FN
(r = 0,79; p < 0,0007). Para a Fazenda Sta. Luzia a correlação entre MN e os
biomarcadores, PNP (r = 0,84; p < 0,0002) e FN (r = 0,89; p < 0,0001) também foi
verificada (Tabela 7).
Estudos realizados por Jalava et al. (2008) demonstraram que macrófagos
RAW 264.7 expostos a 150 µg/ml da fração urbana de MP2,5 solúvel em água,
mostrou atividade citotóxica pelo ensaio MTT. Os resultados obtidos foram similares
aos encontrados nas frações extraídas do MP2,5 coletado no Amarelão. Meng e
Zhang (2007) analisando os efeitos toxicológicos da fração solúvel em água e fração
orgânica do MP2,5 de tempestades de poeira na China observaram um decréscimo
na viabilidade celular e um aumento de danos ao DNA de macrófagos alveolares de
ratos, atribuindo tais efeitos a formação de adutos de DNA pelos hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos e o potencial oxidativo da fração solúvel em água. Além
disso, os solventes orgânicos extraíveis apresentaram maior dano do DNA do que a
fração solúvel em água.
O presente estudo identificou a presença de altas concentrações de MP na
comunidade do Amarelão, provocada pela queima da castanha de caju.
Adicionalmente, foi observada toxicidade genética em Tradescantia pallida e
citotoxicidade em células MRC-5. Diante da importância da qualidade do ar e da
grande importância social e econômica do beneficiamento da castanha de caju para
as centenas de famílias ao redor do mundo que fazem uso da queima artesanal, se
faz necessário a elaboração de um programa periódico de avaliação da qualidade do
ar, levando em conta não somente os parâmetros químicos, mas também análises
de mutagenicidade. Os resultados contidos neste estudo possibilitaram a
identificação de um problema ocupacional grave, com sérios riscos aos
trabalhadores e familiares que vivem da atividade. Diante disto, a adoção de
medidas preventivas e de melhores práticas, tais como o uso de exaustores
coletivos e equipamentos de segurança (máscaras e luvas), objetivando a melhoria
tanto para a atividade como na qualidade de vida da população, seria de
fundamental importância para o desenvolvimento sustentável da atividade.
Estudos adicionais também devem ser realizados, utilizando outras
metodologias e frações, para detecção de outros tipos de poluentes e seus efeitos
DISCUSSÃO
77
sobre a biota e trabalhadores envolvidos, como também para uma melhor
caracterização e compreensão dos processos genético-moleculares envolvidos na
toxicidade observada.
CONCLUSÃO
78
6. CONCLUSÃO
As medições de MP1,0, MP2,5, MP10 e BC na comunidade do Amarelão alertam
para um problema ocupacional grave, com sérios riscos a saúde dos trabalhadores
envolvidos no beneficiamento artesanal da castanha de caju, fazendo necessário o
planejamento de medidas que visem o desenvolvimento sustentável da atividade,
garantindo o controle na emissão de poluentes ambientais. Para a análise
elementar, a elevada presença de metais de transição encontrados no MP2,5
coletado na comunidade do Amarelão, sobretudo Fe, Ni, Cu, Cr e Zn, pode estar
influenciando na genotoxicidade e citotoxicidade observada.
O bioensaio de micronúcleo utilizando tétrades de Tradescantia pallida
demonstrou-se tão efetivo quanto o clone KU-20 em detectar a ação de poluentes
atmosféricos na indução de danos cromossômicos, indicando que os elementos
oriundos da queima da castanha de caju são capazes de elevar significativamente a
taxa de mutações no DNA de células germinativas de T. pallida. Além disto,
variáveis ambientais, como a precipitação pluviométrica, influenciam na
genotoxicidade observada.
Outras alterações nucleares, como as pontes nucleoplasmáticas e fragmentos
nucleares apresentaram forte correlação com a frequência de micronúcleos e podem
ser utilizados como biomarcadores de danos em tétrades de Tradescantia.
