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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICAPÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ANÁLISE MOLECULAR DOS ÉXONS 8 A 11 DO GENE DA p53 EM AMOSTRAS DE CÂNCER DE COLO DO ÚTERO NO
RIO GRANDE DO NORTE
RODRIGO NISKIER FERREIRA BARBOSA
NATAL – RN2007
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Barbosa, Rodrigo Niskier Ferreira.
Análise molecular dos éxons 8 a 11 do gene da p53 em amostras de câncer de colo do útero no Rio
Grande do Norte / Rodrigo Nisker Ferreira Barbosa. – Natal [RN], 2007.
66 f.
Orientador: Rosely de Vasconcellos Meissner.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.
Departamento de Biologia Celular e Genética. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular.
1. Câncer de colo do útero - Dissertação. 2. P53 - Dissertação. 3. D66e - Dissertação. I. Meissner,
Rosely de Vasconcellos. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 618.14-006(043.3)
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICAPÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ANÁLISE MOLECULAR DOS ÉXONS 8 A 11 DO GENE DA p53 EM AMOSTRAS DE CÂNCER DE COLO DO ÚTERO NO
RIO GRANDE DO NORTE
RODRIGO NISKIER FERREIRA BARBOSA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Orientadora: Profª. Drª. Rosely de Vasconcellos Meissner
NATAL – RN2007
ii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, que sempre enfatizaram a importância
do estudo, independente da vida profissional a qual eu
decidisse me dedicar.
iii
AGRADECIMENTOS
Aqueles a quem devo minha própria existência e que, carinhosa e
pacientemente, vêm me assistindo dia-a-dia, amparando-me e perdoando todas as
minhas falhas: meus pais. Por essa razão, pediria aos aqui não citados, que,
igualmente, perdoassem-me por mencionar apenas alguns poucos e caros amigos,
dado a exigüidade do espaço.
À minha namorada, Ana Flávia de Oliveira Galvão, por ter acreditado em mim
e nunca ter desistido de construir um relacionamento maravilhoso, cujo
companheirismo e amor foram indispensáveis para minha solidez e segurança
durante todo esse tempo e para sempre.
À Ana Beatriz (Bia) por ter sido uma luz de inspiração e carinho, com seu
sorriso sempre me animando em todas as horas.
À professora Dra. Rosely de Vasconcellos Meissner pela orientação neste
trabalho e apoio em todos os sentidos.
Ao professor Dr. José Veríssimo Fernandes pelos conhecimentos passados,
dedicação, atenção e exemplo de profissionalismo.
Ao professor Ms. Thales pelas dicas, sugestões e amizade durante várias
etapas do trabalho.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Genética e
Biologia Molecular, pelos conhecimentos passados, dedicação, credibilidade e
exemplo de paixão pela profissão.
À professora Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros pela orientação no
estágio em docência e em vários aspectos pelos quais ela se tornou um exemplo.
À professora Dra. Lucymara Fassarella Agnez-Lima por toda dedicação ao
nosso grupo e empenho em melhorar o curso e exemplo de profissionalismo que se
tornou para mim e certamente para muitos.
À minha amiga Leila, secretária do PPG-GBM, por todo auxílio, carinho e
principalmente paciência para resolver absolutamente todos os problemas que tive.
A todos os funcionários da UFRN pela simples razão de serem partes
fundamentais para o funcionamento do sistema sem o qual nada disso seria
possível, principalmente os funcionários do departamento de Microbiologia e
Parasitologia e em especial a Otamir e “Seu” Aníbal.
iv
À minha amiga Walkíria que sempre se mostrou disponível a conversas e
sugestões, além do carinho e atenção e um sorriso sempre pronto a oferecer.
Aos amigos do laboratório: Cristina Pacheco, Renato, Tatiana e Gustavo pelo
companheirismo e dicas profissionais.
Aos demais colegas recém-chegados: Jean, Mariana, Kaline, Adriana, Ítalo,
Mendel, Ricardo, Cínthia e Alinne, a quem carinhosamente chamei de “novas
aquisições” do laboratório, pela oportunidade que me deram de aprender muito
sobre a arte de ensinar, pelo coleguismo e amizade.
A todo pessoal do Laboratório de Biologia Molecular e Genética pelo
coleguismo, paciência e dedicação.
A todos os meus colegas de turma (Matheus, Thiago, Giva, Lourena, Lorena,
Cristiane, Valeska, Vanessa, Cíntia, Leo, Ingrid, Antônio e Viviane) e das demais
turmas do PPG-GBM pelo coleguismo, ajuda e apoio, em especial a Igor Santos.
A Gilson e Giva Brito por terem agüentado minhas particularidades e talvez
chatices durante esses dois anos.
