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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

FELIPE PORTO FIUZA

O ENVELHECIMENTO DO COMPLEXO GENICULADO LATERAL DE RATOS:

MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E RITMICIDADE DIÁRIA DE CALRETININA

NATAL – RIO GRANDE DO NORTE

2018

FELIPE PORTO FIUZA



Tese apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Psicobiologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte como

requisito parcial para obtenção do título de

Doutor em Psicobiologia (Área: Psicologia

Fisiológica)

Orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza

Cavalcante

Natal-RN, 2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de

Biociências - CB

Fiuza, Felipe Porto.

O envelhecimento do complexo geniculado lateral de ratos:

mudanças morfológicas e ritmicidade diária de calretinina / Felipe Porto Fiuza. - Natal, 2018.

92 f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.

Orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante.

Coorientadora: Profa. Dra. Rovena Clara Galvão Januário Engelberth.

1. Envelhecimento - Tese. 2. Complexo Geniculado Lateral -

Tese. 3. Estereologia - Tese. 4. Zeitgeber Time - Tese. 5.

Calretinina - Tese. I. Cavalcante, Jeferson de Souza. II.

Engelberth, Rovena Clara Galvão Januário. III. Universidade

Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 57.017.5

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

FELIPE PORTO FIUZA



Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção de título de Doutor em

Psicobiologia (Área de concentração: Psicologia Fisiológica).

Data de Aprovação: 09/11/2018

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________

Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante (Presidente)

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN

______________________________________________________________

Prof. Dr. Francisco Gilberto de Oliveira (Externo à instituição)

Universidade Regional do Cariri- URCA

______________________________________________________________

Profa. Dra. Manuela Sales Lima Nascimento (Externo à instituição)

Instituto Internacional de Neurociências Edmond e Lily Safra- IINELS

______________________________________________________________

Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd (Externo ao programa)


______________________________________________________________

Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima (Externo ao programa)


AGRADECIMENTOS

Quase 6 anos se passaram desde que cheguei em Natal pra começar o meu

Mestrado em Psicobiologia. No meu primeiro dia em Natal, ainda sem ter feito a seleção,

perguntei para o Professor Jeferson, a quem eu acabara de conhecer, se ele tinha interesse

de trabalhar comigo em um projeto de ritmos biológicos em sagui. O “Não!” que ele falou

retumbou pela sala e hoje em dia eu acho isso engraçado. Depois de pensarmos em um

projeto que de fato se encaixasse melhor nas linhas de pesquisa do laboratório fiz a seleção

e passei! O pessoal achou ousado eu ter escolhido meu código de identificação como “sem

código” na prova, mas eu simplesmente esqueci de assinar a prova mesmo (caros colículo

superior, pré-frontal e pulvinar, vamos trabalhar mais né queridos?). Como fui o único que

conseguiu tal proeza mesmo tendo assinado a lista de presença, puderam identificar que a

prova era a minha e não me eliminaram da seleção, me concedendo assim meia década de

competição pelo café da copa na Fisiologia. Sou muito grato por isso.

Ao Prof. Jeferson Cavalcante, por ter bancado o risco de me aceitar, mesmo eu

vindo de um mundo bem diferente. Pelos ensinamentos na lógica de resolver problemas e

manejar recursos. Por esses 6 anos de amizade.

À minha co-orientadora Profa. Rovena Engelberth, a mentora intelectual do projeto

que trabalhei durante toda a minha vida científica de Natal, com ela aprendi muito da

literatura e da rotina e organização laboratorial.

Agradeço ao meu amigo e mentor no exterior, Prof. Francisco Clascá que me

proporcionou uma experiencia engrandecedora ao me receber em seu laboratório e me dar

conselhos científicos e de vida.

Aos membros da banca por se disporem a vir avaliar e dar contribuições ao trabalho.

Profa. Manuela Sales, que abriu as portas para uma parceria muito proveitosa com o

instituto internacional de neurociências, Prof. Fernando Ladd, um dos poucos entendidos na

arte das trevas da estereologia que eu conheço, Prof. Gilberto Oliveira, meu ex-companheiro

de casa e um homem muito sábio e ao Prof. Ruthnaldo Lima, que me ensinou o primeiro

procedimento laboratorial de neuroanatomia que fiz e sempre esteve disponível a dar suas

contribuições ao meu trabalho.

Ao Prof. Rodolfo Cavalcanti pela amizade, parceria e por todo o incentivo.

Ao Ramon Lima, pessoa de vital importância para minha formação acadêmica e

realização do meu doutorado. Me ajudou a resolver um problema de cada vez com uma

energia inacabável e sendo uma pessoa muito agradável.

Ao Luiz Eduardo, Diana, Fernanda e Scheila que são amigos queridos para mim e

experts na hora de sair para dar uma desopilada.

Aos demais membros do Laboratório de Estudos Neuroquímicos, em especial a

Carlos e Diego, dois meninos bons que foram fazer perfusões comigo de madrugada e

experimentos no fim de semana e feriado, uma ajuda mais que necessária. A Lara, Marília,

Heloísa, Nelyane, Isabela, Aline, Sarah e Ywlliane obrigado por tornar a rotina laboratorial

mais agradável.

Ao Melquisedec Santana, meu primeiro contato em Natal e aos Profs Expedito Silva

e Miriam Costa por terem me recebido de braços abertos no Labneuro.

Aos demais professores da psicobiologia pela formação acadêmica de qualidade que

me proporcionaram.

Aos funcionários da UFRN, por manterem o ambiente propicio à produtividade.

Ao meu grande amigo Anderson Leão, sempre apto a me dar um excelente conselho

seja ele sobre meus dados ou sobre minha vida. Ao Oliveira Terceiro pela amizade desde a

quarta série que me proporcionou ouvir todas as piadas possíveis que ele faz com seu

nome. Ao Paulo Leonardo, um excelente delimitador de núcleos e companheiro de

exploração das ruas de Natal e Madrid. Aos nobres Geomar Maia, Daniel Oliveira,

Jaqueiuto, Rodolfo, Ivon e Alf, amigos de todas horas e excelentes conversadores.

Aos amigos de Fortaleza, Klausen, Pedro, Larissa, Ariana por compartilharem essa

estrada comigo desde a UECE. Agradeço ao Junior Cunha pelas ideias de piada e pelas

genialidades ocasionais. Ao Renan, Alexandre, Breno, Saulo e Gerardo agradeço o

companheirismo de sempre. Ao Vítor e Rafael pelo encontros científico-etílicos anuais.

Me gustaría aquí tambíen hacer un agradecimiento a mis amigos de Madrid. Al

Profesor Avendaño, gracias por todas las enseñanzas en anatomía, estereología y

“historiología”. A Javier, Jesus, Jose, Diana, Cesar, María, Marian, Angie, Mario, Lorena,

Mariana, Isa y Emilio, gracias por todas las risadas y buenos momentos en el departamento

de Neurociencia en UAM y en las calles de Madrid, Berlín, Glasgow, Tenerife y Las Palmas.

Aos meus pais, Carlos Alberto e Zita Fiuza por terem me fomentado, principalmente

com suporte emocional. À minha irmã Carla e ao meu cunhado Diego, obrigado pelas

ótimas conversas na nossa varanda toda sexta que eu vou em Fortaleza.

Por fim, agradeço a Júlia Trugilio, a quem eu admiro e me inspiro. Os conselhos dela

são certeiros e ficam muito melhores por estarem acompanhados de carinho, apoio,

diversão e um sentimento de parceria que sempre me faz achar que estou no lugar certo.

SUMÁRIO

Lista de Figuras………….…………………………………………………………………….…. i

Lista de Tabelas…………………………………………………………………...……………... ii

Abreviaturas………………………………………………………………………………………. iii

Resumo……………………………………………………………………………………………. iv

Abstract……………………………………………………………………………………………. v

1- INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1

1.1- AS TEORIAS DO ENVELHECIMENTO ................................................................... 2

1.2- O VIÉS E A BIOGERONTOLOGIA .......................................................................... 6

1.3- O SISTEMA VISUAL E CIRCADIANO ................................................................... 14

1.4- ENVELHECIMENTO E A HOMEOSTASE DO CÁLCIO......................................... 17

2- OBJETIVOS ................................................................................................................. 21

2.1- OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 21

2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 21

3- DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................ 22

4- CAPÍTULO 1: REGION-SPECIFIC GLIAL HYPERPLASIA AND NEURONAL

STABILITY OF RAT LATERAL GENICULATE NUCLEUS DURING AGING ..................... 24

4.1- DADOS DA REVISTA ............................................................................................ 25

4.2- MANUSCRITO DO ARTIGO .................................................................................. 26

4.3- MATERIAL SUPLEMENTAR DO CAPÍTULO 1..........................................................49

4.4- CONSIDERAÇÕES FINAIS DO CAPÍTULO 1...........................................................50

5- CAPÍTULO 2: EXPRESSÃO DE CALRETININA NOS NÚCLEOS VENTRAIS DO CGL:

EFEITO DA IDADE E CONDIÇÕES FÓTICAS ................................................................... 51

5.1- INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 52

5.2- METODOLOGIA .................................................................................................... 53

5.2.1- ANIMAIS ......................................................................................................... 53

5.2.2- PERFUSÃO E MICROTOMIA ........................................................................ 53

5.2.3- PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS ............................................................ 54

5.2.4- ESTEREOLOGIA E ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................. 55

5.3- RESULTADOS ...................................................................................................... 60

5.3.1- RITMICIDADE DIÁRIA DE CALRETININA NO CGL ....................................... 60

5.3.2- INTERAÇÃO ENTRE ZT E IDADE ................................................................. 60

5.4- DISCUSSÃO ......................................................................................................... 68

5.5- CONSIDERAÇÕES FINAIS DO CAPÍTULO 2............................................................... 72

APÊNDICE- PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA.................................... 73

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 74

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Pirâmide etária do Brasil em 1940 (em cima) e previsão para 2020 (abaixo)............................................................................ 2

Figura 2: Os marcadores de envelhecimento mais bem estabelecidos na literatura............................................................................... 6

Figura 3: Encolhimento pós-processamento diferencial de tecidos de idades diferentes leva a um viés na quantificação de densidades numéricas de células............................................. 7

Figura 4: Alterações na concentração de Ca2+ intracelular entre neurônios jovens (a) e idosos (b).............................................. 20

Figura 5: Desenho experimental da pesquisa..........................................

23

Figuras do capítulo 1 Figura 1: Delimitation of rat LGN subdivisions in a coronal brain section

processed for NeuN immunohistochemistry and Nissl counterstain………………………………………………………… 33

Figura 2: Neuronal (solid circles) and glial (open circles) cell numbers estimated by the optical fractionator in dLGN (A), IGL (B), vLGN external layer (C) and vLGN internal layer (D) of 3, 13 and 23 month-old rats (n= 5 per age group)……….…………. 35

Figura 3: Mean glia/neuron ratio within each LGN nuclei in 3, 13 and 23 month-old rats……………………………………………………… 36

Figura 4: Volumes (in mm³) obtained by Cavalieri estimator in dLGN (A), IGL (B), vLGN external layer (C) and vLGN internal layer (D of 3, 13 and 23 month-old rats (n= 5 per age group)………. 37

Figura 5: Examples of counts in each micrometer displaced from the topmost focal plane in all disectors……………………………… 49

Figuras do capítulo 2 Figura 1: Amostra (SURS) das secções contendo os núcleos ventrais

do CGL de ratos........................................................................ 55 Figura 2: Fotomicrografias em campo claro de secções processadas

por imunoistoquímica para CTb (cima) e CR (baixo)................ 56 Figura 3: Exemplos de neurônios CR+ visualizados em alta

magnificação no FIG (esquerda), GLVe (meio) e GLVI (direita) evidenciando o equador do núcleo como unidade de contagem.................................................................................... 57

Figura 4: Histogramas de contagem de células CR+ ao longo do eixo Z................................................................................................. 59

Figura 5: Fotomicrografias em campo claro de secções processadas por imunoistoquímica para CR em ratos jovens (A-E), de meia-idade (F-J) e idosos (K-O) nas diferentes condições fóticas......................................................................................... 62

Figura 6: Ritmicidade diária das células CR+ (esquerda) e efeito da idade (direita) no FIG (cima), GLVe (meio) e GLVi (baixo)........ 63

Figura 7: Imunorreatividade à CR nos núcleos ventrais do CGL em animais de 3, 13 e 23 meses perfundidos no ZT 12.................. 64

Figura 8: Correlações entre a idade e número de células CR+ no FIG (esquerda), GLVe (meio) e GLVi (direita) dentro de cada ZT (de cima a baixo, 0, 6, 12, 14, 18 respectivamente) ................. 66

Figura 9: Matriz de correlação entre o FIG, GLVe e GLVi nos ZTs 0, 6 (gráficos de cima), 12, 14 (gráficos do meio) e 18 (gráfico de baixo) ......................................................................................... 67

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais achados do efeito da idade em parâmetros morfoquantitativos obtidos com estereologia baseada em design........................................................................................ 11

Tabelas do capítulo 1 Tabela 1: Stereological parameters for optical fractionator……………………… 31 Tabela 2: Mean Coefficient of error for cell number and volumes………………. 32 Tabela 3: Mean estimated quantitative parameters in LGN subdivisions in 3,

13 and 23 months-old wistar rat………………………………………… 38 Tabelas do capítulo 2

Tabela 1: Números de células CR+ estimadas no FIG, GLVe e GLVi nos grupos de ZT e Idade......................................................... 65

ABREVIATURAS

ANOVA

Análise de variância GNR Razão glia/neurônio (Do inglês glia neuron ratio)

BNST Núcleo da estria terminal (Do inglês bed nucleus of stria terminalis)

Hc Hipocampo

CaBPs

Proteínas ligantes de Cálcio (Do inglês calcium binding proteins)

IGL Folheto intergeniculado do tálamo (Do inglês intergeniculate leaflet)

CB

Calbindina LHA

Área hipotalâmica lateral (Do inglês lateral hipothalamic area)

CGL Complexo geniculado lateral

MEA

Amigdala medial

CR

Calretinina MMN Núcleo mamilar medial do hipotálamo (Do inglês medial mammillary nucleus)

Ctx

Cortex NeuN

Proteína neuronal nuclear

dLGN

Núcleo geniculado lateral dorsal (Do inglês dorsal lateral geniculate nucleus)

NPY

Neuropeptídeo Y

DM

Núcleo dorsomedial do tálamo

NSQ

Núcleo supraquiasmático do hipotálamo

FIG Folheto intergeniculado do tálamo

PGN Núcleo prégeniculado do tálamo

GCL

Camada granular do giro dentado (Do inglês granule cell layer)

PV Parvalbumina

GFAP

Proteína glial fibrilar ácida

PVN

Núcleo paraventricular do hipotálamo (Do inglês paraventricular nucleus)

GLD Núcleo geniculado lateral dorsal

SCN

Núcleo supraquiasmático (Do inglês suprachiasmatic nucleus)

GLV Núcleo geniculado lateral ventral

SON Núcleo supraóptico do hipotálamo (Do inglês supraoptic nucleus)

GLVe Núcleo geniculado lateral ventral externo

STC Sistema de temporização circadiana

GLVi Núcleo geniculado lateral ventral interno

TGH Tracto geniculo-hipotalâmico

vLGNe Núcleo geniculado lateral ventral externo (Do inglês ventral lateral geniculate nucleus- external)

vLGNi Núcleo geniculado lateral ventral interno (Do inglês ventral lateral geniculate nucleus-internal)

VTA Área tegmentar ventral (Do inglês ventral tegmental area)

ZT Zeitgeber Time

RESUMO

O processo de envelhecimento é acompanhado por declínios funcionais no sistema visual

mesmo na ausência de quadros patológicos. Dentre os componentes desse sistema, o

complexo geniculado lateral do tálamo (CGL) é subdividido em: núcleo geniculado lateral

dorsal (GLD), folheto intergeniculado (FIG) e núcleo geniculado lateral ventral (GLV). Uma

característica desses núcleos é a imunorreatividade a proteínas ligantes de cálcio (CaBPs),

cuja expressão varia regional e diariamente de acordo com as condições de iluminação e

tem função de tamponar a concentração intracelular desse íon. Em paralelo, teorias

modernas do envelhecimento correlacionam déficits funcionais de neurônios à perda dos

mecanismos de homeostase de cálcio. Nesse sentido, o presente trabalho visa descrever

parâmetros morfoquantitativos do CGL e imunorreatividade da CaBP calretinina (CR) em

diferentes fases do dia e grupos de idade. Para isso, ratos Wistar machos foram divididos

em 3 grupos etários, sendo jovens (3 meses), meia-idade (13 meses) e idosos (23 meses).

Esses animais foram perfundidos com formalina (10%) em horas de Zeitgeber (ZTs)

correspondentes a distintas condições fóticas ao longo do dia, quais sejam: ZT 0 (transição

escuro-claro), ZT 6 (claro), ZT 12 (transição claro-escuro), ZT 14 (início do escuro) e ZT 18

(escuro). Os animais tiveram o encéfalo seccionado coronalmente e os cortes foram

processados histologicamente por imunoistoquímica para proteína neuronal nuclear (NeuN)

com contra marcação de Nissl ou imunoistoquímica para CR. Através das metodologias

estereológicas do fracionador óptico e estimador de Cavalieri, foram estimados o volume,

número de neurônios, número de células gliais, razão glia/neurônio e número de células CR-

positivas nos núcleos do CGL. Mostramos que o envelhecimento não causa alteração no

número de neurônios, mas sim aumento glial, na razão glia/neurônio e no volume de forma

região-específica no CGL. Além disso, observamos um pico de células imunorreativas a CR

na fase de claro que foi diminuído no início da fase de escuro em todos os subnúcleos do

CGL de animais jovens. Relatamos ainda uma redução idade-dependente de células CR-

positivas em todos os núcleos no ZT 12, bem como no ZT 6 no FIG e na porção externa do

GLV. Sugerimos que essas alterações estão relacionadas com a capacidade da célula em

expressar CR nesses horários específicos, uma vez que não há redução idade-dependente

significativa no número total de neurônios. A perda de ritmicidade diária de CR já pode ser

detectada na meia-idade, mas fica evidente na fase idosa, sendo as alterações na fase de

claro as mais características durante o processo de envelhecimento.

Palavras-chave: Envelhecimento, Complexo Geniculado Lateral, Estereologia, Zeitgeber

Time, Calretinina.

ABSTRACT

Normal aging is accompanied by declines in visual system even in the absence of

pathological processes. Among the components of this system, the lateral geniculate nucleus

(LGN) comprises the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN), intergeniculate leaflet (IGL)

and ventral lateral geniculate nucleus (vLGN). A characteristic of these nuclei is the

immunoreactivity of calcium binding proteins (CaBPs), which regulates the intracellular

concentration of this ion and presents a daily and regional expression. In parallel, modern

theories of aging correlates functional deficits of neurons to dysregulation of calcium

homeostatic mechanisms. In this context, the present study aims to describe quantitative

morphological parameters of LGN and immunoreactivity of the CaBP calretinin (CR) in

distinct phases of day across different age groups. Male wistar rats were divided into three

age groups: young, middle-age and aged (3, 13 and 23 months old) and perfused with

formalin (10%) in Zeitgeber times (ZTs) corresponding to distinct photic conditions, namely

ZT 0 (dark/light transition), ZT 6 (light), ZT 12 (light/dark transition), ZT 14( beginning of dark)

and ZT 18 (dark) . Then, the brains were sectioned and submitted to immunohistochemistry

for Neuronal Nuclei protein (NeuN) with Nissl counterstain or immunohistochemistry for CR.

Through the stereological methodologies of optical fractionator and Cavalieri estimator we

estimated the regional volume, neuronal and glial number, glia/neuron ratio and CR+

neuronal number in the CGL nuclei. We observed LGN neuronal numbers remained stable

during aging. However, glial numbers, glia/neuron ratio and volume increased in a region-

specific manner. In addition, we observed a peak of CR-immunoreactive cells in the light

phase that was diminished in the beginning of the dark in all LGN subnuclei of young

animals. Furthermore, we show an age-related reduction of CR+ cells in all subnuclei at ZT

12, as well as in ZT 6 of IGL and the external portion of vLGN. These reductions seem to be

due to the neuron capacity in express CR rather than neuronal loss, since no alterations

were observed in total cell numbers. The daily rhythm of CR observed in young is lost in

middle-aged and aged animals and were detected only in the light phase.

Keywords: Aging, Lateral geniculate nucleus, Stereology, Zeitgeber Time, Calretinin.

1

1. INTRODUÇÃO

A era moderna é marcada por uma revolução tecnológica que tem proporcionado um

aumento da expectativa de vida da população mundial. Essa revolução, somada à

diminuição da taxa de natalidade de países desenvolvidos e ao “baby boom” do cenário pós-

segunda guerra, levaram às pirâmides etárias de vários países das Américas, Ásia e Europa

se transformarem de uma base larga de jovens para um inchaço nas camadas superiores

correspondentes a indivíduos de meia-idade e idosos (Zaidi, 2008). Dessa forma, nos

últimos anos tem-se observado um crescente número na população idosa mundial. Isso fica

evidente no Brasil (Fig.1), uma vez que indivíduos com mais de 60 anos de idade

correspondiam a 11,7% da população em 2015, enquanto estima-se que em 2020 essa

porcentagem será de 18,8%. Essa perspectiva é ainda mais acentuada em outros países,

como na Espanha, onde mais de 30% da população terá acima de 60 anos em 2030 (ONU,

2015). Esse cenário traz impactos econômicos diversos onde, por exemplo, se estima um

crescimento de 288,8% nos gastos do sistema único de saúde com internações hospitalares

da população idosa no ano de 2030 quando comparado a 2009 no Brasil (Melo, 2011).

Nesse contexto, pesquisas visando compreender o processo de envelhecimento se

tornam muito importantes como potenciais provedoras de tecnologias para assistência da

saúde do idoso, com a finalidade de promover uma melhora na qualidade de vida em

conjunto com o aumento da expectativa de vida. Tendo em vista que um dos objetivos da

biogerontologia, ciência que estuda o processo de envelhecimento biológico, é caracterizar

alterações morfológicas que ocorrem ao longo da vida de um organismo, o presente

trabalho aborda essa temática no sistema nervoso central de ratos ao trazer uma descrição

de parâmetros morfoquantitativos, bem como da expressão da proteína calretinina em

diferentes condições fóticas, de um conjunto de núcleos situados no complexo geniculado

lateral (CGL) do tálamo que são envolvidos com a retransmissão de informação visual,

temporização circadiana e integração visuomotora. Especificamente, buscamos responder

às seguintes perguntas: Existem alterações morfoquantitativas nesses núcleos com a

idade? Existem alterações relacionadas à idade e/ou condições fóticas na expressão de

calretinina nesses núcleos?

2

Figura 1- Pirâmide etária do Brasil em 1940 (em cima) e previsão para 2020 (abaixo). Em cada

pirâmide, dados para homens são mostrados no lado esquerdo em azul e à direita, em vermelho, o

de mulheres. Números no eixo x indicam a população em valores absolutos e no eixo y a faixa etária.

Fonte: IBGE, 2013. Projeção da população por sexo e idade: Brasil 2000-2060.

1.1- AS TEORIAS DO ENVELHECIMENTO

O cerne da questão no entendimento do processo de envelhecimento é,

evidentemente, a passagem de tempo para sistemas biológicos. Medawar (1952) conceituou

então esse processo em duas subdefinições: O envelhecimento é a passagem cronológica

de tempo para um organismo associado a uma perda de função fisiológica, definida como

senescência. É importante não confundir essa definição de senescência com o processo

específico de senescência celular, sendo este um fenômeno que ocorre quando uma célula

continua viva, porém perde a capacidade de se dividir (Hayflick & Moorhead, 1961, Collado

3

et al., 2007). Notavelmente, extrai-se desses conceitos a crítica observação de que o

envelhecimento não é uma doença em si e sim um aumento na vulnerabilidade a doenças

de modo geral. Por isso, é vã a suposição muito presente na literatura, de que estudando

isoladamente doenças neurodegenerativas associadas ao envelhecimento podemos

entender os aspectos fundamentais desse processo (Hayflick, 2007).

As pesquisas em biogerontologia buscam explicar o fenômeno do envelhecimento

biológico sob o ponto de vista de duas perguntas: Por que esse processo ocorre sob uma

perspectiva evolutiva? Como esse processo se manifesta fisiologicamente? Isso configura

dois níveis de abordagem nas pesquisas da área, quais sejam: um nível distal que busca

estabelecer os tipos de pressões evolutivas que levam a esse fenótipo aparentemente

desvantajoso ser selecionado ao longo de gerações e um nível proximal que busca

descrever como genes, fatores de transcrição, proteínas, células, processos fisiológicos e

comportamentais se expressam de forma diferente ao longo do envelhecimento biológico

(Trindade et al., 2013).

Na perspectiva evolutiva, as teorias que explicam o envelhecimento são formuladas

sob três planos de fundo conceituais diferentes, como sumarizados por Arbuthnott et al.

(2016):

1. O envelhecimento é um processo adaptativo: O envelhecimento é favorável

ao fitness, de modo que a associação entre o envelhecimento e fitness é

causal.