A futura utilização destes parâmetros avaliativos constitue uma importante
ferramenta adicional ao Trad-MCN.
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APÊNDICE
99
APÊNDICE
Apêndice 1: Dados brutos obtidos durante a leitura das lâminas de tétrades de
Tradescantia pallida e clone KU-20 durante o biomonitoramento (07/2008-09/2009).
Tabela A1 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de julho/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia 1 291 7 2 0 0 1 0 11 0,666
Fazenda Santa Luzia 2 291 6 2 0 0 0 0 10 1,666
Fazenda Santa Luzia 3 297 2 1 0 0 1 1 4 0,666
Fazenda Santa Luzia 4 297 2 1 0 0 1 0 4 0,333
Fazenda Santa Luzia 5 297 1 2 0 0 0 0 5 0,333
Fazenda Santa Luzia 6 299 1 0 0 0 1 0 1 2,666
Fazenda Santa Luzia 7 293 5 0 0 0 1 0 5 1,333
Fazenda Santa Luzia 8 297 2 1 0 0 2 1 4 2,333
Fazenda Santa Luzia 9 295 3 1 0 0 1 0 5 1,000
Fazenda Santa Luzia 10 296 3 1 0 0 0 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia 11 299 1 0 0 0 1 0 1 0,666
Fazenda Santa Luzia 12 298 2 0 0 0 1 1 2 1,666
Fazenda Santa Luzia 13 297 1 2 0 0 0 0 5 0,666
Fazenda Santa Luzia 14 295 4 1 0 0 1 0 6 0,333
APÊNDICE
100
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 294 5 1 0 0 3 1 7 2,333
Amarelão 2 288 7 3 0 0 1 1 13 4,333
Amarelão 3 295 3 1 0 0 2 0 5 1,666
Amarelão 4 293 3 2 2 0 2 0 13 4,333
Amarelão 5 293 4 3 0 0 2 0 10 3,333
Amarelão 6 286 7 5 0 0 1 1 17 5,666
Amarelão 7 289 8 2 0 0 2 1 12 4,000
Amarelão 8 294 3 2 0 0 2 1 7 2,333
Amarelão 9 293 1 5 0 0 1 0 11 3,666
Amarelão 10 292 4 3 0 0 2 0 10 3,333
Amarelão 11 285 12 3 0 0 2 1 18 6,000
Amarelão 12 289 7 3 1 0 1 1 16 5,333
Amarelão 13 294 4 2 0 0 2 0 8 2,666
Amarelão 14 294 4 1 0 0 1 0 6 2,000
Amarelão 15 285 9 3 2 0 1 1 21 7,000
Amarelão 16 296 2 1 1 0 2 0 7 2,333
Amarelão 17 289 8 2 0 0 2 1 12 4,000
Amarelão 18 291 6 3 0 0 2 1 12 4,000
Amarelão 19 292 4 2 0 0 1 0 8 2,666
Amarelão 20 291 6 3 0 0 2 1 12 4,000
APÊNDICE
101
Tabela A2 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de agosto/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 297 2 1 0 0 2 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
2 294 3 2 0 0 1 1 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
3 298 1 1 0 0 0 1 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
4 297 2 0 0 0 1 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
5 295 2 2 0 0 1 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
6 295 5 0 0 0 1 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
7 294 4 2 0 0 1 0 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
8 296 4 0 0 0 0 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
9 293 5 2 0 0 1 0 9 3,000
Fazenda Santa Luzia
10 298 2 0 0 0 1 0 2 0,666
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 291 6 3 0 0 3 2 12 4,000
Amarelão 2 292 4 1 1 0 2 2 9 3,000
Amarelão 3 294 4 1 1 0 4 1 9 3,000
Amarelão 4 287 10 1 0 0 4 1 12 4,000
Amarelão 5 287 9 2 1 0 3 2 16 5,333
Amarelão 6 291 3 4 1 0 3 3 14 4,666
Amarelão 7 289 3 7 0 0 2 1 17 5,666
Amarelão 8 288 6 5 0 1 2 2 20 6,666
Amarelão 9 290 6 1 1 1 4 1 15 5,000
Amarelão 10 285 7 3 2 0 3 2 19 6,333
Amarelão 11 284 8 4 1 1 4 0 23 7,666
APÊNDICE
102
Tabela A3 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de setembro/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 295 5 0 0 0 2 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
