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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA CELULAR
DANIEL CHAVES DE LIMA
RESPOSTA DE Chromobacterium violaceum CULTIVADA EM ALTA CONCENTRAÇÃO DE FERRO
NATAL-RN 2012
DANIEL CHAVES DE LIMA
RESPOSTA DE CHROMOBACTERIUM VIOLACEUM CULTIVADA EM ALTA CONCENTRAÇÃO DE FERRO
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros
NATAL 2012
Como sempre, dedico este trabalho aos meus pais pela excelente educação
que me deram, pelo apoio sempre presente e por serem os exemplos pelos
quais me espelho como pessoa. Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
Mais um ciclo se fechando e muitas pessoas foram responsáveis por
este desfecho.
Agradeço, primeiramente, aos meus pais Evanildo e Vanice. Obrigado,
por apoiar toda e qualquer decisão que tomo, pelos conselhos experientes e
advertências que tornam minha vida longe de vocês um pouco mais fácil. Amo
vocês.
À Mariana por, simplesmente, ser você mesma e continuar comigo.
Sempre. Obrigado pela companhia, pelo cuidado, pela preocupação, enfim, por
tudo o que você faz. Je t’aime.
A toda minha família (irmã, tios e tias, primos e primas, avós e avô e
sogra), que apesar de estarem distantes, estão sempre torcendo pelo meu
sucesso. Obrigado vovó Alice, pelo exemplo de bondade.
A família Chromo (Raí, Vivi e Jana) pelas contribuições que permitiram a
conclusão desse trabalho e, principalmente, Fábio. Mais que um tutor ou um
coorientador, um amigo divertido que me aconselha dentro e fora da vida
acadêmica. Espero que nossa parceria continue sempre.
Ao time da faculdade: Ysa, Diego, Manel, Cris e, especialmente,
Priscilla, João e Ricardo. Vocês são como irmãos e irmãs e tenho certeza que
sempre poderei contar com o apoio de vocês. Saibam que também podem
contar comigo.
A todos os amigos do LBMG/LAMA pelas ótimas experiências. Muitas
vezes vou ao laboratório apenas para rir e me descontrair com vocês.
Aos amigos da minha turma de mestrado. Aprendi bastante com vocês.
À Prof.ª Silvia Batistuzzo por continuar comigo e acreditar na minha
capacidade e vontade.
A todo o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, especialmente
dona Margarita (desculpa por incomodar tanto) e aos professores Hugo e João
Paulo, pelas boas conversas.
À Deus. Apesar de não ser muito religioso, sei que o Senhor cuida de
mim e dos que estão ao meu redor.
Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.
Nada faz correr mais o tempo e abrevia mais o caminho do que um pensamento capaz de absorver em si mesmo todas as faculdades mentais daquele que pensa. A vida exterior
assemelha-se então a um sono de que esse pensamento é o sonho. Graças a ele, o tempo
perde a medida, o espaço perde a distância. Partimos de um lugar e chegamos a outro, e
isso é tudo. Do intervalo percorrido, nada permanece em nossa lembrança, a não ser
um nevoeiro difuso, no qual se diluem mil imagens confusas de árvores, montanhas e
paisagens.
Alexandre Dumas, Os Três Mosqueteiros
RESUMO
A Chromobacterium violaceum é uma β-proteobactéria Gram-negativa encontrada amplamente em regiões tropicais e subtropicais, cujo genoma foi sequenciado em 2003 mostrando grande versatilidade metabólica e potencial biotecnológico e farmacêutico. Dada à grande quantidade de ORFs relacionadas com o metabolismo de ferro descritas no genoma da C. violaceum, a importância deste metal para diversos processos biológicos e devido à carência de dados a respeito das conseqüências do excesso do ferro em organismos de vida livre, é importante estudar o mecanismo de resposta desta bactéria em meio repleto com ferro. Trabalhos anteriores mostram que a C. violaceum apresenta resistência a grandes concentrações desse metal, embora ainda não tenha sido descrito qual mecanismo é utilizado para esta sobrevivência. Assim, visando elucidar a resposta da C. violaceum cultivada em alta concentração de ferro e esperando-se obter genes candidatos para serem utilizados em processos de biorremediação, o presente trabalho utilizou a abordagem de proteômica em shotgun e Biologia de Sistemas para avaliar a resposta de C. violaceum cultivada na presença e ausência de 9 mM de ferro. A análise identificou 531 proteínas, sendo 71 expressas exclusivamente pela bactéria cultivada na presença do metal e 100 apenas na condição controle. O aumento na expressão de proteínas relacionadas com o ciclo do TCA possivelmente representa uma reprogramação metabólica na bactéria causada pela grande concentração de ferro no meio. Além disso, foi observado um aumento no ensaio de atividade das enzimas Superóxido dismutase e Catalase, bem como no ensaio de Atividade Antioxidante Total, sugerindo que o metal está induzindo um quadro de estresse oxidativo em C. violaceum, que passou a aumentar os níveis de violaceína e enzimas antioxidantes para melhor se adaptar à condição emergente. Também faz parte da resposta adaptativa a alteração na expressão de proteínas relacionados a transporte, inclusive de ferro, e com a resposta quimiotáxica, o que levaria a bactéria a mudar a orientação de sua locomoção afastando-se do metal. Os dados de Biologia de Sistemas também sugerem uma reprogramação metabólica com mecanismos coordenados por gargalos proteicos envolvidos com transcrição (GreA), metabolismo energético (Rpe e TpiA) e metilação (AhcY). Palavras-chave : estresse; bottleneck; proteoma; biologia de sistemas.
ABSTRACT
The Chromobacterium violaceum is a β-proteobacterium Gram-negative widely found in tropical and subtropical regions, whose genome was sequenced in 2003 showing great metabolic versatility and biotechnological and pharmaceutical potential. Given the large number of ORFs related to iron metabolism described in the genome of C. violaceum, the importance of this metal for various biological processes and due to lack of data about the consequences of excess of iron in free-living organisms, it is important to study the response mechanism of this bacterium in a culture filled with iron. Previous work showed that C. violaceum is resistant to high concentrations of this metal, but has not yet been described the mechanism which is used to this survival. Thus, to elucidate the response of C. violaceum cultured in high concentrations of iron and expecting to obtain candidate genes for use in bioremediation processes, this study used a shotgun proteomics approach and systems biology to assess the response of C. violaceum grown in the presence and absence of 9 mM of iron. The analysis identified 531 proteins, being 71 exclusively expressed by the bacteria grown in the presence of the metal and 100 just in the control condition. The increase in expression of proteins related to the TCA cycle possibly represents a metabolic reprogramming of the bacteria caused by high concentration of iron in the medium. Moreover, we observed an increase in the activity assay of superoxide dismutase and catalase as well as in Total Antioxidant Activity assay, suggesting that the metal is inducing oxidative stress in C. violaceum that increases the levels of violacein and antioxidant enzymes to better adapt to the emerging conditions. Are also part of the adaptive response changes in expression of proteins related to transport, including iron, as well as an increased expression of proteins related to chemotaxis response, which would lead the bacteria to change the direction of its movement away from the metal. Systems Biology results, also suggest a metabolic reprogramming with mechanisms coordinated by bottleneck proteins involved in transcription (GreA), energy metabolism (Rpe and TpiA) and methylation (AhcY). Key-words: stress; bottleneck; proteome; systems biology.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura química da violaceína. Adaptado de: Durán et al.
(2007).................................................................................................................17
FIGURA 2 Biossíntese da violaceína. Adaptado de: Ryan et al.
(2008).................................................................................................................19
FIGURA 3 Reação de Fenton. Adaptado de Touati, (2000)..............................23
FIGURA 4. Reação espontânea na qual ocorre a formação do íon ferroso.
Adaptado de Harrison e Arosio (1996)..............................................................23
FIGURA 5. Reação de Haber-Weiss. Adaptado de Harrison e Arosio (1996)..23
FIGURA 6. Esquema da reação bioquímica envolvida no ensaio para detecção
de superóxido dismutase. Fonte: Manual do kit Superoxido Dismutase Assay
(706002).............................................................................................................32
FIGURA 7 Curva de crescimento de Chromobacterium violaceum. Cada ponto
representa a média de triplicatas biológicas......................................................37
FIGURA 8 Perfil antioxidante em Chromobacterium violaceum, após exposição
ao ferro. A) Ensaio de atividade enzimática da enzima catalase. B) Atividade
enzimática da enzima Superóxido Dismutase. C) Atividade antioxidante total do
extrato protéico total de C. violaceum. Cada coluna representa o valor médio de
três experimentos independentes. * p <
0,05....................................................................................................................38
FIGURA 9 Diagrama de Venn mostrando a quantidade de proteínas detectadas
em cada condição. C = Controle negativo; F = Tratamento com ferro..............39
FIGURA 10 Distribuição dos principais processos biológicos (P) detectados na
análise de proteômica. A) Classificação das proteínas que aumentaram a
expressão ou surgiram após o tratamento. B) Classificação das proteínas que
diminuíram a expressão ou desapareceram após o tratamento........................40
FIGURA 11 Medidas de centralidade (Rede Fe+) plotadas em um gráfico
Betweenness X Node Degree. Os nós com altos valores em ambos os índices
(Bottlenecks) e que possuem grande probabilidade de interligarem processos,
estão destacados na figura, com seus respectivos nomes ao
lado....................................................................................................................42
FIGURA 12 Medidas de centralidade (Rede Fe-) plotadas em um gráfico
Betweenness X Node Degree. Os nós com altos valores em ambos os índices
(Bottlenecks) e que possuem grande probabilidade de interligarem processos,
estão destacados na figura, com seus respectivos nomes ao
lado....................................................................................................................42
FIGURA 13 A) Rede de interação de proteínas do grupo Fe+. O input das
proteínas foram os dados obtidos a partir das analises de proteômica. Os
bottlenecks estão destacados em diferentes cores (ver texto). B e C ,
representam os clusters obtidos a partir do plugin MCODE............................44
FIGURA 14 A) Rede de interação de proteínas do grupo Fe-. O input das
proteínas foram os dados obtidos a partir das analises de proteômica. Os
bottlenecks estão destacados em diferentes cores (ver texto). B, C, D, e E
representam os clusters obtidos a partir do plugin MCODE............................45
Figura 15 Integração do metabolismo energético em C. violaceum. O aumento
da expressão das enzimas com ferro em seu centro ativo está levando a uma
maior ativação do ciclo do TCA e do ciclo do Glioxilato. Entretanto, a segunda
etapa da glicólise está sendo inibida, enquanto a primeira etapa está mais
ativada. Consequentemente está havendo um acúmulo de Gliceraldeído 3-
fosfato, que pode estar sendo utilizado no mecanismo de adaptação de C.
violaceum...........................................................................................................52
FIGURA 16 Modelo do mecanismo adaptativo proposto para C. violaceum em
resposta ao ferro. A) O aumento de ferro no citoplasma leva a uma maior
expressão de enzimas com ferro em seu centro catalítco, como as que estão
envolvidas no ciclo do TCA; B) O aumento do metabolismo energético causado
pelas ferro-enzimas induz a produção de ânions superoxido pela cadeia
transportadora de elétrons; C) A dismutação dos ânions superóxidos pela
Superóxido dismutase (SOD) leva a uma maior produção de Peróxido de
hidrogênio. Estes podem estar sendo decompostos por peroxidases diferentes
da catalase ou outros compostos como o piruvato (ver discussão). Ao mesmo
tempo, o excesso de peróxido está reagindo com o ferro livre, produzindo
radicais hidroxila; D) Fatores de transcrição relacionados com a expressão de
enzimas antioxidantes podem estar sendo sensibilizados pelo ferro livre, o que
inibe a produção dessas enzimas, como a tioredoxina; E) Glutationas
Transferases, juntamente com a violaceína, podem estar antagonizando o
estresse oxidativo causado pelo ferro; F) Para balancear a grande quantidade
de ferro no citoplasma, está ocorrendo a diminuição da expressão de proteínas
transportadores responsáveis pela entrada do metal, enquanto que outras
relacionadas com a saída do ferro estão sendo produzidas em maior
quantidade; G) Aumento da resposta quimotáxica induzida pelo ferro. O metal
interage com proteínas quimiotáticas aceptoras de metil (MCPs) que
transmitem o sinal para o sistema quimiossensório, induzindo a uma mudança
na rotação flagelar, o que causa o afastamento da bactéria do ambiente
inóspito; H) As setas vermelhas indicam os processos coordenados pelas
proteínas bottlenecks (ver discussão)...............................................................66
Figura 1 (Apêndice) SDS-PAGE das proteínas totais extraídas de C. violaceum.
M = Marcador de peso molecular. 1-3 representam os extratos protéicos totais
de C. violaceum cultivada sem adição de ferro; 4-6 representam os extratos
protéicos totais de C. violaceum cultivada com adição de 9mM de ferro. As
grades mostram os fragmentos que foram excisados para posterior digestão in
gel....................................................................................................................105
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Proteínas identificadas na condição Fe+. As ORFs com *
representam as proteínas que foram expressas exclusivamente após o
tratamento.........................................................................................................88
TABELA 2 Proteinas que deixaram de ser expressas na condição de cultivo
com ferro...........................................................................................................94
TABELA 3 Proteínas que tiveram a sua expressão diminuída na condição de
cultivo com ferro................................................................................................98
TABELA 4 ORFs hipotéticas encontradas na condição Fe+. As ORFs com *
foram expressas exclusivamente após o tratamento com o
ferro..................................................................................................................104
SUMÁRIO
1. Introdução ............................................................................................................................... 16
1.1. Chromobacterium violaceum ........................................................................................... 16
1.2. O ferro e sua importância biológica para os microrganismos ......................................... 21
1.3. Proteômica, Biologia de Sistemas e a Era Pós-genômica ................................................. 24
2. Objetivos ................................................................................................................................. 29
2.1. Objetivo geral ................................................................................................................... 29
2.2. Objetivos específicos ........................................................................................................ 29
3. Metodologia ............................................................................................................................ 30
3.1. Condições de cultivo, curva de crescimento e tratamento com FeSO4 ........................... 30
3.2. Extração de proteínas ...................................................................................................... 30
3.3. Avaliação da atividade antioxidante de C. violaceum ...................................................... 31
3.4. SDS-PAGE .......................................................................................................................... 32
3.5. Digestão in gel e extração dos peptídeos ........................................................................ 33
3.6. Análise de espectrometria de massas e análise in silico .................................................. 33
3.7. Anotação das proteínas pelo Gene Ontology (GO) .......................................................... 35
3.8. Análises de Bioinformática ............................................................................................... 35
3.9. Análises de Biologia de Sistemas ...................................................................................... 35
4. Resultados ............................................................................................................................... 37
4.1. Crescimento relativo de C. violaceum .............................................................................. 37
4.2. Perfil antioxidante de C. violaceum .................................................................................. 37
4.3. Análise de LC-MS/MS ....................................................................................................... 38
4.4. Análises de biologia de sistemas ...................................................................................... 41
5. Discussão ................................................................................................................................. 48
5.1. Metabolismo energético .................................................................................................. 48
5.2. O papel da violaceína ....................................................................................................... 52
5.3. Quimiotaxia ...................................................................................................................... 54
5.4. Proteínas Relacionadas a Transporte ............................................................................... 55
5.5. Proteínas relacionadas ao estresse .................................................................................. 56
5.6. Proteínas Hipotéticas ....................................................................................................... 58
5.7. Ferric uptake regulator..................................................................................................... 59
5.8. Proteínas do metabolismo geral ...................................................................................... 60
15
5.9. Biologia de Sistemas ......................................................................................................... 60
6. Conclusões ............................................................................................................................... 68
7. Considerações finais e perspectivas ........................................................................................ 69
8. Referências .............................................................................................................................. 70
9. Apêndice .................................................................................................................................. 88
16
1. Introdução
1.1. Chromobacterium violaceum
Primeiramente descrita no final do século XIX por Boisbaudran (1882),
Chromobacterium violaceum é uma β-proteobactéria Gram-negativa
encontrada amplamente em regiões tropicais e subtropicais. Trata-se de um
bacilo móvel, anaeróbio facultativo pertencente à ordem Neisseriales e à
família Neisseriaceae (GARRITY e HOLT, 2001). O interesse por esta bactéria
vem desde o final da década de 1970 em que diversos estudos foram
realizados visando às propriedades terapêuticas de seus produtos metabólicos
(CALDAS, 1978; DURAN, 1989; HUNGRIA, 2004). No Brasil, além da Região
Amazônica, esta bactéria é encontrada em outros dois ecossistemas: no
Cerrado e na Mata Atlântica, de forma que os três ecossistemas representam
juntos quase 50% da área de toda região Neotropical (LIMA-BITTENCOURT et
al., 2007).
Com quase quatro décadas de pesquisas realizadas sobre C. violaceum,
foi observado que esta bactéria possui grande potencial biotecnológico, com
aplicabilidade em várias áreas. Duran e Menk (2001) descreveram, em uma
completa revisão, enzimas e metabólitos encontrados nessa bactéria,
conferindo a ela inúmeras propriedades industriais e farmacológicas. Por
exemplo, a bactéria produz potencializadores de antibióticos como os
glicopeptídeos beta-lactâmicos SQ28,504 e SQ28,546 que agem em bactérias
Gram-negativas (COOPER et al., 1984; COOPER et al., 1985), além de
aerocianidina, um antibiótico que atua tanto em bactérias Gram-negativas
quanto em Gram-positivas (PARKER et al., 1988). C. violaceum também
produz substâncias que são intermediários do analgésico alfamenina B (ZII,
1984; OHUCHI et al., 1997), o depsipeptídeo antitumoral FR901228, que
apresentou citotoxicidade contra várias linhagens de células tumorais como
câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de cólon e leucemia (NAKAJIMA et
al., 1998). Entre as aplicabilidades industriais podemos citar a síntese de
homopolímeros como o 3-hidroxivalerato (polihidroxivalerato) e
polihidroxialcanoatos de cadeia curta (PHAs) que podem ser usados na
produção de plásticos biodegradáveis (SHERWOOD, 1983). Esses bioplásticos
são grandes candidatos a substituírem os polímeros derivados do petróleo e
17
possuem aplicações médicas e na indústria (KOLIBACHUK et al., 1999;
STEINBÜCHEL et al., 1993).
Entretanto, a característica mais notável da C. violaceum é a produção
de um pigmento de cor púrpura escuro o qual lhe confere esse nome, a
violaceína. Trata-se de um metabólito secundário com massa molecular de
343,3 daltons e que se apresenta insolúvel em água, pouco solúvel em etanol,
moderadamente solúvel em dioxano e acetona e apresenta-se totalmente
solúvel em DMSO, metanol e acetato de etila (DURAN et al., 2007). Esta
substância se decompõe acima de 270ºC e possui três picos de absorbância:
258, 372 e 575 nm (RETTORI e DURÁN, 1998). Além da C. violaceum, outras
bactérias produzem esse pigmento, dentre elas a Chromobacterium lividum, a
bactéria psicrotrófica RT 102 e a Alteromonas luteociolacea (SHIRATA et al.,
1997; NAKAMURA et al., 2003; LAATSCH e THOMSON, 1984). A violaceína
teve sua estrutura química primeiramente estudada no fim da década de 1920
(REILLY e PYNE, 1927), e foi isolada pela primeira vez apenas em 1944
(STRONG, 1944). Apesar disso, foi apenas em 1958, através de estudos de
degradação e síntese que o composto teve sua estrutura deduzida
(BELLATINE et al., 1958), sendo confirmada depois através de análise de
espectroscopia (LAATSCH e THOMSON, 1984) (Figura 1).
Figura 1. Estrutura química da violaceína. Adaptado de: Durán et al. (2007).
Diversas funções biológicas foram sugeridas para esse pigmento, entre
elas a de que a violaceína seria um pigmento respiratório, uma vez que foi
observado um aumento na atividade respiratória quando um extrato de
violaceína foi adicionado a uma suspensão de células não-pigmentadas de C.
violaceum (FRIEDHEIM, 1936). Foi sugerido também que o pigmento estaria
18
envolvido na regulação da produção do triptofano, visto que este aminoácido é
tóxico para a bactéria em altas concentrações (DEMOSS, 1967). Apesar disso,
nenhum desses papéis são aceitos, visto que foi observado que C. violaceum
não necessita do pigmento para sobreviver e crescer (SIVENDRA e LO, 1975;
DURAN e FALJONI-ALARIO, 1980). Hoje, acredita-se que a violaceína está
envolvida na proteção contra radiação, uma vez que a bactéria é amplamente
encontrada exposta em águas e solos de regiões tropicais e subtropicais
(VASCONCELLOS e CRECZYNSKI-PASA, 2004). Apesar disso, esta hipótese
ainda não foi investigada, de forma que, até hoje, ainda não existe nenhum
dado experimential que sugira, com segurança, o papel biológico deste
pigmento.