Ao meu melhor amigo: Gustavo Vaz pela amizade, companheirismo,
cumplicidade e experiências, os quais tentamos manter mesmo quando a distância,
tempo, disciplinas ou dissertações teimam em nos afastar.
Ao Banco do Nordeste pelo financiamento do projeto.
A CAPES pelo financiamento da minha bolsa de estudos.
A todos vocês o meu mais sincero agradecimento, obrigado!
v
“Do rio que tudo arrasta se diz que é violento.
Mas ninguém diz que são violentas as margens que o oprimem”
Bertolt Brecht
vi
RESUMO
As mutações no TP53 são frequentes nos cânceres humanos, mas não no câncer do colo do útero onde são raramente detectadas e a inativação e degradação da p53 é atribuída à ação do oncogene viral E6 dos papilomavírus humanos (HPVs) de alto risco. A partir da análise de linhagens celulares de carcinoma cervical foi sugerido que carcinomas cervicais HPV negativos apresentavam mutações no TP53, mas a análise de amostras clínicas não confirmou esta hipótese. Entretanto, na maioria dos estudos de mutações do TP53 no câncer de colo do útero foram analisados principalmente os éxons 5 a 8, região onde estão localizadas cerca de 90% das mutações descritas neste gene. Estudos recentes em diferentes tipos de câncer sugerem que a freqüência de mutações nos demais éxons do TP53 não é desprezível. O objetivo deste trabalho foi verificar se ocorrem mutações em regiões codificantes e não codificantes do TP53 humano em amostras de tecido de câncer de colo do útero de pacientes no Rio Grande do Norte utilizando eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE) como técnica de triagem. Foram analisados os exons 8 a 11, incluindo alguns introns, de 80 amostras de tumor e 8 amostras de sangue periférico de mulheres saudáveis. O DNA obtido das amostras foi amplificado por PCR usando iniciadores com grampo GC na extremidade de um deles. Os resultados para cada região foram visualizados após DGGE e coloração por nitrato de prata. Não foram observadas bandas amplificadas com padrão de migração diferente das obtidas de DNA de sangue periférico. Estes resultados estão de acordo com os descritos na literatura onde mutações no TP53 no câncer do colo do útero têm sido descritas com freqüência muito baixa.
vii
ABSTRACT
Mutations on TP53 gene are common in human cancer but not in cervical cancer where they are rarely found and the inactivation and degradation of p53 protein are attributed to the action of E6 viral oncogene from high risk human papillomavirus (HPV). Analysis of cervical cancer cell lines suggests that HPV negative samples shows mutation on TP53, but clinical approaches didn’t confirmed this hypothesis.However, in most TP53 mutations studies on cervical cancer, only the exons 5 to 8 were analyzed. Approximately 90% of mutations described are on this region. Recent studies on several cancer suggests that mutation frequency in the other exons must be considered. The aim of this work was to verify whether mutations on coding and non-coding regions occur in cancer tissue from cervical cancer in patients from Rio Grande do Norte using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) as screening tool. Exons 8 to 11 were analyzed including some introns from 80 tumor samples and 8 peripheral blood samples from healthy women. DNA were submitted to PCR using primers with GC clamp on the end of one of them. The results were observed for each region after DGGE and silver staining. It was observed no amplified fragment with different migration profile from those obtained from DNA of peripheral blood. These results agree with those from literature where TP53mutations in cervical cancer have been described in a very low frequency.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
µL Microlitro
ATP Adenosine Triphoshate – adenosina trifosfato
CDK Kinase dependent cycline – Quinase dependente de ciclina
DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação
DHPLC Denaturing High Perfomance Liquid Cromatography – Cromatografia desnaturante liquida de alta performance
DNA Desoxiribonucleic acid – Ácido Desoxirribunucleíco
dNTP Desoxynucleotide triphosphate –Desoxinucleotídeo trifosfato
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid – Ácido etilenodiaminotetraacético
HPV Human PapillomaVirus - Papiloma vírus humano
IARC Institute of Advanced Research on Cancer – Instituto de pesquisas avançadas em câncer
INCA Instituto Nacional do Câncer
kD Quilo Dalton
mL Mililitro
mM Milimolar
mRNA Mesenger Ribonucleic Acid – Ácido ribonucléico mensageiro
PAGE Poliacrylamide Gel – Gel de poliacrilamida
Pb Pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da polimerase
RFLPRestriction Fragmente Lenght Polymorphism – Polimorfismo de
comprimento dos fragmentos de restrição
SNP Single Nucleotide Polymorphism – Polimorfismo de nucleotídeo simples
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism – Polimorfismo de conformação da fita simples
TAE Tris-Acetato-EDTA
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borato-EDTA
UTR Untranslable Region – Região não traduzida
UV Ultra violeta
V Volts
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Alguns genes regulados pela p53 em resposta a diversos estímulos e as vias celulares onde atuam.