2 298 1 1 0 0 3 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
3 298 1 0 1 0 2 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
4 295 3 1 1 0 1 1 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
5 293 6 1 0 0 2 0 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
6 298 2 0 0 0 1 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
7 294 5 1 0 0 2 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
8 295 4 1 0 0 1 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
9 291 5 4 0 0 0 2 13 4,333
Fazenda Santa Luzia 10 293 4 2 1 0 1 0 11 3,666
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 289 5 5 1 0 3 2 18 6,000
Amarelão 2 286 9 4 1 0 4 4 20 6,666
Amarelão 3 290 6 3 1 0 1 2 15 5,000
Amarelão 4 291 8 1 0 0 3 3 10 3,333
Amarelão 5 287 10 2 1 0 5 2 17 5,666
Amarelão 6 282 13 4 1 0 5 3 24 8,000
Amarelão 7 292 6 1 1 0 3 3 11 3,666
Amarelão 8 294 4 1 1 0 6 4 9 3,000
Amarelão 9 289 8 1 1 1 4 3 17 5,666
Amarelão 10 285 10 3 1 1 6 0 23 7,666
Amarelão 11 282 14 4 0 0 4 5 22 7,333
APÊNDICE
103
Tabela A4 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de outubro/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 298 2 0 0 0 0 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
2 295 5 0 0 0 1 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
3 295 3 2 0 0 1 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
4 295 4 1 0 0 1 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
5 296 3 1 0 0 1 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
6 297 3 0 0 0 0 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
7 298 2 0 0 0 0 1 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
8 298 2 0 0 0 1 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
9 296 4 0 0 0 2 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
10 296 4 0 0 0 1 0 4 1,333
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 296 4 0 0 0 5 3 4 1,333
Amarelão 2 283 12 4 1 0 6 4 23 7,666
Amarelão 3 289 9 2 0 0 4 2 13 4,333
Amarelão 4 291 5 4 0 0 3 5 13 4,333
Amarelão 5 287 9 4 0 0 3 3 17 5,666
Amarelão 6 287 10 2 1 0 5 3 17 5,666
Amarelão 7 284 10 2 4 0 3 2 26 8,666
Amarelão 8 295 5 0 0 0 6 4 5 1,666
Amarelão 9 283 7 9 1 0 4 2 28 9,333
Amarelão 10 287 7 4 0 2 4 3 23 7,666
APÊNDICE
104
Tabela A5 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de novembro/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 294 5 1 0 0 2 2 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
2 294 1 5 0 0 3 2 11 3,666
Fazenda Santa Luzia
3 294 3 2 1 0 2 3 10 3,333
Fazenda Santa Luzia
4 293 5 1 0 1 3 3 11 3,666
Fazenda Santa Luzia
5 290 5 5 0 0 5 4 15 5,000
Fazenda Santa Luzia
6 293 4 2 1 0 2 5 11 3,666
Fazenda Santa Luzia
7 290 9 1 0 0 1 3 11 3,666
Fazenda Santa Luzia
8 291 5 4 0 0 3 2 13 4,333
Fazenda Santa Luzia
9 295 2 3 0 0 4 2 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
10 293 3 4 0 0 3 3 11 3,666
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 286 7 6 1 0 5 5 22 7,333
Amarelão 2 283 10 6 0 1 6 6 26 8,666
Amarelão 3 285 11 2 2 0 7 5 21 7,000
Amarelão 4 284 10 4 2 0 5 4 24 8,000
Amarelão 5 279 11 10 0 0 8 5 31 10,33
Amarelão 6 279 11 10 0 0 6 4 31 10,33
Amarelão 7 282 9 5 4 0 6 8 31 10,33
Amarelão 8 279 14 5 1 1 8 6 31 10,33
Amarelão 9 283 8 7 2 0 6 8 28 9,333
Amarelão 10 285 7 4 2 2 5 7 29 9,666
APÊNDICE
105