Houveram várias tentativas para se descrever a via biossintética da
violaceína, com estudos antigos descrevendo a necessidade de oxigênio
molecular e L-triptofano para sua síntese (DEMOSS e EVANS, 1959) e a
origem dos átomos de O, N e H foi determinada por meio de estudos com
isótopos radiativos (HOSHINO et al., 1987). Em 2000, August e colaboradores
descreveram a provável via metabólica para a biossíntese da violaceína. Esta
via é composta por várias enzimas cujos genes fazem parte do operon da
violaceína (VioA-E) e também por outros genes que não estão codificados
neste operon (VASCONCELLOS e CRECZYNSKI-PASA, 2004; BALIBAR e
WALSH, 2006; RYAN et al., 2008). A síntese da violaceína envolve a união de
dois triptofanos e a produção deste metabólito secundário está sob controle de
mecanismos de quorum sensing através de auto indutores como os acil-
homoserina-lactona (AHL) (CHERNIN et al., 1998) (Figura 2).
19
Figura 2. Biossíntese da violaceína. Adaptado de: Ryan et al. (2008).
A violaceína possui grandes atributos farmacológicos como toxicidade
contra vários tipos celulares, entre eles leveduras (PEREIRA et al., 2005) e
fibroblastos (MELO et al., 2000). Foi visto também que este pigmento
apresenta atividade antitumoral com indução de apoptose em células de
leucemia mieloide em humanos (MELO et al., 2003; FERREIRA et al., 2004)
bem como ação citotóxica em outras linhagens de células tumorais (DURAN et
al., 2007). Além disso, o pigmento apresenta potencial microbicida contra
20
bactérias Gram-negativas e, principalmente, contra Gram-positivas como a
Mycobacterium tuberculosis (SOUZA et al., 1999; DURAN, et al., 1983; DURAN
et al., 1990). A violaceína também foi relacionada com ação antifúngica
(BARRETO et al., 2008), antileishmaniose (LEON et al., 2001),
tripanossomicida (DURÁN, 1994) e foi visto que esse metabólito também
apresenta atividade antiviral, com a inibição de células infectadas por poliovírus
e vírus da herpe (MAY et al., 1991).
Devido ao seu grande valor biotecnológico, o genoma da
Chromobacterium violaceum foi sequenciado pela Rede Nacional de
Sequenciamento Nucleotídico. A linhagem sequenciada foi a ATCC 12472,
isolada de águas da cidade de Mentekab, Malásia (HUNGRIA et al., 2005).
Esta linhagem foi escolhida por ser a linhagem tipo (SNEATH, 1984) e por ser
utilizada em vários estudos no Brasil. O genoma completo de C. violaceum
consiste de um único cromossomo circular de 4.751.080 pares de base e uma
média de G + C de 64,83%. A bactéria possui 4.431 quadros de leitura aberta
(ORFs) e constatou-se que cerca de 40% dessas ORFs não possuem uma
função identificada, sendo classificados como hipotéticos ou hipotéticos
conservados (VASCONCELOS et al., 2003). Comparando o genoma de C.
violaceum com outros organismos foi vista uma maior semelhança com
Ralstonia solanacearum (17,4%), Neisseria meningitidis (9,75%) e
Pseudomonas aeruginosa (9,61%). O aparato genético dessa bactéria permite
que ela prospere em diversas condições ambientais já que possui um versátil
metabolismo de geração de energia, capaz de explorar uma ampla variedade
de recursos (VASCONCELOS et al., 2003). O sequenciamento também
mostrou a presença de 496 ORFs classificadas como proteínas de membrana
relacionadas com transporte, indicando a versatilidade da C. violaceum em
controlar a concentração de várias substâncias em seu meio intracelular
(GRANGEIRO et al., 2004). O genoma possui também uma ampla variedade
de genes relacionados à aclimatação ao estresse. Isso era de se esperar
considerando-se a notável abundância dessa bactéria no Rio Negro, o que é
indicativo de sua habilidade de suportar uma variedade de condições
ambienteis adversas como escassez de nutrientes, altas temperaturas, altos
níveis de radiação e elevadas concentrações de agentes tóxicos como
21
espécies reativas de oxigênio (HUNGRIA et al., 2004). Foi visto que C.
violaceum possui genes relacionados com várias vias de reparo de DNA,
incluindo as vias: reparo por reversão direta do dano, reparo por excisão de
base, reparo por excisão de nucleotídeo, reparo mismatch, reparo
recombinacional e resposta SOS, bem como a presença de genes de reparo
duplicados, o que sugere uma defesa mais elaborada contra danos no DNA
(DUARTE et al., 2004). C. violaceum possui ainda, inúmeros genes com ação
biotecnológica como, por exemplo, biorremediação, visto que foram
encontrados operons envolvidos na resistência ao arsênico (AZEVEDO et al.,
2008) e ao cianeto, genes capazes de reduzir compostos halógenos a formas
menos tóxicas e outros genes que podem ser usados na redução de impactos
provocados por metal (ouro, por exemplo) em áreas de garimpo, além do
controle de pragas na agricultura (CAREPO et al., 2004).
Além disso, foi observada a presença de um grande número de genes
em C. violaceum relacionados com o metabolismo de ferro. Entre estes,
encontram-se 35 genes envolvidos no transporte e armazenamento desse
metal, indicando a sua grande relevância para a bactéria (VASCONCELOS et
al., 2003).
1.2. O ferro e sua importância biológica para os mi crorganismos
O ferro é o segundo metal mais abundante da crosta terrestre, perdendo
apenas para o alumínio (AROSIO e HARRISON, 1996). Ele é considerado um
metal pesado, pois possui alta densidade e é tóxico para os organismos
quando presentes em grandes concentrações (ALLOWAY, 1990). Uma das
propriedades desse metal, que vem sendo amplamente utilizada pelos
organismos, é a sua capacidade de trocar de valência. Por se tratar de um
metal de transição, o ferro é capaz de adotar tanto uma forma ferrosa reduzida
(Fe2+) ou uma forma férrica oxidada (Fe3+) (HASS et al., 2008). Nos valores de
pH que ficam em torno do neutro (pH 7,0), o ferro existe primariamente na
forma insolúvel, tanto na forma ferrosa quanto na férrica (CORNELL e
SCHWERTMANN, 2003). A solubilidade do Fe3+ aumenta em valores de pH
baixos (STUMM e MORGAN, 1996) e em valores abaixo de pH 4,0 a forma
reduzida (Fe2+) existe em espécies aquosas, mesmo na presença de oxigênio
(WEBER et al., 2006). Essa capacidade do ferro de ganhar e de perder
22
elétrons torna-o um dos principais mediadores das reações de oxido-redução
de forma que, sozinho ou incorporado em agregados de ferro-enxofre ou
grupos heme, o ferro é indispensável para uma variedade de processos
celulares incluindo respiração, ciclo do ácido tricarboxílico, inibição de estresse
oxidativo, bem como a síntese de aminoácidos, desoxiribonucleotídeos,
lipídeos e esteróis (HASS et al., 2008).
O ferro também é um componente muito importante relacionado ao
processo de patogenicidade de microrganismos, uma vez que o processo de
multiplicação de bactérias dentro do hospedeiro requer, entre outros nutrientes,
uma quantidade mínima de ferro, o que torna este metal um fator limitante para
organismos patogênicos (MIETZNER e MORSE, 1994). Dessa forma, todos os
microrganismos precisam de ferro, porém a disponibilidade deste é limitada na
maioria dos ambientes aeróbios, uma vez que é encontrado somente em
complexos minerais insolúveis ou ligados a proteínas com grupos prostéticos
de ferro pertencentes a mamíferos ou a plantas (HUNGRIA et al., 2004). Por
isso, muitos organismos desenvolveram maneiras eficientes de obter ferro sob
condições ambientais desfavorecidas. Um importante mecanismo são os
clusters gênicos que codificam enzimas e receptores que reconhecem
componentes quelantes de ferro com baixo peso molecular, chamados de
sideróforos. Esses sideróforos são secretados no ambiente onde se ligam ao
ferro no estado férrico com alta afinidade em um mecanismo crucial para
aumentar a competitividade e adaptação em diferentes condições ambientais
(LANKFORD, 1973; CROSA, 1989).
Outro exemplo de moléculas relacionadas com a captura de ferro são as
enterobactinas. Essas moléculas estão envolvidas no transporte de ferro no
sentido ambiente-citoplasma, e estudos mostram que mutantes de E. coli
deficientes em enzimas relacionadas com a produção de enterobactinas
possuem dificuldades no crescimento em ambientes deficientes em ferro
(ARMSTRONG et al., 1989; CODERRE e EARHART, 1989). Hungria e
colaboradores (2004) e Grangeiro e colaboradores (2004) descrevem uma
série de genes de Chromobacterium violaceum que estão relacionados com a
síntese de enterobactinas e outros compostos relacionados com a captura e
23
transporte de ferro, mostrando que esta bactéria está bem adaptada a
ambientes contendo este metal.
Embora o ferro em excesso não possua ação genotóxica uma vez que
não é capaz de reagir com o DNA, esse metal pode promover a reação de
Fenton a qual produz espécies reativas de oxigênio e estes sim têm atividade
genotóxica e mutagênica (AROSIO e HARRISON, 1996). Nessa reação, o íon
ferroso (Fe2+) não complexado reage com o peróxido de hidrogênio, que
também não possui efeito direto sobre o DNA. Durante a reação (Figura 3),
ocorre a oxidação do íon ferroso e a decomposição do peróxido de hidrogênio,
levando à produção de radicais hidroxilas que podem causar danos a qualquer
macromolécula biológica (TOUATI, 2000).
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH● + OH-
Figura 3. Reação de Fenton. Adaptado de Touati, (2000).
Outra reação envolvendo o ferro e que pode levar, indiretamente, à
formação de espécies reativas de oxigênio é a Reação de Haber-Weiss
(HABER e WEISS, 1934). Esta é a soma de duas reações: a Reação de
Fenton e outra reação espontânea na qual o superóxido reduz o íon férrico
(Fe3+), de forma que há a produção do íon ferroso mais oxigênio (Figura 4). Por
sua vez, o Fe2+ pode reagir com o peróxido de hidrogênio, produzindo radicais
hidroxila que têm potencial de reagir com o DNA e outras biomoléculas como
proteínas e lipídeos (Figura 5).
O2●- + Fe3+ Fe2+ + O2
Figura 4. Reação espontânea na qual ocorre a formação do íon ferroso. Adaptado de Harrison
e Arosio (1996).
O2●- + H2O2 + O2 + OH- + OH●
Figura 5. Reação de Haber-Weiss. Adaptado de Harrison e Arosio (1996).
24
Dessa forma, quando o ambiente está com um excesso de ferro, pode
ocorrer uma desregulação no metabolismo desse metal, levando a um aumento
da concentração intracelular do íon ferroso na bactéria, que por sua vez pode
provocar as reações supra citadas, levando à produção de radicais hidroxila
que poderão reagir diretamente com o material genético levando a uma
instabilidade genômica.
1.3. Proteômica, Biologia de Sistemas e a Era Pós-g enômica
Com os avanços da tecnologia, cresce, a cada dia, o número de
organismos que tiveram seu material genético totalmente sequenciado. Em
junho de 2012, segundo o NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), os genomas de
mais de 12.400 procariontes já estavam disponíveis nos bancos de dados e
esse valor cresce, paralelamente, com os avanços tecnológicos (YATES et al.,
2009). Por outro lado, pouco progresso vem sendo feito em acessar toda essa
informação visto que o conhecimento de todos os genes de um determinado
organismo não é suficiente para entender sua fisiologia. Dessa forma, uma
nova área de estudo surge na era pós-genômica: a Genômica Funcional. Esse
campo utiliza abordagens e técnicas que estudam além da função do gene, sua
interação e relação com metabólitos, mRNA, proteínas entre outros (SAITO e
MATSUDA, 2010). Um dos alvos da Genômica Funcional é o trascriptoma, o
conjunto de todos os genes expressos por um organismo em uma determinada
condição. A Trascriptômica é a área responsável por esse estudo e utiliza,
principalmente, técnicas de DNA Microarray para determinar a regulação
transcricional dos genes através de seus mRNAs (SÁNCHEZ-PLA et al., 2012).
A Proteômica é a terceira “ômica” e trata de estudar as informações
referentes à estrutura, identificação, modificação, quantificação, localização e
função das proteínas de um determinado organismo, bem como as interações
que ocorrem entre aquelas (TOMANEK, 2011; YATES et al., 2009). Proteoma é
o equivalente de genoma para as proteínas. Estas, por sua vez são os
principais componentes das células com inúmeras funcionalidades como ação
catalítica, sinalização molecular, transporte de substâncias e interações físicas
entre os constituintes celulares. Isso, além do fato das proteínas serem o
produto final da expressão da maioria dos genes, realça a importância da
proteômica para o entendimento dos organismos.
25
O estudo da proteômica inclui duas áreas distintas de pesquisa: a
expressão das proteínas e as suas interações (BLACKSTOCK e WEIR, 1999).
O principal objetivo de se estudar a expressão de proteínas é estabelecer
mapas quantitativos e qualitativos de expressão de proteínas em condições
específicas como diferentes estímulos ambientais e estados de doença, por
exemplo (TOMANEK, 2011). Esta abordagem é especialmente útil em estudos
durante desenvolvimento de drogas ou estudos toxicológicos em que é de
interesse traçar todo o perfil do proteoma em resposta a alguma perturbação
fisiológica e identificar proteínas biomarcadoras cujos níveis de expressão
possam ser usados para diagnosticar doenças ou avaliar a eficiência de drogas
(BAHOU, 2012; HAN et al., 2012). Os dados gerados por esta abordagem da
proteômica permitem atingir objetivos como identificar as proteínas envolvidas
em rotas metabólicas relacionadas aos diferentes processos celulares;
identificar novos alvos farmacológicos e marcadores biológicos, relacionados
ao processo de estabelecimento e progressão de doenças; a identificação de
moléculas bioativas a partir de extratos biológicos naturais, levando ao
desenvolvimento de novos fármacos; caracterização das respostas celulares a
determinadas drogas, doenças e mudanças ambientais (SILVA et al., 2007). Já
a abordagem de interação de proteínas cuida da caracterização específica de
interações proteína-proteína e da formação de complexos proteicos (SAITO e
MATSUDA, 2010). A identificação de interações entre proteínas facilita o
estudo de processos específicos, vias metabólicas e leva ao desenvolvimento
de mapas de interação para vários tipos de células e condições, aumentando
nosso entendimento das redes intracelulares (SAITO e MATSUDA, 2010;
BLACKSTOCK e WEIR, 1999).
Auxiliando no estudo de interações de proteínas, a Biologia de Sistemas
surge como uma ferramenta que procura entender de maneira dinâmica e
global como os vários componentes de um complexo biológico ou estado
fisiológico cooperam ou se comunicam, lançando mão de outras áreas como
matemática, química e computação (SMITH e FIGEYS, 2006). Visto que o
funcionamento de uma célula não depende apenas das proteínas, a Biologia de
Sistemas investiga a interação entre outros componentes como DNA, RNA,
vias de sinalização, metabólitos e outras pequenas moléculas, que
26
coordenadamente, permitem a sobrevivência de um organismo a uma
determinada condição (ALBERT, 2005). Estas interações, por sua vez, podem
ser representadas graficamente por meio de redes de interações. Neste
diagrama, os componentes (DNA, RNA, Proteína, entre outros) são designados
como “nós” que se comunicam com os outros componentes por meio de
“conectores”, que por sua vez podem especificar um ponto de início e de fim ou
podem não especificar nenhuma direção (ALBERT, 2005).
Apesar de os diagramas de interações terem a sua importância, também
é necessário compreender o sentido, o fluxo, o padrão ou qualquer outra
informação contida nestas interações (KITANO, 2002). Assim, alguns índices
estatísticos auxiliam as análises de Biologia de Sistemas. Por exemplo, os nós
de uma determinada rede podem ser caracterizados pela quantidade de
conexões que faz com outros nós adjacentes, o que é conhecido como Node
Degree (ALBERT, 2005). Nós com altos valores de Node Degree são referidos
como “hubs” e estes, caso sejam removidos do organismo (por meio de
mutações, por exemplo), podem ser letais dada a grande quantidade de
processos que interliga (ARMSTRONG et al., 2006). Outro conceito importante
em Biologia de Sistemas é o de Betweenness. Originalmente introduzido por
Freeman (1977) como uma nova medida de centralidade para redes sociais,
Betweenness refere-se, de maneira simplista, à menor distância existente entre
um par de nós. A maioria dos “caminhos” mais curtos dentro de uma rede
passa por nós com altos valores de betweenness, de forma que estes nós
tornam-se pontos centrais na comunicação entre processos biológicos (YU et
al., 2007). Por fim, um dos conceitos mais importantes dentro da Biologia de
Sistemas é o de Bottleneck (ou gargalo). Proteínas (ou nós) Bottlenecks
possuem altos valores de betweenness e de node degree e, dessa forma,
representam os componentes de redes que interligam grandes quantidades de
processos (YU et al., 2007; FELTES et al., 2011). Dessa forma, caso esses
gargalos sejam removidos das redes, haverá uma interrupção entre o fluxo dos
diferentes processos, evidenciando a importância dos bottlenecks. De fato, Yu
e colaboradores (2007) avaliam a importância desta medida e confirmam que
os gargalos são conectores chaves em redes de interações de proteínas.
27
Todos esses parâmetros mencionados acima fornecem informações
importantes que tornam as análises de Biologia de Sistemas uma poderosa
ferramenta para o estudo de complexos biológicos, permitindo uma visão global
e dinâmica dos dados fornecidos a partir de técnicas de alto rendimento, além
de identificar os principais componentes regulatórios de um dado mecanismo
fisiológico.
Dessa forma, vários estudos utilizando abordagens da genômica
funcional vêm sendo realizados para investigar as conseqüências tanto do
excesso quanto da carência de ferro em microrganismos (CRESTANI et al.,
2012; MIYAMOTO et al., 2009; LAFRENTZ et al., 2009; WINTERS et al., 2008;
EBANKS et al., 2004). Estes trabalhos utilizam, em sua maioria, abordagem
bottom-up de proteômica que traz resultados similares do efeito de
desequilíbrios na homeostasia do ferro, principalmente para organismos
patogênicos. Em contrapartida, poucos trabalhos são realizados investigando
as conseqüências do excesso de ferro em microrganismos de vida livre.
Estudos prévios em nosso laboratório mostram que a C. violaceum apresenta
ampla capacidade de resistência e tolerância a metais, inclusive ao ferro,
quando comparadas com E. coli (LEAL, comunicação pessoal; BRITO,
comunicação pessoal). De acordo com Leal, C. violaceum apresenta
capacidade de sobrevivência prolongada em concentrações de até 8 mM de
ferro, o que é uma concentração superior a que maioria de outros
microrganismos suportam. Além disso, dados do genoma mostram que C.
violaceum possui 50 ORFs relacionadas ao metabolismo de ferro, o que, em
comparação com outros genomas bacterianos, é um número considerável o
que indica grande capacidade de resistência a este metal (HUNGRIA et al.,
2004). Não obstante, nenhum desses estudos relacionou o cultivo em
condições de excesso de ferro com a ocorrência de estresse oxidativo, apesar
de, como mencionado acima, este metal ser capaz de produzir, por meio da
reação de Fenton, espécies reativas de oxigênio. Estudos iniciais de
proteômica em nosso laboratório mostraram que, a partir de 9 mM, é possível
observar mobilização de bandas do extrato protéico total de C. violaceum em
SDS-PAGE, indicando que esta concentração está induzindo mudanças no
metabolismo da bactéria (LIMA, comunização pessoal). Apesar disso, nenhum
28
ensaio foi realizado para verificar a ocorrência de estresse oxidativo, ou
identificar qual padrão protéico está sendo utilizado como resposta da bactéria
a esta concentração de ferro.