15
Figura 2. (A) Esquema mostrando a distribuição dos éxons no TP53. (B) Distribuição dos domínios funcionais da p53.
17
Figura 3. Distribuição por códons de 19.796 mutações descritas no TP53 em câncer.
20
Figura 4. Prevalência de 23.544 mutações descritas no TP53 em câncer. 20
Figura 5. Tipos de alterações envolvidas em 23.544 mutações descritas no TP53 em câncer.
21
Figura 6. Posição para anelamento de cada par de iniciadores no gene da p53. 28
Figura 7. Etapas para confirmação da amplificação de cada produto e análise por DGGE. 30
Figura 8. Esquema mostrando a disposição para aplicação do produto amplificado com o gradiente de desnaturação perpendicular ao sentido da corrente elétrica.
31
Figura 9. Esquema mostrando a disposição para aplicação do produto amplificado com gradiente de desnaturação paralelo ao sentido da corrente elétrica.
32
Figura 10. Resultado da eletroforese dos 8 produtos de PCR para o éxon 11 do TP53 das amostras de mulheres saudáveis, após coloração com nitrato de prata.
34
Figura 11. Perfil de dissociação do produto de amplificação do éxon 11 do TP53. 35
Figura 12. Resultados da DGGE corada com nitrato de prata. 36
Figura 13. Resultado da DGGE perpendicular corado com brometo de etídio. 37
Figura 14. Resultado da DGGE corada com brometo de etídio. 38
Figura 15. Resultado da eletroforese dos 8 produtos de PCR para o éxon 10 do TP53 das amostras de mulheres saudáveis, após coloração com solução de brometo de étidio.
39
Figura 16. Perfil de dissociação do produto de amplificação do éxon 11 do TP53. 39
x
Figura 17. Resultado da DGGE perpendicular corado com brometo de etídio. 40
Figura 18. Resultado da DGGE para o éxon 10 corada com nitrato de prata. 41
Figura 19. Resultado da eletroforese dos 8 produtos de PCR para os éxons 8 e 9 do TP53 das amostras de mulheres saudáveis, após coloração com nitrato de prata.
42
Figura 20. Perfil de dissociação do produto de amplificação do éxon 11 do TP53. 42
Figura 21. Resultado da DGGE para os éxons 8 e 9 corada com nitrato de prata.
43
Figura 22. Distribuição por códons de 96 subistituições de bases descritas no TP53 em câncer de colo do útero.
48
Figura 23. Prevalência dos tipos de 105 mutações descritas no TP53 em câncer de colo do útero.
49
Figura 24. Tipos de alterações envolvidas em 105 mutações descritas no TP53em câncer de colo do útero.
49
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Seqüências dos iniciadores utilizados, temperatura de anelamento e tamanho dos produtos formados após a reação da PCR para cada região analisada 28
Tabela 2. Relação de amostras que não amplificaram. 33
Tabela 3. Dados sobre as mutações já descritas para câncer de colo do útero disponíveis na internet. 47
xii
SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................................vi
ABSTRACT.................................................................................................................vii
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................viii
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................ix
LISTA DE TABELAS....................................................................................................xi
INTRODUÇÃO............................................................................................................13
Funções da proteína p53 ..........................................................................................14
Estrutura molecular do gene e da proteína p53 ........................................................16
Mutações e polimorfismos do TP53 ..........................................................................18
Inativação da p53 e HPV...........................................................................................22
Triagem de mutações por DGGE..............................................................................23
Considerações Finais................................................................................................24
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................25
2.1 Objetivo Geral .....................................................................................................25
2.2 Objetivos Específicos ..........................................................................................25
3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................26
3.1Tipo de estudo e população .................................................................................26
3.2Local e período do estudo....................................................................................26
3.3 Considerações éticas ..........................................................................................26
3.4 Obtenção das amostras ......................................................................................26
3.5 Extração de DNA do material ..............................................................................27
3.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) para região entre os éxons 8 a 11......27
3.7 Determinação do perfil de desnaturação.............................................................29
3.8 Eletroforese em gel dos produtos amplificados...................................................29
4 RESULTADOS.......................................................................................................33
4.1 Análise da região do éxon 11 ..............................................................................34
4.2 Análise da região do éxon 10 ..............................................................................38
4.3 Análise da região dos éxons 8 e 9. .....................................................................41
5 DISCUSSÃO ..........................................................................................................44
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................51
7. ANEXO I.................................................................................................................65
Barbosa, R.N.F 13
1 INTRODUÇÃO
O câncer de colo do útero é a segunda principal causa de morte por câncer
em mulheres no mundo, ficando atrás apenas do câncer de mama (World Health
Organization - http://www.who.int). A estimativa é de cerca de 250 mil mortes por ano
O número de casos novos de câncer de colo do útero esperados para o Brasil
em 2006 é de 19.260, com um risco estimado de 20 casos a cada 100 mil mulheres,
segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA,2006:
http://www.inca.gov.br/estimativa).