Tabela A6 – Dados obtidos para o clone KU-20 no mês de novembro/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 286 12 2 0 0 10 3 16 5,333
Fazenda Santa Luzia
2 291 7 1 1 0 4 6 12 4,000
Fazenda Santa Luzia
3 285 13 2 0 0 5 4 17 5,666
Fazenda Santa Luzia
4 281 16 2 1 0 7 3 23 7,666
Fazenda Santa Luzia
5 288 10 2 0 0 6 5 14 4,666
Fazenda Santa Luzia
6 287 10 3 0 0 11 4 16 5,333
Fazenda Santa Luzia
7 283 15 1 1 0 6 3 20 6,666
Fazenda Santa Luzia
8 287 11 2 0 0 5 6 15 5,000
Fazenda Santa Luzia
9 289 10 0 1 0 3 7 13 4,333
Fazenda Santa Luzia
10 289 9 1 0 0 9 8 11 3,666
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 268 17 12 2 0 14 14 47 15,666
Amarelão 2 274 12 10 3 1 10 10 45 15,000
Amarelão 3 270 21 7 2 0 19 19 41 13,666
Amarelão 4 268 20 11 1 0 16 16 45 15,000
Amarelão 5 279 16 4 1 0 22 8 27 9,000
Amarelão 6 277 12 9 2 0 18 6 36 12,000
Amarelão 7 278 13 7 2 0 10 10 33 11,000
Amarelão 8 274 18 7 1 0 27 9 35 11,666
Amarelão 9 276 18 5 1 0 14 14 31 10,333
Amarelão 10 271 15 11 2 1 7 7 47 15,666
APÊNDICE
106
Tabela A7 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de dezembro/2008.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 295 4 1 0 0 3 1 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
2 293 6 1 0 0 2 1 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
3 293 4 3 0 0 3 2 10 3,333
Fazenda Santa Luzia
4 289 10 1 0 0 3 1 12 4,000
Fazenda Santa Luzia
5 293 4 3 0 0 2 0 10 3,333
Fazenda Santa Luzia
6 295 3 0 1 1 3 0 10 3,333
Fazenda Santa Luzia
7 296 1 2 0 1 2 1 9 3,000
Fazenda Santa Luzia
8 290 6 4 0 0 2 2 14 4,666
Fazenda Santa Luzia
9 296 3 1 0 0 3 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
10 294 6 0 0 0 3 2 6 2,000
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 280 16 4 0 0 1 2 24 8,000
Amarelão 2 282 12 5 1 0 2 4 25 8,333
Amarelão 3 282 11 6 1 0 4 2 26 8,666
Amarelão 4 281 14 3 1 1 2 4 27 9,000
Amarelão 5 284 9 6 1 0 5 4 24 8,000
Amarelão 6 285 8 7 0 0 6 3 22 7,333
Amarelão 7 288 5 4 3 0 7 2 22 7,333
Amarelão 8 283 7 9 1 0 5 5 28 9,333
Amarelão 9 289 7 1 3 0 3 1 18 6,000
Amarelão 10 280 12 6 2 0 3 2 30 10,000
APÊNDICE
107
Tabela A8 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de janeiro/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 298 2 0 0 0 0 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
2 296 1 3 0 0 1 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
3 298 2 0 0 0 0 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
4 297 2 1 0 0 1 1 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
5 297 2 1 0 0 0 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
6 296 3 1 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
7 299 1 0 0 0 1 0 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
8 295 4 1 0 0 0 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
9 298 1 1 0 0 1 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
10 297 2 1 0 0 0 0 4 1,333
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 10 3 0 1 10 - - 20 6,666
Amarelão 2 13 5 2 0 13 - - 29 9,666
Amarelão 3 10 3 0 1 10 - - 20 6,666
Amarelão 4 10 7 2 1 10 - - 34 11,33
Amarelão 5 9 6 1 0 9 - - 24 8,000
Amarelão 6 15 5 1 0 15 - - 28 9,333
Amarelão 7 7 5 0 0 7 - - 17 5,666
Amarelão 8 7 4 1 0 7 - - 18 6,000
Amarelão 9 14 7 2 1 14 - - 38 12,66
Amarelão 10 9 7 1 0 9 - - 26 8,666
APÊNDICE
108