Assim, utilizando a Proteômica em shotgun e a Biologia de Sistemas
como ferramentas, procuramos entender a resposta da Chromoabcterium
violaceum cultivada em 9 mM de ferro, contribuindo para o entendimento da
biologia deste microrganismo. Além disso, dada a grande quantidade de ORFs
com funções desconhecidas, esperamos ter encontrado genes candidatos que
possam vir a ser utilizados em biorremediação ou novas proteínas relacionadas
à adaptação ao estresse.
29
2. Objetivos:
2.1. Objetivo geral
Elucidar a resposta de Chromobacterium violaceum cultivada em alta
concentração de ferro.
2.2. Objetivos específicos
• Verificar o padrão de crescimento de C. violaceum cultivada em 9 mM de
ferro;
• Mensurar a atividade antioxidante da bactéria por meio da quantificação
das enzimas catalase e superóxido dismutase, bem como analisar a
atividade antioxidante total da bactéria na presença e ausência do ferro;
• Identificar o padrão de expressão proteica de C. violaceum cultivada na
presença e ausência de ferro;
• Identificar, por meio de Biologia de Sistemas, os principais bottlenecks
responsáveis pela resposta da bactéria ao ferro;
• Propor um mecanismo de resposta da bactéria cultivada em alta
concentração desse metal.
30
3. Metodologia
3.1. Condições de cultivo, curva de crescimento e t ratamento com FeSO 4
Colônias isoladas de Chromobacterium violaceum cepa ATCC 12472
foram inoculadas previamente em meio Luria Bertani (LB) líquido por 16-18
horas a 28 ºC e sob agitação de 200 rpm.
O tratamento foi realizado em Erlenmeyer contendo o cultivo prévio de
bactéria e meio LB líquido (1:10) em um volume final de 100 mL. A solução de
FeSO4 foi previamente filtrada em filtros Acrodisk GSF GHP 0,2 µm PALL e
adicionada em uma concentração final de 9 mM. O controle negativo consistiu
apenas de C. violaceum mais meio de cultura. A duração do tratamento foi de 4
horas sob as mesmas condições mencionadas acima. O controle negativo e a
condição experimental do tratamento foram realizados em triplicata biológica.
Para comparar o padrão de crescimento da bactéria no meio com e sem
adição do metal, foi realizada uma curva de crescimento. Dessa maneira, o
tratamento supracitado foi realizado e a densidade óptica (OD) com
absorbância em 720 nm foi verificada nos seguintes tempos nas duas
condições: 0h, 2h, 4h, 6h e 8h. Todos os experimentos foram realizados em
triplicata biológica.
3.2. Extração de proteínas
Após o tratamento, as amostras foram centrifugadas a 2880 g, 4ºC por
20 minutos. Após descartar o sobrenadante, todas as amostras (inclusive o
controle negativo) foram ressuspendidas em EDTA 50 mM pH 8,0. Em seguida,
as amostras foram centrifugadas novamente nas mesmas condições
anteriores. Ao final deste processo, as amostras foram lavadas em solução de
Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e centrifugadas a 2880g, 4 ºC por 25 minutos. As
células foram lisadas em 400 µL – 300 µL tampão de extração contendo Uréia
7 M, Tiouréia 1M, DTT 50 mM, CHAPS 0,5% e Tris 30 mM pH 8,5. Para
precipitar as proteínas foi adicionando 1 mL de acetona, seguido da agitação
das amostras em vortex e finalmente centrifugando a 10000 g, 4 ºC por 3
minutos. Este processo foi realizado uma segunda vez, centrifugando
novamente por 5 minutos. Finalmente, as proteínas foram solubilizadas no
mesmo tampão de extração (900 µL - 300 µL).
31
3.3. Avaliação da atividade antioxidante de C. violaceum
Com intuito de avaliar se o tratamento com ferro altera o nível de
estresse oxidativo em Chromobacterium violaceum, a atividade das enzimas
antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) foi mensurada no
extrato protéico total na 4ª hora de crescimento utilizando os kits: Catalase
Assay Kit 707002 e Superoxide Dismutase Assay Kit 706002 (Cayman
Chemical, Ann Arbor, MI) de acordo com as recomendações do fabricante. A
concentração protéica das amostras foi determinada pelo método de Bradford e
utilizada para normalizar a atividade enzimática detectada.
O kit utilizado para catalase (Catalase Assay Kit) fundamenta-se na
função peroxidásica da catalase para a determinação da atividade enzimática.
O método é baseado na reação da enzima com metanol, na presença de uma
concentração ótima de H2O2. O metanol que serve de substrato para atividade
peroxidásica da catalase não é utilizado por outras peroxidases. O formaldeído
produzido é medido espectrofotometricamente utilizando-se o 4-amino-3-
hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) como cromógeno. O Purpald reage
especificamente com aldeídos e o produto dessa reação, ao sofrer oxidação,
origina um produto de coloração roxa. A atividade é mensurada lendo-se a
absorbância em 540 nm.
Para a dosagem dos níveis de SOD o kit utiliza um sal tetrazólio para a
detecção de O2• gerados pela xantina oxidase e hipoxantina, sendo uma
unidade de SOD definida como a quantidade de enzima necessária para
dismutar 50% do O2•. O ensaio avalia todos os três tipos de SOD (Cu/Zn, Mn e
FeSOD) verificando-se a absorbância em 450 nm (Figura 6).
Figura 6. Esquema da reação bioquímica envolvida no ensaio para detecção de superóxido
dismutase. Fonte: Manual do kit Superoxido Dismutase Assay (706002).
O ensaio de Atividade Antioxidante Total (AAT) foi realizado utilizando o
Antioxidant Assay kit da Sigma
ensaio é a formação do radical mioglobina ferril a partir da metmioglobina e do
peróxido de hidrogênio, o
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico), produzindo o radical catiônico ABTS·+, um
cromógeno de cor verde detectável espectrofotometricamente a 405 nm.
Os antioxidantes suprimem a produção do radical catiônico
dependentemente da concentração de forma que quanto maior a quantidade
de agentes antioxidantes, menor a intensidade colorimétrica emitida. O
TroloxTM, um análogo da Vitamina E, foi utilizado na preparação da curva
padrão.
3.4. SDS-PAGE
Os extratos protéicos tot
(1976) e 20 µg de proteínas de cada amostra foram resolvidas em gel de
poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS
utilizado foi o Precision Plus Proteins
gel foi corado usando o Coomassie Coloidal da Sigma
Figura 6. Esquema da reação bioquímica envolvida no ensaio para detecção de superóxido
dismutase. Fonte: Manual do kit Superoxido Dismutase Assay (706002).
O ensaio de Atividade Antioxidante Total (AAT) foi realizado utilizando o
da Sigma-Aldrich (CS0790). O princípio utilizado neste
ensaio é a formação do radical mioglobina ferril a partir da metmioglobina e do
peróxido de hidrogênio, o qual oxida o ABTS (2,2’
ácido sulfônico), produzindo o radical catiônico ABTS·+, um
cromógeno de cor verde detectável espectrofotometricamente a 405 nm.
Os antioxidantes suprimem a produção do radical catiônico
emente da concentração de forma que quanto maior a quantidade
de agentes antioxidantes, menor a intensidade colorimétrica emitida. O
, um análogo da Vitamina E, foi utilizado na preparação da curva
Os extratos protéicos totais foram quantificados pelo método de Bradford
(1976) e 20 µg de proteínas de cada amostra foram resolvidas em gel de
poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) a 12%. O marcador
utilizado foi o Precision Plus ProteinsTM WesternCTM Standard da
gel foi corado usando o Coomassie Coloidal da Sigma-Aldrich.
32
Figura 6. Esquema da reação bioquímica envolvida no ensaio para detecção de superóxido
dismutase. Fonte: Manual do kit Superoxido Dismutase Assay (706002).
O ensaio de Atividade Antioxidante Total (AAT) foi realizado utilizando o
Aldrich (CS0790). O princípio utilizado neste
ensaio é a formação do radical mioglobina ferril a partir da metmioglobina e do
qual oxida o ABTS (2,2’-azino-bis(3-
ácido sulfônico), produzindo o radical catiônico ABTS·+, um
cromógeno de cor verde detectável espectrofotometricamente a 405 nm.
Os antioxidantes suprimem a produção do radical catiônico
emente da concentração de forma que quanto maior a quantidade
de agentes antioxidantes, menor a intensidade colorimétrica emitida. O
, um análogo da Vitamina E, foi utilizado na preparação da curva
ais foram quantificados pelo método de Bradford
(1976) e 20 µg de proteínas de cada amostra foram resolvidas em gel de
PAGE) a 12%. O marcador
Standard da Bio-Rad. O
33
3.5. Digestão in gel e extração dos peptídeos
Após o final da eletroforese, cada lane foi excisado em nove fragmentos
conforme a densidade de proteínas. A digestão dos fragmentos foi realizada de
acordo com a adaptação do protocolo de Shevchenko e colaboradores (1996).
Para remover o corante e o SDS, os fragmentos foram lavados três vezes em
solução de acetonitrila (ACN) 50% e bicarbonato de amônio 10 mM. Em
seguida, os géis foram desidratados em ACN a 100%, reduzidos com ditiotreitol
(DTT) 10 mM à temperatura ambiente e alquilados com iodacetamida (IAA) 50
mM em ambiente escuro. Os fragmentos foram lavados mais uma vez com
bicarbonato de amônio 100 mM. Novamente os fragmentos foram desidratados
com ACN 100% e reidratados com bicarbonato de amônio 100 mM. Após mais
uma desidratação com ACN a 100%, os géis foram hidratados em solução de
tripsina (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade da Promega [v5280]),
preparada de acordo as instruções do fabricante. Foram aplicados de 35-50 µL
de tripsina em banho de gelo. Em seguida, foi adicionado bicarbonato de
amônio 50 mM, o suficiente para cobrir os géis que foram incubados a 37ºC por
16-18 horas.
Para extrair os peptídeos, foram adicionados de 10-30 µL de ácido
fórmico 5% sobre os géis. Após incubação de 10 minutos em temperatura
ambiente, o sobrenadante contendo parte dos peptídeos foi transferido para
outro tubo. Em seguida, foi adicionada a segunda solução de extração (ácido
fórmico 5% e ACN 50%) em um volume suficiente para cobrir os géis que
foram incubados por 10 minutos, em temperatura ambiente. O sobrenadante
mais uma vez foi transferido para o tubo previamente separado, contendo os
peptídeos já extraídos. A extração de peptídeos feita com a segunda solução
foi realizada mais uma vez. Finalmente, a solução contendo os peptídeos
digeridos foi concentrada em Concentrator Plus da Eppendorf.
3.6. Análise de espectrometria de massas e análise in silico
Após a digestão in gel as amostras foram carregadas no sistema de
cromatografia líquida NanoAcquity UPLC (Waters) acoplado a um
espectrômetro de massas do tipo ESI-Q-Tof premier (Waters). Os peptídeos
trípticos de cada amostra (4,5 µL) foram separados em uma coluna BEH130-
34
C18 (100µm × 100 mm) em um fluxo de 600 nL/min. O gradiente foi de 2-98%
de ACN em ácido fórmico de 0,1% durante 45 minutos. O modo de operação
do instrumento foi o “top three”. Neste modo, um espectro MS é adquirido
seguido pelo MS/MS dos três mais intensos picos detectados. Os espectros
foram adquiridos utilizando o programa MassLynx v.4.1 e os arquivos de
extensão raw foram convertidos em formato de lista de picos (mgf) utilizando o
Mascot Distiller 2.2.1.0, 2008, (Matrix Science Ltda) contra o banco de dados
de proteínas não-redundantes de Chromobacterium violaceum ATCC 12472
baixados do NCBI em 24 de Janeiro de 2012. A busca utilizou como
modificação fixa a carbamidometilação, oxidação de metionina como
modificação variável, uma clivagem perdida pela tripsina e tolerância de erro de
massa de 0.1 Da, tanto para o íon precursor ou para o fragmento. Apenas
peptídeos com score significativo (p < 0,05) calculado pelo Mascot foram
analisados. Após a análise inicial do Mascot, os resultados obtidos de todas as
três replicatas de cada condição foram concatenados utilizando o modo merge
do programa.
Em seguida, os dados foram organizados e normalizados utilizando o
programa Scaffold (Proteome Software, Inc., Portland, OR; versão v1_17_00).
Os parâmetros utilizados foram: peptídeos identificados considerando no
mínimo 60% de probabilidade, pelo menos um peptídeo detectado para cada
proteína e as proteínas foram identificadas se atingiram no mínimo 50% de
probabilidade. Além disso, foi utilizado um filtro de score do Mascot, levando
em consideração as cargas dos peptídeos (+1 >40, +2 > 30, +3 > 30, +4 > 40).
Considerando os parâmetros acertados obtivemos o False Discovery Rate
(FDR) menor ou igual a 1%. A contagem espectral dos peptídeos identificados
tanto no controle quanto no tratamento foi utilizada para descrever a mudança
relativa das proteínas entre as duas condições. Proteínas que apresentaram
mudança relativa menor ou igual a 0,5 representam aquelas que aumentaram a
sua expressão em resposta ao tratamento com o ferro. As que tiveram
mudança relativa maior ou igual a 1,5 foram consideradas proteínas que
diminuíram a sua expressão na condição experimental. Proteínas entre 0,5 e
1,5 estão no grupo protéico constitutivo de C. violaceum.
35
3.7. Anotação das proteínas pelo Gene Ontology (GO)
As categorias funcionais das proteínas foram obtidas com o programa
Blast2GO (http://www.blast2go.org) (CONESA et al., 2005). Nessa análise, a
ferramenta escolhida usa as sequências FASTA das proteínas que são
alinhadas usando-se a ferramenta BLAST contra os bancos de dados do NCBI.
Todos os parâmetros utilizados estavam no modo default. Assim, com base em
similaridade de sequências, o programa realizou a anotação das proteínas nos
três domínios do Gene Ontology: Função Molecular (F), Processo Biológico (P)
e Componente Celular (C). Gráficos de Pizza foram gerados pelo Blast2GO
representando as anotações do GO.
3.8. Análises de Bioinformática
As comparações das sequências protéicas foram realizadas por meio da
ferramenta BLAST (ALTSCHUL et al., 1990). As proteínas hipotéticas e/ou
hipotéticas conservadas detectadas no trabalho foram reanotadas, a fim de
verificarmos se estas continuavam com funções indefinidas. Aquelas que
continuaram sem função estabelecida mesmo após o alinhamento, tiveram
seus domínios funcionais identificados no Conserved Domain Database (CDD)
(MARCHLER-BAUER et al., 2011).
3.9. Análises de Biologia de Sistemas
Para desenhar as redes de interação de proteína-proteína relacionadas
com a resposta ao ferro, a ferramenta de metabusca STITCH 3.1
(http://stitch.embl.de) foi utilizada. Duas redes iniciais foram criadas: 1) uma
composta pelas proteínas que foram expressas exclusivamente no tratamento
com o ferro ou que aumentaram a expressão após a exposição ao metal e 2)
outra rede criada com as proteínas que deixaram de ser expressas ou
diminuíram a expressão após o tratamento com o ferro. O STITCH é um
recurso utilizado para explorar interações conhecidas e preditas entre proteínas
ou agentes químicos ou físicos. Esses agentes estão ligados a outros agentes
e proteínas por evidências derivadas de experimentos, banco de dados e
literatura. Como os alvos de interação foram provenientes de dados
36
experimentais, um índice de baixa confidência (0.150) foi utilizado para gerar
as redes, permitindo um maior número de interações entre os nós. Todos os
métodos de predição foram ativos: Neighborhood, Gene Fusion, Co-
occurrence, Co-expression, Experiments, Databases e Textmining.
As redes montadas foram exportadas e subsequentemente analisadas
no Cytoscape 2.8.2 (SMOOTH et al,. 2010). Para selecionar as subredes de
proteínas mais relevantes dentro do interatoma, o plugin do Cytoscape MCODE
(Molecular Complex Detection) v. 1.32 foi utilizado (BADER e HOGUE, 2003).
Os parâmetros da análise do MCODE foram: inclusão de loops; degree cutoff
2; opção haircut ativada (o que leva a deleção do cluster de nós com uma única
conexão); opção de fluff ativada; node score cutoff de 0.2; K-core 2 e maximum
depth de 100. Apenas os clusters gerados com índice acima ou igual a 2.5
foram usados.
Os cálculos de centralidade das redes foram computados a partir das
redes e topologias locais. Os nós Bottlenecks das redes foram identificados
por meio do gráfico Betweenness X Node Degree com valores gerados pelo
plugin CestiScaPe 1.21. Betweenness indica a extensão em que um nó
específico está entre todos os outros nós dentro de uma rede e, em geral,
mostra a influência de um nó sobre a propagação da informação dentro da rede
(NEWMAN, 2005; FELTES et al., 2011). Node Degree corresponde à
quantidade de conexões que um nó específico faz com outros nós adjacentes.
Altos índices de Node degree são denominados “hubs” (YU et al., 2007). Dessa
forma, um nó específico com altos valores de Node Degree e de Betweenness
representa um Bottleneck, ou seja, uma proteína que interliga muitos processos
biológicos (FELTES et al., 2011)
A classificação funcional dos nós e clusters foi realizada pelo plugin
BiNGO 2.44 (MAERE et al., 2005). As categorias foram computadas usando
distribuição hipergeométrica e a correção de testes múltiplos foi acessada
aplicando o algoritmo de False Discovery Rate (FDR) implementado pelo
BiNGO com nível de significância de P < 0.05. O organismo selecionado para a
anotação das categorias funcionais foi o Pseudomonas syringae.
37
4. Resultados
4.1. Crescimento relativo de C. violaceum
Com o objetivo de avaliar a interferência do ferro no crescimento de C.
violaceum, foi realizada uma curva de crescimento com e sem adição desse
metal (Figura 7). Foi observada uma evidente diferença no crescimento a partir
de 4 horas de cultivo, indicando que o ferro está inibindo o crescimento
populacional da bactéria impedindo-a de alcançar a fase log de crescimento.
Figura 7 Curva de crescimento de Chromobacterium violaceum. Cada ponto representa a média de triplicatas biológicas.
4.2. Perfil antioxidante de C. violaceum
Visando verificar se a concentração de ferro estabelecida para a
proteômica gerava um estresse oxidativo, as atividades enzimáticas da
catalase e superoxido dismutase foram mensuradas, assim como foi realizada
uma avaliação da atividade antioxidante total do extrato protéico de C.
violaceum.
As atividades das enzimas catalase (Figura 8A) e superóxido dismutase
(Figura 8B) bem como a atividade antioxidante total (Figura 8C), aumentaram
de forma significativa na 4ª hora de tratamento realizado com 9 mM de ferro,
indicando que a presença do metal está induzindo um quadro de estresse
oxidativo em C. violaceum.
38
Figura 8. Perfil antioxidante em Chromobacterium violaceum, após exposição ao ferro. A) Ensaio de atividade enzimática da enzima catalase. B) Atividade enzimática da enzima Superóxido Dismutase. C) Atividade antioxidante total do extrato protéico total de C. violaceum. Cada coluna representa o valor médio de três experimentos independentes. * p < 0,05.
4.3. Análise de LC-MS/MS
As proteínas totais foram resolvidas em SDS-PAGE seguida de digestão
in gel (Apêndice, Figura 1) com posterior identificação por espectrometria de
massas. A análise feita no programa Scaffold identificou um total de 531
proteínas (Figura 9). Desse total, 100 proteínas são exclusivas da condição
controle e 71 exclusivas da condição tratada com ferro. Das 360 proteínas
encontradas em ambas as condições, 61 aumentaram a sua expressão
enquanto que 124 diminuíram a expressão na presença de ferro.
A
C
B
Figura 9 Diagrama de Venn mostrando a quantidade de proteínas detectadas em cada condição. C = Controle negativo; F = Tratamento com ferro.
A anotação das proteínas nas categorias do Gene Ontology foi realizada
pela ferramenta Blast2GO. Após a anotação, as categ
representação de proteínas foram também fornecidas pelo software. Daqui por
diante, para melhorar a interpretação dos resultados, as proteínas que
apareceram apenas no tratamento com o ferro (71), juntamente com as que
aumentaram a expressã
mencionadas como proteínas da condição Fe+. As exclusivas do controle (100)
e as que diminuíram a expressão (124) serão as da condição Fe
Entre as proteínas da condição Fe+,
destacou foi Transporte e Ciclo do Ácido Tricarboxílico (Figura 10A).
relação às proteínas do grupo Fe
de proteínas foram os processos de oxirredução, regulação da transcrição e
biossíntese de aminoácidos
100
Diagrama de Venn mostrando a quantidade de proteínas detectadas em cada
C = Controle negativo; F = Tratamento com ferro.