2. O envelhecimento é um processo mal-adaptativo: O envelhecimento é

prejudicial ao fitness, mas a seleção natural não tem força para eliminar os

genes relacionados a esse processo.

3. O envelhecimento é um processo de co-ação: A relação entre fitness e

envelhecimento não é causal, porém o envelhecimento emerge como um

subproduto de um driver para outro fenótipo pela seleção natural.

As primeiras hipóteses formuladas propuseram o envelhecimento como um processo

adaptativo, assumindo a lógica de que indivíduos idosos competem com jovens por recursos

e por isso a seleção natural favorecia a eliminação dos primeiros em favorecimento dos

últimos (Weismann 1889). No entanto, essa ideia necessita de pré-requisitos que tem pouca

consistência ao considerar a literatura evolutiva atual. O primeiro, é que nesse caso a

seleção natural atua a nível de grupo e não de indivíduo. Apesar de que há precedentes de

propostas de seleção de grupo, como a seleção de parentesco de Hamilton, elas identificam

mecanismos neodarwinianos que justificam o favorecimento do fitness do grupo em

detrimento do individual, o que não foi formulado na ideia do envelhecimento adaptativo. O

segundo pré-requisito é que esse modelo presume a preexistência do declínio funcional

4

atrelado ao envelhecimento, caso contrário indivíduos cronologicamente mais velhos seriam

tão valiosos para o fitness do grupo quanto indivíduos cronologicamente mais novos, o que

torna a hipótese intrinsicamente incapaz de explicar a própria origem da senescência

(Arbuthnott et al. 2016).

As hipóteses sobre a evolução do envelhecimento mais aceitas nos dias de hoje

foram formuladas nos anos 1950. Elas se baseiam no fato de que a força da seleção natural

diminui com a idade, isto é, genes que trazem características desvantajosas que se

manifestam em estágios anteriores da vida, ou mesmo antes do período reprodutivo do

animal, sofrem uma maior pressão para serem eliminados, uma vez que o animal terá

menos possibilidade de se reproduzir para transferir tal característica para a próxima

geração (Haldane, 1941, Medawar, 1952, Williams, 1957). Dessa forma, o envelhecimento

pode aparecer por um acúmulo de mutações ou por pleiotropia antagônica (Yeoman et al.,

2012). A teoria do acúmulo de mutações, formulada por Peter Medawar em 1952, postula

que o envelhecimento é ocasionado por um quadro progressivo e mal-adaptativo de

mutações cujo acúmulo se manifesta fenotipicamente em fases tardias da vida do animal e

por isso não podem ser removidas pela força da seleção natural (Medawar, 1952). Em

contraste, a hipótese da pleiotropia antagônica proposta por Williams em 1957, propõe que

o envelhecimento ocorre por uma seleção de genes que favorecem o aparecimento de

características vantajosas no início da vida do animal, mesmo que em fase tardia o mesmo

gene expresse características que sejam prejudiciais, sendo assim um processo de co-ação

(Williams et al., 1957).

Em nível proximal, a biogerontologia busca a identificação de padrões

característicos, ou marcadores, do processo de envelhecimento (Fig.2). Dentre os

marcadores mais bem estabelecidos na literatura, tem-se: instabilidade genômica, atrito nos

telômeros, alterações epigenéticas, perda de proteostase, desregulação na sensibilidade a

nutrientes, disfunções mitocondriais, senescência celular, exaustão das células tronco e

alterações na comunicação intercelular (López-Otín et al., 2013).

Embora sejam fenômenos independentes, esses eventos celulares e moleculares

são interconectados de forma hierárquica. Essa lógica leva ao agrupamento desses

marcadores em três categorias, quais sejam: Marcadores primários, antagonísticos ou

integrativos.

Os primários são eventos exclusivamente negativos e mais suscetíveis a ocorrer

inicialmente em resposta a dano progressivo acumulado ao longo do tempo. A exemplo, os

sistemas que regulam integridade estrutural proteica, sejam eles ubiquitina-proteassoma

para degradação ou os de autofagia/remodelação mediados por chaperonas, são avariados

pela influência contínua do estresse oxidativo (Calderwood et al., 2009; Koga et al., 2011;

5

Tomaru et al., 2012). O mal funcionamento desses mecanismos proporciona

proteotoxicidade e a formação de agregados proteicos característicos de doenças

neurodegenerativas associadas ao envelhecimento como Parkinson e Alzheimer (Powers et

al., 2009).

Os antagonísticos, por sua vez, são mecanismos compensatórios benéficos a curto

prazo que cronicamente se tornam prejudiciais. Na visão hierárquica, eles podem ser uma

resposta às alterações caracterizadas nos marcadores primários ou potencializados por elas

(López-Otín et al., 2013). A combinação de danos de marcadores primários e antagonísticos

resulta nos marcadores integrativos que são os principais responsáveis pelos fenótipos

associados ao envelhecimento. Por exemplo, a cada ciclo de divisão celular ocorre um

encurtamento progressivo de telômeros (marcador primário) que, ao atingir um limite de

tamanho, favorece a senescência celular (marcador antagonístico). O processo de

senescência fornece uma vantagem ao forçar a célula parar de se dividir e dificultar a

proliferação descontrolada e o desenvolvimento de câncer. No entanto, a célula continua

produzindo citocinas pro-inflamatórias (marcador integrativo) que tendem a se acumular

progressivamente intervindo negativamente no ambiente celular.

Esses marcadores permitem a comparação de variações interespecíficas no

processo de envelhecimento e explicar a grande variabilidade de expectativas de vida no

reino animal. Ademais, a identificação de marcadores moleculares possibilita o estudo de

intervenções farmacológicas com o objetivo de aumentar a expectativa de vida ou

antagonizar efeitos negativos dependentes de idade (Yeoman et al., 2012).

6

Figura 2- Os marcadores de envelhecimento mais bem estabelecidos na literatura: Instabilidade

genômica, atrito nos telômeros, alterações epigenéticas, perda de proteostase, desregulação na

sensibilidade a nutrientes, disfunções mitocondriais, senescência celular, exaustão das células tronco

e alterações na comunicação intercelular. Fonte: López-Otín et al. 2013.

1.2- O VIÉS E A BIOGERONTOLOGIA

Caracterizar o processo de envelhecimento de qualquer sistema biológico subjaz a

compreensão de como suas unidades estruturais básicas se alteram (ou não)

numericamente ao longo da vida do animal. Nesse âmbito, uma problemática na

identificação dos marcadores de envelhecimento se dá por existirem dados conflitantes de

acordo com as metodologias empregadas nos estudos. No sistema nervoso, trabalhos feitos

até o fim dos anos 1970 apontavam que reduções drásticas e globais na densidade

numérica de neurônios eram características do processo de envelhecimento em diversas

espécies (Brody, 1955, 1970; Brizee et al., 1980, Heuman e Leuba, 1983). Isso ajudou a

fundamentar afirmações de que “aos 60 anos de vida adulta o ser humano perderia metade

dos neurônios” (Hanley et al., 1974). Essa ideia de “neuron fallout”, ou seja, decaimento

neuronal idade-dependente, perdura até hoje e estabeleceu um prognóstico depressivo para

a população idosa (Bartheld et al., 2016, Bartheld, 2018).

Os estudos pioneiros supracitados se baseavam em técnicas de quantificação

morfométrica de densidade de neurônios em imagens bidimensionais de lâminas

7

histológicas, desconsiderando que estruturas reais estão sujeitas às regras de geometria

Euclidiana em um espaço tridimensional. Haug e colaboradores (1984) foram os primeiros a

fazer um contraponto ao mostrar que tecidos de diferentes idades possuíam composições

distintas de água e lipídios, de forma que sofrem um encolhimento diferencial ao serem

processados (Fig. 3). Portanto, o uso do parâmetro de densidade numérica, ou seja, célula

por área, traz um viés à investigação já que o tecido jovem encolhe mais que o idoso

fazendo com que existam menos células colapsadas por área neste em relação àquele

(Haug et al., 1984).

Figura 3- Encolhimento pós-processamento diferencial de tecidos de idades diferentes leva

a um viés na quantificação de densidades numéricas de células. Fonte: Long et al., 1999.

Até meados dos anos 1980, quantificar densidades era o padrão da neuroanatomia

quantitativa. Apesar disso, já existia uma disciplina, então com poucos adeptos, que

advogava pela combinação de métodos de geometria estocástica e estatística para

aumentar o rigor das amostragens e possibilitar a estimativa de estruturas em 3D analisando

amostras em 2D. Atualmente essa disciplina, denominada estereologia, continua com

poucos adeptos, mas é aplicada nas mais diversas situações de quantificação de forma,

desde quantificar número de células, volumes de núcleos, tamanho de vasos a

conectividade de estruturas (West, 2012).

Técnicas estereológicas antigas usadas para quantificar o parâmetro de número total

de partículas se enquadravam na classificação de “estereologia baseada em modelo”. Para

esse fim, o observador se valia de modelos pré-determinados para corrigir a natureza

enviesada do experimento. Nessa época não existiam métodos para garantir que cada

8

célula fosse contada uma única vez e que todas as células tivessem a mesma probabilidade

de serem amostradas, condição chamada de isotropia. Dessa forma, eram usados fatores

de correção que supunham o tamanho, distribuição e esfericidade das partículas analisadas

para ajustar a estimação. Assim, apesar da eliminação dos vieses referentes à quantificação

de densidades, a estereologia baseada em modelo trazia em si outro viés intrínseco por não

ser livre de suposições (Long et al., 1999; Bartheld et al., 2016).

Com o objetivo de quantificar o número de células de maneira não enviesada, Sterio

em 1984 dá uma grande contribuição à neuroanatomia quantitativa publicando o primeiro

método de “estereologia baseada em design”. Em comparação com a baseada em modelo,

a estereologia baseada em design estabeleceu regras específicas a priori para garantir a

isotropia das partículas contadas. A referida técnica de Sterio, por exemplo, consistia em

fazer secções finas (menos de 10µm pós-processamento) de tecido histológico e analisa-las

em pares usando frames de contagem com zonas de exclusão e inclusão. Dessa forma,

uma célula contada que aparecia numa zona de inclusão em uma secção era eliminada se

aparecesse no seu par e assim por diante. Esse princípio foi denominado de “disector”

sendo uma alusão às duas (“di”) secções (“sector”) que eram comparadas.

Atualmente, com o desenvolvimento de microscópios e softwares mais sofisticados,

a mesma lógica do disector de Sterio é aplicada para secções grossas (mais de 10µm pós-

processamento) com a diferença que ao invés de pares de secções físicas são usados

múltiplos planos focais ópticos, obtidos ao vivo através de mover o foco entre os pontos de

topo e de baixo do espécimen. Nesse caso, as células são registradas em um frame de

contagem tridimensional que também é chamado de disector. Em resumo, os métodos de

estimação de células podem ser classificados em físicos: secções finas comparadas em

pares ou ópticos: secções grossas analisadas em distintos planos focais.

As formas de estimar células são ainda classificadas em duas outras categorias,

quanto ao tipo de estimador matemático usado. Ambas estimações dependem, em maior ou

menor grau, do princípio do fracionador (Equação 1). Esse princípio basicamente diz que se

for possível medir um parâmetro (𝑥) em uma fração (𝑓) conhecida de uma amostra não

enviesada, então a divisão do valor medido pela fração é uma estimação válida desse

parâmetro para toda a população (�̂�).

�̂� =𝑥

𝑓 (Eq. 1)

De acordo com o fracionador, se o material histológico tiver sido coletado de forma

sistemática onde se saiba exatamente a ordem e a distância entre as secções, é possível

criar amostras uniformes e aleatórias para estimar parâmetros quantitativos, como número

de células, em frações do tecido mesmo que este tenha sido seccionado em um plano de

corte de orientação preferencial- como o plano coronal. Esse tipo de amostragem é definido

9

como SURS, do inglês “systematic uniform random sampling” e é pré-requisito para

inúmeros tipos de estimações estereológicas, em especial de número de células

(Gundersen e Jensen, 1999).

Uma das formas matemáticas de estimar número é calcular a densidade numérica de

partículas (Nv) e multiplicar pelo volume de referência (Vref) da região inteira. O termo

disector pode ser aplicado, outra vez, para definir esse método que também é conhecido

como NvVref. O volume de referência pode ser obtido através de outro estimador, baseado

numa inferência derivado do princípio estabelecido pelo matemático Cavalieri de que o

volume de qualquer sólido, mesmo que irregular, pode ser calculado multiplicando a área da

base pela altura. O estimador de Cavalieri (Equação 2) consiste então em dividir a estrutura

em frações de série das secções e sobrepor um grid de pontos de distância (conhecida

entre pontos), sendo, portanto, discernida a área associada a cada ponto (𝐴𝑝). Assim, a

soma de pontos (𝑃𝑖) que se sobrepõem à estrutura multiplicada pela área associada por

ponto equivale a área da base de cada secção enquanto a altura corresponde à espessura

de corte (𝑡̅) do tecido. O volume estimado da região (�̂�) será calculado pelo somatório de

cada área da base por altura pelo intervalo (𝑚′) entre cada secção amostrada (Gundersen e

Jensen, 1987).

�̂� = 𝐴𝑃𝑚′𝑡̅(∑ 𝑃𝑖

𝑛

𝑖=1

) (Eq. 2)

A outra forma é aplicar totalmente o princípio do fracionador e contar partículas em

frações do material histológico. O experimentador primeiramente estabelece uma fração de

cortes (“serial sampling fraction” ou ssf) a serem usados, por exemplo 1 a cada 4 cortes.

Depois, as bordas da região são delimitadas no eixo XY através das ferramentas de

desenho e contorno do software e é estabelecida uma fração de área (“area sampling

fraction” ou asf), por exemplo 20% da área contornada, onde serão postos aleatoriamente

os frames de contagem. No caso da técnica específica do fracionador óptico (Equação 3), é

necessário ainda medir a espessura pós-processamento em alta magnificação e designar a

altura do disector, ou seja, o tamanho do frame de contagem no eixo Z. Isso permite

estabelecer uma fração de volume (“height sampling fraction” ou hsf) através da divisão da

altura pela espessura. O número total de células (�̂�) será estimado através da multiplicação

do somatório do número de partículas contadas (𝑄−) pela magnitude em que ssf, asf e hsf

são extrapolados para equivaler a 100% da população (West et al., 1991).

�̂� = ∑ 𝑄− .

1

𝑠𝑠𝑓.

1

𝑎𝑠𝑓.

1

ℎ𝑠𝑓

(Eq. 3)

10

Sumarizando o exposto, os métodos de estereologia baseada em design para

estimar número de células são os seguintes:

1. Disector físico: Secções finas, comparadas em pares e estimação pelo

método NvVref.

2. Disector óptico: Secções grossas, uso de frame tridimensional em múltiplos

planos focais ópticos e estimação pelo método NvVref.

3. Fracionador físico: Secções finas, comparadas em pares e estimação

através de frações.

4. Fracionador óptico: Secções grossas, uso de frame tridimensional em

múltiplos planos focais ópticos e estimação através de frações.

Com o advento dos métodos estereológicos não enviesados de contagem de células,

começam a ser publicados dados de que alterações no número de células do sistema

nervoso central em animais idosos são muito discretas e restritas a certas regiões (Tabela

1), sendo que na maioria dos núcleos do encéfalo não se configuram como perda

significativa e não justificam déficits cognitivos (West, 1993; Burke & Barnes, 2006). Para

ilustrar, nas subunidades hipocampais do giro dentado, hilus, CA3/2, CA1 e subiculum não

foram reportadas alterações em camundongos, escandentes ou macaco rhesus (Calhoun et

al., 1998; Keuker et al., 2003, 2004, Woodruff-Pak et al., 2010). Em cães, foram reportadas

reduções apenas no hilus (Siwak-Tapp et al., 2008) e em humanos, foram reportadas

reduções em CA1, subiculum e hilus (Simic et al., 1997; West et al., 1993). Além disso, os

estudos estereológicos puderam também contribuir para entender como a idade afeta

diferencialmente os gêneros onde, entre várias outras observações, foi relatado que o

número de micróglia aumenta com a idade em CA1, giro dentado e núcleo da estria terminal

em camundongos fêmeas, mas não em machos (Mouton et al., 2002; Perkins et al., 2018).

Recentes trabalhos empregando a nova metodologia do fracionador isotrópico

(Herculano-Houzel & Lent, 2005) reportam perdas globais de neurônios no encéfalo

(Morterá & Herculano-Houzel, 2012, Fu et al., 2015). Esses trabalhos, contudo,

desconsideram as variações inter-regionais que existem e suas interpretações precisam ser

muito cuidadosas, caso contrário podem estar substituindo o viés da metodologia de

contagem pelo viés da interpretação global dos achados.

11

Tabela 1. Principais achados do efeito da idade em parâmetros morfoquantitativos obtidos

com estereologia baseada em design. Dados descritos por espécie, região analisada,

gênero, variação de idade e tipo de célula.

Espécie Região Gênero Idade Célula Resultado Referência

Humano Neocortex Ambos 18-93 anos Neurônio Redução de 9,5% em ambos os

sexos

Pakkenberg & Gundersen

1997

Humano Neocortex Ambos 18-93 anos Oligodendrócito Redução em machos

Pelvig et al. 2008

Astrócito Sem alterações

Microglia Aumento em machos

Glia/Neurônio Sem alterações

Humano Hc (GCL, Hilus, CA3/2, CA1, Subiculum)

Ambos 16-52 e 71-99 anos

Neurônio Redução em CA1 e

subiculum

Simic et al. 1997

Humano Hc (GCL,Hilus, CA3/2, CA1 e Subiculum)

Machos 13-85 anos Neurônio Redução em hilus e

subiculum

West et al. 1993

Humano Complexo amigdaloide

Ambos 20-75 anos Neurônio Sem alterações García-Amado &

Prensa 2012 Glia Aumento no núcleo

acessório basal dorsal

Humano Núcleo mamilar medial

Machos 17-88 anos Neurônio Sem alterações Begega et al. 1999

Glia Sem alterações

Humano Substância negra Machos 19-92 anos Neurônio Pigmentado Redução Cabello et al. 2002

Humano Substância negra Ambos 50-91 anos Neurônio Sem alterações Lorenzo-Alho et al. 2016

Célula granular Sem alterações

Humano Substância negra pars compacta

Ambos 0- 88 anos Glia Aumento até o primeiro ano

sem mais alterações

Jyothi et al. 2015

Humano Locus coeruleus Machos 19-43 e 65-78 anos

Neurônio Pigmentado Sem alterações Mouton et al 1994

Humano Locus coeruleus Machos 49-98 anos Neurônio Pigmentado Sem alterações Ohm et al 1997

Humano Cerebelo (Vermis e lobos anterior,

posterior e FlocNo)

Machos 19-84 anos Célula granular Redução de 40% no lobo

anterior

Andersen et al 2003

Célula de Purkinje Redução de 40% no lobo

anterior

Humano Gânglio vestibular Ambos 2-88 anos Neurônio Redução Park et al 2001

Macaco rhesus

Area 17 Ctx (camadas

supragranular, Granular e

infragranular)

Ambos 7.4-31 anos Neurônio Sem alterações Giannaris e Rosene, 2012

Glia Aumento na camada

infragranular

12

Macaco rhesus

Area V1 Ctx (camadas IVb e VI)

Ambos 7-11 e 26-32 anos

Neurônios IVb Sem alterações Hof et al 2000

Célula de Meynert Sem alterações

Macaco rhesus

Area 46 e 8A Ctx (camadas II-IV e V-

VI)

Ambos 11.0 e 25.4 anos

(média)

Neurônio Redução na Area 8A

Smith et al 2004

Macaco rhesus

Ctx entorrinal camada II

Ambos 1-2, 8-12 e 25-32 anos

Neurônio Sem alterações Gazzaley et al 1997

Macaco rhesus

Ctx entorrinal camadas II, III e

V/VI

Ambos 8.2-15.3 e 20.4-28.7

anos

Neurônio Sem alterações Merril et al 2000

Macaco rhesus

Hc (GCL do DG) Ambos 6.1-31.5 anos

Célula granular Aumento Ngwenya et al 2015

Macaco rhesus

Hc (Subiculum, CA1, CA2, CA3,

Hilus, DG)

Machos 0-4 e 18-31 anos

Neurônio Sem alterações Keuker et al 2003

Macaco rhesus

Hipotálamo (SCN, SON, PVN, DM, VM, MMN, LHA)

Ambos 6.5-31 anos Neurônio Aumento no PVN de Machos

Roberts et al 2012

Glia Aumento no PVN de Machos

Macaco rhesus

Substância negra e VTA

Ambos 9-10, 14-17 e 22-29

anos

Microglia Sem alterações Kanaan et al 2010

Rato Area 17 e Ctx pré-frontal medial

Ambos 2.5-3 e 19-22 meses

Neurônio Redução camada V/VI do mPFC ventral em Machos

Yates et al 2008

Rato PVN, BNST,MEA e Hc (CA1, CA3 e

DG)

Ambos 3 e 18 meses

Microglia Aumento na MEA em ambos sexos, Aumento em BNST e DG

em fêmeas

Perkins et al 2018

Microglia Ramificada/quiescente

Aumento na MEA em ambos sexos, Aumento em BNST e DG

em fêmeas

Microglia ativada Aumento na MEA em ambos sexos, Aumento em BNST e DG

em fêmeas, Aumento no

PVN de machos

Rato Amígdala basolateral

Ambos 20 dias, 35 dias, 3 e 19-

22 meses

Neurônio Sem alterações Rubinow & Juraska 2009

Rato Complexo geniculado lateral

(dLGN, IGL, vLGNe e vLGNi)

Machos 3, 13 e 23 meses

Neurônio Sem alterações Fiuza et al 2017

Glia Aumento no dLGN e IGL

13

Glia/Neurônio Aumento no dLGN, IGL e

vLGNi

Rato SCN Ambos 1,6,12,18,24 e 30 meses

Neurônio Sem alterações Madeira et al 1995


Rato Núcleo ventromedial do

hipotálamo

Ambos 6 e 24 meses

Neurônio Sem alterações Madeira et al 2001

Camundongo Hc (CA1 e DG) Machos 2, 14 e 28-31 meses

Neurônio Piramidal Sem alterações Calhoun et al 1998

Camundongo Hc (DG, CA1 e Hilus)

Machos 4-5, 13-14, 27-28 meses

Microglia Sem alterações Long et al 1998


Camundongo Hc (DG e CA1) Ambos 3-4, 13-14 e 20-24 meses

Microglia Aumento no DG e CA1 de fêmeas

Mouton et al 2002

Astrócito Aumento no DG e CA1 de fêmeas

Camundongo Cerebelo e Hc NA 4,8,12,18 ou 24 meses

Célula de Purkinje Redução Woodruff-Pak et al 2010

Neurônio piramidal Sem alterações

Camundongo Cerebelo Machos 4,8,12,18 e 25 meses

Célula de Purkinje Redução de 12 a 25 meses

Kennard et al 2013

Musaranho Hc (Subiculum, CA1, CA2, CA3,

Hilus)

Machos 0.9-1.4 e 4.6-9.0 anos

Neurônio Sem alterações Keuker et al 2004

Preá Gânglio cervical superior

Machos 0, 1, 12 e 36 meses

Neurônio mononucleado

Sem alterações Ladd et al 2012

Paca Gânglio cervical superior

Machos 0, 45 dias, 2 anos e 7

anos

Neurônio mononucleado

Aumento em animais de 7

anos

Melo et al 2009

Neurônio binucleado Sem alterações

Cachorro Hc (GCL,Hilus, CA3, CA2, CA1 e Subiculum) e EC

Ambos 3.4-4.5 e 13.0-15.0

anos

Neurônio Redução em hilus

Siwak-Tapp et al 2008

Pombo Hc região triangular e bulbo olfatório

Ambos 1, 2, 6, 12 , 24-36, 72-84 e 144-

168 meses

Neurônio Aumento em Hc trangular e redução no

bulbo olfatório

Meskenaite et al. 2016

14

1.3- O SISTEMA VISUAL E CIRCADIANO

Em paralelo com os danos estocásticos cumulativos que mal adaptativamente

originam o processo de envelhecimento, a passagem de tempo implica também que

organismos biológicos sejam ajustados por meio de mecanismos adaptativos. Isso fica claro

ao percebermos, por exemplo, que os sistemas de memória que permitem cruzar

experiencias do passado para tomar decisões no presente ou planejar o futuro não fariam

sentido num universo atemporal.

Um outro exemplo de como os seres vivos estão adaptados à passagem de tempo

diz respeito aos ritmos biológicos. O movimento de rotação da Terra faz com que os

organismos estejam submetidos a uma estimulação sensorial cíclica de claro e escuro com

período de 24 horas. Dessa forma, padrões antecipatórios de comportamento, fisiologia e

atividade bioquímica fornecem uma vantagem adaptativa por possibilitarem uma execução

temporal otimizada de funções (Bell-Pedersen et al., 2005). De fato, essa ciclicidade de luz-

escuro existe desde antes dos primeiros organismos vivos sendo a principal pista temporal

(ou Zeitgeber) a qual eles estão sincronizados e um forte driver para a seleção natural.