Na população feminina, sem considerar os tumores de pele não melanoma, o
câncer de colo do útero é o mais incidente na região Norte (22/100.000). Nas regiões
Sul (28/100.000), Centro-Oeste (21/100.000) e Nordeste (17/100.000) representa o
segundo tipo de tumor mais incidente. Na região Sudeste é o terceiro mais freqüente
(20/100.000) (INCA, 2006).
Este tipo de neoplasia está associado à atividade sexual, com um agente
infeccioso envolvido na sua etiologia (Maciag & Villa, 1999). Resultados de
numerosas pesquisas epidemiológicas e moleculares contribuíram para indicar
certos tipos de HPV de alto risco (HPV16 e HPV18 principalmente) como sendo
responsáveis pelo aparecimento e desenvolvimento do câncer do colo do útero e
suas lesões precursoras, independente de outros fatores de risco (Um et al., 2002).
Um dos eventos principais para o desenvolvimento do câncer de colo do útero
é a inativação de supressores tumorais como a p53 através da sua degração
proteolítica induzida por proteínas virais (May & MAy 1999). A p53 apresenta um
papel importante na regulação de eventos celulares para manutenção da integridade
genômica e estrutura cromossômica em resposta a danos no DNA (Zhan, 2005;
Hanahan & Weinberg, 2000). O não funcionamento destes processos pela
degradação da p53 pode resultar numa instabilidade genômica e transformação
celular maligna.
Barbosa, R.N.F 14
Funções da proteína p53
A p53 é expressa constitutivamente em quase todos os tecidos como uma
proteína reguladora (Guimaraes & Hainaut, 2002), mediando efeitos anti-
proliferativos coordenados, incluindo a regulação do ciclo celular, o reparo do DNA, a
apoptose, a diferenciação e a angiogênese (Vogelstein et al., 2000). O mecanismo
pelo qual a p53 regula estes processos é através de seu papel como fator de
transcrição seqüência-específico, interagindo com seqüências conservadas
presentes, geralmente, na região promotora de seus genes alvo e pela ligação direta
a seqüências não especificas no DNA (Sengupta & Harris, 2005).
A p53, chamada guardiã do genoma (Lane, 1992), está no ponto de
convergência de várias rotas sinalizadoras distintas. Cerca de 200 genes no genoma
humano provavelmente são regulados pela p53. O produto do gene P21CIP1/WAF1, por
exemplo, é um dos maiores mediadores dependentes de p53, atuando na parada do
ciclo celular na fase G1, pela inibição da atividade da cdk2-ciclina ou dos complexos
da cdk4 (Smith et al., 2000). A Figura 1 mostra alguns genes regulados pela p53 em
resposta a diversos estímulos.
Barbosa, R.N.F 15
Figura 1. Alguns genes regulados pela p53 em resposta a diversos estímulos e as vias celulares onde atuam. (adaptado de Volgestein et al., 2000).
A p53 é expressa em baixas quantidades na maioria dos tecidos. Diversos
tipos de sinais podem levar à sua ativação e acúmulo na célula. Estes sinais incluem
agentes danosos ao DNA (estresse genotóxico), ativação de oncogenes e outros
tipos de estresse como a hipóxia. Uma única quebra na estrutura molecular dupla fita
do DNA pode ser suficiente para induzir um aumento nos níveis da p53 (revisto por
Pluquet & Hainaut, 2001).
A quantidade de p53 nas células é determinada principalmente pela taxa
relativa entre produção e degradação. Sua degradação ocorre pela proteólise
mediada por ubiquitina. Uma das principais proteínas envolvidas nesse processo é a
MDM2 humana. Quando produzida em excesso, a p53 liga-se à região regulatória do
gene da MDM2 estimulando sua transcrição. Após a tradução, a MDM2 se liga a p53
e estimula a adição de grupos ubiquitina na região carboxi-terminal levando à
degradação. Isso diminui a concentração de p53 e consequentemente a transcrição
da MDM2, fechando o feedback (Momand, Wu & Dasgupta, 2000).