A anotação das proteínas nas categorias do Gene Ontology foi realizada
pela ferramenta Blast2GO. Após a anotação, as categorias com maior
representação de proteínas foram também fornecidas pelo software. Daqui por
diante, para melhorar a interpretação dos resultados, as proteínas que
apareceram apenas no tratamento com o ferro (71), juntamente com as que
aumentaram a expressão após a exposição com o metal (61), serão
mencionadas como proteínas da condição Fe+. As exclusivas do controle (100)
e as que diminuíram a expressão (124) serão as da condição Fe-
Entre as proteínas da condição Fe+, o processo biológico
Transporte e Ciclo do Ácido Tricarboxílico (Figura 10A).
relação às proteínas do grupo Fe-, os processos biológicos com maior número
de proteínas foram os processos de oxirredução, regulação da transcrição e
biossíntese de aminoácidos (Figura 10B).
100 71360
C F
39
Diagrama de Venn mostrando a quantidade de proteínas detectadas em cada
A anotação das proteínas nas categorias do Gene Ontology foi realizada
orias com maior
representação de proteínas foram também fornecidas pelo software. Daqui por
diante, para melhorar a interpretação dos resultados, as proteínas que
apareceram apenas no tratamento com o ferro (71), juntamente com as que
o após a exposição com o metal (61), serão
mencionadas como proteínas da condição Fe+. As exclusivas do controle (100)
-.
o processo biológico que mais se
Transporte e Ciclo do Ácido Tricarboxílico (Figura 10A). Em
, os processos biológicos com maior número
de proteínas foram os processos de oxirredução, regulação da transcrição e
40
Figura 10 Distribuição dos principais processos biológicos (P) detectados na análise de proteômica. A) Classificação das proteínas que aumentaram a expressão ou surgiram após o tratamento. B) Classificação das proteínas que diminuíram a expressão ou desapareceram após o tratamento.
Dentre as proteínas da condição Fe+ que merecem destaque,
encontram-se proteínas do metabolismo energético, principalmente enzimas
pertencentes ao ciclo do Ácido Tricarboxílico (TCA) (Apêndice, Tabela 1).
Muitas enzimas dessa via, além de proteínas exclusivas do ciclo do glioxilato
tiveram a sua expressão aumentada ou surgiram após o tratamento. De
maneira contrária, proteínas da glicólise deixaram de ser expressas, sugerindo
que o ferro está induzindo a uma reprogramação metabólica em C. violaceum.
Merecem destaque, igualmente, proteínas relacionadas com o processo
de quimiotaxia, transporte e defesa contra estresse (Apêndice, Tabela 1). Esta
última categoria foi bastante representada, principalmente entre as proteínas
41
da condição Fe-, o que poderia ser um indício de algum mecanismo provocado
pelo ferro estar levando à repressão dessas enzimas (Apêndice, Tabelas 2 e
3).
O grupo de proteínas com maior representação nas condições Fe+ e Fe-
foi o das proteínas hipotéticas (Apêndice, Tabela 4). Após a identificação inicial
das proteínas pelo Mascot (22 ORFs hipotéticas em Fe+ e 28 em Fe-), foi
realizada uma reanotação das proteínas hipotéticas por meio de alinhamento
com BLAST, a fim de se verificar quais destas ainda continuavam com função
desconhecida. Mesmo após a reanotação, um número considerável de
proteínas ainda continuou como hipotéticas (22 na condição Fe+ e 26 na Fe-).
Apenas as proteínas hipotéticas que tiveram a expressão aumentada e/ou que
surgiram após o tratamento com o ferro serão discutidas nesse trabalho.
4.4. Análises de biologia de sistemas
A análise dos interatomas pelo Cytoscape mostrou que a rede Fe+ é
composta por 139 nós e 963 conectores, enquanto que a rede Fe- apresenta
235 nós e 5040 conectores. O plugin MCODE forneceu a partir da rede Fe+
dois clusters nos quais a maioria dos nós faz parte de processos metabólicos
(GO-ID 8152) e metabolismo primário (GO-ID 44238), respectivamente.
Segundo a anotação do Gene Ontology (www.geneontology.org), esta primeira
categoria representa as reações e vias químicas responsáveis pelo
crescimento do organismo, compreendendo processos metabólicos envolvendo
tanto pequenas moléculas quanto processos macromoleculares como reparo
de DNA, replicação, transcrição, entre outros. De maneira menos generalista,
esse primeiro cluster abrange nós relacionados com metabolismo energético e
reações de oxidoredução. O segundo cluster da rede Fe+ possui a maioria dos
nós pertencendo a processos metabólicos primários responsáveis pelo
anabolismo e catabolismo de moléculas como carboidratos, lipídeos,
aminoácios, entre outros. Quanto à rede Fe-, todos os clusters gerados estão
relacionados com processos celulares (GO-ID 9987). Esta categoria é bastante
geral e representa qualquer processo que ocorra em nível celular, embora não
seja restrito a uma única célula, podendo incluir mecanismos de comunicação
42
intercelulares. Apesar da análise do MCODE ter separado os interatomas
maiores em sub-redes, muitos nós são compartilhados entre os clusters.
Os índices de centralidade produzidos pelo plugin CestiScaPe
permitiram a identificação dos nós centrais no controle da comunicação entre
processos biológicos, os bottlenecks (Figuras 11 e 12). Os bottlenecks de cada
rede estão destacados nas Figuras 13 e 14, onde também é possível observar
os nós e conectores das redes principais e dos clusters.
Figura 11 Medidas de centralidade (Rede Fe+) plotadas em um gráfico Betweenness X Node
Degree. Os nós com altos valores em ambos os índices (Bottlenecks) e que possuem grande
probabilidade de interligarem processos, estão destacados na figura, com seus respectivos
nomes ao lado.
Figura 12 Medidas de centralidade (Rede Fe-) plotadas em um gráfico Betweenness X Node
Degree. Os nós com altos valores em ambos os índices (Bottlenecks) e que possuem grande
43
probabilidade de interligarem processos, estão destacados na figura, com seus respectivos
nomes ao lado.
Foram encontrados seis nós bottlenecks para a rede Fe+: Ribulose-
fosfato 3-epimerase (Rpe, EC = 5.1.3.1); Adenosil-homocisteinase (AhcY,
EC=3.3.1.1); o Fator de elongação GreA 2; Cisteína-tRNA ligase (CysS,
EC=6.1.1.16); Triosefosfato isomerase (TpiA, EC=5.3.1.1); DNA helicase (Rep,
EC=3.6.1). Quanto à rede Fe-, cinco proteínas são as principais comunicadoras
entres os diferentes processos: Fosfogliceratoquinase (Pgk, EC=2.7.2.3); GMP
sintase (GuaA, EC=6.3.5.2); Chaperona DnaJ; Lisina-tRNA ligase (LysS,
EC=6.1.1.6); Aspartato-tRNA ligase (AspS, EC=6.1.1.12).
44
Figura 13. A) Rede de interação de proteínas do grupo Fe+. O input das proteínas foram os
dados obtidos a partir das analises de proteômica. Os bottlenecks estão destacados em
diferentes cores (ver texto). B e C , representam os clusters obtidos a partir do plugin MCODE.
A
B C
45
A
B
46
C
D
47
Figura 14 A) Rede de interação de proteínas do grupo Fe-. O input das proteínas foram os
dados obtidos a partir das analises de proteômica. Os bottlenecks estão destacados em
diferentes cores (ver texto). B, C, D, e E representam os clusters obtidos a partir do plugin
MCODE.
E
48
5. Discussão
O presente trabalho é um dos primeiros estudos de proteômica
realizados em Chromobacterium violaceum. O único trabalho, até o momento,
a fazer uma análise protéica em larga escala de C. violaceum foi o de Baraúna
e colaboradores (2011) que investigaram os efeitos do cianeto sobre a bactéria.
Entretanto, a técnica utilizada por eles foi o 2D-SDS-PAGE que é de baixa
resolução e poucas proteínas foram identificadas. A abordagem shotgun
permite a identificação de um grande número de proteínas, o que facilita o
entendimento das respostas fisiológicas (YATES et al., 2009). Os processos
biológicos que foram mais representados nas categorias do Gene Ontology
serão discutidos de maneira independente a fim de se entender a sua relação
com a resposta adaptativa da bactéria frente ao ferro.
5.1. Metabolismo energético
As principais vias metabólicas que tiveram suas enzimas mais, ou
exclusivamente, expressas na condição Fe+, foram aquelas relacionadas ao
metabolismo energético, sugerindo uma reprogramação metabólica em
resposta ao acúmulo do ferro.
O fungo Paracoccidioides brasiliensis em condições de depleção de
ferro, mostrou uma diminuição de proteínas relacionadas ao ciclo do ácido
tricarboxílico (TCA) (PARENTE et al., 2011). Muitas das enzimas dessa via
metabólica possuem um cluster de Fe-S em seu centro ativo, o que justificaria
a troca metabólica para vias nas quais as enzimas não utilizem o ferro em seu
núcleo catalítico, o que pode ser visto em C. violaceum. Corroborando os
resultados de nosso trabalho, Nwugo e colaboradores (2011) ao estudarem a
resposta proteica de Acinetobacter baumannii às condições de carência e
excesso de ferro, observaram um aumento na expressão de proteínas
relacionadas ao ciclo do TCA quando a bactéria foi cultivada em um meio rico
neste metal. Proteínas desta via como a succinato desidrogenase (Sdh) e
Aconitato hidratase (AcnB) tiveram a sua expressão induzida pelo ferro tanto
em C. violaceum quanto em A. baumannii, indicando que o uso de enzimas que
possuem o ferro em seu centro catalítico e, consequentemente, as vias que
utilizam essas enzimas, é uma estratégia disseminada entre os microrganismos
49
para evitar o acúmulo de ferro livre no citoplasma. Também relacionado ao
ciclo do TCA, as proteínas citrato sintase (GtlaA), α-cetoglutarato
desidrogenase (SucA) e Succinil-CoA sintetase (SucC) também aumentaram a
sua expressão em decorrência do ferro, sugerindo que não apenas as
proteínas da via com o metal em sua composição aumentam mas também
aquelas que não o possuem. Assim, provavelmente devido ao aumento na
produção de intermediários do ciclo do TCA produzidos pelas ferro-enzimas,
todo este ciclo está mais ativo, em consequência de regulação alostérica
causada pelos intermediários, que são substratos para etapas seguintes da via.
O ciclo do Glioxilato é uma via metabólica na qual algumas de suas
enzimas fazem parte do ciclo do ácido tricarboxílico. Apesar disso, este ciclo
não acontece em mamíferos devido a ausência de duas proteínas exclusivas
dessa via, a Isocitrato Liase (AceA) e a Malato sintase (AceB), sendo
encontrado apenas em alguns invertebrados, plantas e microrganismos
(ENSIGN, 2006). Pieper e colaboradores (2010) ao estudarem os efeitos da
carência de ferro na bactéria patogênica Yersinia pestis observaram uma
diminuição na expressão de enzimas tanto da via do ciclo do TCA quanto do
Glioxiltato. Em C. violaceum foi observado o aparecimento da malato sintase e
um aumento na expressão da isocitrato liase na condição Fe+. Esta via é um
desvio do ciclo do TCA, sendo responsável pela síntese de succinato a partir
de duas moléculas de Acetil-CoA. Além disso, permite a assimilação de
carbono a partir de compostos C2 como o acetato o que pode levar a
gliconeogênese ou outros processos biosintéticos (ENSIGN, 2006; DUNN et
al., 2009). AceA e AceB, juntamente com outras enzimas do ciclo do Glioxilato,
também estão relacionadas com o mecanismo de patogenicidade de algumas
bactérias como revisado por Dunn e colaboradores (2009). O crescimento de
bactérias mutantes nestas enzimas torna-se ineficiente em meio com ácidos
graxos ou acetato, sugerindo que estas enzimas sejam necessárias para
virulência. Soma-se a isso o fato da Malato Sintase ter sido relacionada com
atividade de adesina, aumentando a aderência de Mycobacterium turbeculosis
em superfícies epiteliais de pulmão (MUNÕZ-ELÍAS e MCKINNEY, 2005;
KINHIKAR et al., 2006). Dessa forma, o aumento de atividade do ciclo do
Glioxilato em C. violaceum, além de ter um papel na reprogramação
50
metabólica, poderia também estar relacionado com o sucesso da
patogenicidade da bactéria, visto que o cultivo com o ferro está reprimindo seu
crescimento como é possível observar no gráfico de crescimento (Figura 7).
Ainda relacionado ao metabolismo energético, foi observado o
surgimento de uma subunidade da enzima NADH desidrogenase (NuoD). Esta
enzima faz parte do complexo NADH: ubiquinona oxirredutase, responsável
pela oxidação do NADH, contribuindo para o gradiente de prótons da cadeia
respiratória. Como as outras enzimas mencionadas acima, a NuoD possui em
seu centro catalítico um núcleo de ferro e enxofre, o que justificaria o aumento
em sua expressão na condição Fe+.
A glicólise é a principal via catabólica da glicose. A degradação da
glicose até o piruvato faz parte do metabolismo energético central da maioria
dos sistemas biológicos, com grande conservação de rotas entres os domínios
Eukaryota e Bacteria, divergindo em algumas minúcias em Archaea
(VERHEES et al., 2003). É observado um aumento na expressão de enzimas
que compõem a via da glicólise em diversos trabalhos que investigaram as
consequências das limitações de ferro em bactéria e fungos (PARENTE et al.,
2011; JO et al., 2009; FRIEDMAN et al., 2006). Dessa forma, é de se esperar
que aconteça uma diminuição nas enzimas dessa via em C. violaceum quando
cultivada em grandes concentrações desse metal. Boa parte das enzimas
responsáveis pelas etapas iniciais da oxidação da glicose foi representada com
significância estatística. A etapa inicial da glicólise (etapa preparatória)
converge para a degradação de uma molécula de glicose (seis carbonos) até
duas de gliceraldeído-3-fosfato (G3F, três carbonos). As enzimas Frutose 1,6-
bifosfato aldolase e Triose Fosfato Isomerase (AgaY e TpiA, respectivamente)
aumentaram a expressão em C. violaceum na condição Fe+. A segunda etapa
da glicólise, a etapa de pagamento, compreende o final dessa via na qual
finalmente os intermediários oxidados da glicose são convertidos em piruvato.
De maneira contrária ao que foi observado na etapa preparatória, enzimas
como a Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, Fosfoglicerato quinase e
Piruvato quinase (GapA, Pgk e PykF, respectivamente) deixaram de ser
expressas e/ou diminuíram a sua expressão na condição experimental. Ao que
parece, C. violaceum está iniciando a glicólise até as etapas que formam o
51
G3F, enquanto que a oxidação deste intermediário até o piruvato e,
consequentemente, até o Acetil-CoA (etapa catalisada pela Piruvato
desidrogenase – não detectada em níveis significantes) está diminuindo. Dessa
forma, o ciclo do TCA estaria perdendo a principal via que o alimenta. Assim, a
C. violaceum necessitaria de vias anapleróticas para alimentar este ciclo, o que
pode ser observado pelo aumento na expressão de enzimas como a Acetil-CoA
sintetase (AcsA), Glutamato desidrogenase (GdhA) e Aspartato Amônia-Liase
(AspA) que produz Acetil-CoA, α-cetoglutarato e fumarato, respectivamente. A
não-utilização do gliceraldeído-3-fosfato no restante da glicólise pode estar
relacionada com o direcionamento deste composto para alguma outra função,
provavelmente relacionada com a adaptação da bactéria a condição de
estresse. O aparecimento da enzima Glicerol kinase (GlpK), que produz G3F a
partir de glicerol e ATP, na condição Fe+ é mais um indício de que C.
violaceum necessita aumentar os níveis dessa molécula para realizar alguma
outra função que não o metabolismo energético usual. As proteínas envolvidas
no metabolismo de lipídios foi outro grupo de proteínas que, apesar de pouco
representadas, foram encontradas na análise do perfil protéico. A Acil-CoA
desidrogenase (CaiA), enzima chave no catabolismo de ácidos graxos,
apareceu em C. violaceum na condição Fe+, indicando um aumento da beta-
oxidação, processo no qual há uma grande produção de acetil-CoA, o que seria
mais uma via anaplerótica que estaria alimentando o ciclo do TCA. Em
contrapartida, foi observada uma diminuição de enzimas relacionadas com a
biossíntese de lipídios. A acetil-CoA carboxilase catalisa a etapa inicial na
formação de malonil-CoA, reação irreversível no anabolismo de ácidos graxos.
Quatro subunidades desta enzima (AccA-D) tiveram a sua expressão diminuída
ou desapareceram na condição Fe+. Esses resultados mostram que C.
violaceum está mobilizando sua reserva lipídica, provavelmente para alimentar
o ciclo do TCA. Parente e colaboradores (2011) observam diferenças nesse
resultado em que enzimas envolvidas na beta-oxidação diminuíram a sua
expressão em P. brasiliensis em condições de escassez de ferro. A figura 15
integra algumas vias metabólicas relacionadas com o metabolismo energético
em C. violaceum.
Figura 15 Integração do metabolismo energético em das enzimas com ferro em seu centro ativo está levando a uma maior ativaçãe do ciclo do Glioxilato. Entretanto, a segunda etapa da glicólise está sendo inibida, enquanto a primeira etapa está mais ativada. Consequentemente está havendo um acúmulo de Gliceraldeído 3-fosfato, que pode estar sendo utilizado no mecviolaceum.
5.2. O papel da v iolaceína
A violaceína é um metabólito secundário produzido pela
que está associada com diversas propriedades farmacológicas (K
al., 2006; LOPES et al
Integração do metabolismo energético em C. violaceum. O aumento da expressão das enzimas com ferro em seu centro ativo está levando a uma maior ativaçãe do ciclo do Glioxilato. Entretanto, a segunda etapa da glicólise está sendo inibida, enquanto a primeira etapa está mais ativada. Consequentemente está havendo um acúmulo de
fosfato, que pode estar sendo utilizado no mecanismo de adaptação de
iolaceína
A violaceína é um metabólito secundário produzido pela
que está associada com diversas propriedades farmacológicas (K
et al., 2009; DURÁN et al., 2010). No entanto, o papel
52
. O aumento da expressão das enzimas com ferro em seu centro ativo está levando a uma maior ativação do ciclo do TCA e do ciclo do Glioxilato. Entretanto, a segunda etapa da glicólise está sendo inibida, enquanto a primeira etapa está mais ativada. Consequentemente está havendo um acúmulo de
anismo de adaptação de C.
A violaceína é um metabólito secundário produzido pela C. violaceum
que está associada com diversas propriedades farmacológicas (KODACH et
2010). No entanto, o papel
53
fisiológico do pigmento no contexto bacteriano ainda não foi completamente
elucidado.
As etapas e os genes necessários para a biossíntese da violaceina (e
outros intermediários com grupo indol) foram revisados recentemente por
Hoshino (2011). Cinco genes são responsáveis por produzir a violaceína (VioA-
E) além de etapas não enzimáticas de autooxidação (Hoshino, 2011). Em
nosso trabalho, um desses genes teve a sua expressão aumentada (VioE)
após o tratamento com o ferro, enquanto que o VioA foi detectado
exclusivamente nesta condição, embora o VioA também esteja sendo expresso
no grupo controle, visto que esta enzima é essencial na biossíntese da
violaceína e o pigmento também estava sendo produzido na ausência de ferro.
Genes relacionados com a biossíntese do aminoácido triptofano também foram
representados na condição Fe+ (TrpA e TrpE), sugerindo um aumento nas vias
que convergem para a produção do pigmento violaceína. Esse resultado
sugere que a violaceína pode ter um papel na sobrevivência de C. violaceum
frente às condições de estresse gerado pelo excesso de ferro.
De fato, um papel antioxidante foi proposto para a violaceína por Konzen
e colaboradores (2006). Nesse trabalho foi possível observar que o pigmento
se incorpora à membrana plasmática, o que protegeria a bactéria contra
peroxidação lipídica. Além disso, foi observado que a violaceína é capaz de
varrer (scavenge) diversas espécies reativas de oxigênio, incluindo o radical
hidroxila. Este pode ser produzido pela Reação de Fenton e constitui uma das
espécies reativas de oxigênio mais danosas às biomoléculas (TOUATI, 2000;
CORNELIS et al., 2011). Assim, podemos sugerir que o tratamento de ferro
está induzindo a formação de radicais hidroxil via Reação de Fenton e que a C.
violaceum está aumentando a produção da violaceína para se proteger do
estresse oxidativo ou de alguma outra perturbação na homeostasia causada
pela exposição excessiva ao ferro. Visto que a violaceína se incorpora em
bicamadas lipídicas, podemos sugerir que o pigmento esteja se incorporando à
membrana plasmática e um aumento na produção deste pigmento poderia
funcionar como uma barreira contra o estresse gerado pela grande quantidade
de ferro, através do “scavanger” de espécies reativas extra- e
intracitoplasmáticas.