Para ilustrar o argumento acima é útil a observação de que os seres

fotossintetizantes primitivos dependiam da luz absorvida para gerar ATP ao passo que

sofriam dano ultravioleta (UV), prejudicial à estrutura do DNA (Pittendrigh, 1993). Na

cianobactéria Synecchocus elongatus, é visto que a proteína KaiC tem maior expressão

durante a fase de claro e se hexameriza com moléculas de ATP formando um complexo que

auxilia a compactação do DNA para evitar danos UV. Em adição, esse ATP preso à

conformação estrutural proteica fica mais disponível para ser gasto durante a noite, quando

os hexâmeros se desfazem, em conjunto com a redução na expressão de KaiC, o que se

traduz em economia energética (Simons, 2009). Exemplos como esse de ritmicidade em

nível molecular estão presentes em todos os seres vivos (Hut & Beersma, 2011).

Os estudos em cronobiologia, disciplina científica que investiga os ritmos biológicos,

descrevem uma rede interligada de estruturas anatômicas responsáveis por organizar

fisiologicamente esses ritmos, sendo definida como o sistema de temporização circadiana

(STC). O principal componente do STC no sistema nervoso central de mamíferos é o núcleo

supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo, que recebe informação fótica diretamente da retina

e tem função de gerar e modular o ritmo através das informações sensoriais, sincronizando

assim padrões fisiológicos de outros núcleos do sistema nervoso e órgãos periféricos

(Dibner et al., 2010).

Potenciais explicações de como o STC está relacionado com o envelhecimento

incluem as observações de que ele está envolvido em inúmeros processos de regulação

15

metabólica, tais como regulação de espécies reativas de oxigênio (Green et al., 2008), da

produção de melatonina (Skene & Swab, 2003), do sistema de reparo do DNA (Kang et al.,

2009) e das atividades de autofagia (Sachdeva & Thompson, 2008). Kondratova &

Kondratov (2012) explicam que esses processos, se desregulados, podem levar a um

aumento do estresse oxidativo e tendência à formação de agregados proteicos que levam à

neurodegeneração e diminuição da função cognitiva, fenômenos relacionados ao

envelhecimento. Dessa forma, existe um delicado equilíbrio onde tanto o envelhecimento

afeta negativamente o STC quanto o STC, à medida que funciona normalmente, retardada a

senescência (Kondratova & Kondratov, 2012; Hood & Amir, 2017).

O STC, que tem como maior influência a luz captada pela retina, tem uma relação

anatômica muito próxima com o sistema visual, onde muitos estudos sobre o processo de

envelhecimento são focados. Parte desse interesse da biogerontologia pelo sistema visual

se dá pelo fato de que muito se conhece sobre os seus aspectos morfológicos e fisiológicos

básicos, o que favorece um bom embasamento teórico para interpretar suas alterações

(Spear, 1993). Além disso, mesmo na ausência de condições patológicas indivíduos idosos

possuem déficits na acuidade visual (Owsley, 2011) e redução na sensibilidade de contraste

a frequências espaciais médias e altas (Derefeldt et al., 1979, Crassini et al., 1988). Sendo

assim, os estudos da área buscam estabelecer correlações entre tais disfunções e

alterações anatômicas e fisiológicas nos componentes do sistema visual, tais como: olho,

retina, nervo óptico, complexo geniculado lateral (CGL) e áreas corticais (Spear, 1993).

Nesse âmbito, mudanças bem documentadas foram descritas no cristalino, mostrando que

nessa região ocorre acúmulo de pigmentos que reduzem a absorção de luz azul, causam

amarelamento e perda de transparência da lente com a idade (Petrash, 2013). Perdas de

células ganglionares da retina, bem como nas aferências retinianas para núcleos do sistema

nervoso central também foram documentadas em animais idosos (Harwerth et al. 2008,

Fiuza et al., 2016, Engelberth et al., 2017). Nos neurônios do córtex visual primário, parece

não ocorrer perda no número de neurônios em idades avançadas, entretanto reduções na

seletividade a orientação e direção foram reportadas em conjunto com aumento de

excitabilidade (Peters & Sethares, 1993; Schmolesky et al., 2000; Giannaris & Rosene,

2012).

O CGL é um ponto interessante para investigações de envelhecimento, uma vez que

a mesma região anatômica possui distintas subdivisões relacionadas à formação de imagem

e a funções visuomotoras e circadianas. Esse núcleo subdivide-se em: Núcleo geniculado

lateral dorsal (GLD) que retransmite informação da retina para o córtex visual primário;

Folheto intergeniculado (FIG), que se projeta pra o Núcleo supraquiasmático (NSQ) do

hipotálamo a fim de ajustar a fase em resposta estímulos fóticos e não-fóticos; Núcleo

16

geniculado lateral ventral (GLV) que se projeta para o colículo superior e áreas pré-tectais

estando envolvido em atenção visual e reflexos visuomotores (Cosenza et al., 1984; Morin,

2013). Apesar de alguns estudos quantificarem a variabilidade ao longo do período de vida

de parâmetros morfológicos, tais como número de neurônios e glia no GLD, essas

descrições são limitadas a poucas espécies e fazem uso de métodos mais antigos de

estereologia baseada em modelo (Satorre et al., 1985; Ahmad & Spear, 1993; Diaz et al.,

1999).

O GLD é o mais conhecido componente talâmico da via visual primária e único

componente do CGL que é advindo do tálamo dorsal. Em primatas e mamíferos carnívoros

essa estrutura é organizada em camadas, o que não é observado em roedores (Jones,

2007). Existem dois tipos de neurônios no GLD: neurônios de projeção excitatórios

glutamatérgicos, que se projetam para o córtex visual primário, e interneurônios inibitórios

GABAérgicos. Apesar da aferência mais importante (do tipo “driver”) para esse núcleo ser a

retina, projeções retinianas apenas compreendem cerca de 5 a 10% dos inputs sinápticos

que o GLD recebe. Em maior quantidade estão os inputs do tipo “modulator” advindos da

camada 6 do córtex visual, núcleo reticular do tálamo e colículo superior (Jones, 2007;

Bickford, 2016).

O FIG e o GLV são os núcleos do tálamo ventral componentes do CGL. Ambos

os núcleos têm grande quantidade de neurônios GABAérgicos, possivelmente estando

presente em 100% dos neurônios do FIG (Moore & Speh 1993). Encefalina, substância P,

NADPH-diaforase, neuropeptídio Y (NPY), calbindina, calretinina são outras características

neuroquímicas das populações neuronais dos 2 núcleos, sendo as 3 últimas proteínas

particularmente úteis na delimitação do FIG (Harrington, 1997; Cavalcante et al., 2008).

As principais conexões do FIG são a projeção que ele recebe da retina e a que

ele origina para o NSQ. A projeção retiniana para o FIG não tem organização retinotópica e

parece informar sobre o comprimento da fase de claro, uma vez que apenas pulsos

prolongados de luz causam expressão constante da proteína codificada pelo gene de

expressão imediata c-fos, um marcador de atividade celular (Edelstein & Amir, 1996). A

comunicação FIG-NSQ, ou tracto geniculo-hipotalâmico (TGH), é oriunda majoritariamente

de células que contêm NPY e GABA e promove o “reset” de fase do NSQ (Edelstein & Amir,

1999). Em adição, a entrada de informação proveniente do colículo superior, complexo pré-

tectal e núcleo dorsal da rafe embasa a sugestão que a função circadiana do FIG reside na

integração de estímulos fóticos e não fóticos, como de informação metabólica, excitação e

novidades ambientais, para ajustar a sincronização do NSQ. É importante reforçar que o

FIG se conecta no total com cerca de 100 áreas cerebrais, a maioria destas conexões sendo

17

recíproca, e por isso a real dimensão da sua participação em sistemas funcionais

permanece pouco elucidada (Morin, 2013).

Citoarquitetonicamente, o GLV pode ser subdivido em dois componentes: Um

componente externo (GLVe), situado em uma porção mais lateral que recebe projeções da

retina e apresenta células grandes, por isso sendo chamado de camada magnocelular do

GLV; um componente interno (GLVi), situado em uma porção mais medial, não recebe

projeções da retina e apresenta células menores, sendo por isso referido como subdivisão

parvocelular do GLV (Niimi, 1963, Harrington, 1997).

O GLV tem um padrão de conexões muito similar ao FIG. Contudo, as projeções

retinianas são restritas ao GLVe e apenas neurônios do GLVi compõem o TGH. As

conexões mais evidentes do GLV, no entanto, são as projeções recíprocas para o colículo

superior. Na realidade, segundo Matute & Streit (1985) o GLV é o maior contribuidor

talâmico de projeções para o colículo superior e todas as camadas deste núcleo recebem

inputs daquele. Diferente do FIG, tanto o GLVe e o GLVi recebem projeções de neurônios

piramidais da camada 5 de áreas do córtex visual relacionadas à percepção de movimentos

ajustada pelas sacadas (Schiller & Tehovnik, 2001). Em conjunto com a conhecida conexão

recíproca com o complexo pré-tectal, esses dados sugerem que o GLV participe da atenção

visual guiada e funções visuomotoras, como o reflexo pupilar a luz e nistagmo optocinético

(Harrington, 1997).

Apesar de classicamente o FIG e GLV serem definidos como estruturas

independentes em roedores, Jones (2007) argumenta que não há critérios anatômicos

suficientes para considerá-los assim, uma vez que eles compartilham o mesmo tipo de

neurotransmissores e tem uma coincidência hodológica muito grande. De fato, Harrington

(1997) define o FIG como o núcleo talâmico que: 1) recebe projeções bilaterais da retina, 2)

se conecta com o FIG e GLV contralateral e 3) se projeta para o NSQ. Como exposto acima,

todos esses critérios também estão presentes nas subunidades do GLV. Ademais, estudos

sobre a citoarquitetura do núcleo pré-geniculado (PGN) de primatas, considerado homólogo

ao FIG e GLV de roedores e localizado curiosamente numa posição dorsal ao GLD,

mostram que as fronteiras dos 3 subnúcleos não são óbvias de modo que através da

densidade e tamanho de células alguns trabalhos classificaram o PGN em 2 subdivisões

enquanto outros o fizeram em 3 (Niimi et al., 1963; Babb et al., 1980; Lima et al., 2012). No

entanto, uma análise neuroquímica detalhada revela que ele é dividido em 3 lâminas e cada

uma tem características mais correlatas a uma subunidade específica do FIG, GLVe ou

GLVi (Lima et al., 2012).

1.4- ENVELHECIMENTO E A HOMEOSTASE DO CÁLCIO

18

Dentre as teorias proximais do envelhecimento, a hipótese da homeostase do cálcio

(Ca2+) tem especial importância no âmbito das neurociências, tendo em vista o papel

funcional desse íon para o sistema nervoso central. Essa teoria postula que grande parte,

possivelmente a totalidade, de déficits funcionais apresentados por neurônios durante o

processo de envelhecimento são promovidos por um desequilíbrio nos mecanismos que

regulam concentrações intracelulares de Ca2+, o que geralmente resulta em acúmulo desse

íon dentro da célula e modifica suas cascatas de sinalização (Landfield, 1987; Alzheimer’s

Association Calcium Hypothesis Workgroup, 2017) .

A hipótese da homeostase do cálcio é particularmente corroborada por achados de

que em neurônios jovens o glutamato estimula receptores AMPA e Canais de Ca2+

dependente de voltagem (VGCC) a despolarizar a célula, causando desbloqueio do íon Mg2+

dos receptores NMDA. O Ca2+ que entra pelos receptores NMDA está envolvido em vias

diferentes do Ca2+ que entra pelos VGCC, a primeira via relacionada a mecanismos de

potenciação de longo prazo e a segunda via estimula receptores de Rianodina (RyR) do

retículo endoplasmático liso a liberar mais Ca2+ no meio intracelular para estimular os canais

de K+ a liberar esse íon para o meio extracelular afim de hiperpolarizar a célula e reverter o

potencial de repouso. No entanto, em neurônios idosos o desbloqueio do Mg2+ não ocorre,

favorecendo uma entrada preferencial de Ca2+ pelos VGCCs que por sua vez estimulam

mais ainda os RyRs, resultando em um acúmulo desproporcional de Ca2+ no meio

intracelular. Esse acúmulo vai sinalizar intermitentemente a saída de K+ dos canais iônicos,

mantendo um constante estado de hiperpolarização e consequente diminuição de

excitabilidade neuronal (Fig.4) (Foster, 2007; Yeoman et al., 2012)

Nesse contexto, uma classe especial de proteínas que se ligam ao Ca2+ para regular

a sua concentração intracelular ganhou destaque em estudos de envelhecimento e doenças

neurodegenerativas no início dos anos 1990 (Iacopino & Christakos, 1990; Heizmann &

Braun, 1992). Tais proteínas ligantes de Ca2+ (CaBPs), sendo a Calbindina (CB), a

Calretinina (CR) e a Parvalbumina (PV) as mais bem documentadas (Baimbridge et al.,

1992; Cavalcante et al., 2008), se distribuem diferencialmente nos núcleos encefálicos o que

as tornam boas marcadores de sub-regiões e indicadoras de populações neuronais

específicas (Celio, 1990). No CGL, por exemplo, a presença de CB e CR são características

marcantes de parte neurônios dos FIG, estando presentes também no GLV, mas aparecem

em pouquíssimas quantidades no GLD (Jones, 2007). Já a proteína PV está presente, em

moderadas quantidades, apenas em neurônios da porção externa do GLV e demarca

densamente terminais axônicos no GLD e GLV, estando completamente ausente no FIG.

19

Reduções no número de células CB e CR positivas, foram observadas no córtex

somatossensorial de camundongos, ratos e gerbils enquanto o número de células PV

positivas aumentou em animais idosos quando comparados a adultos (Ahn et al., 2017).

Além disso, os níveis de proteína e número de células CB e CR positiva também são

reduzidos em subunidades no colículo inferior e núcleo geniculado medial em ratos das

linhagens Long Evans e Fischer 344 (Ouda et al., 2012). É proposto que tal redução idade-

dependente na expressão das CaBPs pode agravar ainda mais o acúmulo intracelular de

cálcio pelo prejuízo nos seus mecanismos de tamponamento (Fig.4). Por essas

características, especula-se que tais proteínas podem desempenhar um papel neuroprotetor

área-específico, sendo candidatas em potencial a serem utilizadas como marcadores

biológicos do processo de envelhecimento e possíveis alvos para intervenções

farmacológicas anti-envelhecimento (Geula et al., 2003; Moyer Jr et al., 2011).

Um ponto interessante e pouco estudado dessas proteínas é que, em alguns núcleos

do encéfalo, elas têm variações de expressão relacionadas a distintas condições fóticas do

dia, fenômeno referido como ritmicidade diária (Arvanitogiannis et al., 2000; Cayetanot et al.,

2007; Campos et al., 2015a, Moore, 2016). No NSQ de ratos, por exemplo, há mais células

CR positivas em animais avaliados na fase de claro do que na fase de escuro (Moore et al.

2016). Diferenças estatísticas de número de neurônios expressando CB, CR ou PV em

distintas condições fóticas também foram reportadas em subunidades do núcleo geniculado

medial, na camada granular do giro dentado e nas camadas polimórfica e piramidal do

hipocampo no primata Sapajus apella (Campos et al., 2015a, 2015b).

Essas variáveis de cronobiologia têm sido muito pouco exploradas no âmbito de

pesquisas do envelhecimento. Apesar de muitos neurotransmissores terem expressão

rítmicas ao longo do dia, eles são investigados apenas em um horário restrito, o que pode

trazer conclusões enviesadas. Para exemplificar, no trabalho de Cayetanot et al. (2007), a

quantificação de células imunorreativas à CB no NSQ tem uma tendência não significativa

de aumento em Microcebus murinus idosos quando comparados a jovens no começo da

fase de claro. Entretanto, no começo da fase de escuro ocorre tendência não significativa de

aumento de células que expressam CB em jovens quando comparados a idosos. Em um

cenário hipotético de que as tendências se configurassem em diferença estatística, 2

pesquisas distintas restritas a cada um desses horários poderiam chegar a 2 diferentes

conclusões. Esse é o caso da maioria das pesquisas atuais. Apesar de isso não tirar sua

validade, por explicarem os dados na hora analisada, é necessário ter cautela para não

transformar uma observação feita em um horário específico em um panorama geral do

fenômeno.

20

Figura 4- Alterações na concentração de Ca2+ intracelular entre neurônios jovens (a) e idosos (b). Em

animais jovens a despolarização induzida pela ação do glutamato em receptores AMPA leva a uma

entrada de cálcio por receptores NMDA, ao serem desbloqueados pelo magnésio, e canais de cálcio

dependentes de voltagem (VGCC) que estão associados à hiperpolarização da célula e sinalização

para o cálcio armazenado no reticulo endoplasmático liso se deslocar ao citoplasma. Em animais

idosos, o bloqueio de magnésio do receptor NMDA perdura e o cálcio entra preferencialmente por

VGCCs induzindo tanto uma hiperpolarização prolongada quanto um acúmulo de cálcio no

citoplasma. Em paralelo, proteínas ligantes de cálcio (CaBPs) tem expressão reduzida com a idade

potencializando o acúmulo desproporcional de cálcio no citoplasma. Adaptado de Yeoman et al.

2012.

21

2- OBJETIVOS

2.1- OBJETIVO GERAL

• Descrever parâmetros morfológicos quantitativos gerais e a expressão de

CR em horários de diferentes condições de iluminação no GLD, FIG e GLV de ratos

jovens, de meia-idade e idosos.

2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Capítulo 1:

• Quantificar o número de neurônios, glia, razão glia/neurônio e volume do

GLD, FIG e GLV de ratos jovens, de meia-idade e idosos através de análises

estereológicas.

Capítulo 2:

• Quantificar a distribuição de células imunorreativas à CR nos núcleos

ventrais do CGL em períodos de claro (ZT 6), de escuro (ZT 14 e ZT 18) e nas faixas de

transição, escuro-claro (ZT 0) e claro-escuro (ZT 12) em ratos jovens, de meia-idade e

idosos através de análises estereológicas;

• Verificar possíveis interações entre o fator horário e o fator idade na

imunorreatividade à CR nos núcleos do CGL.

22

3- DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O trabalho consiste em dois capítulos, quais sejam: Capítulo 1) Descrição

morfológico-quantitativa do CGL em animais jovens, de meia-idade e idosos; Capítulo 2)

Análise da imunorreatividade de CR em distintas condições fóticas nos núcleos ventrais do

CGL em animais jovens, de meia-idade e idosos (Fig.6).

No capítulo 1, secções do CGL de 15 animais (N=5 por grupo etário) foram

submetidas à imunohistoquímica de NeuN com coloração de Nissl como contramarcador

para serem descritos parâmetros até então não reportados na literatura, tais como volume

dos núcleos, número total de neurônios e células gliais, razão glia/neurônio e possíveis

diferenças relacionadas à idade. Esses dados foram analisados através de técnicas de

estereolgia baseada em design, onde foram empregados o fracionador óptico e estimador

de Cavalieri para a estimação do número de células e volume dos núcleos, respectivamente.

No capítulo 2, os animais dos 3 grupos etários foram estudados em 5 momentos

distintos do dia, referentes às condições de iluminação como agente sincronizador, ou

zeitgeber. Dessa forma, os animais foram estudados em 5 horas de zeitgeber (ZT, do inglês

Zeitgeber Time) sendo elas: ZT 0, correspondendo às 06:00 horas - momento que as luzes

do biotério acendiam; ZT 6, 12:00 horas - condição de claro; ZT 12, 18:00 horas - momento

onde as luzes se apagavam; ZT 14, 20:00 horas – inicio da condição de escuro; ZT 18,

00:00 horas- meio da condição de escuro (N = 4 grupo etário/ZT). A escolha desses horários

se deve à possibilidade de comparação com outros trabalhos da literatura (Campos et al.

2015a; 2015b; Moore, 2016) e por representar tanto condições de iluminação (ZT 6) e

escuro (ZT 14 e ZT 18), quanto as faixas de transição escuro-claro (ZT 12) e claro-escuro

(ZT 0). Dessa forma, os subnúcleos do CGL, excetuando-se o GLD uma vez que ele

praticamente não apresenta células CR+, foram processados por imunoistoquímica para

CR, tendo número total de células analisados pelo fracionador óptico para comparação entre

os grupos.

23

Fig. 5- Desenho experimental da pesquisa

.

24

4- CAPÍTULO 1: REGION-SPECIFIC GLIAL HYPERPLASIA AND NEURONAL

STABILITY OF RAT LATERAL GENICULATE NUCLEUS DURING AGING

Apresentação: Com o objetivo de lançar dados inéditos sobre as propriedades

morfométricas básicas do CGL e sua relação com o processo de envelhecimento,

publicamos o artigo “REGION-SPECIFIC GLIAL HYPERPLASIA AND NEURONAL

STABILITY OF RAT LATERAL GENICULATE NUCLEUS DURING AGING“ (DOI:

10.1016/j.exger.2017.11.001) em 15 de dezembro de 2017 na revista Experimental

Gerontology, volume 100, páginas 91-99. Nesse capítulo, apresentamos o manuscrito do

artigo, material suplementar e considerações finais sobre os achados.

https://doi.org/10.1016/j.exger.2017.11.001

25

4.1- DADOS DA REVISTA

NOME: Experimental Gerontology

EDITORA: Elsevier

ISSN: 0531-5565

FATOR DE IMPACTO (2 ANOS): 3.2 - JCR 2017

QUALIS: Psicologia- A2

ESCOPO: “Experimental Gerontology is a multidisciplinary journal for the publication of work

from all areas of biogerontology, with an emphasis on studies focused at the systems level

of investigation, such as whole organisms (e.g. invertebrate genetic models), immune,

endocrine and cellular systems, as well as whole population studies (e.g. epidemiology).

The journal also publishes studies into the behavioural and cognitive consequences

of aging, where a clear biological causal link is implicated. Studies aimed at bridging the gap

between basic and clinical aspects of gerontology, such as papers on the basic aspects

of age-related diseases, are welcomed, as is research orientated toward the modulation of

the aging process. Original research manuscripts, special issues, short reports, reviews,

mini-reviews, and correspondence are published. Manuscripts on social aspects of aging and

reports on clinical studies do not fall within the scope of the journal.”

26

4.2- MANUSCRITO DO ARTIGO

REGION-SPECIFIC GLIAL HYPERPLASIA AND NEURONAL STABILITY OF RAT

LATERAL GENICULATE NUCLEUS DURING AGING

Felipe P. Fiuzaa, Antônio Carlos A. Queiroza, Diego A. Câmaraa, José Rodolfo L. P.

Cavalcantib, Expedito S. Nascimento Júniorc, Ramon H. Limaa, Rovena Clara G. J.

Engelbertha, Jeferson S. Cavalcantea.

a- Laboratory of Neurochemical Studies, Department of Physiology, Biosciences Center,

Federal University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal, RN, Brazil.

b- Laboratory of Experimental Neurology, Department of Biomedical Sciences, Health

Science Center, University of State of Rio Grande do Norte, 59607-360, Mossoró, RN,

Brazil

c- Laboratory of Neuroanatomy, Department of Morphology, Biosciences Center, Federal

University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal, RN, Brazil

Corresponding author: Felipe P. Fiuza

Address: Department of Physiology, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande

do Norte, 59072-970, Natal, RN, Brazil

Phone: +55 85 988918950

E-mail: [email protected]

27

ABSTRACT

The normal aging process is accompanied by functional declines in image-forming and

non-image forming visual systems. Among the components of these systems, the thalamic

lateral geniculate nucleus (LGN) offers a good model for aging studies since its three

anatomical subdivisions, namely dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN), intergeniculate

leaflet (IGL) and ventral lateral geniculate nucleus (vLGN), receives light information from

retina and projects to different brain areas involved in visual-related functions. Nevertheless,

there is very little data available about quantitative morphological aspects in LGN across

lifespan. In this study, we used design-based stereology to estimate the number of neurons,

glial cells, the glia/neuron ratio and the volume of the LGN of wistar rats from 3, 13 or 23

months of age. We examined each LGN subdivision processed by immunohistochemistry for

NeuN and Nissl counterstain. We observed no significant age-related neuronal loss in any

nuclei and a 21% and 33% significant increase in dLGN and IGL glial cells of 23 month-old

rats. We also observed the glia/neuron relation increases in dLGN of 13 month-old rats and

in dLGN, IGL and vLGN internal portion of 23 month-old ones. Moreover, we report an age-

related increase in IGL volume. These results show region-specific glial hyperplasia during

aging within LGN nuclei, perhaps due to compensatory responses to inflammation. In

addition, we observed the glia/neuron ratio as a more sensitive parameter to quantify age-

related alterations. Hence, we provide an updated and expanded quantitative

characterization of these visual-related thalamic nuclei and its variability across lifespan.