Quebrasno DNA
Luz Ultravioleta, Estresse Oncogenes
Parada do crescimento Apoptose
Prevenção da angiogenese
Espécies reativas de oxigênio
Barbosa, R.N.F 16
Além de regular o ciclo celular via inibição de CDKs, por exemplo, a p53 irá
também induzir a expressão de genes envolvidos com a apoptose (revisto por
Attardi, 2005). A proteína Bax, por exemplo, é um codificador de uma proteína pró-
apoptótica membro da família Bcl-2, que vai promover a formação de poros na
membrana mitocondrial externa, desencadeando o lançamento de fatores pró-
apoptóticos para o citoplasma, tais como a citocromo-c, ativando a pro-caspase 9 e,
assim, a cascata das caspases (Miyashita & Reed, 1995).
É sugerido que o reparo de danos ao DNA seja regulado pela atividade da
p53 através da ativação da transcrição de genes como o GADD45A, (Smith et al.,
2000; Zhan, 2005) e o DDB2 (Itoh et al., 2000), ambos envolvidos no processo de
ligação do complexo protéico do reparo por excisão de nucleotídeos a seqüências de
DNA danificadas por luz UV. Outra forma de regular o dano ao DNA é pela interação
direta da p53 com a porção ão
de bases (Zhou et al., 2001).
Estrutura molecular do gene e da proteína p53
O gene da proteína p53 (TP53), descrito primeiramente em 1979, foi o
primeiro gene supressor de tumor a ser identificado (DeLeo et al., 1979). Está
localizado na posição cromossômica 17p13.1, apresentando uma estrutura com 11
éxons e um tamanho de 19179 pb (Miller et al., 1986). Este gene faz parte de uma
família de genes altamente conservados a qual inclui pelo menos dois outros
membros: TP63 e TP73 (Levrero et al., 2000). O TP53 codifica uma fosfoproteína de
53 kD geralmente encontrada no núcleo, composta de 393 aminoácidos, sendo os
monômeros organizados numa conformação tetramérica (dímeros de dímeros) em
uma estrutura clássica para um fator de transcrição seqüência-específica (Levine et
al., 1991).
O primeiro éxon é descrito como não codificante, estando separado dos
demais por um íntron de 10.740 pb. Os demais éxons codificam o monômero da
estrutura tetramérica da proteína e podem ser agrupados em três regiões de acordo
com os domínios polipeptídicos determinados pelas suas seqüências. A Figura 2
esquematiza a organização clássica dos éxons do TP53, bem como os domínios
funcionais.
Barbosa, R.N.F 17
(A)
(B)
Figura 2. (A) Esquema mostrando a distribuição dos éxons no TP53. (B) Distribuição dos domínios funcionais da p53 (Vos et al., 2003).
A região amino-terminal é codificada pelos éxons 2 a 4 e corresponde aos
aminoácidos de 1 a 100. Nesta região se encontra o domínio transativador da
transcrição (aminoácidos de 1 a 42) (Unger et al., 1992). Mutações nos resíduos
Fen19, Leu22 e Trp23 alteram a capacidade da p53 em atuar como fator de
transcrição (Lin et al., 1995). Uma outra porção desta região (aminoácidos de 63 a
97) apresenta grande flexibilidade intramolecular assemelhando-se ao domínio de
ligação SH3 de algumas proteínas no qual ocorre ligação rápida e reversível de
outras proteínas (Williamson et al., 1994). Esta porção media a apoptose (Sakamuro
et al., 1997), a supressão de tumor (Walker & Levine, 1996) e a degradação da p53
via proteína E6 do papilomavírus humano (HPV) (Li & Coffino, 1996) e é alvo de
processos de modificações pós-traducionais, regulando, em parte, a atividade da p53
(Soussi & May, 1996).
A região dos éxons 5 a 8 é responsável por codificar os aminoácidos de 98 a
292 aproximadamente, correspondendo ao domínio de ligação ao DNA (Vogelstein &
Kinzler, 1994). Esta porção central do polipeptídio interage com seqüências
específicas do DNA caracterizadas por apresentarem um sítio de ligação consenso
com duas cópias da seqüência 5’ – PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy – 3’ (Pu = Purina e
Py = Pirimidina), separadas ou não por 1 – 13 nucleotídeos (May & May, 1999).
Nesta região, três códons para resíduos de cisteína (Cys176, Cys238 e Cys242) são
essenciais para ligação ao DNA e a transativação, encontrando-se alterados por
mutações em uma grande diversidade de tumores. A grande maioria das mutações
já mapeadas em TP53 se concentra nesta região e provocam, geralmente, uma
desestabilização termodinâmica no domínio (Bullock et al., 1997).