54
5.3. Quimiotaxia
O sistema quimiossensório é utilizado por bactérias patogênicas e de
vida livre para perceber condições ambientais que podem ou não ser nocivas
para o microrganismo (PORTER et al., 2011; LERTSETHTAKARN et al., 2011).
O sinal ambiental é captado e transmitido no meio intracelular, controlando a
movimentação flagelar o que permite as bactérias mudarem para ambientes
com condições adequadas ao crescimento (PORTER et al., 2011).
C. violaceum possui um grande aparato protéico relacionado com o
mecanismo de quimiotaxia já descrito em outros microrganismos (Pereira e
colaboradores, 2004). As proteínas quimiotáxicas aceptoras de metil (MCP)
são responsáveis por captar o sinal externo que em seguida é transmitido para
proteínas de quimiotaxia intracelulares.
Em nosso trabalho, foram detectadas cinco proteínas relacionadas com
a resposta quimiotática (CV_0899, CV_1082, CheV1, CheY3 e CheA) bem
como uma proteína flagelar (FlaD) que aumentaram e/ou surgiram na condição
Fe+, indicando que o ferro no meio está agindo como um repelente para a
bactéria que, dessa maneira, utiliza a movimentação flagelar para buscar
ambientes menos hostis. As MCPs são responsáveis por receber o sinal
externo que é transmitido por proteínas acopladoras do sistema
quimiossensório. As proteínas acopladoras podem ser as CheW e/ou CheV.
Esta última está também associada com a capacidade de adaptação da
quimiotaxia que permite os microrganismos reiniciar os sinais do ambiente,
impedindo a saturação do sistema (ALEXANDER et al., 2010). A proteína
CheA, quando fosforilada, doa o seu grupo fosfato para CheY que se difunde
para o motor flagelar, modificando a rotação do flagelo o que é responsável
pela mudança direcional da bactéria (PORTER et al., 2011). A proteína CheY
tem um papel crucial nessa resposta visto que a sua interação com o flagelo
controla a frequência com que a bactéria muda de direção enquanto nada
(WADHAMS et al., 2004).
Assim, o ferro agindo como um repelente interage com a(s) MCPs que
transmitem o sinal para outras proteínas da resposta quimiotáxica o que leva a
mudança na rotação do flagelo. A força motriz para essa rotação flagelar é um
55
gradiente eletroquímico de H+ ou Na+ entre a membrana citoplasmática (SOWA
e BERRY, 2008). De fato, está havendo um acúmulo de prótons no espaço
inter-membranas, visto que as subunidades de ATP-sintase estão deixando de
ser expressas enquanto que a cadeia transportadora de elétrons está
continuamente sendo alimentada pelo ciclo do TCA. Maurer e colaboradores
(2005) mostram que em condições de ácidas, ocorre uma diminuição na
expressão de ATP-sintase como mecanismo para evitar que o acúmulo de
prótons no citoplasma acidifique, ainda mais, o meio, de forma que esta
diminuição na ATP-sintase também pode ter um papel direto na regulação do
pH. A NuoD também pode estar contribuindo para esse gradiente de prótons.
Dessa forma, o gradiente gerado pode estar sendo utilizado para a
movimentação flagelar orientada pela resposta quimiotáxica.
5.4. Proteínas Relacionadas a Transporte
Juntamente com as proteínas hipotéticas e as do metabolismo geral, o
grupo com maior representação foi o das proteínas relacionadas ao transporte,
principalmente as do sistema ABC. O seqüenciamento do genoma de C.
violaceum mostrou a presença de uma grande quantidade de genes que
codificam proteínas transportadoras de ferro, além de ORFs hipotéticas que
possuem domínios possivelmente relacionados com o transporte desse metal
(VASCONCELOS et al., 2003). Grangeiro e colaboradores (2004) sugerem que
a grande quantidade de genes de transporte em C. violaceum provavelmente
está relacionada com o fato de esse microrganismo habitar um grande número
de ambientes, o que facilitaria a sua adaptação a diversas condições
ambientais.
Um dos grupos de proteínas de transporte com maior diversidade é o
sistema de transporte ABC. Cada transportador ABC é específico para um tipo
de substrato que necessita passar pela membrana (GRANGEIRO et al., 2004).
Dessa forma, a diversidade de transportadores do sistema ABC em nosso
trabalho é um forte indício de que o ferro está induzindo uma reprogramação
metabólica em C. violaceum. O sistema de transporte ABC interage com outros
mecanismos e proteínas de transporte como sistema de secreção tipo I e
porinas (DAVIDSON e MALONEY, 2007). De fato, algumas porinas estão
56
presentes na condição Fe+, embora não possamos garantir a sua interação
com os transportadores ABC.
A Ferric binding protein (FbpA) é uma proteína periplasmática que serve
de domínio auxiliar do transportador ABC FbpABC e tem um papel crucial na
entrada de ferro em microrganismos patogênicos (SIBURT et al., 2012;
WEAVER et al., 2010). Esta proteína deixou de ser expressa em C. violaceum
após a exposição ao ferro. Devido à grande quantidade desse metal no meio, a
inibição da expressão de proteínas relacionadas com a captação de ferro é
uma estratégia eficiente na sobrevivência do organismo, associada com a
incorporação de Fe livre a metaloproteínas.
As outras proteínas de transporte detectadas estão associadas com
outros tipos de substâncias como aminoácidos e peptídeos (CV_2481,
CV_2983, CV_4053, CV_4329) e carboidratos (CV_1197), o que seria
esperado em um quadro de reprogramação metabólica na qual as
concentrações necessárias de cada nutriente seriam modificadas.
5.5. Proteínas relacionadas ao estresse
Como já mencionado, o ferro é capaz de reagir com o peróxido de
hidrogênio, produzindo o radical hidroxila, uma espécie reativa de oxigênio
capaz de danificar biomoléculas (ATACK e KELLY, 2009). Dessa forma, o
tratamento com ferro em C. violaceum pode estar induzindo o estresse
oxidativo via Reação de Fenton. Esse quadro foi comprovado quando
verificamos a atividade antioxidante total (AAT) em C. violaceum que foi
significativamente maior no extrato protéico Fe+ em comparação com o Fe-
(Figura 8C). Assim, podemos inferir que o excesso de ferro no meio está
levando a uma maior produção de ROS e a bactéria, por sua vez, está
aumentando as suas defesas antioxidantes, o que pode ser observado quando
comparamos a AAT dos dois extratos protéicos.
Como na maioria dos organismos aeróbicos o ciclo do TCA está
continuamente alimentando a cadeia transportadora de elétrons é de se
esperar que haja um aumento na formação de ânions superóxido (BAE et al.,
2011). Estes, por sua vez, são removidos pelas enzimas superóxido
dismutases (SODs), que constituem a primeira linha de defesa contra estresse
57
oxidativo (ALSCHER et al., 2002). De fato, houve um aumento significativo da
atividade de SOD no extrato protéico da condição Fe+ quando comparado com
o controle negativo (Figura 8B). Outra evidência que reforça a existência de
estresse oxidativo, foi o aumento observado na expressão da Sodb2 na
condição Fe+, embora sem significância estatística. Apesar disso, esse
pequeno aumento na expressão, provavelmente foi suficiente para elevar a
atividade de SOD nos níveis observados no ensaio.
Dessa forma, como consequência do aumento da atividade de SOD,
estaria ocorrendo um aumento na produção de peróxido de hidrogênio, que é
um produto da dismutação do superóxido. Assim, é de se esperar uma
elevação na atividade da enzima catalase (KatE), que de fato, foi observado na
condição Fe+. Apesar disso, os níveis da enzima diminuíram significativamente
na condição experimental, o que nos leva a questionar o que está causando o
aumento da atividade observado. Provavelmente, alguma enzima similar à
catalase está sendo responsável pelo aumento da atividade de detoxificação,
visto que o ensaio utilizado mensura a decomposição do peróxido de
hidrogênio. Além disso, Atack e Kelly (2009) ao revisarem as conseqüências de
estresse oxidativo para a bactéria Gram-negativa Campylobacter jejuni
afirmaram que a catalase, em muitos organismos, não é o principal meio de
remover o peróxido de hidrogênio. Outras peroxidases, bem como o piruvato,
estão associadas com a capacidade de reduzir esta ROS até água (MALLET et
al., 2005). Foi visto que reguladores transcricionais estão relacionados com a
expressão de proteínas com papel antioxidante. Um desses reguladores, o
PerR, possui como co-fator metais como o manganês e o ferro. Jakubovics e
Jenkinson (2001) afirmam que o PerR ligado ao ferro é mais sensível a
oxidação, o que levaria a uma diminuição de enzimas antioxidantes. De fato,
Holmes e colaboradores (2005), ao investigarem as conseqüências do excesso
e carência de ferro em C. jejuni observaram um aumento de enzimas
antioxidantes como catalase, tioredoxinas, entre outras, quando a bactéria foi
cultivada em ambiente com depleção de ferro. Apesar do regulador PerR não
ter sido encontrado em C. violaceum, algum outro regulador transcricional
poderia estar causando a regulação negativa (por razões similares que foram
descritas para PerR) da catalase, tioredoxinas (família de proteínas
58
antioxidantes bastante representada, embora com expressão diminuída) e
outras enzimas antioxidantes na bactéria como a Dps.
Um grupo de proteínas relacionadas ao estresse bastante representado
foi o das glutationa transferases (GSTs). Esta família de proteínas é encontrada
de forma abundante em eucariontes e procariontes e está relacionada com
defesa contra estresse oxidativo e degradação de xenobióticos (ALLOCATI et
al., 2009). Em C. violaceum cinco proteínas dessa família foram detectadas,
sendo que quatro (Gst1, Gst2, GstA e CV_0972) são da condição Fe+ e a
CV_4373 teve sua expressão diminuída. Embora esta família de proteínas seja
mais conhecida por seu papel na degradação de compostos nocivos como
drogas e pesticidas, algumas isoformas de GSTs tem peróxidos como
substratos, podendo decompor H2O2 (OAKLEY, 2005). Dessa forma, um
aumento na expressão de GSTs é mais um forte indício de estresse oxidativo
em C. violaceum causado pelo ferro. A capacidade de peroxidase de algumas
GSTs pode estar sendo a responsável pelo aumento na atividade do ensaio de
catalase.
5.6. Proteínas Hipotéticas
Possíveis funções das proteínas hipotéticas da condição Fe+ foram
investigadas utilizando ferramentas de bioinformática como o BLAST, além de
consultas no CDD (Conserved Domain Database). A identificação de domínios
conservados pode ser a única pista para conseguir descrever a localização e
função de algumas proteínas, uma vez que estes domínios indicam
similaridades com outras proteínas que já foram descritas experimentalmente
(Marchler-Bauer e colaboradores, 2011).
Das 22 proteínas hipotéticas da condição Fe+ (Apêndice, Tabela 4), três
(CV_0008, CV_1082 e CV_3099) não possuem nenhum domínio conservado
conhecido em sua estrutura. Outras (CV_0856, CV_0868 e CV_3824) possuem
diferentes domínios DUF que apesar de serem descritos em outros
organismos, não possuem nenhuma função relacionada (Domain of Unkown
Function). As ORFs CV_2376 e CV_4300 possuem o domínio funcional
USP_like que está relacionado com defesa contra estresse. De acordo com o
CDD a expressão de proteínas da família USP é aumentada quando bactérias
59
são expostas a agentes estressores, aumentando a taxa de sobrevivência
durante a exposição do agente. A ORF CV_3694 possui o domínio da
superfamília Fe-S biosyn, que está relacionado com a biossíntese de cluster de
Fe-S, o que poderia ser mais uma proteínas relacionada com armazenamento
de ferro. Outras ORFs possuem domínios de proteínas transportadores, o que
pode sugerir uma função relacionada com a remoção do ferro excedente na
bactéria.
As ORFs hipotéticas aqui encontradas representam fortes candidatas a
produtos biotecnológicos como armazenamento e transporte de ferro além de
novas proteínas relacionadas com defesa ao estresse (ex. as com domínio
USP), visto que a resposta aqui apresentada da C. violaceum ao cultivo em
meio com ferro difere dos mecanismos clássicos observadas em outros
trabalhos, embora contenha muitos elementos em comum. Trabalhos visando à
caracterização funcional destas ORFs já estão sendo realizadas por nosso
grupo.
5.7. Ferric uptake regulator
A proteína Fur (Ferric uptake regulator) é responsável por inibir genes
relacionados com a captação de ferro em microrganismos (CORNELIS et al.,
2011). Em C. violaceum, esta proteína apresentou diminuição de expressão na
presença de ferro, porém de forma não significativa. O aumento nos níveis
desta proteína está relacionado com a inibição de genes responsáveis por
captar o ferro, como sideróforos ou transportadores de ferro transmembrana, o
que é de se esperar em condições nas quais há grande quantidade desse
metal (CORNELIS et al., 2011). Apesar da expressão de Fur ter tido uma leve
diminuição em C. violaceum, a presença desta proteína nos níveis detectados
pode ser suficiente para causar a repressão de proteínas envolvidas na
captação e/ou monitoramento de ferro. Além disso, outros reguladores
transcricionais podem estar relacionados com estas funções. Friedman e
colaboradores (2006) ao investigarem o papel do mutante fur de
Staphylococcus aureus propuseram a existência de outros reguladores
transcricionais envolvidos com a homeostasia de ferro embora não tenham
apontado nenhum em específico. A existência de outros reguladores de ferro
também já foi afirmada em outros trabalhos (CORNELIS et al., 2011; LEE e
60
HELMANN, 2007). A ORF CV_1029, exclusiva da condição Fe+, codifica um
regulador transcricional da família GntRe pode ser um desses fatores
transcricionais sugeridos por Friedman e colaboradores.
5.8. Proteínas do metabolismo geral
Proteínas do metabolismo geral (replicação, tradução, ciclo celular, etc)
foram as mais detectadas nesse estudo, principalmente na condição Fe-. De
fato, em outros trabalhos de proteômica, proteínas ribossomais, proteínas
relacionadas com a síntese de biomoléculas como tRNAs entre outras, são as
com maiores representações nesses estudos (GOMES et al., 2012; SIXT et al.,
2011; ANDERSON et al., 2006). Isso provavelmente indica uma diminuição na
expressão das proteínas housekeeping em detrimento de outros grupos que
permitam uma melhor aclimatação à condição de estresse emergente. Dessa
forma, essa diminuição na expressão pode estar relacionada com a diferença
de crescimento observada em C. violaceum quando esta foi cultivada em meio
contendo ferro.
5.9. Biologia de Sistemas
Os dados produzidos a partir de análises de experimentos em larga
escala, como os de transcriptômica e proteômica, muitas vezes não são
suficientes para elucidar os mecanismos envolvidos em um dado processo
biológico. Dessa forma, a Biologia de Sistemas surge como uma ferramenta
capaz de analisar como os componentes (genes, proteínas, metabólitos, entre
outros) relacionados com um ou mais processos biológicos interagem,
permitindo uma análise global e dinâmica dos dados gerados por técnicas de
alto rendimento.
Ao analisarmos redes de interações de proteínas, os bottlenecks, ou
gargalos, são os nós mais importantes uma vez que representam proteínas que
interligam diferentes clusters funcionais (YU et al., 2007). No nosso trabalho,
encontramos na rede Fe+ seis nós com altos valores de betweenness e de
node degree, que se destacam dos demais, o que representa possivelmente
bottlenecks que controlam o fluxo da informação dentro desta rede. Destes seis
nós, cinco tiveram apenas um peptídeo identificado relacionando às
respectivas proteínas na análise de proteômica, enquanto que apenas a TpiA
61
apresentou mais de um peptídeo na análise (Tabela 1). De certa forma, a
quantidade de peptídeos associados a uma proteína está relacionada com a
sua expressão dentro da célula, e estes resultados indicam que os bottlenecks
possuem baixa expressão em comparação com os outros nós dentro da rede.
Visto que os bottlenecks são hubs que coordenam diferentes processos
biológicos, um aumento na sua expressão levaria a uma sobrecarga das vias
metabólicas que são reguladas por estas proteínas. Yu e colaboradores (2007)
ao investigarem a importância de bottlenecks em redes de interações,
observaram que nós bottlenecks, de fato, possuem uma menor média de
expressão quando comparados com nós não-bottlenecks.
Uma dessas proteínas designadas como gargalo foi a Triose Fosfato
Isomerase (TpiA), uma importante enzima que catalisa a interconversão de D-
gliceraldeído 3-fosfato e diidroxiacetona fosfato, participando de importantes
vias metabólicas como a glicólise, gliconeogênese e via das pentoses
(WIERENGA et al., 2010). De fato, muitas proteínas da rede Fe+ estão
relacionadas com estes processos de forma que a TpiA, devido aos seus altos
índices de centralidade, estaria coordenando estas sub-vias. A TpiA, interage
diretamente (dados não mostrados) com proteínas como a SucA, SucB, AceA,
NuoD, entre outras, o que nos leva inferir que o aumento na expressão de
proteínas relacionadas com metabolismo energético possui um importante
papel na resposta da C. violaceum a altas concentrações de ferro. Esses dados
ajudam a corroborar o mecanismo de reprogramação metabólica proposto no
item 5.1. Além disso, Nakane e colaboradores (2011) observaram que a
inativação de uma proteína hipotética que se enovela em uma estrutura
semelhante à Triose Fosfato Isomerase de Thermus thermophilus aumenta a
sensibilidade desta bactéria a H2O2, sugerindo o envolvimento desta proteína
no mecanismo de proteção contra estresse oxidativo. Assim, a TpiA não seria
apenas um importante gargalo de processos biológicos envolvidos na
adaptação ao ferro, mas também uma enzima que poderia estar protegendo a
C. violaceum contra o estresse oxidativo causado pela grande concentração
deste metal.
Outro importante bottleneck encontrado na rede Fe+ foi a proteína S-
Adenosil-homocisteinase (AhcY). Esta enzima catalisa a hidrólise de S-
62
adenosil-homocisteína (AdoHcy) para formar adenosina e homocisteína
(TAKATA et al., 2002). A AdoHcy é produzida a partir da S-adenosilmetionina
(SAM) como um subproduto de reações metiltransferases dependentes de
SAM (SINGHAL et al., 2012). Dessa forma, o acúmulo de AdoHcy leva à
inibição de reações de transmetilação. Para a inibição ser cancelada, a AdoHcy
é hidrolisada pela AhcY o que torna esta proteína um elemento chave nos
diversos processos que requerem etapas de metilação, justificando seus altos
índices de centralidade. Além disso, Shu e colaboradores (2006) associaram a
Adenosilhomocisteinase de neutrófilos e de Dictyostelium com atividade de
quimiotaxia, uma vez que esta enzima estava associada em actina de células
quimiotáxicas e que a inibição dessa resposta foi observada após a inibição da
Adenosilhomocisteinase. Nós também sugerimos que a C. violaceum utiliza de
mecanismos quimotáxicos para adaptar-se as altas concentrações de ferro, o
que pode ser observado pelo aumento na expressão de genes relacionados à
quimiotaxia (ver acima). Outro experimento evidencia a importância da AhcY no
qual um mutante Agrobacterium radiobacter para esta enzima apresenta
capacidade de crescimento reduzido em meios de cultura com nutrição restrita
(PENYALVER et al., 2009). Os autores sugerem que a ausência da AhcY leva
a um acúmulo de AdoHcy, que acaba inibindo as reações de transferência de
metil dependentes de SAM e, consequentemente, interfere em diversos
processos biológicos, incluindo o crescimento e produção de antibióticos por
esta bactéria.