Keywords: Aging; Lateral geniculate nucleus; Stereology; NeuN;

Immunohistochemistry; Glia/neuron ratio

28

Introduction

Classical morphometric approaches aim to quantify histochemical features in 2

dimensional images, despite real anatomical structures follows Euclidean geometry rules

within a 3 dimensional space. In neuroscience, the bias of these methods led to

misinterpretations of important quantitative aspects of nervous system structure, notably

regarding the brain aging process (Long et al., 1999; von Bartheld et al., 2016). While early

studies of brain aging reported a major loss of neuronal number in several species (Brody,

1955; Brody, 1970; Ordy et al., 1978; Brizzee et al., 1980; Heumann and Leuba, 1983),

further investigations using unbiased stereological methods for cell counting stated there is

no profound loss of neural cells in most brain nuclei (Madeira et al., 1995; Rapp and

Gallagher, 1996; Giannaris and Rosene, 2012; Roberts et al., 2012). Even so, recent works

point to age-related global reductions in neuronal number of entire regions such as

hippocampus of rats and mice (Morterá and Herculano-Houzel, 2012; Fu et al., 2015).

Probably, these global findings reflect the sum of several non-significant alterations with

significant changes restricted to certain sub-regions. Thus, studying this process in a region-

specific manner is crucial to describe in detail the anatomical correlates of aging impacts on

nervous system.

It is noteworthy that several of brain aging quantitative morphological studies are

focused on the visual system components, such like retina (Esquiva et al., 2017), optic nerve

(El-Sayyad et al., 2014), visual cortex (Yates et al., 2008; Giannaris and Rosene, 2012) and

thalamus (Satorre et al., 1985; Ahmad and Spear, 1993; Diaz et al., 1999). The latter, in

rodents, encloses the lateral geniculate nucleus (LGN) which is subdivided in three distinct

nuclei, namely dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN), the intergeniculate leaflet (IGL) and

the ventral lateral geniculate nucleus (vLGN). The vLGN is even further subdivided in an

external (vLGNe) lateral layer and an internal layer (vLGNi) located in a medial portion of

vLGN (Niimi et al., 1963; Mitrofanis, 1992; Harrington, 1997). Although these three nuclei

receive light information from retinal efferent projections, only the dLGN has a well-

established part in visual sensory information relay to the cerebral cortex. Alternatively, IGL

and vLGN are associated to the non-image forming visual system, in which IGL projects to

hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN) to adjust circadian rhythmicity and vLGN is

involved in visuomotor functions such as pupilary reflexes (Harrington, 1997; Horowitz et al.,

2004; Morin, 2013). Thus, from an anatomical perspective, the LGN offers a good model to

understand the aging impact in visual-related functions since in the same brain region are

nuclei involved with distinct aspects of visual and circadian systems.

29

Despite the morphological and neurochemical properties of LGN nuclei are fairly

known, few studies addressed how this morphology is affected by the aging process in

quantitative parameters, especially in IGL and vLGN (Fiuza et al., 2016). Thus, we undertook

a design-based stereological study to determine the volume, total neuron number, total glial

number and the numeric relationship between glia and neurons of LGN subfields in 3, 13 and

23 months-old rats.

Material and Methods

Experimental subjects

A total of 15 adult male wistar rats were housed in cages at 22 ºC, 50% humidity in a

12:12 h light/dark cycle with food and water freely available. These animals were studied at

the ages of 3, 13 or 23 months (n=5 per age). All procedures were in accordance with

Brazilian law number 11.794/2008 for animal experimental use. All experiments were

approved by local ethic committee for animal use (CEUA-UFRN number 054/2015).

Tissue fixation

All animals were firstly anesthetized with sodium thiopental (40mg/kg). Then, they

were transcardiac perfused with a 300 ml NaCl solution (0.9%) followed by 300 mL formalin

(10%) in a 0.1 M phosphate buffer (PB, pH 7.4). Following perfusion, the brains were

removed, post-fixed with the same fixative overnight and cryoprotected in a solution

containing 30% sucrose with 0.1 M PB (pH 7. 4) for 3 days. Then, brains were cut into

coronal sections (50 µm) in a cryostat and the sections were sequentially collected in 96

well plates filled with antifreezing solution to be stored at -20°C until use.

Immunohistochemistry

Representative sections of LGN (See stereology topic for sampling details) were

submitted to free-floating immunohistochemistry. Firstly, the sections were previously

blocked for endogenous peroxidase activity in 0.3% hydrogen peroxide. Then, sections

were incubated overnight with monoclonal mouse anti-NeuN primary antibody (MAB 377,

Millipore) in a dilution containing 2% bovine serum albumin with 0.1 M PB in solution with

0.4% Triton X-100 (PBTX 0.4%). After rinsing, sections were incubated with biotinylated

goat anti-mouse secondary antibody (115-065-003, Jackson ImmunoResearch) diluted with

PBTX 0.4%. Then, sections were incubated in a 0.5% avidin-biotin solution (Vectastain

standard ABC kit, PK-4000, Vector Laboratories), with 2.3% NaCl addiction, for 120

minutes. Then, brain sections were placed with a 2.5% solution of diaminobenzidine (DAB)

diluted with 0.1M PB. The final reaction was performed adding a 0.01% H2O2 solution, to

30

reveal marked areas in brown colors resulting from DAB oxidation. The brain sections were

mounted in gelatinized slides, dried, counterstained for Nissl substance with a 0.1% cresyl

violet solution, dehydrated in graded ethanol solutions, cleared in xylene and coverslipped

with DPX embedding matrix.

Antibody characteristics

The antibody used in this study (Clone A60, MAB 377, Millipore) was generated in

mouse brain cell nuclei and recognizes both 46 and 48-kDa isoforms of Neuronal nuclei

protein (NeuN). This antibody is sensitive and specific for neurons and is widely used to

quantify neurons in animals, from similar or distinct age groups, since it provides highly

correlated neuronal numbers with those obtained by Nissl technique (Wolf et al., 1996;

Gittins and Harrison, 2004; Giannaris and Rosene, 2012). Prior to experiments, we

performed pilot studies to establish optimal antibody concentration and incubation time. Also,

we addressed negative controls by incubating sections with no addition of primary antibody.

In these cases, we observed no immunoreactivity.

Stereology

Unbiased stereological analyses were performed in an optical microscope

(AxioImager Z2, Carl Zeiss) fitted with an X-Y motorized staged, Z encoder and camera

(CX 9000, MBF Bioscience). Prior to estimation of volume and cell number, a pilot study

was performed in order to establish optimal parameters of section fraction, counting frame

area, grid spacing size and disector height. Accordingly, we used a 1/4 section sampling

fraction (ssf), corresponding to approximately 5 IGL and 6 dLGN and vLGN sections from

an average of 24 LGN sections identified by an experienced researcher following the 6th

edition of the rat brain atlas from Paxinos and Watson (2007) and the anatomical

descriptions of Niimi et al. (1963). Thus, our systematic uniform random sampling (SURS)

was established by randomly choosing the first section and analyzing every other LGN

section in a 200 µm interval. All sections were blind-coded, so the experimenter had no

information regarding the animal age in the stereological procedures. The estimation of cell

numbers and volume were performed bilaterally in each LGN sub-nuclei.

Regions of interest

The combination of NeuN immunohistochemistry and cresyl violet counterstain for Nissl

substance allowed us to distinguish the borders of each LGN subdivision. Considering there

are no other nucleus lateral to LGN, the lateral boundary was evident and used to define the

external contour of nuclei. In addition, the medial boundary was also clear to define since it is

delimited by the superior thalamic radiation (str). We established the border between dLGN

31

and IGL by the change in density and orientation of cells. Furthermore, strong NeuN

immunoreactivity was observed at low magnification in vLGNe, which was used to distinguish

from both IGL and vLGNi (Figure 1a). These features were consistent delimitation points

within the rostrocaudal extension. At rostralmost levels, dLGN and vLGN appears as small

clusters of cells positioned dorsal to reticular thalamic nucleus. At intermediate levels both

dLGN and vLGN enlarges and are divided by IGL. At caudal levels the medial portion of IGL

projects ventrally and fuses with Zona Incerta caudal portion (ZIc).

Estimation of neuron and glial numbers

Numbers of glial cells and neurons were estimated by the optical fractionator method

(West et al., 1991). For these estimations, we firstly outlined the LGN subdivisions with a

low magnification objective (2.5x) and counted cells at high magnification. We identified

cells labeled with NeuN in association with Nissl staining as neurons and Nissl-only cells as

glia. Nissl stained endothelial cells were easily identified and excluded from counting and

we only counted cells with evident nucleolus within the inclusion zone of the disector

(Figure 1b). Based on our pilot study, we determined a minimum of 200 counted cells to

obtain reliable results. To achieve the minimum cell number for counting, we used a 40 x 40

µm counting frame with a grid spacing size of 250 x 280 µm in dLGN, 70 x 70 µm in IGL

and 80 x 200 in vLGN subfields within our 1/4 ssf. We calculated the area sampling fraction

(asf) as a result of the counting frame area divided by grid spacing area. Each post-

shrinkage section thickness (t) was calculated by focusing at the topmost of tissue and

slightly moving down to the bottommost focus point to measure the distance moved in Z

axis. We observed an average value of 15 µm for t and set the disector height (h) at 12 µm

with 1.5 µm guard zones above and below. A summary of the parameters used in optical

fractionator analysis is present in Table 1. The coefficient of error (CE) was calculated

following Gundersen et al. (1999) with smoothness class m=1. All CEs for optical

fractionator were below 0.1 (Table 2).

Table 1. Stereological parameters for optical fractionator

ROI SSF Counting

frame area (µm)

Grid spacing (µm)

Disector height (µm)

Average mounted thickness

(µm)

Mean sections counted

dLGN 1/4 40x40 250x280 12 16 6 IGL 1/4 40x40 70x70 12 16 5

vLGNe 1/4 40x40 80x200 12 16 6 vLGNi 1/4 40x40 80x200 12 16 6

ROI: Region of interest; ssf: section sampling fraction; dLGN: Dorsal lateral geniculate nucleus; IGL:

Intergeniculate leaflet; vLGNe: External layer of lateral geniculate nucleus; vLGNi: Internal layer of

lateral geniculate nucleus.

32

Table 2. Mean Coefficient of error for cell number and volumes

ROI Age

(months)

Mean CE for neuronal number

Mean CE for glial number

Mean CE for volume

dLGN 3 0.09 0.09 0.02

13 0.09 0.09 0.02

23 0.09 0.09 0.02

IGL 3 0.08 0.07 0.03

13 0.08 0.07 0.03

23 0.09 0.07 0.03

vLGNe 3 0.08 0.08 0.02

13 0.08 0.08 0.02

23 0.08 0.08 0.02

vLGNi 3 0.09 0.09 0.02

13 0.09 0.09 0.02

23 0.09 0.09 0.02

ROI: Region of interest; CE: Coefficient of error (Gundersen, m=1); dLGN: Dorsal lateral geniculate

nucleus; IGL: Intergeniculate leaflet; vLGNe: External layer of lateral geniculate nucleus; vLGNi:

Internal layer of lateral geniculate nucleus.

After obtain cell counts (Q-) in LGN, the total number of cells (N) was estimated by the

optical fractionator equation (West et al., 1991):

𝑁 = ∑ 𝑄− .𝑡

ℎ.

1

𝑎𝑠𝑓.

1

𝑠𝑠𝑓

After obtaining total estimation of neurons and glial cells, we calculated the glia/neuron

ratio (GNR) dividing the total glial number for the neuronal number.

33

Figure 1- A) Delimitation of rat LGN subdivisions in a coronal brain section processed for

NeuN immunohistochemistry and Nissl counterstain. Scale bar = 400 µm. B) Representative

disector of 40 x 40 µm dimensions within a 12 µm height with distinct focal planes. We

identified the NeuN brownish stain associated with Nissl substance as neurons (stealth

arrows) and the Nissl-only cells as glia (arrowheads). Examples of cells excluded for

counting, e.g. hitting the exclusion zone of disector or nucleolus not identifiable, are pointed

by open arrows. The upper line indicates the border with adjacent nuclei outlined in lower

magnification. Scale bar = 20 µm.

Volume estimation

Volume of each LGN nuclei was obtained by the Cavalieri estimator as described by

Gundersen and Jensen (1987). Based on our pilot study, we superimposed a grid of 100 x

100 µm in dLGN and a grid of 50 x 50 µm in IGL and vLGN subdivisions of evenly

separated points to count the hits within our regions of interest observed with a 5x objective

34

lens. All Gundersen CEs (m=1) for Cavalieri estimates were below 0.1 (Table 2). We used

the following equation to estimate the volume of LGN nuclei:

𝑉 = 𝐴𝑝 𝑚′𝑡 (∑ 𝑃𝑖

𝑛

𝑖=1

)

Where V= total volume estimated; Ap= area associated per point; m’= section

evaluation interval; t = section cut thickness and Pi is the number of points counted in the

grid.

Statistical analysis

We performed a Kolmogorov-Smirnov test to assess the normality of our group

distributions. As we observed all distributions as normal, a one-way analysis of variance

(ANOVA) followed by the Tukey’s test for post hoc comparisons were conducted to compare

the effect of age in number of neurons and glial cells, GNR and volume of each LGN nuclei.

In all analyses, differences were considered significant at p < 0.05 and data are expressed

as mean ± standard deviation (SD). Data analyses were performed with the software

GraphPad prism version 6.0.

Results

Total numbers of neuron and glial cells

We report the mean optical fractionator estimations of neuronal and glial number from

each age-group in Table 3. There were no age-related alterations in neuronal number of

dLGN [F (2, 12) = 1.481; p =0.266; Figure 2a]; IGL [F (2, 12) = 1.745; p= 0.216; Figure 2b];

vLGNe [F (2, 12) = 0.009; p= 0.991; Figure 2c] or vLGNi [F (2, 12) = 0.188; p= 0.831; Figure

2d]. Conversely, the glial number of dLGN increased [F (2, 12) =4.309; p= 0.039; Figure 2a]

in 23 month-old (m.o) animals (54,029 ± 6,530) when compared to 3 m.o ones (42,721 ±

6,437). Similarly, a significant increase of glial cells in IGL was observed [F (2, 12) = 4.403;

p=0.037; Figure 2b] between 3 (6,184 ± 658) and 23 months of age (9,248 ± 2,017). In dLGN

and IGL the Tukey’s test for multiple comparisons reveal no significant differences in glial cell

number between 13 and the other age groups. Moreover, no age-related alterations of glial

cell number were observed in vLGNe [F (2, 12) = 0.123; p= 0.886; Figure 2c] or vLGNi [F (2,

12) =0.417; p= 0.668; Figure 2d].

35

Figure 2- Neuronal (solid circles) and glial (open circles) cell numbers estimated by the

optical fractionator in dLGN (A), IGL (B), vLGN external layer (C) and vLGN internal layer (D)

of 3, 13 and 23 month-old rats (n= 5 per age group). Each point represents one individual. *

significance at p<0.05.

Glia/neuron ratio

The GNR of LGN nuclei is given in Table 3. We observed an significant age-related

increase in GNR of dLGN [F(2,12)=16.78; p= 0.0003], IGL [F(2,12)=11.18; p= 0.0018] and

vLGNi [F(2,12)=4.28; p= 0.0396; Figure 3]. Although we did not report significant alterations

in dLGN neuronal or glial numbers of 13 m.o animals, the multiple comparison analysis of

GNR points an increase in both 13 (1.07 ± 0.06) and 23 m.o rats (1.2 ± 0.12) in comparison

with 3 m.o ones (0.89 ± 0.05). In IGL, we observed a non-significant tendency towards

increase (p=0.06) in glia per neuron of 13 m.o rats (1.5 ± 0.41) and a significant increase

between 3 (1.1 ± 0.11) and 23 months of age (1.9 ± 0.19). No age-related alterations of GNR

were observed in vLGNe [F (2, 12) =0.07; p=0.92]. Similarly to dLGN, we report a significant

increase of GNR in vLGNi between 3 (0.9 ± 0.09) and 23 months of age (1.1 ± 0.14), in spite

of no changes in neuronal or glial numbers.

36

Figure 3- Mean glia/neuron ratio within each LGN nuclei in 3, 13 and 23 month-old rats (n= 5

per age group). Error bars refers to standard deviation. * p<0.05 compared with 3 month-old

rats.

Volume estimation

The volumes from each LGN nuclei obtained by the Cavalieri estimator are present in

Table 3. In dLGN, we observed a non-significant trend towards to volume increase [F (2, 12)

= 3.598; p =0.0597; Figure 4a]. Accordingly, the Tukey’s post hoc test indicated no

differences in dLGN volume between 3 (1.12 ± 0.11 µm³), 13 (1.13 ± 0.10 µm³) and 23

months of age (1.28 ± 0.11 µm³). The analysis of IGL revealed a significant effect of age in

volume enlargement [F (2, 12) = 4.122; p= 0.0434; Figure 4b] with post hoc test indicating

differences in 23 m.o animals (0.13 ± 0.02) when compared with 3 m.o ones (0.10 ± 0.01),

despite both age groups do not differ from 13-month group (0.12 ± 0.02). Furthermore, no

age-related changes in volume were observed in vLGNe [F (2, 12) = 1.242; p= 0.3234;

Figure 4c] and vLGNi [F (2, 12) = 0.8352; p= 0.4575, Figure 4d].

37

Figure 4- Volumes (in mm³) obtained by Cavalieri estimator in dLGN (A), IGL (B), vLGN

external layer (C) and vLGN internal layer (D of 3, 13 and 23 month-old rats (n= 5 per age

group). Each point represents one individual. * significance at p<0.05.

38

Table 3. Mean estimated quantitative parameters in LGN subdivisions in 3, 13 and 23

months-old wistar rat.

Parameter Age (Months) dLGN IGL vLGNe vLGNi

Number of neurons

3 48,157 ± 5,174 5,679 ± 650 17,710 ± 1,922 14,054 ± 2,620

13 43,446 ± 4,493 5,361 ± 777 17,642 ± 2,539 13,815 ± 3,003

23 44,882 ± 3,478 4,831 ± 743 17,881 ± 3,875 12,959 ± 3,257

Number of glial cells

3 42,721 ± 6,437 6,184 ± 658 19,842 ± 3,420 11,954 ± 3,435

13 46,317 ± 5,668 8,738 ± 2,163 20,246 ± 4,382 14,289 ± 3,310

23 54,029 ± 6,530* 9,248 ± 2,017*

21,014 ± 3,525 14,303 ± 4,047

GNR 3 0.89 ± 0.05 1.10 ± 0.11 1.14 ± 0.28 0.91 ± 0.09

13 1.07 ± 0.06* 1.55 ± 0.41 1.15 ± 0.09 1.03 ± 0.02

23 1.20 ± 0.12* 1.90 ± 0.19* 1.19 ± 0.04 1.10 ± 0.06*

Volume (mm³) 3 1.12 ± 0.11 0.10 ± 0.01 0.32 ± 0.03 0.23 ± 0.01

13 1.13 ± 0.10 0.12 ± 0.02 0.32 ± 0.03 0.22 ± 0.03

23 1.28 ± 0.11 0.13 ± 0.02* 0.36 ± 0.06 0.24 ± 0.04

All values expressed as mean ± standard deviation.

*P<0.05 in one-way ANOVA followed by Tukey’s test for multiple comparisons.

GNR: Glia/neuron ratio; dLGN: Dorsal lateral geniculate nucleus; IGL: Intergeniculate leaflet;

vLGNe: External layer of lateral geniculate nucleus; vLGNi: Internal layer of lateral geniculate

nucleus.

Discussion

In this study, we present the first quantitative description of morphological parameters

in the whole LGN nucleus of wistar rat. It should be mentioned there were previous

quantifications of dLGN volume and numbers of neurons and glial cells in other rat strain

(Satorre et al., 1985), so was reported the volume and neuronal cell number in dLGN of the

same rat strain (Diaz et al., 1999). However, as the latter study did not assess glial cell

numbers and consequently glial/neuron relation, relevant quantitative aspects of Wistar rat

dLGN remained nondescript until now. Importantly, we used design-based stereological

analyses and an immunohistochemistry for neurons widely used in the current literature

which facilitates comparisons with other studies. To the best of our knowledge, there are no

data regarding total cell numbers or volume in IGL or vLGN in any species. Thus, we provide

an updated and expanded characterization of these visual-related thalamic nuclei and its

variability across lifespan.

Histochemical considerations

39

The definition of non-obvious boundaries between nearby brain nuclei and

differentiation of small neurons from glial cells are two major difficulties underlying

morphometrical analyses using the conventional stains for Nissl substance (Gittins and

Harrison, 2004). To address these problems, a previous work (Giannaris and Rosene, 2012)

used the combination of NeuN immunohistochemistry and Nissl counterstain to quantify age-

related changes in the number and volume of primary visual cortex in rhesus monkeys. The

authors report this methodology provides an easy qualitative identification of cortical layers

and cell-specific counting for neurons and glia. In accordance with their findings, we

observed that differences in neuron and glial densities reflected in differential NeuN and Nissl

stainings of LGN nuclei which allowed a clear definition of our regions of interest. This was

particular useful in the determination of IGL borders, which are not clear to identify in the

material processed only by Nissl staining (Moore and Card, 1994). Besides, neurons were

well characterized with the brownish NeuN staining surrounded by Nissl substance in

distinction with Nissl-only glial cells. Such advantages in counting cell-specific types and

region delimitation corroborate this histological processing as a powerful tool in studies of

quantitative morphology.

Age-related alterations in cell numbers of LGN nuclei

We found no age-related neuronal loss in any subdivision of LGN. Correspondingly, in

distinct animal models a neuronal number stability has been reported during aging in several

brain regions, such as dLGN (Satorre et al., 1985; Ahmad and Spear, 1993); visual cortex

(Giannaris and Rosene, 2012); suprachiasmatic, supraoptic, paraventricular, dorsomedial,

ventromedial and medial mamillary hypothalamic nuclei (Begega et al., 1999; Madeira et al.,

2001; Roberts et al., 2012); amygdaloid complex (García-Amado and Prensa, 2012) and

CA1, CA2, CA3 and dentate gyrus of hippocampus (West, 1993; Rapp and Gallagher, 1996;

Keuker et al., 2003; Keuker et al., 2004). However, Diaz et al. (1999) found a 24% neuronal

number reduction in dLGN of 18 months-old wistar rats when compared with 3 months-old

ones, but no alterations from 18 months onwards. Although we also observed a mean

reduction in dLGN neurons of 13 and 23 m.o rats in comparison with 3 m.o ones, it did not

reach statistical significance. Such subtle variation between these findings may be attributed

to differences in stereological procedures. The latter study calculated neuronal number by

the product of volume for neuronal density obtained by the model-based stereological

method of Weibel and Gomez (1962), that uses volume correction factors which might be

affected by the size and orientation of the objects counted (Mouton, 2011). In turn, the

present work uses the design-based stereological method of the optical fractionator, which

consists in the combination of the fractionator sampling scheme with the physical disector

methodology and is unbiased in a sense that it estimates cell number regardless regional

40

volume and cellular shape, size or orientation (West et al., 1991). Nevertheless, both works

points to a stability of neuronal number in late ages. Moreover, recent works using the

isotropic fractionator methodology reports age-related neuronal number reductions in entire

brain regions, such as hippocampus, of rats and mice (Morterá and Herculano-Houzel, 2012;

Fu et al., 2015). Although this is a reliable and useful quantitative methodology for

comparative morphological studies (Bahney and von Bartheld, 2014; Herculano-Houzel et

al., 2015) global age-related alterations should be carefully interpreted since it not reflects

the regional variability. For instance, a previous work reports a neuronal reduction in hilus

and subiculum of hippocampus, even though the other hippocampal subdivisions remain

stable in the course of aging (West, 1993). Also, neuronal reductions were found in area 8A

but not in the adjoining area 46 of the aged prefrontal cortex (Smith et al., 2004). Thus, a

global analysis of entire hippocampus or prefrontal cortex would have a limitation of not

being sensitive for such regional variations.

We show a significant increase of 21% and 33% glial cell numbers in dLGN and IGL of

23 m.o rats, respectively. The absence of significant differences between both 23 and 3 m.o

rats in comparison with rats with 13 months of age indicates a gradual hyperplasia rather

than an abrupt alteration in glial cell number during the aging process. Similarly, Satorre et

al. (1985) found a 25% glial increase in dLGN of 29 m.o Sprague-Dawley rats. This is also

consistent with reports in other regions such as basolateral nucleus of rat amygdala

(Rubinow and Juraska, 2009) and infragranular layer of visual cortex in rhesus monkeys

(Giannaris and Rosene, 2012). Moreover, we observe significant GNR increases in dLGN of

13 m.o rats and in dLGN, IGL and vLGNi of 23 m.o ones in comparison with younger

animals, also resembling the data reported by Satorre et al. (1985). The fact these changes

in 13 m.o dLGN and 23 m.o vLGNi occur in spite of no significant variations in neuronal or

glial numbers indicates GNR as a more sensitive parameter for age-related alterations. In

addition, the GNR is an easier quantitative parameter to inform about development, aging

and evolutionary variations since it can be evaluated using either neuronal number or

densities, with no necessity of an unbiased stereological design (von Bartheld et al., 2016).