Domínio de ligação ao DNADomínio de
Transativação
Domínio de
tetramerização
Domínoregulatório
C-terminal
1-42 63-97 98-292 300-323 324-355 363-393
N-Terminal Dominio Central C-Terminal
NLS NES
SH3
Barbosa, R.N.F 18
A região carboxi-terminal (códons 300 a 393), que compreende os éxons 9 a
11, codifica os domínios responsáveis por três sinais de localização nuclear
(possibilita a migração da proteína do citoplasma para o núcleo), um domínio de
oligomerização (promove junção dos monômeros da p53), uma seqüência
reconhecedora do dano primário ao DNA e um domínio de regulação da transcrição
(Prives, 1994; Hupp et al., 1995; Ozbun & Butel, 1997). Modificações pós-
traducionais no produto desta região podem afetar ou alterar seletivamente a
afinidade da p53 pelos sítios de ligação particulares no DNA, ou a interação com
determinados fatores (Brooks & Gu, 2003).
O gene contém ainda uma grande região 3’ não traduzida (3’ UTR, de
Untranslable Region) de 1176 nucleotídeos localizada antes do sítio de inserção da
cauda poli A (Chang et al., 1993). A região 5’-UTR do mRNA tem uma tendência a
formar uma estrutura em alça envolvendo 280 nucleotídeos da região codificante. A
p53 se liga nesta região 5’-UTR e inibe a sua própria transcrição, influenciando
quantitativamente na presença da proteína na célula (Mosner et al., 1995).
A p53 apresenta cinco regiões altamente conservadas, verificadas através da
comparação das seqüências de aminoácidos de sua estrutura com a de diversas
espécies (Soussi et al., 1990). Estas regiões (I – V) correspondem aos resíduos 13-
23, 117-142, 171-181, 234-250 e 270-286, respectivamente. Quatro destas regiões
(II-V) fazem parte do domínio de ligação ao DNA codificada pelos éxons 5 a 8.
Recentemente foram descritas oito isoformas diferentes da p53 além da
forma mais conhecida e um novo promotor no intron 4 (Bourdon et al., 2005). Estas
variantes apresentam padrão de expressão tecido-específico e o promotor alternativo
é conservado evolutivamente estando presente tanto em Drosophila como no o
homem. Além disso, parece ocorrer expressão diferencial destas variantes no tecido
de tumor de mama. A expressão diferencial destas isoformas pode explicar a
dificuldade em associar o status da p53 com as suas propriedades biológicas em
cânceres humanos.
Mutações e polimorfismos do TP53
Desde a identificação de uma mutação somática de sentido trocado tumor-
específico (câncer colorretal) no TP53 em 1989 (Baker et al., 1989), centenas de
mutações na p53 têm sido identificadas em vários tipos de cânceres humanos
Barbosa, R.N.F 19
(Olivier et al., 2002). A localização e caracterização destas mutações podem revelar
dados importantes sobre a etiologia e a patogênese molecular dos tumores
humanos.
Mutágenos e carcinógenos danificam o genoma de forma característica,
deixando impressões mutagênicas no DNA que permitem identificar o tipo de
mutágeno envolvido. Mudanças específicas no DNA podem também surgir de
processos biológicos endógenos. Entretanto, processos de reparo do DNA e seleção
biológica de mutantes com propriedades específicas resultam na determinação de
quais mutantes serão estabilizados e mantidos durante a progressão do câncer
(Hainaut et al., 1998).
Apesar de qualquer éxon codificante poder apresentar uma alteração na sua
seqüência, a maioria das mutações descritas está localizada na região entre central
entre os éxons 4 e 9 (Olivier et al., 2002). Em 19.796 mutações somáticas
identificadas no TP53 em vários tipos de câncer, a maioria ocorre em 6 códons
específicos presentes na superfície de ligação ao DNA (códons 175, 245, 248, 249,
273 e 282) (Figura 3). Além de mutações de sentido trocado, que são a maioria das
mutações identificadas, são descritas mutações silenciosas, sem sentido, mutação
em sítio de processamento de mRNA, intrônicas, deleção, outros tipos e mudanças
na fase de leitura (Figura 4). Análise do perfil das mutações mostra que a principal
troca é do tipo GC>AT em ilhas CpG (24,7%) (Figura 5). Além de mutações, 42 tipos
de polimorfismos do TP53 foram descritos dos quais apenas quatro levam a
substituição de aminoácidos, três são silenciosos e os demais são intrônicos.
Barbosa, R.N.F 20
Figura 3. Distribuição por códons de 19.796 mutações descritas no TP53 em câncer (http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002, versão R11).
Figura 4. Prevalência de 23.544 mutações descritas no TP53 em câncer (adaptado de http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002, versão R11).
Barbosa, R.N.F 21
Figura 5. Tipos de alterações envolvidas em 23.544 mutações descritas no TP53 em câncer (http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002, versão R11).