A Ribulose-5-fosfato 3-epimerase (Rpe) foi outro nó da rede Fe+ que
apresentou altos valores de betweenness e node degree. Esta enzima faz parte
da via das pentoses fosfato, catalisando a conversão de D-ribulose 5-fosfato
em D-xylulose 5-fosfato. A via das pentoses fosfato está relacionada com a
produção de intermediários necessários para a síntese de aminoácidos
aromáticos e metabolismo energético (LIANG et al., 2011). De fato, alguns dos
nós que intereagem diretamente com Rpe na rede Fe+ estão relacionados com
a biossíntese de triptofano (TrpA, TrpE, TrpS2 e TrpB) e de metabolismo
energético (SucC e SucD). Como mencionado anteriormente, o triptofano tem
uma importância especial para a C. violaceum visto que está relacionado com a
síntese da violaceína, que por sua vez, tem um papel antioxidante proposto
63
(KONZEN et al., 2006). Dessa forma, a Rpe além de influenciar no
metabolismo energético da C. violaceum (juntamente com a TpiA), teria
também um papel na defesa antioxidante da bactéria. Este último foi sugerido
uma vez que a Rpe, por participar da via das pentoses fosfato, acaba
influenciando na produção de NADPH e este cofator protege contra espécies
reativas de oxigênio por meio da redução de glutationas que detoxificam H2O2
em H2O (LIANG et al., 2011; NG et al., 2008; THORPE et al., 2004; JUHNKE et
al., 1996). Reforçando a relação entre Rpe e defesa contra estresse oxidativo,
Tan e colaboradores (2009) demonstraram que mutantes desse gene em
levedura são mais suceptíveis a esse tipo de estresse.
Outro gargalo da rede Fe+ foi o fator de elongação da transcrição GreA.
Em alguns momentos, a elongação em procariontes pode ser bloqueada,
gerando complexos de parada. Para a elongação reiniciar, deve haver uma
clivagem endonucleolítica da região 3’ da molécula de RNA que está sendo
transcrita para que a RNA polimerase continue a transcrição. Esta clivagem é
feita por GreA ou GreB que liberam fragmentos de 2-3 ou 2-18 nucleotídeos,
respectivamente (STEPANOVA et al., 2007). Por evitar que a elongação seja
bloqueada, GreA (e também GreB) acaba influenciando na eficiência da
elongação das transcrições (BORUKHOV et al., 2005). Além disso, foi visto que
GreA possui atividade revisora, removendo nucletotídeos incorporados
erroneamente o que contribui para a fidelidade da transcrição (ZENKIN et al.,
2006). Diversos estudos em bactérias, mostram que a deleção de GreA leva a
hipersensibilidade a condições ambientais adversas como temperaturas
elevadas e estresses osmóticos (SUSA et al., 2006; WEI et al., 2004;
NOGALES et al., 2002). A indução de fatores sigmas alternativos é uma
estratégia de bactérias de vida livre e patogênicas para lidar com os estresses
ambientais e com o processo de patogênse, respectivamente, de forma que a
identificação de genes ativados por diferentes fatores sigmas é uma estratégia
para conhecer o mecanismo de adaptação de procariontes a condições
adversas (RHODIUS et al., 2006). Rhodius e colaboradores (2006)
identificaram GreA como membro do regulon controlado pelo fator sigma E de
E. coli, importante por mediar respostas a estresse e mecanismo de virulência
da bactéria, evidenciando o papel da GreA na adaptação à mudanças
64
ambientais. Corroborando a “parceria” entre fatores sigma e GreA na
adaptação à estresses, o nó desta última está interagindo diretamente com um
fator sigma (RpoS) na rede Fe+. Também em E. coli, foi observado que
mutantes de GreA e GreB tem o crescimento inibido em meio suplementado
com metais divalentes como Zn2+ e Mn2+ e que esta inibição era suprimida ao
inserir um plasmídeo carregando tanto GreA quanto GreB, sugerindo que estes
genes, de certa forma, conferem resistência aos metais bivalentes em
concentraçoes tóxicas (SUSA et al., 2006). Tudo isso, associado ao fato de
GreA ter sido apontada como um bottleneck na rede Fe+, nos leva a inferir que
esta proteína tem um papel chave na adaptação de C. violaceum às altas
concentrações de ferro.
A Rep é uma DNA helicase dependente de ATP que realiza uma grande
quantidade de conexões entre nós na rede Fe+. Esta enzima, em E. coli,
compartilha 40% de identidade com a UvrD, uma outra helicase que também
está associada com atividades de reparo mismatch e reparo por excisão de
nucleotídeo (ATKINSON et al., 2009). Apesar da semelhança, nenhuma
atividade de reparo foi associada com a Rep de E. coli (ATKINSON et al.,
2009). Não obstante, um papel na retomada da replicação foi proposto para
Rep e a disrupção desse gene leva a letalidade em E. coli, sugerindo sua
grande importância biológica (LESTINI e MICHEL, 2008). Embora não tenha
sido associada com atividades de reparo em E. coli, estas funções ainda não
foram investigadas para a Rep de Chromobacterium violaceum e o fato desta
proteína ter sido indicada como um gargalo na rede Fe+ reforça a sua
importância para a sobrevivência de microrganismos.
Outra proteína que apresentou altos valores de node degree e
betweenness foi a Cisteína-tRNA ligase (CysS) que está relacionada com a
biossíntese de proteínas, mais especificamente com a incorporação de
resíduos de cisteína em tRNAsCys, formando Cys-tRNACys, em uma reação
dependente de ATP (SAUERWALD et al., 2005). Dessa forma, CysS está
diretamente relacionada com disponibilização de cisteína para ser utilizada na
síntese de proteínas. De fato, resíduos de cisteína fazem parte do centro
catalítico de enzimas antioxidantes como as glutationas transferases (OAKLEY,
2005), grupo também representado em nosso trabalho. Assim, a CysS como
65
gargalo na rede Fe+, indiretamente está relacionado com a defesa antioxidante
de C. violaceum.
Quanto aos bottlenecks da rede Fe- a maioria destes está relacionada
com metabolismo geral como biossíntese de purina e de proteínas e a
diminuição da expressão destas enzimas provavelmente está acontecendo em
detrimento de outras diretamente relacionadas com a adaptação da bactéria ao
ferro. Apesar de não estarem sendo diretamente necessárias, a diminuição da
expressão destas proteínas não deixa de ser um mecanismo coordenado que
contribui para a sobrevivência da C. violaceum em altas concentrações desse
metal.
As análises de proteômica e de biologia de sistemas forneceram
informações importantes que nos permitiram propor um modelo de adaptação
da Chromobacterium violaceum cultivada em altas concentrações de ferro,
embora mais estudos ainda necessitam ser realizados a fim de que tenhamos
uma resposta mais fidedigna de quais mecanismos são utilizados por esta
bactéria para sobreviver em meio repleto com este metal.
A figura 16 resume a resposta de C. violaceum frente ao estresse
causado pelo ferro.
66
Figura 16 Modelo do mecanismo adaptativo proposto para C. violaceum em resposta ao ferro.
A) O aumento de ferro no citoplasma leva a uma maior expressão de enzimas com ferro em
seu centro catalítco, como as que estão envolvidas no ciclo do TCA; B) O aumento do
metabolismo energético causado pelas ferro-enzimas induz a produção de ânions superoxido
pela cadeia transportadora de elétrons; C) A dismutação dos ânions superóxidos pela
Superóxido dismutase (SOD) leva a uma maior produção de Peróxido de hidrogênio. Estes
podem estar sendo decompostos por peroxidases diferentes da catalase ou outros compostos
como o piruvato (ver discussão). Ao mesmo tempo, o excesso de peróxido está reagindo com o
ferro livre, produzindo radicais hidroxila; D) Fatores de transcrição relacionados com a
expressão de enzimas antioxidantes podem estar sendo sensibilizados pelo ferro livre, o que
inibe a produção dessas enzimas, como a tioredoxina; E) Glutationas Transferases, juntamente
com a violaceína, podem estar antagonizando o estresse oxidativo causado pelo ferro; F) Para
balancear a grande quantidade de ferro no citoplasma, está ocorrendo a diminuição da
expressão de proteínas transportadores responsáveis pela entrada do metal, enquanto que
outras relacionadas com a saída do ferro estão sendo produzidas em maior quantidade; G)
Aumento da resposta quimotáxica induzida pelo ferro. O metal interage com proteínas
quimiotáticas aceptoras de metil (MCPs) que transmitem o sinal para o sistema
quimiossensório, induzindo a uma mudança na rotação flagelar, o que causa o afastamento da
67
bactéria do ambiente inóspito; H) As setas vermelhas indicam os processos coordenados pelas
proteínas bottlenecks (ver discussão).
68
6. Conclusões
Este trabalho foi o primeiro a investigar as consequências do excesso do
ferro na fisiologia de Chromobacterium violaceum. A bactéria apresentou uma
reprogramação metabólica em seu metabolismo energético, principalmente
devido ao aumento da expressão de ferroenzimas do ciclo do TCA. O excesso
do ferro provavelmente induz um quadro de estresse oxidativo, o que pode ser
visto pelo aumento da atividade antioxidante total (AAT) e de enzimas
antioxidantes como a superóxido dismutase e catalase. Para amenizar as
consequências do estresse, C. violaceum utiliza de mecanismos quimiotáticos,
aumento na expressão de enzimas antioxidantes e remoção de ferro por
proteínas transportadoras. Uma grande quantidade de ORFs hipotéticas foi
detectada e seu relacionamento com o metabolismo de ferro ainda necessita
ser investigado. Apesar disso, estas ORFs constituem bons candidatos a
produtos biotecnológicos que possam vir a ser utilizados em biorremediação ou
no tratamento de infecções causadas por microrganismos patogênicos. A
análise de Biologia de Sistemas fornece informações relevantes acerca da
interpretação dos dados da proteômica e da resposta da C. violaceum frente a
concentração de ferro utilizada. O fato de proteínas como a TpiA e Rpe terem
sido designadas como bottlenecks reforçam a idéia de reprogramação
metabólica como resposta adaptativa da bactéria. Outros gargalos como GreA
e AhcY indicam, respectivamente, um papel na regulação transcricional e
metilação nessa resposta.
69
7. Considerações finais e perspectivas
Os estudos de genômica funcional trazem uma visão em larga escala da
condição investigada. Dessa forma, os dados obtidos permitem sugerir
modelos que estão de acordo com as informações encontradas na literatura.
Ainda assim, análises laboratoriais necessitam ser realizadas para corroborar
as análises especulativas de um estudo de proteômica em shotgun.
Com isso, sugestões como o possível papel antioxidante da violaceína, a
inibição de enzimas antioxidantes clássicas por meio da repressão de
ativadores transcricionais, além da relação das ORFs hipotéticas com a
resposta de C. violaceum ao ferro serão investigadas por nosso laboratório a
fim de que tenhamos uma resposta mais fidedigna do estresse causado pelo
ferro nesta bactéria.
70
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88
9. Apêndice
ORF
number
Gene
name
Uniprot
ID
Product MW
(kDA)
Sequence
Coverage
Nº of
Unique
Peptides
Nº of
Assigned
Spectra
Fold
Change
Protein
Identification
Probability
Control Fe Control Fe Control Fe Control Fe
CV_0008* CV_0008 Q7P253 Hypothetical ND - ND - 1 - 2 - - 65,00%
CV_0090* CV_0090 Q7P1X2 Hypothetical 29 - 8,00% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_0124* Q7P1T8 inhibitor of septum formation 22 - 5,60% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_0148* Q7P1R5 transcriptional regulator 30 - 8,20% - 1 - 1 - - 99,00%
CV_0161 purE Q7P1Q2 phosphoribosylaminoimidazole
carboxylase catalytic subunit
17 9,30% 9,30% 1 1 4 10 0,4 63,00% 100,00%
CV_0187 agaY Q7P1M6 Fructose-1,6-bisphosphate aldolase 38 19,00% 29,00% 4 6 13 28 0,5 100,00% 100,00%
CV_0213 qor Q7P1K0 quinone oxidoreductase 34 11,00% 15,00% 1 2 2 9 0,2 63,00% 100,00%
CV_0251* glpK Q7P1G2 glycerol kinase 54 - 5,40% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_0289 gst2 Q7P1C4 glutathione S-transferase family
protein
22 25,00% 40,00% 3 6 17 44 0,4 100,00% 100,00%
CV_0323 hutU Q7P190 urocanate hydratase 61 6,30% 9,70% 2 4 2 18 0,1 100,00% 100,00%
CV_0393* aldB Q7P121 Aldehyde dehydrogenase 55 - 12,00% - 4 - 8 - - 100,00%
CV_0475* soj Q7P0U1 chromosome partitioning protein ParA 29 - 8,50% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_0668* atpF Q7P099 ATP synthase F0 subunit B 15 - 13,00% - 2 - 6 - - 100,00%
CV_0677* glmS Q7P091 glucosamine-fructose-6-phosphate
aminotransferase
66 - 3,80% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_0856* CV_0856 Q7NZR5 Conserved Hypothetical 9 - 11,00% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_0868 CV_0868 Q7NZQ3 Conserved Hypothetical 16 36,00% 44,00% 3 4 21 39 0,5 100,00% 100,00%
CV_0884* CV_0884 Q7NZN8 Hypothetical 27 - 5,60% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_0899* Q7NZM3 methyl-accepting chemotaxis protein 71 - 2,10% - 1 - 2 - - 65,00%
Tabela 1 Proteínas identificadas na condição Fe+. As ORFs com * representam as proteínas que foram expressas exclusivamente após o tratamento.
89
CV_0938* pstS Q7NZI4 phosphate ABC transporter substrate-
binding protein
37 - 12,00% - 2 - 4 - - 100,00%
CV_0939 tpiA Q7NZI3 triosephosphate isomerase 26 29,00% 33,00% 4 5 16 38 0,4 100,00% 100,00%
CV_0944* nuoD Q7NZH8 NADH dehydrogenase subunit D 47 - 2,60% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_0965* ahcY Q7NZF7 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase 51 - 3,40% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_0970 hmgA Q7NZF2 Homogentisate 1,2-dioxygenase 42 6,90% 13,00% 1 2 3 16 0,2 63,00% 100,00%
CV_0972 Q7NZF0 glutathione transferase zeta 1 23 8,60% 8,60% 1 1 1 2 0,5 63,00% 65,00%
CV_0984 prmA P60091 ribosomal protein L11
methyltransferase
32 12,00% 20,00% 2 3 3 9 0,3 100,00% 100,00%
CV_0996 metL Q7NZC6 homoserine dehydrogenase 46 6,70% 14,00% 1 2 1 3 0,3 63,00% 100,00%
CV_1029* Q7NZ93 transcriptional regulator, GntR family 25 - 3,70% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_1068 sdhB Q7NZ54 succinate dehydrogenase iron-sulfur
subunit
27 16,00% 20,00% 3 4 11 22 0,5 100,00% 100,00%
CV_1070 gltA Q7NZ52 type II citrate synthase 48 20,00% 31,00% 6 10 19 78 0,2 100,00% 100,00%
CV_1071 sucA Q7NZ51 2-oxoglutarate dehydrogenase E1 105 10,00% 19,00% 3 4 32 59 0,5 100,00% 100,00%
CV_1072 sucB Q7NZ50 dihydrolipoamide succinyltransferase
E2
43 31,00% 33,00% 6 7 18 51 0,4 100,00% 100,00%
CV_1074 ipdA2 Q7NZ48 dihydrolipoamide dehydrogenase 50 19,00% 35,00% 9 12 23 47 0,5 100,00% 100,00%
CV_1075 sucC Q7NZ47 succinyl-CoA synthetase, beta subunit 41 30,00% 37,00% 9 12 36 75 0,5 100,00% 100,00%
CV_1080* Q7NZ42 methyl-accepting chemotaxis protein 67 - 4,00% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_1082* CV_1082 Q7NZ40 Hypothetical 16 - 6,20% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_1097 Q7NZ25 peptide ABC transporter substrate-
binding protein
59 44,00% 45,00% 15 17 183 373 0,5 100,00% 100,00%
CV_1164* gst1 Q7NYV8 glutathione S-transferase family
protein
23 - 5,30% - 1 - 4 - - 65,00%
CV_1173 Q7NYU9 cbb3-type cytochrome c oxidase
subunit II
23 17,00% 17,00% 2 2 2 8 0,3 100,00% 100,00%
CV_1175* CV_1175 Q7NYU7 Conserved Hypothetical 66 - 1,70% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_1177 Q7NYU5 small heat shock protein 16 6,40% 26,00% 1 3 3 13 0,2 63,00% 100,00%
CV_1222* Q7NYQ1 aldehyde dehydrogenase 53 - 5,00% - 1 - 1 - - 65,00%
90
CV_1261 phoU Q7NYL3 phosphate transport system regulatory
protein
27 11,00% 11,00% 1 1 1 2 0,5 63,00% 65,00%
CV_1292* ctaQ Q7NYI2 carboxypeptidase Taq 56 - 2,60% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_1366 Q7NYA8 phasin 19 60,00% 80,00% 9 13 45 100 0,5 100,00% 100,00%
CV_1413 pflA Q7NY62 pyruvate formate lyase activating
enzyme
29 5,40% 5,40% 1 1 1 2 0,5 63,00% 65,00%
CV_1500 aruB Q7NXX6 succinylarginine dihydrolase 48 2,90% 8,70% 1 3 4 8 0,5 63,00% 100,00%
CV_1513* phoA2 Q7NXW3 Alkaline phosphatase precursor ND - ND - 1 - 2 - - 58,00%
CV_1538 putA Q7NXT8 bifunctional proline
dehydrogenase/pyrroline-5-
carboxylate dehydrogenase
128 3,80% 6,40% 3 5 4 12 0,3 100,00% 100,00%
CV_1541* Q7NXT5 3-oxoacyl-ACP synthase 45 - 3,80% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_1543* CV_1543 Q7NXT3 Hypothetical 10 - 16,00% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_1628* CV_1628 Q7NXJ8 Conserved Hypothetical 54 - 4,90% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_1641 aceA Q7NXI5 isocitrate lyase 48 3,50% 6,00% 1 2 1 5 0,2 63,00% 100,00%
CV_1646* Q7NXI0 porin 41 - 10,00% - 2 - 3 - - 100,00%
CV_1746* cysS Q7NX82 Cysteinyl-tRNA synthetase 51 - 3,50% - 1 - 3 - - 65,00%