Our data, in which the higher GNR observed was 1.9:1 in IGL of 23 m.o rats, are also in

accordance with the current consensus (Hilgetag and Barbas, 2009; von Bartheld et al.,

2016) which contradicts previous unsubstantiated claims that GNR would vary from 10:1 to

50:1 (Kandel and Schwartz, 1985).

Regarding cell-specific glial differences, previous studies found variable alterations in

astrocyte, oligodendrocyte and microglia numbers throughout the central nervous system

during aging (Peters, 2002; Ojo et al., 2015). For instance, mRNA transcription and protein

levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP), usual marker of activated astrocytes, are

41

commonly upregulated and astrocyte morphology shifts to a fibrous state with soma

enlargement while cell numbers remain generally stable, indicating mainly astrocyte

hypertrophy rather than hyperplasia during aging (Nichols et al., 1993; Kohama et al., 1995;

Long et al., 1998; Pelvig et al., 2008; Ojo et al., 2015). The oligodendrocytes alterations are

much more heteregenous and region-specific in which increases, decreases and stability

were described (Peters and Sethares, 2004; Pelvig et al., 2008; Soreq et al., 2017).

Furthermore, increases in microglia-specific gene expression in humans (Soreq et al., 2017)

and in microglial density and cell numbers have been reported in hippocampus, cerebral

cortex and retina over the course of aging (Mouton et al., 2002; Damani et al., 2011;

Tremblay et al., 2012). These studies support the proposition that compensatory shifts in glial

cell populations during aging occur due to a chronic low-level inflammatory state, process

known as “inflammaging” (Franceschi et al., 2000; Ojo et al., 2015) which accounts for

accumulation of senescent microglial cells (Streit and Xue, 2010; Mosher and Wyss-Coray,

2014). In this context, although we did not investigate glial-specific differences, we

hypothesize the glial increase of dLGN and IGL could be at least partially due to increase in

microglial subpopulation. Since several age-related neurodegenerative disorders are also

associated with inflammatory responses (Amor et al., 2014), characterizing in more detail the

glial-specific alterations would be an interesting topic for further studies of aging.

Notably, the region-specific increases in glial cell number and GNR might reflect

selective vulnerability to aging effects within LGN nuclei. We observed a higher age-related

glial increase in IGL than dLGN or vLGN. It is noteworthy that high GFAP immunoreactivity is

a distinct feature of structures related to circadian rhythmicity such as IGL or SCN even in

young animals (Botchkina and Morin, 1995). Additionally, the aged SCN presents age-

related declines such as reductions in regulatory inputs from retina and IGL (Engelberth et

al., 2014; Engelberth et al., 2017) accompanied by increases in the microglia-associated

protein CD11b and GFAP mRNAs expression and immunoreactivity (Deng et al., 2010).

Therefore, these two central structures of circadian entrainment system ages in a

neuroinflammatory-like environment which might account for increased glial compensatory

shifts.

Age-related changes in volume of LGN nuclei

We found a non-significant trend towards to volume increase in dLGN of 23 m.o rats

and a 23% increase of IGL volume between 3 and 23 months of age. Our data corroborates

the studies of Satorre et al. (1985) and Diaz et al. (1999) since these authors only found

increases in dLGN volume of 28 months-old rats, with no significant changes between 3 and

24 months. Notwithstanding, while we report a mean dLGN volume of 1.12 mm3 in 3 m.o rats

42

and 1.28 mm3 in 23 m.o animals, Diaz et al. (1999) reports mean dLGN volumes of 1.24 mm3

and 1.41 mm3 in rats of 3 and 24 months, respectively. In addition to the different

stereological methodology discussed above, those subtle variations in estimates of dLGN

volumes might occur due to differential shrinkage of histological processing, since we used

combination of immunohistochemistry and Cresyl-violet staining whereas Diaz et al. (1999)

used the Kluver-Barrera procedure (Kluver and Barrera, 1953) for myelin and cell staining.

Such slight differences in quantitative morphological parameters due to distinct histological

processing are well reported in the literature (García-Amado and Prensa, 2012; von Bartheld

et al., 2016). Besides, we suggest age-related hypertrophy of soma and nucleus in dLGN

neurons (Ahmad and Spear, 1993; Villena et al., 1997) and the increase in dLGN and IGL

glial cell numbers are likely factors that account for these volumetric changes.

Conclusions

In summary, we describe the number of neuronal and glial cells, the quantitative

relationship between glia and neurons and the volume of each subfield within LGN across

the rat lifespan. Altogether these results indicate age-related impairments in image-forming

system, circadian synchronization or visuomotor functions are not related to neuronal losses

in subfields of LGN, though a selective regional vulnerability might occur driving

compensatory responses reflected in the observed glial and volume alterations. Furthermore,

GNR seems a more sensitive parameter to describe age-related alterations since we

observed an increase in dLGN of 13 months-old animals and vLGNi of 23 month-old ones, in

spite of no significant alterations were observed in neuronal or glial numbers in these

regions.

Conflict of interest statement

The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgements

We thank Dr. Edgard Morya and Pedro Cavalcanti from International Institute of

Neurosciences- Edmond and Lily Safra (IIN-ELS) for aiding in microscopy analyses with

structural and technical support. This work was supported by Brazilian funding agencies

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) and Coordenação

de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES).

References

Ahmad, A., Spear, P.D., 1993. Effects of aging on the size, density, and number of rhesus

monkey lateral geniculate neurons. J. Comp. Neurol. 334, 631–643.

doi:10.1002/cne.903340410

43

Amor, S., Peferoen, L., Vogel, D., Breur, M., van der Valk, P., Baker, D., van Noort, J, 2014.

Inflammation in neurodegenerative diseases- an update. Immunology 142,151-66. doi:

10.1111/imm.12233.

Bahney, J., von Bartheld, C.S., 2014. Validation of the Isotropic Fractionator: Comparison

with Unbiased Stereology and DNA Extraction for Quantification of Glial Cells. J

Neurosci Methods 222, 165–174. doi:10.1016/j.jneumeth.2013.11.002

Begega, A., Cuesta, M., Santín, L.J., Rubio, S., Astudillo, A., Arias, J.L., 1999. Unbiased

estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary

nucleus in humans. Exp. Gerontol. 34, 771–782.

Botchkina, G.I., Morin, L.P., 1995. Specialized neuronal and glial contributions to

development of the hamster lateral geniculate complex and circadian visual system. J.

Neurosci. 15, 190–201.

Brizzee, K.R., Ordy, J.M., Bartus, R.T., 1980. Localization of cellular changes within

multimodal sensory regions in aged monkey brain: possible implications for age-related

cognitive loss. Neurobiol. Aging 1, 45–52.

Brody, H., 1955. Organization of the cerebral cortex. III. A study of aging in the human

cerebral cortex. J. Comp. Neurol. 102, 511–516.

Brody, H., 1970. Structural changes in the aging nervous system. Interdisciplinary Topics in

Gerontology 7, 9– 21.

Damani, M.R., Zhao, L., Fontainhas, A.M., Amaral, J., Fariss, R.N., Wong, W.T., 2011. Age-

related alterations in the dynamic behavior of microglia. Aging Cell 10, 263–276.

doi:10.1111/j.1474-9726.2010.00660.x

Deng, X.-H., Bertini, G., Palomba, M., Xu, Y.-Z., Bonaconsa, M., Nygård, M., Bentivoglio, M.,

2010. Glial transcripts and immune-challenged glia in the suprachiasmatic nucleus of

young and aged mice. Chronobiol. Int. 27, 742–767. doi:10.3109/07420521003681498

Diaz, F., Villena, A., Gonzalez, P., Requena, V., Rius, F., Perez De Vargas, I., 1999.

Stereological age-related changes in neurons of the rat dorsal lateral geniculate nucleus.

Anat. Rec. 255, 396–400.

El-Sayyad, H.I.H., Khalifa, S.A., El-Sayyad, F.I., AL-Gebaly, A.S., El-Mansy, A.A.,

Mohammed, E.A., 2014. Aging-related changes of optic nerve of Wistar albino rats. Age

(Dordr) 36, 519–532. doi:10.1007/s11357-013-9580-5

Engelberth, R.C.G.J., Silva, K.D. de A., Azevedo, C.V. de M., Gavioli, E.C., Santos, J.R. dos,

Soares, J.G., Nascimento Junior, E.S., Cavalcante, J.C., Costa, M.S.M.O., Cavalcante,

J.S., 2014. Morphological Changes in the Suprachiasmatic Nucleus of Aging Female

Marmosets (Callithrix jacchus). BioMed Research International 2014, e243825.

doi:10.1155/2014/243825

44

Engelberth, R.C.G.J., Silva, K.D. de A., Fiuza, F.P., Soares, J.G., Costa, M.S.M.O., Lima,

R.R. de M., Nascimento, E.S. do, Santos, J.R.D., Cavalcanti, J.R.L.P., Cavalcante, J.S.,

2017. Retinal, NPY- and 5ht- inputs to the aged suprachiasmatic nucleus in common

marmosets (Callithrix jacchus). Neurosci. Res. doi:10.1016/j.neures.2017.03.005

Esquiva, G., Lax, P., Pérez-Santonja, J.J., García-Fernández, J.M., Cuenca, N., 2017. Loss

of melanopsin-expressing ganglion cell subtypes and dendritic degeneration in the aging

human retina. Frontiers in Aging Neuroscience 9. doi:10.3389/fnagi.2017.00079

Fiuza, F.P., Silva, K.D.A., Pessoa, R.A., Pontes, A.L.B., Cavalcanti, R.L.P., Pires, R.S.,

Soares, J.G., Nascimento Júnior, E.S., Costa, M.S.M.O., Engelberth, R.C.G.J.,

Cavalcante, J.S., 2016. Age-related changes in neurochemical components and retinal

projections of rat intergeniculate leaflet. Age (Dordr) 38, 4. doi:10.1007/s11357-015-

9867-9

Franceschi, C., Bonafè, M., Valensin, S., Olivieri, F., De Luca, M., Ottaviani, E., De

Benedictis, G., 2000. Inflamm-aging: An Evolutionary Perspective on

Immunosenescence. Annals of the New York Academy of Sciences 908, 244–254.

doi:10.1111/j.1749-6632.2000.tb06651.x

Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G., Watson, C., Rusznák, Z., 2015. Aging-dependent changes in the

cellular composition of the mouse brain and spinal cord. Neuroscience 290, 406–420.

doi:10.1016/j.neuroscience.2015.01.039

García-Amado, M., Prensa, L., 2012. Stereological analysis of neuron, glial and endothelial

cell numbers in the human amygdaloid complex. PLoS ONE 7, e38692.

doi:10.1371/journal.pone.0038692

Giannaris, E.L., Rosene, D.L., 2012. A stereological study of the numbers of neurons and

glia in the primary visual cortex across the lifespan of male and female rhesus monkeys.

J Comp Neurol 520, 3492–3508. doi:10.1002/cne.23101

Gittins, R., Harrison, P.J., 2004. Neuronal density, size and shape in the human anterior

cingulate cortex: a comparison of Nissl and NeuN staining. Brain Res. Bull. 63, 155–160.

doi:10.1016/j.brainresbull.2004.02.005

Gundersen, H.J., Jensen, E.B., 1987. The efficiency of systematic sampling in stereology

and its prediction. J Microsc 147, 229–263.

Gundersen, H.J., Jensen, E.B., Kiêu, K., Nielsen, J, 1999. The efficiency of systematic

sampling in stereology- reconsidered. J Microsc 193, 199-211.

Harrington, M.E., 1997. The ventral lateral geniculate nucleus and the intergeniculate leaflet:

interrelated structures in the visual and circadian systems. Neurosci Biobehav Rev 21,

705–727.

45

Herculano-Houzel, S., von Bartheld, C.S., Miller, D.J., Kaas, J., 2015. How to count cells: the

advantages and disadvantages of the isotropic fractionator compared with stereology.

Cell Tissue Res 360, 29–42. doi:10.1007/s00441-015-2127-6

Heumann, D., Leuba, G., 1983. Neuronal death in the development and aging of the cerebral

cortex of the mouse. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 9, 297–311.

Hilgetag, C.C., Barbas, H., 2009. Are there ten times more glia than neurons in the brain?

Brain Struct Funct 213, 365–366. doi:10.1007/s00429-009-0202-z

Horowitz, S.S., Blanchard, J.H., Morin, L.P., 2004. Intergeniculate leaflet and ventral lateral

geniculate nucleus afferent connections: An anatomical substrate for functional input

from the vestibulo-visuomotor system. J. Comp. Neurol. 474, 227–245.

doi:10.1002/cne.20125

Kandel E., Schwartz J., 1985. Principles of neural science, 2nd ed., Elsevier.

Keuker, J.I.H., de Biurrun, G., Luiten, P.G.M., Fuchs, E., 2004. Preservation of hippocampal

neuron numbers and hippocampal subfield volumes in behaviorally characterized aged

tree shrews. J. Comp. Neurol. 468, 509–517. doi:10.1002/cne.10996

Keuker, J.I.H., Luiten, P.G.M., Fuchs, E., 2003. Preservation of hippocampal neuron

numbers in aged rhesus monkeys. Neurobiol. Aging 24, 157–165.

Kluver, H., Barrera, E., 1953. A method for the combined staining of cells and fibers in the

nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400–403.

Kohama, S.G., Goss, J.R., Finch, C.E., McNeill, T.H., 1995. Increases of glial fibrillary acidic

protein in the aging female mouse brain. Neurobiology of Aging 16, 59–67.

doi:10.1016/0197-4580(95)80008-F

Long, J.M., Kalehua, A.N., Muth, N.J., Calhoun, M.E., Jucker, M., Hengemihle, J.M., Ingram,

D.K., Mouton, P.R., 1998. Stereological analysis of astrocyte and microglia in aging

mouse hippocampus. Neurobiol. Aging 19, 497–503.

Long, J.M., Mouton, P.R., Jucker, M., Ingram, D.K., 1999. What counts in brain aging?

Design-based stereological analysis of cell number. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci.

54, B407-417.

Madeira, M.D., Ferreira-Silva, L., Ruela, C., Paula-Barbosa, M.M., 2001. Differential effects

of the aging process on the morphology of the hypothalamic ventromedial nucleus of

male and female rats. Neuroscience Letters 314, 73–76. doi:10.1016/S0304-

3940(01)02294-7

Madeira, M.D., Sousa, N., Santer, R.M., Paula-Barbosa, M.M., Gundersen, H.J., 1995. Age

and sex do not affect the volume, cell numbers, or cell size of the suprachiasmatic

nucleus of the rat: an unbiased stereological study. J. Comp. Neurol. 361, 585–601.

doi:10.1002/cne.903610404

46

Mitrofanis, J., 1992. NADPH-diaphorase reactivity in the ventral and dorsal lateral geniculate

nuclei of rats. Visual Neuroscience 9, 211–216. doi:10.1017/S0952523800009676

Moore, R.Y., Card, J.P., 1994. Intergeniculate leaflet: An anatomically and functionally

distinct subdivision of the lateral geniculate complex. J. Comp. Neurol. 344, 403–430.

doi:10.1002/cne.903440306

Morin, L.P., 2013. Neuroanatomy of the Extended Circadian Rhythm System. Exp Neurol

243, 4–20. doi:10.1016/j.expneurol.2012.06.026

Morterá, P., Herculano-Houzel, S., 2012. Age-related neuronal loss in the rat brain starts at

the end of adolescence. Front. Neuroanat. 6. doi:10.3389/fnana.2012.00045

Mosher, K.I., Wyss-Coray, T., 2014. Microglial dysfunction in brain aging and Alzheimer’s

disease. Biochem. Pharmacol. 88, 594–604. doi:10.1016/j.bcp.2014.01.008

Mouton, P., 2011. Unbiased stereology: a concise guide, The John Hopkins University Press.

Mouton, P.R., Long, J.M., Lei, D.-L., Howard, V., Jucker, M., Calhoun, M.E., Ingram, D.K.,

2002. Age and gender effects on microglia and astrocyte numbers in brains of mice.

Brain Res. 956, 30–35.

Nichols, N.R., Day, J.R., Laping, N.J., Johnson, S.A., Finch, C.E., 1993. GFAP mRNA

increases with age in rat and human brain. Neurobiol. Aging 14, 421–429.

Nimi, K., Kanaseki, T., Takimoto, T., 1963. The comparative anatomy of the ventral nucleus

of the lateral geniculate body in mammals. J Comp Neurol. 121, 313-323. doi:

10.1002/cne.901210303

Ojo, J.O., Rezaie, P., Gabbott, P.L., Stewart, M.G., 2015. Impact of age-related neuroglial

cell responses on hippocampal deterioration. Front Aging Neurosci 7.

doi:10.3389/fnagi.2015.00057

Ordy, M., Brizzee, K.R., Kaack, B., Hansche, J., 1978. Age Differences in Short-Term

Memory and Cell Loss in the Cortex of the Rat. GER 24, 276–285.

doi:10.1159/000212260

Paxinos, G., Watson, C., 2007. The rat brain atlas in stereotaxic coordinates, sixth ed.,

Academic press.

Pelvig, D.P., Pakkenberg, H., Stark, A.K., Pakkenberg, B., 2008. Neocortical glial cell

numbers in human brains. Neurobiol. Aging 29, 1754–1762.

doi:10.1016/j.neurobiolaging.2007.04.013

Peters, A., 2002. Structural changes that occur during normal aging of primate cerebral

hemispheres. Neurosci Biobehav Rev. 26, 733-41.

Peters, A., Sethares, C., 2004. Oligodendrocytes, their Progenitors and other Neuroglial

Cells in the Aging Primate Cerebral Cortex. Cereb Cortex 14, 995–1007.

doi:10.1093/cercor/bhh060

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12470684

47

Rapp, P.R., Gallagher, M., 1996. Preserved neuron number in the hippocampus of aged rats

with spatial learning deficits. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 9926–9930.

Roberts, D.E., Killiany, R.J., Rosene, D.L., 2012. Neuron Numbers in the Hypothalamus of

the Normal Aging Rhesus Monkey: Stability Across the Adult Lifespan and Between the

Sexes. J Comp Neurol 520, 1181–1197. doi:10.1002/cne.22761

Rubinow, M.J., Juraska, J.M., 2009. Neuron and glia numbers in the basolateral nucleus of

the amygdala from preweaning through old age in male and female rats: a stereological

study. J. Comp. Neurol. 512, 717–725. doi:10.1002/cne.21924

Satorre, J., Cano, J., Reinoso-Suárez, F., 1985. Stability of the neuronal population of the

dorsal lateral geniculate nucleus (LGNd) of aged rats. Brain Research 339, 375–377.

doi:10.1016/0006-8993(85)90108-8

Smith, D.E., Rapp, P.R., McKay, H.M., Roberts, J.A., Tuszynski, M.H., 2004. Memory

impairment in aged primates is associated with focal death of cortical neurons and

atrophy of subcortical neurons. J. Neurosci. 24, 4373–4381.

doi:10.1523/JNEUROSCI.4289-03.2004

Soreq, L., Rose, J., Soreq, E., Hardy, J., Trabzuni, D., Cookson, M.R., Smith, C., Ryten, M.,

Patani, R., Ule, J., 2017. Major Shifts in Glial Regional Identity Are a Transcriptional

Hallmark of Human Brain Aging. Cell Reports 18, 557–570.

doi:10.1016/j.celrep.2016.12.011

Streit, W.J., Xue, Q.-S., 2010. The Brain’s Aging Immune System. Aging Dis 1, 254–261.

Tremblay, M.-È., Zettel, M.L., Ison, J.R., Allen, P.D., Majewska, A.K., 2012. Effects of aging

and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia 60, 541–558.

doi:10.1002/glia.22287

Villena, A., Díaz, F., Requena, V., Chavarría, I., Rius, F., Pérez de Vargas, I., 1997.

Quantitative morphological changes in neurons from the dorsal lateral geniculate

nucleus of young and old rats. Anat. Rec. 248, 137–141.

von Bartheld, C.S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S., 2016. The search for true numbers of

neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. J.

Comp. Neurol. 524, 3865–3895. doi:10.1002/cne.24040

Weibel, E.R., Gomez, D.M., 1962. A principle for counting tissue structures on random

sections. J Appl Physiol 17, 343–348.

West, M.J., 1993. Regionally specific loss of neurons in the aging human hippocampus.

Neurobiol. Aging 14, 287–293.

West, M.J., Slomianka, L., Gundersen, H.J., 1991. Unbiased stereological estimation of the

total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical

fractionator. Anat. Rec. 231, 482–497. doi:10.1002/ar.1092310411

48

Wolf, H., Buslei R., Schimidt-Kastner, R., Schimidt-Kastner, P., Pietsch, T., Wiestler, O.,

Blümcke, I., 1996. NeuN: a useful neuronal marker for diagnostic histopathology. J

Histochem Cytochem 44:1167-1171.

Yates, M.A., Markham, J.A., Anderson, S.E., Morris, J.R., Juraska, J.M., 2008. Regional

variability in age-related loss of neurons from the primary visual cortex and medial

prefrontal cortex of male and female rats. Brain Res 1218, 1–12.

doi:10.1016/j.brainres.2008.04.055

49

4.3- MATERIAL SUPLEMENTAR DO CAPÍTULO 1

S1: Penetration of the histochemical procedures

To confirm the NeuN antibody and Nissl stain penetration, Z depth histograms of the

counted cells were evaluated. Similar counts of both neuronal and glial cells were obtained in

dLGN, IGL, vLGNe and vLGNi in every micrometer after the displacement from the topmost

to the bottommost focal planes (Examples given in Fig.S1). No differences among age

groups were observed.

Figure 5 (S1)- Examples of counts in each micrometer displaced from the topmost focal

plane in all disectors.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

d L G N

D is ta n c e fro m to p s ite

Co

un

ts

N e u ro n

G lia

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

0

1 0

2 0

3 0

IG L


Co

un

ts

N e u ro n

G lia

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

v L G N e


Co

un

ts

N e u ro n

G lia

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

v L G N i


Co

un

ts

N e u ro n

G lia

50

4.4- CONSIDERAÇÕES FINAIS DO CAPÍTULO 1

Através da análise estereológica das lâminas processadas pela combinação da

imunoistoquímica para NeuN e contramarcação pelo método de Nissl nossos principais

achados são:

1) Quantificamos o número de neurônios, células gliais, relação

glia/neurônio e volume nos núcleos do CGL de ratos wistar;

2) Não há perda no número de neurônios com a idade em nenhum dos

núcleos estudados;

3) Ocorre um aumento glial no GLD e FIG de ratos idosos, bem como na

razão glia/neurônio no GLD, FIG e GLVi em ratos idosos e em ratos de meia-idade

no GLD;

4) Observamos aumento do volume do FIG em animais idosos.

Além da caracterização e descrição inédita desses parâmetros morfo-quantitativos,

esses dados fornecem uma base para o entendimento de mudanças específicas nas

populações neuronais desses núcleos uma vez que fica estabelecido quanto é o 100% de

neurônios, ou seja, quanto uma dada porcentagem de variação neuroquímica se reflete na

realidade total dessas estruturas.

51

5- CAPÍTULO 2: EXPRESSÃO DE CALRETININA NOS NÚCLEOS VENTRAIS DO

CGL: EFEITO DA IDADE E CONDIÇÕES FÓTICAS

Apresentação: No capítulo 1 estabelecemos um patamar para o entendimento de

qualquer alteração específica de parametros morfoquantitativos nos núcleos do CGL. No

capítulo 2 investigamos se a expressão da proteína ligante de cálcio calretinina varia de

acordo com a condição fótica e/ou idade dos animais. Apresentamos este capítulo na forma

de um manuscrito em português contendo introdução, metodologia, resultados, discussão e

considerações finais.

52

5.1- INTRODUÇÃO

O ciclo claro-escuro originado pelo movimento que a terra faz ao redor do seu

próprio eixo, em aproximadamente 24 horas, existe desde antes dos primeiros organismos

vivos e, portanto, moldou a evolução biológica. De fato, cianobactérias, que estão entre os

mais antigos seres fotossintetizantes, possuem mecanismos moleculares de otimizar o

armazenamento de ATP e proteger seu DNA do dano UV durante o dia, favorecendo a

transcrição de RNA durante a noite. Exemplos de mecanismos celulares e moleculares

sincronizados ritmicamente com sinais ambientais (ou Zeitgebers), dos quais o mais

relevante é a presença de luz, são reportados em todos os seres vivos (Hut & Beersma,

2011).

Outro processo que também é universal, conservado pela evolução e envolve a

passagem de tempo para sistemas biológicos é o de envelhecimento. No entanto,

diferente da sincronização antecipatória a pistas ambientais que se repetem em um

determinado período, o processo de envelhecimento é mal-adaptativo e envolve

alterações estocásticas cumulativas que se refletem em déficits funcionais manifestados

após o período reprodutivo do animal, tendo menos chance de serem eliminados pela

seleção natural (Medawar, 1952; Williams, 1957).