Em câncer de colo do útero, a grande maioria dos estudos onde o TP53 foi
analisado, tem investigado apenas os éxons 5 a 8 por se tratar da região mais
freqüentemente estudada na maioria dos tumores (Olivier et al., 2002).
Alguns polimorfismos descritos no TP53 têm sido estudados como possíveis
fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de colo do útero, principalmente o
polimorfismo do códon 72, no éxon 4 que resulta na presença alternativa de prolina
ou arginina (Harris et al., 1986). Em um estudo recente foi mostrado que a variante
Arg72 pode induzir a apoptose pelo menos cinco vezes mais que a variante Pro72
(Dumont et al., 2003). Além disso, foi inicialmente sugerido que a variante Arg72
parece estar correlacionada a um aumento na susceptibilidade de câncer de colo do
útero (Storey et al., 1998), mas resultados posteriores não comprovaram esta
hipótese (revisados e analisados por meta-análise por Koushik et al., 2004).
Outras variações polimórficas do TP53 muito estudadas em diferentes tipos de
câncer são as que envolvem uma duplicação de 16 pb no íntron 3 (p53PIN3) e um
polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) para enzima MspI
no íntron 6 (G13494C) (Gaspar et al., 2001). Indivíduos com genótipos homozigotos
Barbosa, R.N.F 22
para a duplicação de 16 pb no íntron 3 e ausência do sítio de restrição no íntron 6
foram descritos como tendo um risco aumentado para alguns tipos de câncer (Wang-
Gohrke et al., 1999; Wu et al., 2002; Mitra et al., 2005). O impacto funcional do
polimorfismo p53PIN3 tem sido investigado. Sugere-se, através de caracterização in
vitro, que a presença do alelo A2 (duplicação de 16 pb) está associada a uma
diminuição nas quantidades de mRNA do TP53 (Gemignani et al., 2004). Em relação
ao polimorfismo G13494C, os estudos realizados mostram dados contraditórios em
relação a sua associação com o desenvolvimento de diferentes tipos câncer
(Lehman et al., 2000; Marsh et al., 2001; Buyru et al., 2005). Em trabalhos anteriores
de nosso grupo, realizados com amostras do Rio Grande do Norte, não foram
encontradas diferenças significativas nas distribuições genotípicas ou alélicas do
p53PIN3 ou G13494C entre pacientes com câncer do colo do útero e o grupo de
mulheres saudáveis (Fernandes, 2005; Bezerra & Galvão, 2006).
Inativação da p53 e HPV
O HPV é um pequeno vírus de DNA (7904 pb) que está bem adaptado ao
tecido hospedeiro, infectando células epiteliais diferenciadas da pele ou da mucosa
(Lowy & Howley, 2001). O gene E6 do HPV é essencial para o potencial oncogênico
do vírus, sendo um dos principais genes virais relacionados à imortalização e
transformação da célula infectada.
O produto deste gene, a proteína E6, está diretamente envolvido com a
degradação proteolítica dependente de ATP da p53, mediada pela ubiquitina ligase
E6AP (Scheffner et al., 1990; Thomas et al., 1999). Além disso, essa degradação é
altamente dependente da ligação de E6 à p53 uma vez que mutações que eliminam
esta interação promovem resistência à degradação (Scheffner et al., 1992).
Alguns trabalhos nos quais foi feito o seqüenciamento do TP53 em tecidos e
linhagens celulares derivados de carcinoma do colo do útero sugeriram que a
proteína se encontra no estado selvagem em amostras de câncer do colo de útero
onde foram verificadas seqüências de DNA de HPVs de alto risco, enquanto
mutações no gene foram encontradas em amostras HPV negativas (Crook et al.,
1991; Srivastava et al., 1992). Estudos mostrando o estado do gene da p53 em
amostras clínicas têm falhado na confirmação desta hipótese. Apenas uma pequena
Barbosa, R.N.F 23
porcentagem dos casos analisados apresenta o TP53 alterado por mutação entre os
éxons 5 e 8 (Munirajan et al., 1998; Pinheiro & Villa, 2001).
Triagem de mutações por DGGE
A identificação das mutações no gene da p53 presentes nos diversos tipos de
câncer requer uma ferramenta de triagem rápida e segura (Breton et al., 2003). Os
métodos mais comumente usados envolvem a investigação de polimorfismos de
conformação de fita simples (SSCP), a eletroforese em gel com gradiente de
desnaturação (DGGE) e o seqüenciamento direto. Uma quarta técnica, a
cromatografia liquida desnaturante de alta performance (DHPLC), surgiu em meados
da década de 1990 como alternativa para distinção de padrões desnaturantes
diferentes ocasionados por mau pareamento nas moléculas de DNA dupla fita, mas
seu uso na detecção das mutações na p53 ainda é restrito devido à alta
heterogeneidade das alterações que afetam este gene e o custo elevado (Oefner &
Underhill, 1995).