CV_1789 prkA Q7NX40 protein kinase 74 28,00% 53,00% 11 25 25 187 0,1 100,00% 100,00%
CV_1790* CV_1790 Q7NX39 Conserved Hypothetical 49 - 7,50% - 2 - 4 - - 100,00%
CV_1934* metY Q7NWP7 O-acetylhomoserine (thiol)-lyase 45 - 9,90% - 2 - 4 - - 100,00%
CV_1981 Q7NWK5 ABC transporter binding protein 63 4,00% 6,00% 1 2 1 6 0,2 63,00% 100,00%
CV_1989 Q7NWK0 porin 22 17,00% 37,00% 3 6 12 31 0,4 100,00% 100,00%
CV_2019 Q7NWH0 aldehyde dehydrogenase 53 13,00% 36,00% 3 10 10 59 0,2 100,00% 100,00%
CV_2025 Q7NWG4 aminotransferase 51 9,60% 15,00% 2 4 6 12 0,5 100,00% 100,00%
CV_2084* caiA Q7NWA6 acyl-CoA dehydrogenase 42 - 3,10% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_2088 atoB Q7NWA2 acetyl-CoA C-acetyltransferase 41 6,30% 9,10% 1 2 1 3 0,3 63,00% 100,00%
CV_2097* Q7NW93 nitrilase 29 - 10,00% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_2179* trpE Q7NW11 anthranilate synthase component I 54 - 7,20% - 2 - 2 - - 100,00%
CV_2181* Q7NW09 Short Chain Dehydrogenase 26 - 10,00% - 1 - 6 - - 65,00%
91
CV_2182* rpe Q7NW08 ribulose-phosphate 3-epimerase 24 - 3,50% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_2207 fabZ Q7NVY3 (3R)-hydroxymyristoyl-ACP
dehydratase
17 5,30% 5,30% 1 1 3 6 0,5 63,00% 65,00%
CV_2364 phaB Q7NVH9 acetoacetyl-CoA reductase 26 9,80% 30,00% 1 4 7 17 0,4 63,00% 100,00%
CV_2374* CV_2374 Q7NVG9 Hypothetical 16 - 8,00% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_2376* CV_2376 Q7NVG7 Conserved Hypothetical 16 - 23,00% - 2 - 3 - - 100,00%
CV_2424 gstA Q7NVB9 glutathione S-transferase 26 7,70% 7,70% 1 1 1 3 0,3 63,00% 65,00%
CV_2470 acnB Q7NV74 bifunctional aconitate hydratase w/w-
methyllisocitrate dehydratase
93 24,00% 33,00% 13 18 42 83 0,5 100,00% 100,00%
CV_2481* Q7NV64 amino acid ABC transporter 42 - 4,50% - 1 - 1 - - 100,00%
CV_2721 CV_2721 Q7NUH7 Hypothetical 52 2,10% 14,00% 1 5 2 6 0,3 98,00% 100,00%
CV_2728 Q7NUH0 alcohol dehydrogenase 39 24,00% 24,00% 7 7 53 104 0,5 100,00% 100,00%
CV_2761 trpA Q7NUD9 tryptophan synthase subunit alpha 28 5,30% 11,00% 1 2 1 4 0,3 63,00% 100,00%
CV_2802* Q7NUA1 Peptide Synthetase 382 - 0,34% - 1 - 1 - - 100,00%
CV_2914* pepA Q7NTY9 leucyl aminopeptidase 56 - 2,30% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_2932* Q7NTX1 Signal Peptide Protein 28 - 4,60% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_2983 Q7NTS0 amino acid ABC transporter substrate-
binding protein
27 43,00% 43,00% 6 6 15 30 0,5 100,00% 100,00%
CV_3001* CV_3001 Q7NTQ3 Hypothetical 31 - 6,80% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3011* flaD Q7NTP3 Flagellin D 38 - 4,80% - 1 - 3 - - 65,00%
CV_3012* Q7NTP2 serine carboxypeptidase ND - ND - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3016 rbsB Q7NTN8 ribose ABC transporter, substrate
binding protein
32 4,50% 4,50% 1 1 2 4 0,5 63,00% 65,00%
CV_3041* ugd Q7NTL3 UDP-glucose dehydrogenase 48 - 8,00% - 2 - 2 - - 100,00%
CV_3084 gdhA Q7NTH1 glutamate dehydrogenase 179 7,80% 12,00% 7 13 18 40 0,5 100,00% 100,00%
CV_3099* CV_3099 Q7NTF7 Hypothetical 12 - 34,00% - 3 - 16 - - 100,00%
CV_3244* nagD Q7NT20 N-acetylglucosamine metabolism
protein
34 - 11,00% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3270 vioE Q7NSZ5 violacein biosynthetic Enzyme VioE 22 8,20% 18,00% 1 2 1 3 0,3 63,00% 100,00%
CV_3274* vioA Q9S3V1 vioA - tryptophan 2-monooxygenase 47 - 7,20% - 1 - 1 - - 65,00%
92
CV_3282* acsA Q7NSY7 Acetyl-CoA synthetase 72 - 3,50% - 2 - 6 - - 100,00%
CV_3304* aceB Q7NSW5 malate synthase 59 - 4,30% - 2 - 4 - - 100,00%
CV_3305 CV_3305 Q7NSW4 Conserved Hypothetical 25 7,30% 13,00% 1 2 1 5 0,2 63,00% 100,00%
CV_3352* pgm Q7NSR8 phosphoglyceromutase 56 - 3,00% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3354* prc Q7NSR6 carboxy-terminal processing protease 50 - 2,10% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_3376 minD Q7NSP4 septum site-determining protein minD 29 15,00% 20,00% 2 3 8 16 0,5 100,00% 100,00%
CV_3424 ompC Q7NSK0 porin 38 56,00% 67,00% 13 18 282 559 0,5 100,00% 100,00%
CV_3447 cheV1 Q7NSH9 chemotaxis protein CheV 34 11,00% 20,00% 2 4 11 26 0,4 100,00% 100,00%
CV_3448 cheY3 Q7NSH8 chemotaxis regulator protein CheY 15 8,40% 8,40% 1 1 2 4 0,5 63,00% 65,00%
CV_3450 Q7NSH6 chemotaxis protein CheA 67 6,30% 11,00% 2 4 4 13 0,3 100,00% 100,00%
CV_3573* cysl Q7NS53 sulfite reductase hemoprotein, beta
subunit
62 - 1,60% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3589 glnA Q7NS38 glutamine synthetase 52 7,00% 23,00% 3 7 12 31 0,4 100,00% 100,00%
CV_3605* Q7NS22 hydrolase 17 - 7,90% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3615* purM Q7NS12 phosphoribosylformylglycinamidine
cyclo-ligase
37 - 3,20% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3640* rpsF Q7NRY7 30S ribosomal protein S6 14 - 18,00% - 1 - 3 - - 65,00%
CV_3682* rpoS Q7NRU8 RNA polymerase sigma factor RpoS 36 - 6,60% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_3694* CV_3694 Q7NRT6 Conserved Hypothetical 13 - 12,00% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_3699 deoB Q7NRT1 phosphopentomutase 43 4,40% 4,40% 1 1 1 2 0,5 63,00% 98,00%
CV_3715* trpS2 Q7NRR5 Tryptophanyl-tRNA synthetase 38 - 12,00% - 2 - 5 - - 100,00%
CV_3780 arcC Q7NRK1 carbamate kinase 34 350,00% 13,00% 1 3 1 5 0,2 63,00% 100,00%
CV_3801* greA Q7NRI0 transcription elongation factor 17 - 9,50% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_3814* Q7NRG7 type II secretion system protein 73 - 1,70% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_3824* CV_3824 P60012 Conserved Hypothetical 29 - 7,50% - 1 - 2 - - 98,00%
CV_3850* CV_3850 Q7NRD3 Hypothetical 32 - 12,00% - 3 - 4 - - 100,00%
CV_3926* goaG Q7NR58 4-aminobutyrate aminotransferase 45 - 8,80% - 1 - 1 - - 98,00%
CV_3943* Q7NR41 ABC transporter ATP-binding protein 27 - 6,80% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_4001 CV_4001 Q7NQY4 Conserved Hypothetical 11 13,00% 13,00% 1 1 2 10 0,2 63,00% 98,00%
93
CV_4057 rply Q7NQT0 50S ribosomal protein L25 11 46,00% 67,00% 3 6 9 24 0,4 100,00% 100,00%
CV_4068 rep Q7NQR9 ATP-dependent DNA helicase 76 1,00% 1,00% 1 1 2 4 0,5 63,00% 65,00%
CV_4103 ompW Q7NQN4 outer membrane protein W 23 30,00% 30,00% 4 4 17 49 0,3 100,00% 100,00%
CV_4107* CV_4107 Q7NQN0 Conseved Hypothetical 61 - 2,20% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_4112 aspA Q7NQM5 aspartate ammonia-lyase 50 21,00% 32,00% 6 10 23 117 0,2 100,00% 100,00%
CV_4142* hoxX Q7NQJ5 hoxX-like protein 63 - 1,80% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_4163 rpsM Q7NQH4 30S ribosomal protein S13 13 13,00% 42,00% 1 4 3 10 0,3 99,00% 100,00%
CV_4204* ftsE Q7NQD6 cell division ATP-binding protein ftsE,
ABC transporter ATP-binding protein
24 - 7,80% - 1 - 1 - - 65,00%
CV_4239* Q7NQA1 Amidase 19 - 8,00% - 1 - 3 - - 65,00%
CV_4259 Q7NQ81 nitrogen assimilation regulatory
protein NtrX
48 3,80% 7,10% 1 2 1 3 0,3 100,00% 100,00%
CV_4276* Q7NQ64 glutamate-cysteine ligase 47 - 4,90% - 1 - 2 - - 65,00%
CV_4300 CV_4300 Q7NQ40 Conserved Hypothetical 17 63,00% 78,00% 5 7 27 63 0,4 100,00% 100,00%
CV_4329 Q7NQ13 oligopeptide ABC transporter system,
substrate-binding protein
59 19,00% 32,00% 6 10 40 97 0,4 100,00% 100,00%
CV_4392* Q7NPV0 ABC transporter 32 - 7,20% - 1 - 2 - - 65,00%
94
ORF nº Gene Uniprot
ID
Product name MW
(kDA)
Sequence
Coverage
Nº of unique
peptides
Nº of Assigned
Spectra
Protein Identification
Probability
CV_0995 Q7NZC7 aminotransferase 45 11,00% 2 4 100,00%
CV_1100 dppD Q7NZ22 ABC transporter ATP-binding protein 35 8,30% 2 6 100,00%
CV_1651 tdh Q7NXH5 L-threonine 3-dehydrogenase 37 6,70% 1 3 63,00%
CV_2024 Q7NWG5 glutamine synthetase 50 5,20% 1 1 63,00%
CV_0162 purK Q7P1Q1 phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
ATPase subunit
40 2,70% 1 2 63,00%
CV_0750 Q7P019 glutamine-scyllo-inositol transaminase 41 3,70% 1 1 63,00%
CV_4118 spsC Q7NQL9 spore coat polysaccharide biosynthesis
protein C
45 6,40% 2 4 100,00%
CV_0815 ptsH Q7MBF9 sugar transport PTS system phosphocarrier
protein HPr
10 27,00% 1 1 63,00%
CV_3107 Q7NTF0 two-component response regulator 26 15,00% 2 3 100,00%
CV_3791 Q7NRJ0 FKBP-type peptidylprolyl isomerase 12 14,00% 1 2 63,00%
CV_0249 pykF Q7P1G4 Pyruvate kinase 51 13,00% 2 10 100,00%
CV_0383 rhlE3 Q7P131 ATP-dependent RNA helicase 51 5,90% 2 3 100,00%
CV_0586 ilvl Q7P0I1 acetolactate synthase isozyme III, large
subunit
65 4,40% 2 2 100,00%
CV_1295 ecpD Q7NYH9 chaperone protein ecpD 27 18,00% 3 9 100,00%
CV_0189 pgk Q7P1M4 phosphoglycerate kinase 41 8,20% 2 3 100,00%
CV_1742 glnS Q7NX86 glutaminyl-tRNA synthetase 64 2,30% 1 2 63,00%
CV_3575 cysB1 Q7NS51 transcriptional regulator CysB-like protein 35 3,80% 1 2 63,00%
CV_3465 guaA Q7NSG1 GMP synthase 58 3,00% 1 2 100,00%
CV_0038 Q7P223 histidinol-phosphate aminotransferase 39 7,40% 1 1 63,00%
CV_0130 Q7P1T3 Xaa-Pro aminopeptidase 50 1,90% 1 1 63,00%
CV_0146 pgl Q7P1R7 6-phosphogluconolactonase 23 7,20% 1 1 63,00%
CV_0149 pgi Q7P1R4 glucose-6-phosphate isomerase 61 2,60% 1 3 63,00%
CV_0174 dksA Q7P1N9 DnaK suppressor protein 16 26,00% 2 3 100,00%
Tabela 2 Proteinas que deixaram de ser expressas na condição de cultivo com ferro.
95
CV_0402 hslU Q7P112 ATP-dependent protease ATP-binding
subunit HslU
50 5,40% 2 3 100,00%
CV_0433 oprM Q7P0Y2 outer membrane efflux protein 50 8,20% 3 3 100,00%
CV_0435 Q7P0Y0 multidrug efflux membrane permease 42 14,00% 4 6 100,00%
CV_0494 Q7P0S2 outer membrane receptor protein 67 3,40% 1 1 63,00%
CV_0505 leuS Q7P0R1 leucyl-tRNA synthetase 97 5,00% 2 2 100,00%
CV_0530 Q7P0N6 NADPH:quinone oxidoreductase 17 8,00% 1 1 63,00%
CV_0577 Q7P0J0 transcriptional regulator, MarR family 18 13,00% 1 1 63,00%
CV_0592 CV_0592 Q7P0H5 Conserved Hypothetical 35 5,20% 1 1 63,00%
CV_0610 hisG Q7P0F7 ATP phosphoribosyltransferase 23 13,00% 1 1 63,00%
CV_0658 CV_0658 Q7P0A9 Conserved Hypothetical 34 3,60% 1 2 63,00%
CV_0710 Q7P058 outer membrane multidrug resistance
lipoprotein
51 2,50% 1 1 63,00%
CV_0758 Q7P011 Hypothetical 23 8,30% 1 2 63,00%
CV_0928 Q7NZJ4 translational inhibitor protein 13 60,00% 3 8 100,00%
CV_0985 accC Q7NZD7 Acetyl-CoA carboxylase biotin carboxylase
subunit
50 3,30% 1 2 99,00%
CV_1106 trxC Q7NZ16 thioredoxin 15 24,00% 2 2 100,00%
CV_1189 Q7NYT3 two-component system 37 2,40% 1 1 63,00%
CV_1310 ampC Q7NYG4 beta-lactamase 43 11,00% 3 6 100,00%
CV_1354 ihfA Q7NYC0 integration host factor alpha-subunit 11 11,00% 1 3 63,00%
CV_1445 CV_1445 Q7NY30 Hypothetical 22 14,00% 2 2 100,00%
CV_1460 CV_1460 Q7NY15 Conserved Hypothetical 16 26,00% 2 6 100,00%
CV_1561 cobW Q7NXR5 cobalamin synthesis protein 40 3,80% 1 2 63,00%
CV_1611 CV_1611 Q7NXL5 Conserved Hypothetical 13 17,00% 2 4 100,00%
CV_1645 dnaJ Q7NXI1 molecular chaperone DnaJ 41 2,70% 1 2 63,00%
CV_1654 glyQ Q7NXH2 glycyl-tRNA synthetase, alpha chain 35 5,20% 1 1 63,00%
CV_1787 mutT Q7NX42 ADPribose diphosphatase 20 13,00% 1 1 63,00%
CV_1832 sbp Q7NWZ7 sulfate transport system sulfate-binding 38 5,20% 1 2 63,00%
96
protein
CV_1908 fbpA Q7NWS2 ABC transporter, iron binding protein 36 8,80% 2 6 100,00%
CV_1937 gltX Q7NWP4 glutamyl-tRNA synthetase 52 7,80% 2 3 100,00%
CV_2036 Q7NWF4 peroxiredoxin/glutaredoxin family protein 27 21,00% 4 16 100,00%
CV_2047 Q7NWE3 nucleotide-binding protein 19 6,60% 1 6 98,00%
CV_2060 mucB Q7NWD0 negative regulator for alginate biosynthesis
MucB
35 4,70% 1 2 63,00%
CV_2063 lepA Q7NWC7 GTP-binding protein LepA 66 2,50% 1 1 63,00%
CV_2199 frr Q7NVZ1 ribosome recycling factor 21 22,00% 3 10 100,00%
CV_2213 Q7NVX8 sensor histidine kinase/response regulator 81 1,60% 1 1 63,00%
CV_2218 CV_2218 Q7NVX3 Conserved Hypothetical ND ND 1 1 56,00%
CV_2287 nrdA Q7NVQ5 ribonucleoside-diphosphate reductase
subunit alpha
108 5,80% 4 6 100,00%
CV_2347 Q7NVJ5 membrane lipoprotein 35 9,70% 3 6 100,00%
CV_2360 Q7MBF3 Dioxygenase related to 2-nitropropane
dioxygenase
49 8,10% 1 2 63,00%
CV_2386 prfC Q7NVF7 peptide chain release factor RF-3 60 3,00% 1 2 99,00%
CV_2389 ribAB Q7NVF4 bifunctional 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-
phosphate synthase/GTP
cyclohydrolase II-like protein
40 8,00% 2 6 100,00%
CV_2391 nusB Q7NVF2 transcription antitermination protein NusB 17 6,70% 1 1 100,00%
CV_2397 map1 Q7NVE6 methionine aminopeptidase 29 4,20% 1 1 63,00%
CV_2528 dapF Q7NV18 diaminopimelate epimerase 30 9,10% 1 1 63,00%
CV_2533 mobB Q7NV13 molybdopterin-guanine dinucleotide
biosynthesis protein B
18 7,90% 1 1 62,00%
CV_2553 Q7NUZ4 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase 66 2,10% 1 1 63,00%
CV_2555 lon Q7NUZ2 endopeptidase La 89 1,50% 1 1 63,00%
CV_2614 CV_2614 Q7NUT3 Conserved Hypothetical 15 17,00% 1 1 63,00%
CV_2688 Q7NUK9 binding protein component of ABC
transporter
66 3,20% 1 1 63,00%
97
CV_2760 accD Q7NUE0 Acetyl-CoA carboxylase subunit beta 32 4,50% 1 1 60,00%
CV_2767 usg Q7NUD3 aspartate-semialdehyde dehydrogenase 36 6,50% 1 1 63,00%
CV_2876 speA Q7NU27 arginine decarboxylase 70 4,30% 3 6 100,00%
CV_2971 CV_2971 Q7NTT2 Hypothetical 32 3,70% 1 1 63,00%
CV_2976 Q7NTS7 short chain dehydrogenase 28 15,00% 1 1 63,00%
CV_3052 fruB Q7NTK2 phosphotransferase system 89 3,70% 1 1 63,00%
CV_3069 CV_3069 Q7NTI5 Conserved Hypothetical 16 14,00% 1 2 63,00%
CV_3077 CV_3077 Q7NTH7 Conserved Hypothetical 13 15,00% 1 1 63,00%
CV_3537 hisS Q7NS89 histidyl-tRNA synthetase 47 5,00% 1 2 63,00%
CV_3613 CV_3613 Q7NS14 Conserved Hypothetical 26 9,10% 1 3 63,00%
CV_3647 Q7MBD8 Crp/Fnr family transcriptional regulator 28 4,40% 1 2 63,00%
CV_3674 rimM Q7NRV6 16S rRNA processing protein 19 11,00% 1 3 63,00%
CV_3710 CV_3710 Q7NRS0 Conserved Hypothetical 31 8,40% 1 1 63,00%
CV_3878 fliC3 Q7NRA5 flagellin 29 4,60% 1 1 63,00%
CV_3971 CV_3971 Q7NR14 Conserved Hypothetical 77 2,30% 1 1 63,00%
CV_3998 dsbA Q7NQY7 thiol:disulfide interchange protein DsbA 23 14,00% 2 4 100,00%
CV_4038 gltB Q7NQU9 glutamate synthase subunit alpha 162 2,40% 2 2 100,00%
CV_4129 udg Q7NQK8 udpglucose 6-dehydrogenase 47 5,80% 1 3 63,00%
CV_4178 rpmC Q7NQG0 50S ribosomal protein L29 7 23,00% 1 1 63,00%
CV_4230 surA Q7NQB0 survival protein surA 48 2,60% 1 1 63,00%
CV_4245 sseA Q7NQ95 thiosulfate sulfurtransferase 30 4,30% 1 1 63,00%
CV_4262 Q7NQ78 sun protein 46 6,20% 1 1 63,00%
CV_4279 dsbE Q7NQ61 thioredoxin-related transmembrane protein 16 12,00% 1 1 63,00%
CV_4373 Q7NPW9 glutathione transferase 24 13,00% 1 1 63,00%
CV_1204 mrp Q7NYR9 Mrp protein 38 4,40% 1 3 100,00%
CV_1584 trxA Q7NXP2 thioredoxin 12 38,00% 3 19 100,00%
CV_2073 Q7NWB7 Beta-hexosaminidase 38 5,00% 1 4 63,00%
CV_2387 ribE Q7NVF6 riboflavin synthase, alpha chain 22 5,90% 1 2 63,00%
CV_3415 fabD Q7NSK8 ACP S-malonyltransferase 33 4,90% 1 2 63,00%
98
ORF
number
Gene
name
Uniprot
ID
Product MW
(kDA)
Sequence
Coverage
Nº of Unique
Peptides
Nº of Assigned
Spectra
Fold
Change
Protein
Identification
Probability
Control Fe Control Fe Control Fe Control Fe
CV_1496 Q7NXY0 bifunctional N-
succinyldiaminopimelate-
aminotransferase/acetylornithine
transaminase
43 26,00% 9,20% 6 2 24 8 3 100,00% 100,00%
CV_1197 Q7NYS5 polysaccharide/polyol phosphate
ABC transporter ATPase
42 9,20% 3,20% 2 1 9 2 4,5 100,00% 65,00%
CV_0671 Q7P096 ATP synthase F0F1 subunit
gamma
32 10,00% 3,50% 2 1 13 4 3,3 100,00% 65,00%
CV_0003 Q7P257 DNA gyrase subunit B 88 6,90% 4,10% 3 2 11 7 1,6 100,00% 100,00%
CV_0145 zwf Q7P1R8 glucose-6-phosphate 1-
dehydrogenase
55 11,00% 2,20% 4 1 13 3 4,4 100,00% 65,00%
CV_3343 adk Q7NSS7 adenylate kinase 23 14,00% 21,00% 2 3 6 4 1,5 100,00% 100,00%
CV_3429 gcvP Q7NSJ5 glycine dehydrogenase 102 7,90% 6,90% 4 4 11 6 1,8 100,00% 100,00%
CV_3431 gcvT Q7NSJ3 glycine cleavage system
aminomethyltransferase T
39 14,00% 10,00% 2 1 4 2 2 100,00% 65,00%
CV_0191 tktA Q7P1M2 transketolase 72 23,00% 16,00% 10 7 47 23 2,1 100,00% 100,00%
CV_4162 rpsK Q7NQH5 30S ribosomal protein S11 14 24,00% 6,10% 2 1 7 2 3,5 100,00% 65,00%
CV_1060 lysS Q7NZ62 lysyl-tRNA synthetase 57 9,20% 2,00% 4 1 6 1 6 100,00% 65,00%
CV_1003 rhlE4 Q7NZB9 ATP-dependent RNA helicase 49 5,70% 5,70% 2 1 4 1 4 100,00% 65,00%
CV_2892 rhlE1 Q7NU11 ATP-dependent RNA helicase 48 6,40% 3,20% 2 1 3 1 3 100,00% 65,00%
CV_3394 Q7NSM7 cystathionine gamma-lyase 41 6,60% 6,60% 1 1 3 1 3 63,00% 65,00%
CV_3333 Q7NST7 sigma-54 modulation protein 12 12,00% 12,00% 1 1 3 2 1,5 100,00% 65,00%
CV_4124 Q7NQL3 aminotransferase 39 9,30% 3,00% 2 1 7 4 1,8 100,00% 65,00%
CV_0876 prlC Q7NZP6 oligopeptidase A 76 7,50% 7,50% 3 3 12 5 2,4 100,00% 100,00%
Tabela 3 Proteínas que tiveram a sua expressão diminuída na condição de cultivo com ferro.