Não por acaso, há um delicado equilíbrio entre o processo de envelhecimento e a

temporização circadiana. Eventos celulares moleculares que são caracterizados como

marcadores do processo de envelhecimento exercem influência e são influenciados por

mecanismos moleculares rítmicos (Kondratova & Kondratov, 2012; Hood & Amir, 2017). A

disfunção mitocondrial ocasionada pelo dano oxidativo prolongado de radicais livres, por

exemplo, é regulada pela ação de enzimas anti-oxidantes que tem expressão rítmica

(Harderland et al. 2003).

Similarmente, a (des)regulação da concentração intracelular de cálcio, proposta

como a principal causalidade que traz déficits funcionais a neurônios idosos (Landfield,

1957), envolve o tamponamento desse íon por proteínas ligantes de cálcio (CaBPs) que

apresentam expressão que varia de acordo com a fase do dia em regiões do hipotálamo,

hipocampo e tálamo (Campos et al., 2015a; 2015b; Moore et al., 2016). Nesse contexto, já

foi relatado que o envelhecimento se correlaciona com a redução da CaBP calretinina

(CR) em núcleos cerebrais (Ouda et al. 2012; Ahn et al. 2017). Porém, a relação entre o

envelhecimento e a ritmicidade diária dessas proteínas permanece elusiva.

O presente trabalho objetivou caracterizar a ritmicidade diária e os efeitos do

envelhecimento na expressão de CR nos núcleos ventrais do complexo geniculado lateral

(CGL) de ratos. Especificamente, esses núcleos são o folheto intergeniculado (FIG) e as

53

porções externa (GLVe) e interna (GLVi) do núcleo geniculado lateral ventral (GLV).

Hodolologicamente, destacam-se a projeção retiniana para o FIG e GLVe, a projeção do FIG

e GLVi para o NSQ e as projeções recíprocas dos três núcleos com o colículo superior e

pré-tecto indicando que estes núcleos estão envolvidos com a sincronização circadiana,

atenção visual e respostas visuomotoras (Harrington, 1997). Esperamos que o presente

estudo ajude a entender se alterações de ritmicidade diária podem ser classificadas como

marcador de envelhecimento e como os mecanismos de tamponamento de cálcio podem

estar correlacionados a déficits no sistema de integração visuomotora e circadiano

observados com o avanço da idade.

5.2- METODOLOGIA

5.2.1- ANIMAIS

Tempo de incubação

Um total de 60 ratos machos da linhagem wistar foi dividido em 3 diferentes grupos

etários, sendo eles: Jovem (aproximadamente 3 meses), Meia-idade (aproximadamente 13

meses) e Idoso (aproximadamente 23 meses). Os animais foram criados no Biotério da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte com livre acesso a água e alimentação. Os

animais foram mantidos sob um regime de iluminação de 12:12 h claro-escuro, onde as

luzes apagavam às 18:00 horas da noite, momento que por definição corresponde à hora de

zeitgeber (ZT) 12. Em cada grupo de idade, os animais foram eutanaziados em 5 diferentes

ZTs (n = 4/grupo de idade/ZT) correspondentes à distintas condições de iluminação, sendo

ZT 0 às 06:00 horas, momento de transição entre escuro e claro. ZT 6, às 12:00 horas, meio

da fase de claro. ZT 12, às 18:00 horas, transição entre claro e escuro. ZT 14, às 20:00, no

início da fase de escuro. ZT 18, às 00:00 horas, no meio da fase de escuro. O uso dos

animais foi previamente submetido e aprovado pelo comitê de ética da instituição (CEUA

UFRN-054/2015, Apêndice 1).

5.2.2- PERFUSÃO E MICROTOMIA

Os animais foram previamente anestesiados por via intraperitoneal com tiopental

sódico (40 mg/kg). Posteriormente foram perfundidos transcardiacamente com a impulsão

de 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato (PB) 0,1M com heparina, seguido de

300 ml de solução fixadora de formalina a 10%, correspondente à paraformaldeído diluído

em 0,4%, através de uma bomba peristáltica. Após 2 horas, os encéfalos foram removidos

da cavidade craniana, sendo em seguida pós-fixados na mesma solução fixadora por 4

54

horas e então crioprotegidos em sacarose a 30% até serem submetidos a microtomia em

criostato. Foram obtidas secções coronais de 50 µm, coletadas em placas para cultura de

células com 96 poços a fim de manter a sequencia exata para uma amostragem sistematica,

uniforme e aleatória (SURS, do inglês “systematic uniform random sampling”), pré-requisito

de análises estereológicas. Os cortes foram então armazenados em uma solução anti-

congelante à base de etileno-glicol e conservados a -20ºC.

5.2.3- PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS

Secções do CGL foram processadas por imunoistoquímica para CR. Nesse

procedimento as secções foram previamente submetidas a um bloqueio de peroxidases

endógenas utilizando o peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3% por 20 minutos. Em seguida,

os cortes foram incubados em solução contendo anticorpo primário de CR obtido em coelho

em concentração de 1:1000 (C7479, Sigma) com 2% de albumina sérica bovina (BSA) e

Triton x 100 a 0,4% (TX 100). Posteriormente, foram incubados em solução contendo

anticorpo secundário anti-coelho conjugado à biotina em concentração de 1:1000 (111-065-

003, Jackson Immunoresearch). Após esta etapa, os cortes foram incubados em uma

solução contendo avidina e biotina (2%) e TX-100 com adição de NaCl, por 120 minutos.

Para visualizar a reação, os cortes foram colocados em um recipiente com diaminobenzidina

a 2,5% (DAB) diluída em PB 0,1M. A reação final foi revelada adicionando-se H2O2 a

0,003%, obtendo-se as regiões alvos marcadas em cor marrom, resultante da oxidação da

DAB. Sempre, entre cada uma das etapas descritas anteriormente, foram feitas quatro

lavagens do tecido, de 5 minutos cada, com PB a 0,1 M. Com a finalidade de manter o

controle da ordem das secções, todas as incubações foram feitas em placas de 96 poços,

ao passo que todas as lavagens foram feitas em placa com poços individuais pras secções.

Os cortes foram montados em lâminas de vidro previamente gelatinizadas com gelatina-

alúmem-cromo. As lâminas processadas por CR foram desidratas em séries de álcool,

diafanizadas em xilol intensificadas com tetróxido de ósmio e cobertas com lamínulas

usando-se DPX.

55

5.2.4- ESTEREOLOGIA E ANÁLISE ESTATÍSTICA

As lâminas obtidas foram estudadas em microscópio óptico acoplado a uma placa

motorizada X-Y e Z encoder (BX61, Olympus, Japão), que permite medição da distância

movimentada no eixo Z, e as análises foram feitas no software NewCAST (Visiopharm,

Dinamarca). As secções do CGL contendo o FIG, GLVe e GLVi foram identificadas em

coordenadas correspondentes a aproximadamente -4.0 e -5.0 milímetros do bregma (Fig.1),

baseado no estudo piloto guiado pelo atlas de coordenadas estereotáxicas do cérebro de

rato de Paxinos & Watson (2007). Para garantir a SURS, nós aleatorizamos a primeira

secção e selecionamos sequencialmente cada quarta secção para serem submetidas aos

procedimentos histológicos.

Figura 1- Amostra (SURS) das secções contendo os núcleos ventrais do CGL de ratos. O

tecido processado pela imunoistoquímica de Nissl com contra marcação de NeuN (acima)

serviu como base para definir a fração de série da amostra processada para CR (abaixo).

Os números acima relatam a distância estereotáxica do bregma. Barra de escala 1000 µm.

Tendo em vista que a característica anatomica que discrimina esses núcleos é a

inervação retiniana para o FIG e GLVe, comparamos as amostras procesadas para CR com

material do acervo do nosso laboratório de animais injetados intraocularmente com a toxina

colérica subunidade b (CTb), cuja imunoistoquimica revela regiões retino-recipientes nessas

condições. Esse material de CTb foi publicado anteriormente em Fiuza et al. (2016) e seu

uso no presente trabalho teve a única finalidade de ser um modelo para a delimitação dos

56

núcleos, não tendo sido gerados dados acerca dele em nenhum momento. A marcação de

CR deixa as bordas do FIG evidentes e a neurópila mais densa no GLVe permite a

discriminação do limite com o GLVi. Ademais, a GLVe tem células maiores, por isso sendo

chamada de subdivisão magnocelular do GLV, o que serviu como critério de confirmação

dessas subdivisões. (Fig. 2).

Figura 2- Fotomicrografias em campo claro de secções coronais processadas por

imunoistoquímica para CTb (acima) e CR (abaixo) em diferentes níveis ao longo do eixo

rostrocaudal. Em evidência, o FIG (pontilhado preto), GLVe (pontilhado azul) e o GLVi

(pontilhado verde) delimitados nas secções processadas por CR com base na comparação

do contraste da marcação negativa de GLVi com as regiões retino-recipientes, FIG e GLVe

demarcadas por CTb. Barra de escala de 200 µm.

57

O fracionador óptico foi utilizado para quantificar o número total de células CR-

positivas (CR+) no CGL. Os núcleos foram demarcados em uma objetiva de baixa

magnificação (4x) e as células foram contadas em lentes de alta magnificação (100x, 1.4

N.A) usando como critério de contagem o equador do núcleo (Fig.3)

Figura 3- Exemplos de neurônios CR+ visualizados em alta magnificação no FIG

(esquerda), GLVe (meio) e GLVI (direita) evidenciando o equador do núcleo como unidade

de contagem. A magnificação ilustrada foi a mesma utilizada durante a contagem. Barra de

escala de 10 µm.

Todos os parâmetros de número de secções, fração de série, de área, altura dos

frames volumétricos de contagem (Disectores) e espessura pós-processamento foram

definidos com base no estudo piloto. Nesse estudo, observamos um número mínimo de 100

células contadas para obter resultados confiáveis com Coeficiente de erro menor que 0,1

(Gundersen m=1). Além disso, foi feita uma identificação com códigos para que o

observador não soubesse a qual grupo as lâminas analisadas pertenciam. Os disectores

postos tinham dimensão de 50 x 50 µm e foram colocados com um espaçamento de 90 x 90

µm resultando numa fração de área de 0,3. Em cada corte analisado foi determinada a

espessura real do tecido focando no primeiro ponto de foco e descendo até o último para

registro do deslocamento do eixo Z. Através dessas estimativas no estudo piloto, os

dissectores foram definidos com 12 µm de altura para contagem. Dessa forma o número

total de células (N) foi estimado levando-se em conta o número de células contadas (Q-), a

fração de amostragem de série (ssf), a fração de área de amostragem (asf) definida pela

divisão do tamanho do dissector pela área em que ele foi colocado; e a razão entre a altura

do disector (h) pela espessura real do corte (t) que traduz a fração de volume (hsf).

A relação entre essas variáveis foi estabelecida através da equação 3, com a

modificação de que, ao invés de o valor de t usado para calcular a hsf ser uma média das

espessuras pós processamento das secções, foi calculada uma média ponderada (𝑡𝑄−̅̅ ̅̅ ) da

espessura (𝑡𝑖) de acordo com a quantidade de partículas (𝑄𝑖) contadas em cada secção,

58

conforme indicado na Equação 4 onde 𝑚 denota o número total de secções e 𝑖 sua posição

ordinal.

𝑡𝑄−̅̅ ̅̅ =

∑ 𝑡𝑖𝑚𝑖=1 𝑄𝑖

∑ 𝑄𝑖𝑚𝑖=1

(Eq.4)

Para comprovar a penetração adequada da imunomarcação de CR, ilustramos um

histograma de contagem em cada micrometro distanciado do primeiro ponto de foco no

topo do tecido. Observamos assim que contagens similares foram obtidas em cada plano

focal indicando uma penetração homogênea do processamento de tecido no eixo Z, sem

ocorrer diferenças entre os grupos de idade. (Fig. 4)

Os dados foram analisados estatisticamente, com auxílio do software

GraphpadPrism. Considerando que observamos as distribuições como normal no teste de

Kolmogorov-smirnov, utilizamos a ANOVA de duas vias, seguida de post hoc de Tukey,

para avaliar a variação do número total de células dos núcleos de acordo com os fatores

ZT e idade. Esses dados de número são expressos como média ± desvio padrão.

Considerando que o parâmetro idade nesse estudo é contínuo, também analisamos o

coeficiente de correlação de Pearson dentro de cada ZT. Por fim, com o uso do programa

R, plotamos uma matriz de correlação para entender se o envelhecimento impacta os

subnúcleos de forma coordenada ou se as possíveis alterações são devidas a variações

individuais.

59

Figura 4- Histogramas de contagem de células CR+ ao longo do eixo Z. Animais jovens

(colunas da esquerda), de meia-idade (colunas do meio) e idosos (colunas da direita)

tiveram semelhante número de células contadas no FIG (cima), GLVe (meio) e GLVi (baixo)

em cada micrometro distante do primeiro ponto de foco no espécimen em alta resolução.

Cada histograma corresponde a um caso representativo em grupos de idade e ZT.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2

D is tâ n c ia d o to p o (m )

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

J o v e m

F IG

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

M e ia -Id a d e

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

Id o s o

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

G L V e

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

G L V i

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

0

3

6

9

1 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

60

5.3- RESULTADOS

Com o uso de imunoistoquímica para CR obtivemos o material de análise consistindo

nas secções contendo o CGL de animais jovens, de meia-idade e idosos perfundidos nos

ZTs 0, 6, 12, 14 e 18 (Fig. 5). A maioria das células marcadas tem características de

neurônios pelo tamanho grande e moderado do citoplasma (Fig. 3), semelhante ao

apresentado pelos neurônios caracterizados no Nissl e NeuN do capítulo 1. Uma quantidade

ínfima de células, no entanto, foi desconsiderada da contagem por apresentar núcleo curvo

e alongado, sendo presentes nas proximidades dos vasos sanguíneos e, portanto, podendo

ser células endoteliais. Em análise conjunta com o capítulo 1, calculamos quanto a

população de neurônios CR+ representa a população total nesses núcleos no grupo jovem.

Essas porcentagens foram obtidas relacionando as médias dos ZTs com o 100% de

neurônios em cada região. Assim, indicamos que no FIG a população CR+ corresponde

cerca de 32% a 45% da população neuronal total, sendo esta a maior proporção entre as 3

estruturas. No GLVe, esses números se traduzem entre 16% a 23% e no GLVi de 13% a

20%.

5.3.1- RITMICIDADE DIÁRIA DE CALRETININA NO CGL

Através da ANOVA de duas vias, identificamos que a condição fótica tem efeito

significativo nas variações de imunorreatividade à CR no FIG [F (4,45) = 4,36; p = 0,0046,

21% da variação], GLVe [F (4,45) = 6,46; p = 0,0003; 26% da variação] e GLVi [F (4,45) =

5,43; p = 0,0012; 26% da variação]. A tabela 1 mostra os valores das estimativas médias

obtidas em cada grupo. No FIG, o teste de Tukey para múltiplas comparações (Fig.6

esquerda) revela que em animais jovens há mais células CR-positivas no ZT 12 (2572 ±

232) quando comparado aos ZTs 0 (1889 ± 516) e 14 (1861 ± 336). Também há presença

de mais células CR-positivas nos animais eutanaziados no ZT 6 (2533 ± 111) em

comparação com o ZT 14. No GLVe de animais jovens há mais células CR-positivas no ZT 6

(4055 ± 619) em comparação aos ZTs 0 (2999 ± 459), 14 (2858 ± 369) e 18 (2909 ± 702).

No GLVi, reportamos que os animais jovens eutanaziados no ZT 12 (2831 ± 148)

apresentam maior quantidade de células CR-positivas em comparação com o ZT 0 (1916 ±

375), 6 (2040 ± 393) e 14 (1817 ± 150). Em animais de meia-idade e idosos não foram

detectadas diferenças significativas entre nenhum dos grupos de condição fótica (Fig.6,

esquerda).

5.3.2- INTERAÇÃO ENTRE ZT E IDADE

Observamos que a idade, como fator isolado, não tem efeito significativo sobre a

imunorreatividade à CR no FIG [F (2,45) = 1,94; p= 0,15; 4,7% da variação]. Entretanto,

61

quando analisada a interação entre o fator ZT e o fator idade é visto efeito significativo [F

(8,45) = 2,10; p = 0,05; 20% da variação]. Dessa forma, o teste de Tukey para múltiplas

comparações revela que no ZT 6 existe uma diminuição significativa do número de células

CR+ em animais idosos (1963 ± 240) quando comparados a jovens (2.533 ± 111). No ZT 12,

essa redução nos idosos (1796 ± 87) se dá tanto em comparação com animais jovens (2572

± 232) e de meia-idade (2.397 ± 170) (Fig.6 direita; Fig.7).

No GLVe, foi observado tanto um efeito significativo da idade [F (2,45) = 6,01; p=

0,005; 12% da variação] quanto uma tendência não significativa da interação idade/ZT sobre

a imunorreatividade à CR [F (8,45) = 2,07; p= 0,06; 16,6% da variação]. Em adição,

observamos que o pico de células do ZT 6 de jovens (4055 ± 619) difere significativamente

dos grupos de meia-idade (3088 ± 209) e idoso (3163 ± 218). No ZT12, também há redução

de células CR+ no grupo idoso (2804 ± 253) em comparação ao grupo jovem (3480 ± 256)

(Fig.6 direita; Fig.7).

No GLVi, a idade [F (2,45) = 3,1; p= 0,05; 7,5% da variação], mas não a interação

idade/ZT [F (8,45) = 1,19; p= 0,32], influenciam significativamente a imunorreatividade à CR.

Através das múltiplas comparações, observamos que o pico de células do ZT 12 de jovens

(2831 ± 148) difere significativamente do grupo idoso (2152 ± 347) (Fig.6, direita; Fig.7).

Quando tratamos a idade como parâmetro continuo através da análise de correlação,

observamos que a redução dependente de idade se confirma no FIG (r = -0,72, p = 0,008) e

GLVe (r = 0,63, p = 0,03) no ZT 6 e o mesmo efeito da idade ocorre no ZT 12 no FIG (r = -

0,81, p = 0,002), GLVe (r = -0,79, p = 0,002) e GLVi (r = -0,73, p = 0,007) em acordo com o

resultado obtido na ANOVA de duas vias (Fig. 8). Essas reduções parecem ocorrer de forma

coordenada apenas entre o FIG e o GLVe, os núcleos retino-recipientes da porção ventral

do CGL, uma vez que essa á a única correlação muito forte (r = 0,9) evidenciada pela matriz

de correlação (Fig. 9).

62

Figura 5- Fotomicrografias em campo claro de secções processadas por imunoistoquímica

para CR em ratos jovens (A-E), de meia-idade (F-J) e idosos (K-O) nas diferentes condições

fóticas: transição escuro-claro (ZT 0); claro (ZT 6); transição claro-escuro (ZT 12), começo e

meio do escuro (ZT 14 e ZT 18). Barra de escala de 100 µm.

63

Figura 6- Ritmicidade diária das células CR+ (esquerda) e efeito da idade (direita) no FIG

(acima), GLVe (meio) e GLVi (abaixo). Nos gráficos de linha à esquerda, as variações entre

os grupos de condição fótica ficam em evidência e para melhor ilustrar esse aspecto

replicamos os valores do grupo ZT 0 como ZT 24. O sombreamento por trás do gráfico

indica a fase de escuro. As letras a e b nos gráficos de linha são relativas apenas ao grupo

jovem e denotam similaridade intragrupo entre os diferentes ZTs. Nos gráficos de dispersão

alinhada à direita, cada círculo representa a estimação do número de células CR+ de um

indivíduo evidenciando a variação dentro do grupo e precisão do estimador. Os asteriscos

nos gráficos à direita representam diferenças estatística entre os grupos indicados pelos

colchetes. O grupo jovem é representado pela cor preta, meia-idade por vermelho e idoso

verde em todos os gráficos.

ZT

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 6 1 2 1 4 1 8 2 4

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

Jo vem

M e ia -Id a d e

Id o s o

F IG

aa

bb

a b a

ZT

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 6 1 2 1 4 1 8 2 4

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

Jo vem

M e ia -Id a d e

Id o s o

G L V e

a

b

a b

a

aa

ZT

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 6 1 2 1 4 1 8 2 4

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

Jo vem

M e ia -Id a d e

Id o s o

G L V i

aa

a a b

b

a

ZT

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 6 1 2 1 4 1 8

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

Jo vem

M e ia -Id a d e

Id o s o

F IG

* * **

ZT

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 6 1 2 1 4 1 8

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

Jo vem

M e ia -Id a d e

Id o s o

G L V e

* *

* **

ZT

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 6 1 2 1 4 1 8

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

Jo vem

M e ia -Id a d e

Id o s o

G L V i

*

64

Figura 7- Imunorreatividade à CR nos núcleos ventrais do CGL em animais de 3, 13 e 23

meses perfundidos no ZT 12. Barra de escala de 50 µm.

65

Tabela 1- Números de células CR+ estimadas no FIG, GLVe e GLVi nos grupos de ZT e

Idade. * indica diferença significativa em comparação com o grupo jovem. # indica diferença

significativa em comparação com o grupo de meia-idade. Dados expostos como média ±

desvio padrão.

Núcleo ZT Jovem Meia-idade Idoso

FIG

0 1889 ± 516 1777 ± 525 1950 ± 443

6 2533 ± 111 2279 ± 421 1963 ± 240*

12 2572 ± 232 2397 ± 170 1796 ± 87*, #

14 1861 ± 336 1805 ± 445 1902 ± 171

18 1926 ± 442 1830 ± 205 2159 ± 45

GLVe

0 2999 ± 459 2634 ± 721 2763 ± 180

6 4055 ± 619 3088 ± 209* 3163 ± 218*

12 3480 ± 256 3212 ± 155 2804 ± 253*

14 2858 ± 369 2414 ± 375 2827 ± 240

18 2909 ± 702 2798 ± 341 3306 ± 265

GLVi

0 1916 ± 375 1770 ± 472 1713 ± 695

6 2040 ± 393 2129 ± 395 1729 ± 430

12 2831 ± 148 2415 ± 459 2152 ± 347*

14 1817 ± 150 1939 ± 345 2118 ± 202

18 2146 ± 312 1997 ± 485 1548 ± 134

66

Figura 8- Correlações entre a idade e número de células CR+ no FIG (esquerda), GLVe

(meio) e GLVi (direita) dentro de cada ZT (de cima a baixo, 0, 6, 12, 14, 18

respectivamente). Correlações negativas significativas foram observadas no FIG e GLVe no

ZT 6 e em todos os núcleos no ZT 12.

Id a d e (m e s e s )

Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0r = -0 .7 2

p = 0 .0 0 8


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0 r = -0 .6 3

p = 0 .0 3

Id a d e (m e s e s )N

úm

ero

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

r = -0 .8 1

p = 0 .0 0 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0r = -0 .7 9

p = 0 .0 0 2


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0r = -0 .7 3

p = 0 .0 0 7


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0


Nú

me

ro

de

cé

lula

s C

R+

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

ZT0

F IG

ZT6

Z T 12

Z T 14

Z T 18

G L V e G L V i

67

Figura 9- Matriz de correlação entre o FIG, GLVe e GLVi nos ZTs 0, 6 (gráficos de cima),

12, 14 (gráficos do meio) e 18 (gráfico de baixo). Cada distribuição plotada com a curva de

melhor ajuste corresponde à correlação do número de células CR+ entre os núcleos

assinalados na linha e na coluna correspondente. Valores do r de Pearson estão

assinalados no quadrante superior direito. Uma correlação com tamanho de efeito muito

forte foi observada apenas no ZT 12 entre o FIG e GLVe.

68

DISCUSSÃO

O presente trabalho é o primeiro a relatar a ritmicidade diária da expressão de CR e

o efeito do envelhecimento sobre ela nos núcleos ventrais do CGL de ratos. Um dos nossos

diferenciais metodológicos é que eliminamos dois vieses presentes na literatura atual ao

usar métodos de quantificação de estereologia baseada em design e considerar a variável

cronobiológica. É importante notar que a presença de CR nesses núcleos, em especial no

FIG, é uma característica de roedores (Arai et al., 1992), saguis, mocós (Cavalcante et al.,

2008) e lagartos (Dávila et al., 2000) denotando um padrão conservado durante a evolução.

O fato dessa característica ser comum a animais diurnos e noturnos traz a interessante

perspectiva de avaliar se essa ritmicidade diária está presente, e como ela difere, em

diferentes cronotipos ajustados ao ciclo-claro escuro.

Em todos os núcleos de animais jovens, observamos que as diferenças significativas

se refletem em um maior número de células CR+ na fase de claro ou na transição

claro/escuro. No entanto, essa ritmicidade diária tem padrões diferentes nos três

subnúcleos, sendo que no FIG esse pico se mantem durante toda a fase de claro (ZT 6 e

12), enquanto no GLVe há um pico apenas no meio dessa fase (ZT 6) e no GLVi um pico

somente no fim, visto na transição do claro para o escuro (ZT 12). A redução desse número

de células é observada já no começo da fase de escuro (ZT14), onde observamos que em

um curto intervalo de 2 horas (ZT 12 vs ZT 14) há uma diminuição em 28% das células CR+

no FIG e em 36% no GLVi. Isso significa que, em população total, 12% dos neurônios do

FIG (diferença média de 710) e 7% dos neurônios do GLVi (diferença média de 1014) tem

uma redução abrupta dependente de fase na expressão de CR. Em adição, em comparação

com o ZT 6, no ZT 14 há uma redução em 26% e 29% no FIG e GLVe, respectivamente. Em

contraste, nenhum padrão de ritmicidade diária foi observado em animais de meia idade ou

idosos.