Tabela A9 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de fevereiro/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 294 5 1 0 0 3 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
2 298 2 0 0 0 2 1 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
3 294 3 3 0 0 0 0 9 3,000
Fazenda Santa Luzia
4 296 3 1 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
5 297 1 2 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
6 296 2 2 0 0 2 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
7 297 3 0 0 0 3 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
8 298 0 2 0 0 0 1 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
9 297 3 0 0 0 2 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
10 296 3 1 0 0 0 0 5 1,666
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 288 9 2 1 0 3 1 16 5,333
Amarelão 2 287 7 5 1 0 2 5 20 6,666
Amarelão 3 289 8 1 2 0 5 2 16 5,333
Amarelão 4 279 16 5 0 0 4 2 26 8,666
Amarelão 5 285 9 3 3 0 2 3 24 8,000
Amarelão 6 291 5 3 1 0 3 1 14 4,666
Amarelão 7 287 9 2 1 1 3 2 20 6,666
Amarelão 8 277 11 7 0 0 5 0 25 8,333
Amarelão 9 288 8 4 0 1 3 2 20 6,666
Amarelão 10 285 11 2 1 1 5 0 22 7,333
APÊNDICE
109
Tabela A10 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de março/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 295 3 2 0 0 2 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
2 297 2 1 0 0 0 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
3 295 3 2 0 0 0 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
4 296 3 1 0 0 3 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
5 296 3 1 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
6 293 7 0 0 0 3 2 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
7 295 3 2 0 0 0 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
8 297 2 1 0 0 2 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
9 296 4 0 0 0 4 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
10 299 1 0 0 0 0 0 1 0,333
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 288 9 2 1 0 4 2 16 5,333
Amarelão 2 287 9 3 1 0 3 3 18 6,00
Amarelão 3 290 7 2 1 0 0 2 14 4,666
Amarelão 4 290 4 6 0 0 4 3 16 5,333
Amarelão 5 292 3 4 1 0 2 0 14 4,666
Amarelão 6 288 7 4 1 0 5 2 18 6,000
Amarelão 7 286 11 2 1 0 2 3 18 6,000
Amarelão 8 287 9 3 1 0 6 2 18 6,000
Amarelão 9 288 9 1 2 0 2 1 17 5,666
Amarelão 10 285 13 1 1 0 0 2 18 6,000
APÊNDICE
110
Tabela A11 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de abril/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 295 3 2 0 0 2 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
2 297 1 2 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
3 298 0 2 0 0 5 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
4 297 2 1 0 0 0 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
5 298 1 1 0 0 2 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
6 297 2 1 0 0 0 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
7 297 3 0 0 0 0 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
8 296 4 0 0 0 0 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
9 297 2 0 1 0 4 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
10 296 2 2 0 0 0 1 6 2,000
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 288 6 6 0 0 6 1 18 6,000
Amarelão 2 291 7 2 0 0 2 2 11 3,666
Amarelão 3 287 11 2 0 0 2 0 15 5,000
Amarelão 4 287 11 2 0 0 6 0 15 5,000
Amarelão 5 288 5 5 2 0 0 0 21 7,000
Amarelão 6 285 13 2 0 0 1 0 17 5,666
Amarelão 7 287 9 3 1 0 4 1 18 6,000