99
CV_3476 fumA Q7NSF0 fumarate hydratase 55 5,10% 1,60% 1 1 3 2 1,5 63,00% 65,00%
CV_0886 fpr Q7NZN6 ferredoxin-NADP reductase 29 25,00% 15,00% 4 3 11 7 1,6 100,00% 100,00%
CV_3185 Q7NT76 peptidyl-prolyl cis-trans
isomerase
18 31,00% 6,10% 3 1 11 1 11 100,00% 99,00%
CV_1944 clpB Q7NWN7 ATP-dependent Clp protease
subunit
95 18,00% 10,00% 11 6 52 16 3,3 100,00% 100,00%
CV_3412 fabF Q7NSL0 3-oxoacyl-ACP synthase 43 19,00% 13,00% 3 2 18 7 2,6 100,00% 100,00%
CV_0143 eda Q7P1S0 2-dehydro-3-deoxy-
phosphogluconate aldolase
22 37,00% 24,00% 4 3 17 5 3,4 100,00% 100,00%
CV_0144 edd Q7P1R9 phosphogluconate dehydratase 65 14,00% 3,10% 4 1 13 2 6,6 100,00% 100,00%
CV_0223 CV_0223 Q7P1J0 Conserved Hypothetical 24 32,00% 13,00% 4 2 13 4 3,3 100,00% 100,00%
CV_0234 pcm2 Q7P1H9 protein-L-isoaspartate(D-
aspartate) O-methyltransferase
24 7,80% 7,80% 1 1 5 2 2,5 63,00% 100,00%
CV_0401 hslV Q7P113 ATP-dependent protease
peptidase subunit
20 27,00% 8,20% 3 1 6 1 6 100,00% 65,00%
CV_0446 Q7P0W9 ABC transporter 23 23,00% 7,10% 3 1 19 6 3,2 100,00% 65,00%
CV_0560 gapA Q7P0K7 glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
36 41,00% 31,00% 8 6 57 29 2 100,00% 100,00%
CV_0588 ilvC Q7P0H9 ketol-acid reductoisomerase 37 6,80% 2,70% 2 1 4 1 4 100,00% 65,00%
CV_0669 atpH Q7P098 ATP synthase F1, delta subunit 19 28,00% 21,00% 3 2 17 7 2,4 100,00% 100,00%
CV_0670 atpA Q7P097 ATP synthase F1, alpha subunit 55 40,00% 38,00% 14 13 103 71 1,5 100,00% 100,00%
CV_0848 rplU Q7NZS3 50S ribosomal protein L21 12 47,00% 40,00% 3 2 18 4 4,5 100,00% 100,00%
CV_0850 obgE Q7NZS1 GTPase ObgE 42 6,00% 6,00% 1 1 12 4 3 63,00% 65,00%
CV_0945 nuoE Q7NZH7 NADH dehydrogenase subunit E 18 7,20% 7,20% 1 1 3 2 1,5 63,00% 65,00%
CV_0963 metK Q7NZF9 S-adenosylmethionine synthetase 42 22,00% 14,00% 6 3 19 11 1,7 100,00% 100,00%
CV_0986 accB Q7NZD6 acetyl-CoA carboxylase biotin
carboxyl carrier protein subunit
16 19,00% 13,00% 2 1 4 2 2 100,00% 98,00%
CV_0989 ubiE Q7NZD3 ubiquinone/menaquinone
biosynthesis methyltransferase
29 18,00% 11,00% 3 2 15 9 1,7 100,00% 100,00%
CV_1094 nifS Q7NZ28 pyridoxal-phosphate-dependent 45 7,70% 7,70% 2 2 11 2 5,5 100,00% 100,00%
100
aminotransferase
CV_1137 adhE Q7NYY5 bifunctional acetaldehyde-
CoA/alcohol dehydrogenase
96 28,00% 15,00% 14 7 45 17 2,7 100,00% 100,00%
CV_1281 CV_1281 Q7NYJ3 Conserved Hypothetical 39 17,00% 6,70% 3 1 6 3 2 100,00% 65,00%
CV_1303 guaB Q7NYH1 inosine 5'-monophosphate
dehydrogenase
52 47,00% 45,00% 16 15 111 66 1,7 100,00% 100,00%
CV_1318 hptG Q7NYF6 heat shock protein 90 73 28,00% 14,00% 13 7 65 23 2,8 100,00% 100,00%
CV_1348 thrS Q7NYC6 threonyl-tRNA synthetase 72 6,20% 3,50% 3 2 10 4 2,5 100,00% 100,00%
CV_1349 infC Q7NYC5 translation initiation factor IF-3 17 16,00% 7,20% 2 1 8 2 4 100,00% 65,00%
CV_1350 rpmI Q7NYC4 50S ribosomal protein L35 7 22,00% 22,00% 1 1 9 5 1,8 63,00% 65,00%
CV_1353 pheT Q7NYC1 phenylalanyl-tRNA synthetase
subunit beta
85 7,10% 3,30% 3 1 15 2 7,6 100,00% 65,00%
CV_1355 Q7NYB9 transcriptional regulator protein 13 15,00% 15,00% 1 1 6 2 3 63,00% 65,00%
CV_1451 Q7NY24 transcriptional regulator 51 9,30% 2,20% 3 1 11 1 11 100,00% 65,00%
CV_1499 astD Q7NXX7 succinylglutamic semialdehyde
dehydrogenase
51 31,00% 20,00% 8 5 39 23 1,7 100,00% 100,00%
CV_1530 pta Q7NXU6 phosphate acetyltransferase 74 20,00% 17,00% 8 7 32 19 1,7 100,00% 100,00%
CV_1531 ackA Q7NXU5 acetate kinase 42 49,00% 18,00% 12 5 51 18 2,9 100,00% 100,00%
CV_1588 nadC Q7NXN8 nicotinate-nucleotide
pyrophosphorylase
30 9,70% 6,10% 2 1 3 2 1,5 100,00% 99,00%
CV_1642 grpE Q7NXI4 heat shock protein GrpE 21 23,00% 9,00% 3 1 20 4 5 100,00% 65,00%
CV_1656 glyS Q7NXH0 glycyl-tRNA synthetase subunit
beta
73 17,00% 13,00% 8 5 45 17 2,7 100,00% 100,00%
CV_1796 omlA Q7NX33 outer membrane lipoprotein
OmlA
14 13,00% 13,00% 1 1 4 2 2 63,00% 98,00%
CV_1810 Q7NX19 transcriptional regulator, marR
family
17 25,00% 11,00% 2 1 9 1 9,1 100,00% 65,00%
CV_1820 Q7NX09 Ribonuclease E 108 17,00% 13,00% 11 8 55 25 2,2 100,00% 100,00%
CV_2193 comL Q7NVZ7 competence lipoprotein ComL 30 11,00% 5,30% 2 1 6 2 3 100,00% 65,00%
CV_2198 pyrH Q7NVZ2 uridylate kinase 26 23,00% 9,60% 4 2 10 3 3,4 100,00% 100,00%
101
CV_2204 CV_2204 Q7NVY6 Hypothetical 85 6,60% 4,90% 4 3 15 4 3,8 100,00% 100,00%
CV_2297 Q7NVP5 outer membrane lipoprotein 29 19,00% 19,00% 4 4 14 9 1,6 100,00% 100,00%
CV_2298 gyrA Q7NVP4 DNA gyrase subunit A 96 4,40% 2,80% 3 2 8 5 1,6 100,00% 100,00%
CV_2301 serC Q7NVP1 phosphoserine aminotransferase 40 3,60% 6,60% 1 2 6 4 1,5 63,00% 100,00%
CV_2390 ribH Q7NVF3 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine
synthase
16 42,00% 18,00% 3 1 24 1 24 100,00% 65,00%
CV_2529 CV_2529 Q7NV17 Conserved Hypothetical 24 11,00% 11,00% 2 2 9 5 1,8 100,00% 100,00%
CV_2557 clpX Q7NUZ0 ATP-dependent protease ATP-
binding subunit ClpX
47 21,00% 12,00% 4 2 20 10 2 100,00% 100,00%
CV_2719 fadA Q7NUH9 acetyl-CoA acetyltransferase 42 17,00% 7,80% 5 2 18 3 6 100,00% 100,00%
CV_2720 fadB Q7NUH8 3-hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase
86 8,00% 1,90% 4 1 19 4 4,8 100,00% 65,00%
CV_2813 trxB Q7NU90 thioredoxin reductase 35 23,00% 21,00% 4 3 28 18 1,6 100,00% 100,00%
CV_3072 tyrS Q7NTI2 tyrosine-tRNA synthetase 47 15,00% 7,10% 3 1 15 2 7,6 100,00% 65,00%
CV_3085 aotJ Q7NTH0 arginine/ornithine ABC
transporter substrate-binding
protein
28 20,00% 17,00% 4 3 18 9 2 100,00% 100,00%
CV_3094 dacC Q7NTG2 D-ala-D-ala-carboxypeptidase 42 7,60% 7,60% 2 2 12 3 4 100,00% 100,00%
CV_3190 accA Q7NT71 acetyl-CoA carboxylase
carboxyltransferase subunit alpha
36 4,40% 7,20% 1 1 2 1 2 98,00% 65,00%
CV_3393 CV_3393 Q7NSM8 Conserved Hypothetical 12 20,00% 20,00% 2 2 14 9 1,6 100,00% 100,00%
CV_3418 rpmF Q7NSK5 50S ribosomal protein L32 7 37,00% 37,00% 1 1 3 2 1,5 63,00% 65,00%
CV_3457 pyrG Q7NSG9 CTP synthetase 60 8,40% 2,90% 2 1 3 1 3 100,00% 65,00%
CV_3467 elaB Q7NSF9 transmembrane protein 11 31,00% 41,00% 2 3 9 6 1,5 100,00% 100,00%
CV_3528 purA2 Q7NS98 adenylosuccinate synthetase 47 24,00% 7,00% 7 2 23 5 4,6 100,00% 100,00%
CV_3542 ndk Q7NS84 nucleoside diphosphate kinase 15 60,00% 60,00% 4 4 47 14 3,4 100,00% 100,00%
CV_3549 katE Q7NS77 catalase 54 25,00% 12,00% 6 3 27 10 2,7 100,00% 100,00%
CV_3569 ileS Q7NS57 isoleucyl-tRNA synthetase 104 4,50% 1,30% 3 1 12 5 2,4 100,00% 65,00%
CV_3572 CV_3572 Q7NS54 Conserved Hypothetical 18 21,00% 21,00% 1 1 4 2 2 63,00% 65,00%
CV_3577 Q7NS50 ABC transporter ATP-binding 61 23,00% 17,00% 7 5 26 14 1,9 100,00% 100,00%
102
protein
CV_3579 CV_3579 Q7NS48 Conserved Hypothetical 41 12,00% 3,50% 3 1 7 3 2,4 100,00% 65,00%
CV_3637 rpll Q7NRZ0 50S ribosomal protein L9 16 56,00% 36,00% 6 4 56 28 2 100,00% 100,00%
CV_3659 Q7NRW9 transcriptional regulator arsR
family
22 27,00% 18,00% 4 3 24 7 3,5 100,00% 100,00%
CV_3662 CV_3662 Q7NRW6 Hypothetical 16 29,00% 7,80% 2 1 10 2 5 100,00% 99,00%
CV_3669 clpA Q7NRW0 ATP-dependent Clp protease ATP-
binding subunit
84 18,00% 11,00% 9 6 32 17 1,9 100,00% 100,00%
CV_3740 aspS Q7NRP0 aspartyl-tRNA synthetase 67 22,00% 7,70% 9 4 35 19 1,9 100,00% 100,00%
CV_3762 rpoD Q7NRL8 RNA polymerase sigma factor
RpoD
73 2,60% 2,60% 1 1 9 1 9,1 63,00% 65,00%
CV_3765 rpsU Q7NRL5 30S ribosomal protein S21 8 43,00% 29,00% 4 3 24 12 2 100,00% 100,00%
CV_3784 ubiB Q7NRJ7 CDP-6-deoxy-delta-3,4-glucoseen
reductase
38 5,00% 5,00% 1 1 2 1 2 63,00% 65,00%
CV_3817 Q7NRG4 electron transfer flavoprotein
alpha subunit
31 25,00% 19,00% 3 2 17 9 1,9 100,00% 100,00%
CV_3833 ffh Q7NRE9 signal recognition particle protein 49 9,80% 3,50% 2 1 4 2 2 100,00% 65,00%
CV_3900 hpT Q7NR84 hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase
20 53,00% 22,00% 6 2 42 5 8,5 100,00% 100,00%
CV_3921 argB Q7NR63 acetylglutamate kinase 30 19,00% 6,90% 3 1 4 2 2 100,00% 100,00%
CV_3978 CV_3978 Q7NR07 Conserved Hypothetical 54 32,00% 22,00% 10 6 41 18 2,3 100,00% 100,00%
CV_3982 CV_3982 Q7NR03 Conserved Hypothetical 20 13,00% 13,00% 1 1 9 6 1,5 63,00% 65,00%
CV_4005 sspA Q7NQY0 stringent starvation protein A 23 12,00% 17,00% 2 3 11 6 1,8 100,00% 100,00%
CV_4031 neuB Q7NQV6 N-acetylneuraminic acid synthase 39 17,00% 8,90% 3 2 7 3 2,4 100,00% 100,00%
CV_4053 Q7NQT4 amino acid ABC transporter
substrate-binding protein
28 25,00% 20,00% 4 3 19 8 2,4 100,00% 100,00%
CV_4055 Q7NQT2 GTP-dependent nucleic acid-
binding protein EngD
39 9,10% 5,50% 2 1 11 4 2,8 100,00% 65,00%
CV_4088 Q7NQP9 transcriptional regulator 36 6,90% 4,20% 1 1 2 1 2 63,00% 65,00%
CV_4108 CV_4108 Q7NQM9 Conserved Hypothetical 12 30,00% 30,00% 2 2 8 3 2,8 100,00% 100,00%
103
CV_4160 rpoA Q7NQH7 DNA-directed RNA polymerase
subunit alpha
36 43,00% 31,00% 10 6 73 46 1,6 100,00% 100,00%
CV_4177 rpsQ Q7NQG1 30S ribosomal protein S17 10 54,00% 11,00% 5 1 12 4 3 100,00% 100,00%
CV_4183 rplB Q7NQF5 50S ribosomal protein L2 30 27,00% 18,00% 8 4 59 38 1,6 100,00% 100,00%
CV_4184 rplW Q7NQF4 50S ribosomal protein L23 11 39,00% 32,00% 4 3 24 15 1,6 100,00% 100,00%
CV_4191 rpsL Q7NQE8 30S ribosomal protein S12 14 6,50% 6,50% 1 1 11 7 1,6 63,00% 65,00%
CV_4194 rplL Q7NQE5 50S ribosomal protein L7/L12 12 63,00% 44,00% 6 5 84 56 1,5 100,00% 100,00%
CV_4198 nusG Q7NQE1 transcription antitermination
protein NusG
20 33,00% 12,00% 3 1 18 3 6 100,00% 65,00%
CV_4304 CV_4304 Q7NQ36 Conserved Hypothetical 18 52,00% 22,00% 5 2 26 4 6,6 100,00% 100,00%
CV_4339 ftsA Q7NQ03 cell division protein ftsA 43 3,20% 3,20% 1 1 5 2 63,00% 65,00%
CV_4342 murC Q7NQ00 UDP-N-acetylmuramate--L-
alanine ligase
49 6,70% 4,50% 2 1 7 2 3,5 100,00% 65,00%
CV_4357 mreB Q7NPY5 rod shape-determining protein
MreB
37 20,00% 20,00% 4 4 11 7 1,6 100,00% 100,00%
CV_1352 pheS Q7NYC2 phenylalanyl-tRNA synthetase
subunit alpha
36 16,00% 8,50% 2 1 4 1 4 100,00% 65,00%
CV_1585 rho Q7NXP1 transcription termination factor
Rho
47 17,00% 7,20% 5 2 17 4 4,3 100,00% 100,00%
CV_3372 ppa Q7NSP8 inorganic diphosphatase 19 55,00% 23,00% 6 4 29 15 1,9 100,00% 100,00%
CV_4102 potA Q7NQN5 polyamine transport protein PotA 40 3,90% 3,90% 1 1 4 1 4 63,00% 65,00%
CV_4182 rpsS Q7NQF6 30S ribosomal protein S19 10 57,00% 37,00% 5 4 43 21 2,1 100,00% 100,00%
CV_4248 pyrE Q7NQ92 orotate
phosphoribosyltransferase
23 29,00% 21,00% 3 2 15 5 3 100,00% 100,00%
CV_4253 dps Q7NQ87 DNA-binding stress protein 17 46,00% 24,00% 6 3 36 10 3,6 100,00% 100,00%
CV_4281 secA Q7NQ59 preprotein translocase subunit
SecA
101 28,00% 10,00% 14 6 68 21 3,3 100,00% 100,00%
104
ORFs Domain
CV_0008* No Conserved Domain
CV_0090* Channel_Tsx superfamily
CV_0856* DUF333 super family
CV_0868 DUF1842 super family
CV_0884* Methyltransf_31
CV_1082* No Conserved Domain
CV_1175* GluZicin Superfamily
CV_1543* PP-binding superfamily
CV_1628* outer_NodT
CV_1790* vWFA superfamily; COG2718
CV_2374* terB-like superfamily
CV_2376* USP_like; AANH_like superfamily
CV_2721 OM_channels superfamily
CV_3001* SpoA superfamily
CV_3099* No Conserved Domain
CV_3305 SIMPL superfamily
CV_3694* Fe-S_biosyn superfamily
CV_3824* DUF1342 superfamily
CV_3850* YicC_superfamily; DUF1732 superfamily
CV_4001 BMFP superfamily
CV_4107* Peptidase_M30
CV_4300 USP_like; AANH_like superfamily
Tabela 4 ORFs hipotéticas encontradas na condição Fe+. As ORFs com * foram expressas exclusivamente após o tratamento com o ferro.
Figura 1 SDS-PAGE das proteínas totais extraídas de
molecular. 1-3 representam os extratos protéicos totais de
ferro; 4-6 representam os extratos protéicos totais de
ferro. As grades mostram os fragmentos que foram excisados para posterior digestão
PAGE das proteínas totais extraídas de C. violaceum. M = Marcador de peso
3 representam os extratos protéicos totais de C. violaceum cultivada sem adição de
6 representam os extratos protéicos totais de C. violaceum cultivada com adição de 9mM de
ragmentos que foram excisados para posterior digestão
105
. M = Marcador de peso
cultivada sem adição de
adição de 9mM de
ragmentos que foram excisados para posterior digestão in gel.