No FIG e GLVe foi observada uma redução idade dependente do número de células

CR+ no ZT 6. No FIG essa redução aconteceu apenas em animais idosos quando

comparados a jovens, enquanto no GLVe, essa redução já foi detectada na meia-idade. No

ZT 12, todos os 3 subnúcleos apresentam uma redução dependente de idade no número de

células CR+. É importante notar que quando categorizamos a idade em grupos observamos

através da ANOVA de duas vias, que no FIG o efeito desse fator não é significativo (p =

0,16) existindo apenas efeito da interação entre idade e ZT (p = 0,05). No entanto, quando

tratamos esse parâmetro como continuo, forma mais semelhante com que ele ocorre em

populações reais, o efeito da idade se tornou evidente. A completa falta de alteração no

69

número total de neurônios com a idade, evidenciada no capítulo 1, indica que as alterações

no número de células CR+ durante o envelhecimento estão relacionadas a uma perda da

capacidade da célula em expressar CR ao invés de perda de populações neuronais que

expressam CR.

A partir da redução idade-dependente descrita no ZT 6 e ZT 12, formulamos as

seguintes hipóteses no que concerne as variações interindividuais: 1) Essas reduções são

advindas de um processo que ocorre de forma diferente em cada animal; 2) essa perda se

dá por um mecanismo mais universal ocorrendo de maneira coordenada entre os núcleos.

Para averiguar isso plotamos uma matriz de correlação entre o número de neurônios de

cada estrutura em cada ZT. Curiosamente, observamos que a perda idade-dependente

configurada no ZT 12 parece ocorrer de forma coordenada apenas entre o FIG e o GLVe,

uma vez que as correlações FIG vs GLVi e GLVe vs GLVi resultaram em pouco efeito.

Evidentemente, o fator comum ao FIG e GLVe, que não está presente no GLVi, é a

presença de aferências retinianas (Harrington et al., 1997) e tal fenômeno pode estar

relacionado com mecanismos moleculares advindo de cascatas downstream de cálcio

oriundas desse input glutamatérgico, que supostamente vai estar sendo acionado nessa

zona de transição claro-escuro, que significa o início de atividade para um roedor noturno.

Essa suposição não pode ser confirmada com os dados disponíveis no presente trabalho,

de maneira que lançamos aqui uma possibilidade de investigação para futuros estudos. Não

obstante, corroboramos com as reduções dependentes de idade na expressão de CR já

mostradas no hipocampo, no colículo inferior e no córtex somatossensorial de roedores,

indicativos de que as cascatas de sinalização desse íon são progressivamente alteradas

com a idade. (Villa et al. 1994; Ouda et al., 2012; Ahn et al., 2017).

Ritmos diários de expressão de proteínas já foram publicados por outros estudos.

Para ilustrar, uma menor quantidade de células imunomarcadas para receptores MT1 e MT2

de melatonina foi descrita na fase de claro no NSQ do primata diurno Sapajus apella (Pinato

et al., 2017). Além disso, durante a fase de escuro há um aumento tanto no número de

células que expressam polipeptídio intestinal vasoativo (VIP) quanto a porcentagem de

células que apresenta co-localização de VIP com o peptídeo de liberação de gastrina (GRP)

no NSQ de ratos (Romijin et al. 1998). No neocortex de ratos juvenis ocorre um aumento na

quantidade da proteína BDNF na fase de escuro, o que não é visto em animais adultos

(Katoh-Semba et al. 2008; Hamatake et al. 2011). À semelhança com o presente trabalho,

esses dados são melhor entendidos no contexto de identificar aspectos transversais

relacionados a essa ritmicidade do que para inferir a causalidade molecular que gera o

fenômeno.

70

Em trabalhos anteriores não foram reportadas flutuações dia/noite no número de

células expressando a CaBP calbindina-D 28k (CB) no NSQ de ratos, no roedor diurno

Arvicanthis niloticus (Mahoney et al. 2000) ou no primata noturno Microcebus murinus

(Cayetanot et al. 2007). Em contraponto, quando a marcação de CB foi avaliada apenas no

núcleo e não só no citoplasma, observa-se que a porcentagem de núcleos CB+ no NSQ de

M.murinus é maior em fase de claro do que na fase de escuro, não apresentando alterações

celulares numéricas significativas entre grupos de idade (Cayetanot et al. 2007). Além disso,

no primata diurno Sapajus apella, há um padrão heterogênico de ritmicidade diária em

células CB+ no núcleo geniculado medial e hipocampo, enquanto apenas aumento do

número de neurônios imunopositivos à CaBP parvalbumina foi relatado nesses núcleos (PV,

Campos et al. 2015a, 2015b). Em relação a CR, apenas três outros trabalhos investigam

ritmicidade diária e nenhum avalia diferenças em grupos de idade. De maneira geral,

reportamos aqui um padrão que se assemelha a esses dados, uma vez que eles mostram

uma maior quantidade de células CR+ em ZTs correspondentes à fase de claro no NSQ de

ratos (Moore et al. 2016), bem como nas subdivisões do núcleo geniculado medial e na

camada granular do giro dentado de S. apella (Campos et al. 2015a, 2015b). Contudo, na

camada polimórfica do hipocampo de S.apella há um aumento significativo de células CR+

no ZT 14 em comparação com o ZT 0. A interpretação coletiva desses achados mostra que

existe uma variação regional e interespecífica desse fenômeno, reforçando assim a

necessidade dessas caracterizações.

Considerando que os ratos estão em período de repouso durante a fase de claro,

sugerimos que o aumento de células CR+ nessa fase esteja relacionado às funções

visuomotoras que os núcleos ventrais do CGL participam, em particular aos movimentos

rápidos de olhos que ocorrem durante o sono REM (Harrington, 1997; Horowitz et al., 2004,

Morin & Blanchard 2005). É possível que o padrão de conexões recíprocas entre o FIG,

GLVe e GLVi com os núcleos vestibulares, sistema óptico acessório e sistema

hipocretina/orexina que atua na regulação do sono, envolva ritmicamente cascatas de

sinalização de cálcio e consequentemente seu tamponamento pelas CaBPs. De fato, o

efeito que observamos da perda de ritmicidade nos 3 subnúcleos começando na meia idade

e perdurando na fase idosa pode ser um correlato da substancial redução de densidade de

movimentos rápidos oculares durante o sono REM (Darchia et al. 2003) em conjunto com

aumento de latência e redução de frequência dos movimentos sacádicos em humanos

idosos (Munoz et al. 2008; Dowiasch et al., 2015).

O plano de fundo conceitual que melhor explica a relação entre sincronização

circadiana e o envelhecimento propõe que funcionamento normal dos mecanismos celulares

do sistema circadiano antagoniza o efeito do envelhecimento que, em contrapartida, os

71

deteriora progressivamente (Kondratova & Kondratov 2012, Hood & Amir, 2017). Em acordo

com isso, camundongos nocaute para a proteína BMAL-1, um dos principais componentes

das alças de retroalimentação molecular do sistema circadiano, apresentam expectativa de

vida reduzida, precoces quadros patológicos associados ao envelhecimento e aumento nos

níveis de espécies reativas de oxigênio no fígado e baço (Kondratov et al. 2006). Além

disso, a expressão de C-fos induzida por luz é dramaticamente reduzida no NSQ de

roedores (Zhang et al. 1998; Lupi et al. 2012;) e primatas (Aujard et al 2001) idosos. Essa

redução â sensibilidade à luz também já foi demonstrada em humanos idosos (Esquiva et

al., 2017), bem como uma deficiência na percepção do contraste dia/noite (Martinez-Nicolas

et al., 2014), função que em roedores parece ser correlacionada à modulação do NSQ pelo

FIG/GLVi, uma vez que nas horas de transição de fase há um pico de NPY oriundo do TGH

no marcapasso central (Shinohara et al., 1993). De forma interessante, recentemente foi

demonstrado pela primeira vez que flutuações diárias diferenciais em parâmetros

comportamentais, como atividade em exposição à luz, e fisiológicos, como temperatura

distal da pele, podem ser usados para distinguir indivíduos jovens de idosos (Martinez-

Nicolas et al., 2018). Nesse contexto, ao mostrar que animais de meia-idade e idosos não

apresentam o mesmo padrão rítmico de expressão de CR apresentado por jovens, o

presente trabalho endossa o crescente corpo de evidência de que disfunção circadiana é um

marcador do processo de envelhecimento.

É também relevante notar que marcadores moleculares rítmicos foram identificados

em câncer, bem como terapias que otimizam a toxicidade e rendimento temporal de

fármacos em resposta a esses ritmos (Innominatto et al., 2014, 2015; Innominatto e Spiegel,

2018). Considerando que a presença de CR é um critério de identificação de tipos de câncer

(Chhieng et al., 2000; Powell et al., 2011) e tendo em vista a associação desses fenótipos

celulares com o envelhecimento, trazemos a interessante perspectiva de estudar se as

alterações rítmicas descritas aqui podem caracterizar essas patologias.

72

5.4- CONSIDEREAÇÕES FINAIS DO CAPÍTULO 2

Através da análise estereológica das lâminas processadas pela imunoistoquímica

para CR no CGL nossos principais achados são:

1) Existe uma maior quantidade de células CR positivas na fase de claro

em comparação com a fase de escuro nos 3 subnúcleos ventrais do CGL,

caracterizando uma ritmicidade diária de expressão em animais jovens;

2) Animais de meia-idade e idosos não apresentam essa expressão

rítmica de CR;

3) Nos ZTs correspondentes à fase de claro houve redução significativa

no número de células CR+ com a idade, em particular no ZT 12 de transição

claro/escuro;

4) Uma vez que não houveram perdas no número total de neurônios

nessas regiões, essas reduções parecem ser na expressão de CR+ e ocorrem de

forma coordenada apenas entre o FIG e GLVe no ZT12;

Ao demonstrarmos que o aumento progressivo da idade leva a uma perda de

ritmicidade diária de CR endossamos a ideia de que disfunção circadiana é um marcador do

processo de envelhecimento. Trazemos ainda importantes correlatos sobre como o

processo de envelhecimento pode impactar os sistemas de controle intracelular de cálcio.

No mais, por a sinalização de cálcio ser conservada evolutivamente, esses dados trazem

interessantes perspectivas para a comparação entre diferentes espécies dessas

características que identificamos no presente trabalho.

73

APENDICE: Parecer de aprovação do comitê de ética

74

REFERÊNCIAS

Ahmad, A., & Spear, P. D. (1993). Effects of aging on the size, density, and number of

rhesus monkey lateral geniculate neurons. The Journal of Comparative Neurology,

334(4), 631–643. https://doi.org/10.1002/cne.903340410

Ahn, J. H., Hong, S., Park, J. H., Kim, I. H., Cho, J. H., Lee, T.-K., … Choi, S. Y. (2017).

Immunoreactivities of calbindin-D28k, calretinin and parvalbumin in the somatosensory

cortex of rodents during normal aging. Molecular Medicine Reports, 16(5), 7191–7198.

https://doi.org/10.3892/mmr.2017.7573

Alzheimer’s Association Calcium Hypothesis Workgroup. (2017). Calcium Hypothesis of

Alzheimer’s disease and brain aging: A framework for integrating new evidence into a

comprehensive theory of pathogenesis. Alzheimer’s & Dementia: The Journal of the

Alzheimer’s Association, 13(2), 178-182.e17. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2016.12.006

Andersen, B. B., Gundersen, H. J. G., & Pakkenberg, B. (2003). Aging of the human

cerebellum: a stereological study. The Journal of Comparative Neurology, 466(3), 356–

365. https://doi.org/10.1002/cne.10884

Arai, M., Arai, R., Kani, K., & Jacobowitz, D. M. (1992). Immunohistochemical localization of

calretinin in the rat lateral geniculate nucleus and its retino-geniculate projection. Brain

Research, 596(1), 215–222. https://doi.org/10.1016/0006-8993(92)91550-X

Arbuthnott, D., Promislow, D., Moorad, J. (2016). Evolutionary theory and aging. In:

Handbook of theories of aging, Third edition

Arvanitogiannis, A., Robinson, B., Beaulé, C., & Amir, S. (2000). Calbindin-D28k

immunoreactivity in the suprachiasmatic nucleus and the circadian response to

constant light in the rat. Neuroscience, 99(3), 397–401.

Aujard, F., Dkhissi-Benyahya, O., Fournier, I., Claustrat, B., Schilling, A., Cooper, H. M., &

Perret, M. (2001). Artificially accelerated aging by shortened photoperiod alters early

https://doi.org/10.1002/cne.903340410

https://doi.org/10.3892/mmr.2017.7573

https://doi.org/10.1016/j.jalz.2016.12.006

https://doi.org/10.1002/cne.10884

https://doi.org/10.1016/0006-8993(92)91550-X

75

gene expression (Fos) in the suprachiasmatic nucleus and sulfatoxymelatonin

excretion in a small primate, Microcebus murinus. Neuroscience, 105(2), 403–412.

Babb, R. S. (1980). The pregeniculate nucleus of the monkey (Macaca mulatta). I. A study at

the light microscopy level. The Journal of Comparative Neurology, 190(4), 651–672.

https://doi.org/10.1002/cne.901900404

Baimbridge, K. G., Celio, M. R., & Rogers, J. H. (1992). Calcium-binding proteins in the

nervous system. Trends in Neurosciences, 15(8), 303–308.

Bartheld, C. S. (2018). Myths and truths about the cellular composition of the human brain: A

review of influential concepts. Journal of Chemical Neuroanatomy, 93, 2–15.

https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2017.08.004

Bartheld, C. S. von, Bahney, J., & Herculano‐Houzel, S. (2016). The search for true numbers

of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.

Journal of Comparative Neurology, 524(18), 3865–3895.


Begega, A., Cuesta, M., Santín, L. J., Rubio, S., Astudillo, A., & Arias, J. L. (1999). Unbiased

estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary

nucleus in humans. Experimental Gerontology, 34(6), 771–782.

Bell-Pedersen, D., Cassone, V. M., Earnest, D. J., Golden, S. S., Hardin, P. E., Thomas, T.

L., & Zoran, M. J. (2005). Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from

diverse organisms. Nature Reviews. Genetics, 6(7), 544–556.

https://doi.org/10.1038/nrg1633

Bickford, M. E. (2016). Thalamic Circuit Diversity: Modulation of the Driver/Modulator

Framework. Frontiers in Neural Circuits, 9. https://doi.org/10.3389/fncir.2015.00086

https://doi.org/10.1002/cne.901900404



https://doi.org/10.1038/nrg1633

https://doi.org/10.3389/fncir.2015.00086

76

Brizzee, K.R., Ordy, J.M., Bartus, R.T. (1980). Localization of cellular changes within

multimodal sensory regions in aged monkey brain: possible implications for age-related

cognitive loss. Neurobiology of Aging 1, 45–52.

Brody,H. (1955). Organization of the cerebral cortex. III. A study of aging in the human

cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology 102:511–516.

Brody, H. (1970). Structural changes in the aging nervous system. Interdisciplinary Topics in

Gerontology 7, 9– 21

Burke, S. N., & Barnes, C. A. (2006). Neural plasticity in the ageing brain. Nature Reviews.

Neuroscience, 7(1), 30–40. https://doi.org/10.1038/nrn1809

Cabello, C. R., Thune, J. J., Pakkenberg, H., & Pakkenberg, B. (2002). Ageing of substantia

nigra in humans: cell loss may be compensated by hypertrophy. Neuropathology and

Applied Neurobiology, 28(4), 283–291.

Calderwood, S. K., Murshid, A., & Prince, T. (2009). The shock of aging: molecular

chaperones and the heat shock response in longevity and aging--a mini-review.

Gerontology, 55(5), 550–558. https://doi.org/10.1159/000225957

Calhoun, M. E., Kurth, D., Phinney, A. L., Long, J. M., Hengemihle, J., Mouton, P. R., …

Jucker, M. (1998). Hippocampal neuron and synaptophysin-positive bouton number in

aging C57BL/6 mice. Neurobiology of Aging, 19(6), 599–606.

Campos, L. M. G., Cruz-Rizzolo, R. J., & Pinato, L. (2015). The primate seahorse rhythm.

Brain Research, 1613, 81–91. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2015.03.054

Campos, Leila M. G., Osório, E. C., Santos, G. L. da S., Nogueira, M. I., Cruz-Rizzolo, R. J.,

& Pinato, L. (2015). Temporal changes in calcium-binding proteins in the medial

geniculate nucleus of the monkey Sapajus apella. Journal of Chemical Neuroanatomy,

68, 45–54. https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2015.07.005

Cavalcante, J. S., Britto, L. R. G., Toledo, C. A. B., Nascimento, E. S., Lima, R. R. M.,

Pontes, A. L. B., & Costa, M. S. M. O. (2008). Calcium-binding proteins in the circadian

https://doi.org/10.1038/nrn1809

https://doi.org/10.1159/000225957

https://doi.org/10.1016/j.brainres.2015.03.054


77

centers of the common marmoset (Callithrix jacchus) and the rock cavy (Kerodon

rupestris) brains. Brain Research Bulletin, 76(4), 354–360.

https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2008.02.028

Cayetanot, F., Deprez, J., & Aujard, F. (2007). Calbindin D28K protein cells in a primate

suprachiasmatic nucleus: localization, daily rhythm and age-related changes. The

European Journal of Neuroscience, 26(7), 2025–2032. https://doi.org/10.1111/j.1460-

9568.2007.05826.x

Celio, M. R. (1990). Calbindin D-28k and parvalbumin in the rat nervous system.

Neuroscience, 35(2), 375–475.

Chhieng, D. C., Yee, H., Schaefer, D., Cangiarella, J. F., Jagirdar, J., Chiriboga, L. A., …

Cohen, J. M. (2000). Calretinin staining pattern aids in the differentiation of

mesothelioma from adenocarcinoma in serous effusions. Cancer, 90(3), 194–200.

Collado, M., Blasco, M. A., & Serrano, M. (2007). Cellular senescence in cancer and aging.

Cell, 130(2), 223–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.07.003

Crassini, B., Brown, B., & Bowman, K. (1988). Age-related changes in contrast sensitivity in

central and peripheral retina. Perception, 17(3), 315–332.

https://doi.org/10.1068/p170315

Darchia, N., Campbell, I. G., & Feinberg, I. (2003). Rapid eye movement density is reduced

in the normal elderly. Sleep, 26(8), 973–977.

Dávila, J. C., Guirado, S., & Puelles, L. (2000). Expression of calcium-binding proteins in the

diencephalon of the lizard Psammodromus algirus. The Journal of Comparative

Neurology, 427(1), 67–92.

Derefeldt, G., Lennerstrand, G., & Lundh, B. (1979). Age variations in normal human contrast

sensitivity. Acta Ophthalmologica, 57(4), 679–690.

https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2008.02.028

https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.2007.05826.x

https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.2007.05826.x

https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.07.003

https://doi.org/10.1068/p170315

78

Di Lorenzo Alho, A. T., Suemoto, C. K., Polichiso, L., Tampellini, E., de Oliveira, K. C.,

Molina, M., … Grinberg, L. T. (2016). Three-dimensional and stereological

characterization of the human substantia nigra during aging. Brain Structure &

Function, 221(7), 3393–3403. https://doi.org/10.1007/s00429-015-1108-6

Diaz, F., Villena, A., Gonzalez, P., Requena, V., Rius, F., & Perez De Vargas, I. (1999).

Stereological age-related changes in neurons of the rat dorsal lateral geniculate

nucleus. The Anatomical Record, 255(4), 396–400.

Dibner, C., Schibler, U., & Albrecht, U. (2010). The mammalian circadian timing system:

organization and coordination of central and peripheral clocks. Annual Review of

Physiology, 72, 517–549. https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021909-135821

Dowiasch, S., Marx, S., Einhäuser, W., & Bremmer, F. (2015). Effects of aging on eye

movements in the real world. Frontiers in Human Neuroscience, 9.

https://doi.org/10.3389/fnhum.2015.00046

Edelstein, K., & Amir, S. (1996). Constant light induces persistent Fos expression in rat

intergeniculate leaflet. Brain Research, 731(1), 221–225. https://doi.org/10.1016/0006-

8993(96)00691-9

Edelstein, K., & Amir, S. (1999). The Role of the Intergeniculate Leaflet in Entrainment of

Circadian Rhythms to a Skeleton Photoperiod. Journal of Neuroscience, 19(1), 372–

380. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.19-01-00372.1999

Engelberth, Rovena C. G. J., Silva, K. D. de A., Fiuza, F. P., Soares, J. G., Costa, M. S. M.

O., Lima, R. R. de M., … Cavalcante, J. S. (2017). Retinal, NPY- and 5ht- inputs to the

aged suprachiasmatic nucleus in common marmosets (Callithrix jacchus).

Neuroscience Research, 121, 54–59. https://doi.org/10.1016/j.neures.2017.03.005

Engelberth, Rovena Clara G. J., Silva, K. D. de A., Azevedo, C. V. de M., Gavioli, E. C.,

Santos, J. R. dos, Soares, J. G., … Cavalcante, J. S. (2014). Morphological Changes

https://doi.org/10.1007/s00429-015-1108-6

https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021909-135821

https://doi.org/10.3389/fnhum.2015.00046

https://doi.org/10.1016/0006-8993(96)00691-9

https://doi.org/10.1016/0006-8993(96)00691-9

https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.19-01-00372.1999

https://doi.org/10.1016/j.neures.2017.03.005

79

in the Suprachiasmatic Nucleus of Aging Female Marmosets (Callithrix jacchus)

[Research article]. https://doi.org/10.1155/2014/243825

Esquiva, G., Lax, P., Pérez-Santonja, J. J., García-Fernández, J. M., & Cuenca, N. (2017).

Loss of Melanopsin-Expressing Ganglion Cell Subtypes and Dendritic Degeneration in

the Aging Human Retina. Frontiers in Aging Neuroscience, 9, 79.

https://doi.org/10.3389/fnagi.2017.00079

Fiuza, F. P., Aquino, A. C. Q., Câmara, D. A., Cavalcanti, J. R. L. P., Nascimento Júnior, E.

S., Lima, R. H., … Cavalcante, J. S. (2017). Region-specific glial hyperplasia and

neuronal stability of rat lateral geniculate nucleus during aging. Experimental

Gerontology, 100, 91–99. https://doi.org/10.1016/j.exger.2017.11.001

Fiuza, F. P., Silva, K. D. A., Pessoa, R. A., Pontes, A. L. B., Cavalcanti, R. L. P., Pires, R. S.,

… Cavalcante, J. S. (2016). Age-related changes in neurochemical components and

retinal projections of rat intergeniculate leaflet. Age (Dordrecht, Netherlands), 38(1), 4.

https://doi.org/10.1007/s11357-015-9867-9

Foster, T. C. (2007). Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged

brain. Aging Cell, 6(3), 319–325. https://doi.org/10.1111/j.1474-9726.2007.00283.x

Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G., Watson, C., & Rusznák, Z. (2015). Aging-dependent changes in

the cellular composition of the mouse brain and spinal cord. Neuroscience, 290, 406–

420. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2015.01.039

García-Amado, M., & Prensa, L. (2012). Stereological analysis of neuron, glial and

endothelial cell numbers in the human amygdaloid complex. PloS One, 7(6), e38692.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038692

Gazzaley, A. H., Thakker, M. M., Hof, P. R., & Morrison, J. H. (1997). Preserved number of

entorhinal cortex layer II neurons in aged macaque monkeys. Neurobiology of Aging,

18(5), 549–553.

https://doi.org/10.1155/2014/243825

https://doi.org/10.3389/fnagi.2017.00079


https://doi.org/10.1007/s11357-015-9867-9

https://doi.org/10.1111/j.1474-9726.2007.00283.x

https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2015.01.039

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038692

80

Geula, C., Bu, J., Nagykery, N., Scinto, L. F. M., Chan, J., Joseph, J., … Wu, C.-K. (2003).

Loss of calbindin-D28k from aging human cholinergic basal forebrain: relation to

neuronal loss. The Journal of Comparative Neurology, 455(2), 249–259.


Giannaris, E. L., & Rosene, D. L. (2012). A stereological study of the numbers of neurons

and glia in the primary visual cortex across the lifespan of male and female rhesus

monkeys. The Journal of Comparative Neurology, 520(15), 3492–3508.


Green, C. B., Takahashi, J. S., & Bass, J. (2008). The meter of metabolism. Cell, 134(5),

728–742. https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.08.022

Haldane, J. B. S. (1941). New Paths in Genetics. (1st edition). George Allen & Unwin.

Hamatake, M., Miyazaki, N., Sudo, K., Matsuda, M., Sadakata, T., Furuya, A., … Katoh-

Semba, R. (2011). Phase Advance of the Light-Dark Cycle Perturbs Diurnal Rhythms

of Brain-derived Neurotrophic Factor and Neurotrophin-3 Protein Levels, Which

Reduces Synaptophysin-positive Presynaptic Terminals in the Cortex of Juvenile Rats.