Amarelão 8 291 7 1 1 0 3 0 12 4,000
Amarelão 9 291 6 2 1 0 1 2 13 4,333
Amarelão 10 284 11 3 2 0 2 0 23 7,666
APÊNDICE
111
Tabela A12 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de maio/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 291 8 1 0 0 - - 10 3,333
Fazenda Santa Luzia
2 295 5 0 0 0 - - 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
3 299 1 0 0 0 - - 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
4 299 1 0 0 0 - - 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
5 295 5 0 0 0 - - 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
6 298 2 0 0 0 - - 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
7 299 1 0 0 0 - - 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
8 297 3 0 0 0 - - 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
9 294 5 1 0 0 - - 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
10 292 7 1 0 0 - - 9 3,000
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 289 8 3 0 0 2 2 14 4,666
Amarelão 2 289 10 1 0 0 2 0 12 4,000
Amarelão 3 288 7 3 2 0 4 0 19 6,333
Amarelão 4 293 4 3 0 0 5 1 10 3,333
Amarelão 5 289 9 2 0 0 2 0 13 4,333
Amarelão 6 291 5 3 1 0 6 1 14 4,666
Amarelão 7 282 11 3 4 0 1 1 29 9,666
Amarelão 8 293 4 3 0 0 0 0 10 3,333
Amarelão 9 286 11 3 0 0 2 1 17 5,666
Amarelão 10 282 13 5 0 0 0 0 23 7,666
APÊNDICE
112
Tabela A13 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de junho/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 293 7 0 0 0 2 1 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
2 294 6 0 0 0 1 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
3 297 3 0 0 0 1 1 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
4 296 3 1 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
5 294 4 2 0 0 3 0 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
6 293 4 3 0 0 2 1 10 3,333
Fazenda Santa Luzia
7 295 4 1 0 0 3 0 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
8 295 5 0 0 0 0 2 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
9 297 3 0 0 0 1 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
10 298 1 1 0 0 2 0 3 1,000
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 283 13 3 1 0 2 1 22 7,333
Amarelão 2 288 9 3 0 0 5 2 15 5,000
Amarelão 3 285 11 3 1 0 3 2 20 6,666
Amarelão 4 289 9 2 0 0 6 2 13 4,333
Amarelão 5 289 8 2 1 0 0 1 15 5,000
Amarelão 6 288 9 1 1 1 1 0 18 6,000
Amarelão 7 288 12 0 0 0 0 2 12 4,000
Amarelão 8 284 15 1 0 0 3 0 17 5,666
Amarelão 9 286 9 5 0 0 4 4 19 6,333
Amarelão 10 287 9 3 0 1 5 3 19 6,333
APÊNDICE
113
Tabela A14 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de julho/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 295 4 1 0 0 3 1 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
2 296 2 1 1 0 2 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
3 297 1 1 1 0 0 1 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
4 298 0 1 1 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
5 295 3 2 0 0 1 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
6 295 5 0 0 0 0 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
7 295 3 1 0 0 2 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
8 295 4 1 0 0 2 1 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
9 295 3 2 0 0 3 1 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
10 296 4 0 0 0 3 1 4 1,333
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 288 6 4 1 1 2 6 21 7,000