Journal of Biological Chemistry, 286(24), 21478–21487.

https://doi.org/10.1074/jbc.M110.195859

Hanley, T. (1974). “Neuronal fall-out” in the ageing brain: a critical review of the quantitative

data. Age and Ageing, 3(3), 133–151.

Hardeland, R., Coto-Montes, A., & Poeggeler, B. (2003). Circadian rhythms, oxidative stress,

and antioxidative defense mechanisms. Chronobiology International, 20(6), 921–962.

Harrington, M. E. (1997). The ventral lateral geniculate nucleus and the intergeniculate

leaflet: interrelated structures in the visual and circadian systems. Neuroscience and

Biobehavioral Reviews, 21(5), 705–727.




https://doi.org/10.1074/jbc.M110.195859

81

Harwerth, R. S., Wheat, J. L., & Rangaswamy, N. V. (2008). Age-related losses of retinal

ganglion cells and axons. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 49(10), 4437–

4443. https://doi.org/10.1167/iovs.08-1753

Haug, H., Kühl, S., Mecke, E., Sass, N. L., & Wasner, K. (1984). The significance of

morphometric procedures in the investigation of age changes in cytoarchitectonic

structures of human brain. Journal Fur Hirnforschung, 25(4), 353–374.

Hayflick, L., & Moorhead, P. S. (1961). The serial cultivation of human diploid cell strains.

Experimental Cell Research, 25(3), 585–621. https://doi.org/10.1016/0014-

4827(61)90192-6

Hayflick, Leonard. (2007). Biological aging is no longer an unsolved problem. Annals of the

New York Academy of Sciences, 1100, 1–13. https://doi.org/10.1196/annals.1395.001

Heizmann, C. W., & Braun, K. (1992). Changes in Ca(2+)-binding proteins in human

neurodegenerative disorders. Trends in Neurosciences, 15(7), 259–264.

Herculano-Houzel, S., & Lent, R. (2005). Isotropic fractionator: a simple, rapid method for the

quantification of total cell and neuron numbers in the brain. The Journal of

Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 25(10), 2518–

2521. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4526-04.2005

Hof, P. R., Nimchinsky, E. A., Young, W. G., & Morrison, J. H. (2000). Numbers of meynert

and layer IVB cells in area V1: a stereologic analysis in young and aged macaque

monkeys. The Journal of Comparative Neurology, 420(1), 113–126.

Hood, S., & Amir, S. (2017). The aging clock: circadian rhythms and later life.

https://doi.org/10.1172/JCI90328

Horowitz, S. S., Blanchard, J. H., & Morin, L. P. (2004). Intergeniculate leaflet and ventral

lateral geniculate nucleus afferent connections: An anatomical substrate for functional

https://doi.org/10.1167/iovs.08-1753

https://doi.org/10.1016/0014-4827(61)90192-6

https://doi.org/10.1016/0014-4827(61)90192-6

https://doi.org/10.1196/annals.1395.001

https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4526-04.2005

https://doi.org/10.1172/JCI90328

82

input from the vestibulo-visuomotor system. The Journal of Comparative Neurology,

474(2), 227–245. https://doi.org/10.1002/cne.20125

Hut, R. A., & Beersma, D. G. M. (2011). Evolution of time-keeping mechanisms: early

emergence and adaptation to photoperiod. Philosophical Transactions of the Royal

Society of London. Series B, Biological Sciences, 366(1574), 2141–2154.

https://doi.org/10.1098/rstb.2010.0409

Iacopino, A. M., & Christakos, S. (1990). Specific reduction of calcium-binding protein (28-

kilodalton calbindin-D) gene expression in aging and neurodegenerative diseases.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,

87(11), 4078–4082.

IBGE. (2013). Projeção da população por sexo e idade: Brasil 2000-2060.

Innominato, P. F., Roche, V. P., Palesh, O. G., Ulusakarya, A., Spiegel, D., & Lévi, F. A.

(2014). The circadian timing system in clinical oncology. Annals of Medicine, 46(4),

191–207. https://doi.org/10.3109/07853890.2014.916990

Innominato, P. F., Spiegel, D., Ulusakarya, A., Giacchetti, S., Bjarnason, G. A., Lévi, F., &

Palesh, O. (2015). Subjective sleep and overall survival in chemotherapy-naïve

patients with metastatic colorectal cancer. Sleep Medicine, 16(3), 391–398.

https://doi.org/10.1016/j.sleep.2014.10.022

Innominnato, P.F., Spiegel, D. (2018). Circadian rhythms, sleep and anti-cancer treatments.

In: Sleep, Health and society- from aetiology to public health. Oxford, UK: Clarendom

press

Jones, E. G. (2007). The Thalamus. Cambridge University Press.

Jyothi, H. J., Vidyadhara, D. J., Mahadevan, A., Philip, M., Parmar, S. K., Manohari, S. G., …

Alladi, P. A. (2015). Aging causes morphological alterations in astrocytes and microglia

in human substantia nigra pars compacta. Neurobiology of Aging, 36(12), 3321–3333.

https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2015.08.024


https://doi.org/10.1098/rstb.2010.0409

https://doi.org/10.3109/07853890.2014.916990

https://doi.org/10.1016/j.sleep.2014.10.022


83

Kanaan, N. M., Kordower, J. H., & Collier, T. J. (2010). Age-related changes in glial cells of

dopamine midbrain subregions in rhesus monkeys. Neurobiology of Aging, 31(6), 937–

952. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2008.07.006

Kang, T.-H., Reardon, J. T., Kemp, M., & Sancar, A. (2009). Circadian oscillation of

nucleotide excision repair in mammalian brain. Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 106(8), 2864–2867.

https://doi.org/10.1073/pnas.0812638106

Katoh-Semba, R., Tsuzuki, M., Miyazaki, N., Matsuda, M., Nakagawa, C., Ichisaka, S., …

Nagata, K. (2008). A phase advance of the light-dark cycle stimulates production of

BDNF, but not of other neurotrophins, in the adult rat cerebral cortex: association with

the activation of CREB. Journal of Neurochemistry, 106(5), 2131–2142.

https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2008.05565.x

Kennard, J. A., Brown, K. L., & Woodruff-Pak, D. S. (2013). Aging in the cerebellum and

hippocampus and associated behaviors over the adult life span of CB6F1 mice.

Neuroscience, 247, 335–350. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2013.06.002

Keuker, J. I. H., de Biurrun, G., Luiten, P. G. M., & Fuchs, E. (2004). Preservation of

hippocampal neuron numbers and hippocampal subfield volumes in behaviorally

characterized aged tree shrews. The Journal of Comparative Neurology, 468(4), 509–

517. https://doi.org/10.1002/cne.10996

Keuker, J. I. H., Luiten, P. G. M., & Fuchs, E. (2003). Preservation of hippocampal neuron

numbers in aged rhesus monkeys. Neurobiology of Aging, 24(1), 157–165.

Koga, H., Kaushik, S., & Cuervo, A. M. (2011). Protein homeostasis and aging: The

importance of exquisite quality control. Ageing Research Reviews, 10(2), 205–215.

https://doi.org/10.1016/j.arr.2010.02.001



https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2008.05565.x



https://doi.org/10.1016/j.arr.2010.02.001

84

Kondratov, R. V., Kondratova, A. A., Gorbacheva, V. Y., Vykhovanets, O. V., & Antoch, M. P.

(2006). Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core

componentof the circadian clock. Genes & Development, 20(14), 1868–1873.

https://doi.org/10.1101/gad.1432206

Kondratova, A. A., & Kondratov, R. V. (2012). The circadian clock and pathology of the

ageing brain. Nature Reviews. Neuroscience, 13(5), 325–335.


Ladd, A. A. B. L., Ladd, F. V. L., da Silva, A. A. P., Oliveira, M. F., de Souza, R. R., & Coppi,

A. A. (2012). SCG postnatal remodelling--hypertrophy and neuron number stability--in

Spix’s yellow-toothed cavies (Galea spixii). International Journal of Developmental

Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental

Neuroscience, 30(2), 129–137. https://doi.org/10.1016/j.ijdevneu.2011.12.002

Landfield, P. W. (1987). “Increased calcium-current” hypothesis of brain aging. Neurobiology

of Aging, 8(4), 346–347.

Lima, R. R. M., Pinato, L., Nascimento, R. B. S., Engelberth, R. C. G. J., Nascimento, E. S.,

Cavalcante, J. C., … Cavalcante, J. S. (2012). Retinal projections and neurochemical

characterization of the pregeniculate nucleus of the common marmoset (Callithrix

jacchus). Journal of Chemical Neuroanatomy, 44(1), 34–44.


Long, J. M., Kalehua, A. N., Muth, N. J., Hengemihle, J. M., Jucker, M., Calhoun, M. E., …

Mouton, P. R. (1998). Stereological estimation of total microglia number in mouse

hippocampus. Journal of Neuroscience Methods, 84(1–2), 101–108.

Long, J. M., Mouton, P. R., Jucker, M., & Ingram, D. K. (1999). What counts in brain aging?

Design-based stereological analysis of cell number. The Journals of Gerontology.

Series A, Biological Sciences and Medical Sciences, 54(10), B407-417.

https://doi.org/10.1101/gad.1432206


https://doi.org/10.1016/j.ijdevneu.2011.12.002


85

López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., & Kroemer, G. (2013). The

Hallmarks of Aging. Cell, 153(6), 1194–1217. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.039

Lupi, D., Semo, M., & Foster, R. G. (2012). Impact of age and retinal degeneration on the

light input to circadian brain structures. Neurobiology of Aging, 33(2), 383–392.


Madeira, M. D., Ferreira-Silva, L., Ruela, C., & Paula-Barbosa, M. M. (2001). Differential

effects of the aging process on the morphology of the hypothalamic ventromedial

nucleus of male and female rats. Neuroscience Letters, 314(1–2), 73–76.

Madeira, M. D., Sousa, N., Santer, R. M., Paula-Barbosa, M. M., & Gundersen, H. J. (1995).

Age and sex do not affect the volume, cell numbers, or cell size of the suprachiasmatic

nucleus of the rat: an unbiased stereological study. The Journal of Comparative

Neurology, 361(4), 585–601. https://doi.org/10.1002/cne.903610404

Mahoney, M. M., Nunez, A. A., & Smale, L. (2000). Calbindin and Fos within the

suprachiasmatic nucleus and the adjacent hypothalamus of Arvicanthis niloticus and

Rattus norvegicus. Neuroscience, 99(3), 565–575.

Martinez-Nicolas, A., Madrid, J. A., García, F. J., Campos, M., Moreno-Casbas, M. T.,

Almaida-Pagán, P. F., … Rol, M. A. (2018). Circadian monitoring as an aging predictor.

Scientific Reports, 8(1), 15027. https://doi.org/10.1038/s41598-018-33195-3

Martinez-Nicolas, Antonio, Madrid, J. A., & Rol, M. A. (2014). Day-night contrast as source of

health for the human circadian system. Chronobiology International, 31(3), 382–393.

https://doi.org/10.3109/07420528.2013.861845

Matute, C., & Streit, P. (1985). Selective retrograde labeling with D-[3H]-aspartate in

afferents to the mammalian superior colliculus. The Journal of Comparative Neurology,

241(1), 34–49. https://doi.org/10.1002/cne.902410104



https://doi.org/10.1002/cne.903610404

https://doi.org/10.1038/s41598-018-33195-3

https://doi.org/10.3109/07420528.2013.861845

https://doi.org/10.1002/cne.902410104

86

Melo, S. R., Nyengaard, J. R., da Roza Oliveira, F., Ladd, F. V. L., Abrahão, L. M. B.,

Machado, M. R. F., … Ribeiro, A. A. C. M. (2009). The developing left superior cervical

ganglion of Pacas (Agouti paca). Anatomical Record (Hoboken, N.J.: 2007), 292(7),

966–975. https://doi.org/10.1002/ar.20918

Melo, A. (2011). A saúde do idoso em 2030: uma análise prospectiva do gasto público na

saúde no Brasil. 2011. Dissertação (Saúde Pública)- Fundação Oswaldo Cruz.

Merrill, D. A., Roberts, J. A., & Tuszynski, M. H. (2000). Conservation of neuron number and

size in entorhinal cortex layers II, III, and V/VI of aged primates. The Journal of

Comparative Neurology, 422(3), 396–401.

Meskenaite, V., Krackow, S., & Lipp, H.-P. (2016). Age-Dependent Neurogenesis and

Neuron Numbers within the Olfactory Bulb and Hippocampus of Homing Pigeons.

Frontiers in Behavioral Neuroscience, 10. https://doi.org/10.3389/fnbeh.2016.00126

Moore, R. Y., & Speh, J. C. (1993). GABA is the principal neurotransmitter of the circadian

system. Neuroscience Letters, 150(1), 112–116.

Moore, Robert Y. (2016). Calretinin Neurons in the Rat Suprachiasmatic Nucleus. Journal of

Biological Rhythms, 31(4), 406–410. https://doi.org/10.1177/0748730416654024

Morin, L. P. (2013). Neuroanatomy of the extended circadian rhythm system. Experimental

Neurology, 243, 4–20. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2012.06.026

Morin, L. P., & Blanchard, J. H. (2005). Descending projections of the hamster

intergeniculate leaflet: relationship to the sleep/arousal and visuomotor systems. The

Journal of Comparative Neurology, 487(2), 204–216. https://doi.org/10.1002/cne.20546

Morterá, P., & Herculano-Houzel, S. (2012). Age-related neuronal loss in the rat brain starts

at the end of adolescence. Frontiers in Neuroanatomy, 6, 45.

https://doi.org/10.3389/fnana.2012.00045

https://doi.org/10.1002/ar.20918

https://doi.org/10.3389/fnbeh.2016.00126

https://doi.org/10.1177/0748730416654024

https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2012.06.026


https://doi.org/10.3389/fnana.2012.00045

87

Mouton, P. R., Pakkenberg, B., Gundersen, H. J., & Price, D. L. (1994). Absolute number

and size of pigmented locus coeruleus neurons in young and aged individuals. Journal

of Chemical Neuroanatomy, 7(3), 185–190.

Mouton, Peter R., Long, J. M., Lei, D.-L., Howard, V., Jucker, M., Calhoun, M. E., & Ingram,

D. K. (2002). Age and gender effects on microglia and astrocyte numbers in brains of

mice. Brain Research, 956(1), 30–35.

Moyer, J. R., Furtak, S. C., McGann, J. P., & Brown, T. H. (2011). Aging-related changes in

calcium-binding proteins in rat perirhinal cortex. Neurobiology of Aging, 32(9), 1693–

1706. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2009.10.001

Munoz, D. P., Broughton, J. R., Goldring, J. E., & Armstrong, I. T. (1998). Age-related

performance of human subjects on saccadic eye movement tasks. Experimental Brain

Research, 121(4), 391–400.

Nimi, K., Kanaseki, T., Takimoto, T. (1963). The comparative anatomy of the ventral nucleus

of the lateral geniculate body in mammals. J Comp Neurol. 121, 313-323. doi:

10.1002/cne.901210303

Ngwenya, L. B., Heyworth, N. C., Shwe, Y., Moore, T. L., & Rosene, D. L. (2015). Age-

related changes in dentate gyrus cell numbers, neurogenesis, and associations with

cognitive impairments in the rhesus monkey. Frontiers in Systems Neuroscience, 9.

https://doi.org/10.3389/fnsys.2015.00102

Ohm, T. G., Busch, C., & Bohl, J. (1997). Unbiased estimation of neuronal numbers in the

human nucleus coeruleus during aging. Neurobiology of Aging, 18(4), 393–399.

ONU. (2015). World Population Ageing. Department of Economics and Social Affairs,

Population Division


https://doi.org/10.3389/fnsys.2015.00102

88

Ouda, L., Burianova, J., & Syka, J. (2012). Age-related changes in calbindin and calretinin

immunoreactivity in the central auditory system of the rat. Experimental Gerontology,

47(7), 497–506. https://doi.org/10.1016/j.exger.2012.04.003

Owsley, C. (2011). Aging and vision. Vision Research, 51(13), 1610–1622.

https://doi.org/10.1016/j.visres.2010.10.020

Pakkenberg, B., & Gundersen, H. J. (1997). Neocortical neuron number in humans: effect of

sex and age. The Journal of Comparative Neurology, 384(2), 312–320.

Park, J. J., Tang, Y., Lopez, I., & Ishiyama, A. (2001). Age-related change in the number of

neurons in the human vestibular ganglion. The Journal of Comparative Neurology,

431(4), 437–443.

Paxinos, G., Watson, C. (2007). The rat brain atlas in stereotaxic coordinates, sixth ed.,

Academic press.

Paxinos, G., Watson, C. (2013). The rat brain atlas in stereotaxic coordinates, seventh ed.,

Academic press.

Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., & Pakkenberg, B. (2008). Neocortical glial cell

numbers in human brains. Neurobiology of Aging, 29(11), 1754–1762.


Perkins, A. E., Piazza, M. K., & Deak, T. (2018). Stereological Analysis of Microglia in Aged

Male and Female Fischer 344 Rats in Socially Relevant Brain Regions. Neuroscience,

377, 40–52. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2018.02.028

Peters, A., & Sethares, C. (1993). Aging and the Meynert cells in rhesus monkey primary

visual cortex. The Anatomical Record, 236(4), 721–729.

https://doi.org/10.1002/ar.1092360416

Petrash, J. M. (2013). Aging and age-related diseases of the ocular lens and vitreous body.

Investigative Ophthalmology & Visual Science, 54(14), ORSF54-59.



https://doi.org/10.1016/j.visres.2010.10.020



https://doi.org/10.1002/ar.1092360416


89

Pinato, L., Ramos, D., Hataka, A., Rossignoli, P. S., Granado, M. D., Mazzetto, M. C., &

Campos, L. M. G. (2017). Day/night expression of MT1 and MT2 receptors in

hypothalamic nuclei of the primate Sapajus apella. Journal of Chemical Neuroanatomy,

81, 10–17. https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2017.01.005

Pittendrigh, C. S. (1993). Temporal organization: reflections of a Darwinian clock-watcher.

Annual Review of Physiology, 55, 16–54.

https://doi.org/10.1146/annurev.ph.55.030193.000313

Powell, G., Roche, H., & Roche, W. R. (2011). Expression of calretinin by breast carcinoma

and the potential for misdiagnosis of mesothelioma. Histopathology, 59(5), 950–956.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2559.2011.04031.x

Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., & Balch, W. E. (2009). Biological and

chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of

Biochemistry, 78, 959–991. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.052308.114844

Roberts, D. E., Killiany, R. J., & Rosene, D. L. (2012). Neuron Numbers in the Hypothalamus

of the Normal Aging Rhesus Monkey: Stability Across the Adult Lifespan and Between

the Sexes. The Journal of Comparative Neurology, 520(6), 1181–1197.


Romijn, H. J., Sluiter, A. A., Wortel, J., Van Uum, J. F., & Buijs, R. M. (1998).

Immunocytochemical evidence for a diurnal rhythm of neurons showing colocalization

of VIP with GRP in the rat suprachiasmatic nucleus. The Journal of Comparative

Neurology, 391(3), 397–405.

Rubinow, M. J., & Juraska, J. M. (2009). Neuron and glia numbers in the basolateral nucleus

of the amygdala from preweaning through old age in male and female rats. The Journal

of Comparative Neurology, 512(6), 717–725. https://doi.org/10.1002/cne.21924


https://doi.org/10.1146/annurev.ph.55.030193.000313

https://doi.org/10.1111/j.1365-2559.2011.04031.x

https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.052308.114844



90

Sachdeva, U. M., & Thompson, C. B. (2008). Diurnal rhythms of autophagy: implications for

cell biology and human disease. Autophagy, 4(5), 581–589.

Satorre, J., Cano, J., & Reinoso-Suárez, F. (1985). Stability of the neuronal population of the

dorsal lateral geniculate nucleus (LGNd) of aged rats. Brain Research, 339(2), 375–

377.

Schiller, P. H., & Tehovnik, E. J. (2001). Look and see: how the brain moves your eyes

about. Progress in Brain Research, 134, 127–142.

Schmolesky, M. T., Wang, Y., Pu, M., & Leventhal, A. G. (2000). Degradation of stimulus

selectivity of visual cortical cells in senescent rhesus monkeys. Nature Neuroscience,

3(4), 384–390. https://doi.org/10.1038/73957

Shinohara, K., Tominaga, K., Fukuhara, C., Otori, Y., & Inouye, S. I. (1993). Processing of

photic information within the intergeniculate leaflet of the lateral geniculate body:

assessed by neuropeptide Y immunoreactivity in the suprachiasmatic nucleus of rats.

Neuroscience, 56(4), 813–822.

Simić, G., Kostović, I., Winblad, B., & Bogdanović, N. (1997). Volume and number of neurons

of the human hippocampal formation in normal aging and Alzheimer’s disease. The

Journal of Comparative Neurology, 379(4), 482–494.

Simons, M. J. P. (2009). The evolution of the cyanobacterial posttranslational clock from a

primitive “phoscillator.” Journal of Biological Rhythms, 24(3), 175–182.

https://doi.org/10.1177/0748730409333953

Siwak-Tapp, C. T., Head, E., Muggenburg, B. A., Milgram, N. W., & Cotman, C. W. (2008).

Region specific neuron loss in the aged canine hippocampus is reduced by enrichment.

Neurobiology of Aging, 29(1), 39–50.


https://doi.org/10.1038/73957

https://doi.org/10.1177/0748730409333953


91

Skene, D. J., & Swaab, D. F. (2003). Melatonin rhythmicity: effect of age and Alzheimer’s

disease. Experimental Gerontology, 38(1–2), 199–206.

Smith, D. E., Rapp, P. R., McKay, H. M., Roberts, J. A., & Tuszynski, M. H. (2004). Memory

impairment in aged primates is associated with focal death of cortical neurons and

atrophy of subcortical neurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of

the Society for Neuroscience, 24(18), 4373–4381.


Spear, P. D. (1993). Neural bases of visual deficits during aging. Vision Research, 33(18),

2589–2609.

Sterio, D. C. (1984). The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using

the disector. Journal of Microscopy, 134(Pt 2), 127–136.

Tomaru, U., Takahashi, S., Ishizu, A., Miyatake, Y., Gohda, A., Suzuki, S., … Kasahara, M.

(2012). Decreased proteasomal activity causes age-related phenotypes and promotes

the development of metabolic abnormalities. The American Journal of Pathology,

180(3), 963–972. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2011.11.012

Trindade, L. S., Aigaki, T., Peixoto, A. A., Balduino, A., Mânica da Cruz, I. B., & Heddle, J. G.

(2013). A novel classification system for evolutionary aging theories. Frontiers in

Genetics, 4, 25. https://doi.org/10.3389/fgene.2013.00025

Villa, A., Podini, P., Panzeri, M. C., Racchetti, G., & Meldolesi, J. (1994). Cytosolic Ca2+

Binding Proteins during Rat Brain Ageing: Loss of Calbindin and Calretinin in the

Hippocampus, with no Change in the Cerebellum. European Journal of Neuroscience,

6(9), 1491–1499. https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.1994.tb01010.x

Weismann, A., Shipley, A. E., & Press, A. the C. (2010). Essays Upon Heredity and Kindred

Biological Problems. BiblioLife.


https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2011.11.012

https://doi.org/10.3389/fgene.2013.00025

https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.1994.tb01010.x

92

West, M. J. (1993). Regionally specific loss of neurons in the aging human hippocampus.

Neurobiology of Aging, 14(4), 287–293.

West, M. J., Slomianka, L., & Gundersen, H. J. (1991). Unbiased stereological estimation of

the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical

fractionator. The Anatomical Record, 231(4), 482–497.

https://doi.org/10.1002/ar.1092310411

West, Mark J. (2012). Basic Stereology for Biologists and Neuroscientists (1 edition). Cold

Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Woodruff-Pak, D. S., Foy, M. R., Akopian, G. G., Lee, K. H., Zach, J., Nguyen, K. P. T., …

Thompson, R. F. (2010). Differential effects and rates of normal aging in cerebellum

and hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, 107(4), 1624–1629. https://doi.org/10.1073/pnas.0914207107

Yates, M. A., Markham, J. A., Anderson, S. E., Morris, J. R., & Juraska, J. M. (2008).

Regional variability in age-related loss of neurons from the primary visual cortex and

medial prefrontal cortex of male and female rats. Brain Research, 1218, 1–12.


Yeoman, M., Scutt, G., & Faragher, R. (2012). Insights into CNS ageing from animal models

of senescence. Nature Reviews. Neuroscience, 13(6), 435–445.


Zaidi, A. (2008). Features and Challenges of Population Ageing: The European Perspective.

European Centre – PolicyBrief

Zhang, Y., Brainard, G. C., Zee, P. C., Pinto, L. H., Takahashi, J. S., & Turek, F. W. (1998).

Effects of aging on lens transmittance and retinal input to the suprachiasmatic nucleus

in golden hamsters. Neuroscience Letters, 258(3), 167–170.

https://doi.org/10.1002/ar.1092310411




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