Amarelão 2 288 6 5 1 0 3 2 19 6,333
Amarelão 3 286 6 7 1 0 2 2 23 7,666
Amarelão 4 286 10 4 0 0 4 1 18 6,000
Amarelão 5 285 12 2 1 0 5 2 19 6,333
Amarelão 6 290 8 1 1 0 1 3 13 4,333
Amarelão 7 293 4 2 1 0 6 2 11 3,666
APÊNDICE
114
Tabela A15 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de agosto/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 296 4 0 0 0 2 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
2 297 3 0 0 0 1 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
3 297 2 1 0 0 3 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
4 297 1 2 0 0 1 1 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
5 299 1 0 0 0 1 0 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
6 298 1 1 0 0 2 0 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
7 294 6 0 0 0 1 2 6 2,000
Fazenda Santa Luzia
8 297 1 2 0 0 2 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
9 295 5 0 0 0 3 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
10 297 2 1 0 0 1 0 4 1,333
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 295 3 1 1 0 5 2 8 2,666
Amarelão 2 292 5 2 1 0 3 0 12 4,000
Amarelão 3 284 11 5 0 0 2 2 21 7,000
Amarelão 4 288 7 5 0 0 2 0 17 5,666
Amarelão 5 291 7 2 0 0 4 0 11 3,666
Amarelão 6 286 9 5 0 0 2 1 19 6,333
Amarelão 7 288 8 4 0 0 3 0 16 5,333
Amarelão 8 282 10 8 0 0 5 3 26 8,666
Amarelão 9 286 8 5 0 1 2 0 22 7,333
Amarelão 10 286 10 4 0 0 4 1 18 6,000
APÊNDICE
115
Tabela A16 – Dados obtidos para a Tradescantia pallida no mês de setembro/2009.
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Fazenda Santa Luzia
1 298 2 0 0 0 4 0 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
2 296 3 1 0 0 0 0 5 1,666
Fazenda Santa Luzia
3 298 2 0 0 0 2 1 2 0,666
Fazenda Santa Luzia
4 299 1 0 0 0 0 0 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
5 299 1 0 0 0 2 0 1 0,333
Fazenda Santa Luzia
6 295 2 3 0 0 1 1 8 2,666
Fazenda Santa Luzia
7 296 4 0 0 0 3 0 4 1,333
Fazenda Santa Luzia
8 295 3 2 0 0 0 0 7 2,333
Fazenda Santa Luzia
9 298 1 1 0 0 2 1 3 1,000
Fazenda Santa Luzia
10 295 5 0 0 0 1 1 5 1,666
Número de MN por tétrade Grupo Amostral Lâmina
0 1 2 3 4 PNP FN ∑ MN MN/100
tétrades
Amarelão 1 287 4 5 4 0 2 2 26 8,666
Amarelão 2 291 6 3 0 0 3 1 12 4,000
Amarelão 3 291 8 1 0 0 2 3 10 3,333
Amarelão 4 287 9 4 0 0 3 1 17 5,666
Amarelão 5 288 6 6 0 0 6 2 18 6,000
Amarelão 6 289 6 3 2 0 2 1 18 6,000
Amarelão 7 298 1 0 0 1 4 0 5 1,666
Amarelão 8 292 5 3 0 0 2 2 11 3,666
Amarelão 9 275 18 5 2 0 3 1 34 11,33
Amarelão 10 287 6 5 2 0 6 0 22 7,333
APÊNDICE
116
Apêndice 2: Quantificação de metais pesados presentes na água destilada do Laboratório de Mutagênese Ambiental da UFRN, utilizada para regar as floreiras durante todos os ensaios.
Tabela A18 – Resultado da quantificação de espécimes químicas inorgânicas da
água destilada.
Químico Água destilada (mg/L)
Nitrato 0,0 Nitrito 0,0 Ferro 0,0
Cromo 0,0 Cobre 0,0 Zinco 0,0 Níquel 0,0
Chumbo 0,0
A análise da presença de espécies químicas inorgânicas, foi realizada pela
técnica de espectrofotometria, utilizando o espectrofotômetro para análise de águas
B572A (Micronal). As concentrações (mg/L) dos seguintes químicos inorgânicos
foram determinadas: cobre, cromo hexavalente (IV), chumbo, ferro, níquel, zinco,
nitrito e nitrato utilizando os seus respectivos kits (Vacu-Vials CHEMTERICS).