A técnica de DGGE está bem caracterizada, sendo considerado um método
eficiente para triagem de mutações no gene TP53 (Rebischung et al., 2002; Breton et
al., 2003). Essa técnica baseia-se no perfil de migração eletroforética de amostras
previamente submetidas à PCR e permite que mudanças em um único par de bases
possam ser detectados. Para otimização da detecção das alterações em um
gradiente desnaturante do gel, um dos dois iniciadores usados na PCR deve conter
em sua extremidade 5’ uma seqüência (cerca de 60 nucleotídeos) rica em GC
(grampo GC) (Guldberg et al., 1993).
O gel de poliacrilamida contém um gradiente desnaturante de uréia e
formamida e as amostras analisadas são submetidas a eletroforese vertical com uma
corrente elétrica constante por um período relativamente grande de tempo a uma
temperatura constante (Rebischung et al., 2002). Após a eletroforese o gel pode ser
corado com brometo de etídio ou nitrato de prata e fotografado em um sistema
usando um transiluminador de luz UV ou revelado com hidróxido de sódio,
respectivamente.
Essa técnica permite que toda seqüência codificante (éxons 2 a 11) do gene
TP53 possa ser analisada (Guldeberg et al., 1993; Rebischung et al., 2002). Os
resultados para o produto amplificado com mutações irão apresentar um perfil de
Barbosa, R.N.F 24
bandas diferente daquele apresentado pelas amostras do tipo não mutado da p53
para região considerada. Isso ocorre porque a alteração numa única base irá resultar
num padrão de migração diferente para a molécula de DNA na qual a alteração está
presente (Humbey et al., 2003). Contudo, para determinar qual o tipo de alteração
está presente na banda com padrão de migração diferente, sua seqüência
nucleotidica deve ser determinada por técnicas de seqüenciamento.
Considerações Finais
Na grande maioria dos estudos onde o TP53 foi analisado no câncer de colo
do útero, têm sido investigado apenas os éxons 5 a 8 por se tratar da região mais
freqüentemente estudada na maioria dos tumores. Este é um dos motivos pelos
quais a freqüência de mutações fora dos éxons 5 a 8 pode estar sub-estimada.
Porém, a freqüência e distribuição das mutações podem variar entre os vários tipos
de tumores. Portanto, para um melhor entendimento do câncer de colo do útero
pretendeu-se verificar se alterações em outras regiões estão associadas com esse
tipo de câncer.
Além disso, em praticamente todos os estudos onde foi pesquisada a
presença de mutações no TP53, o percentual de mutações pode estar subestimado
em decorrência de resultados falsos negativos das técnicas utilizadas, como a
amplificação de polimorfismos de conformação de fita simples (PCR-SSCP) que
apresenta limitações relacionadas a sensibilidade.
Dessa maneira, a verificação das mutações em regiões pouco estudadas no
gene da p53, tais como os éxons de 8 a 11, responsáveis pela codificação de uma
região extremamente importante para atividade da proteína e consequentemente
para viabilidade celular, permitirão compreender melhor o papel deste gene no
desenvolvimento da neoplasia do colo do útero.
Barbosa, R.N.F 25
2 OBJETIVOS
2. 1 Objetivo Geral
Verificar a ocorrência de mutações na região dos éxons 8 a 11 do gene da
p53 humano em amostras de tecido de câncer do colo do útero no Rio Grande
do Norte.
2.2 Objetivos Específicos
Implantar a técnica de triagem das mutações do TP53 por eletroforese em gel
com gradiente de desnaturação (DGGE).
Verificar a presença de alterações na seqüência dos éxons 8 a 11 do gene da
p53 em amostras de pacientes com câncer de colo do útero através da
técnica de (DGGE);
Realizar seqüenciamento direto dos produtos amplificados que apresentarem
um perfil eletroforético variante no ensaio com DGGE;
Identificar as mutações encontradas através da comparação com seqüências
descritas como normais para estas regiões.
Barbosa, R.N.F 26
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Tipo de estudo e população
Estudo transversal descritivo. Foram utilizadas na pesquisa amostras de 80
indivíduos do sexo feminino com diagnóstico histopatológico de câncer do colo do
útero e amostras de sangue periférico de oito voluntárias saudáveis. Todas as
amostras são de mulheres nascidas no estado do Rio Grande do Norte.
3.2 Local e período do estudo
Este estudo foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular de Doenças
Infecciosas e Câncer (LDIC) do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do
Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. O trabalho
foi realizado no período de março de 2005 a fevereiro de 2007.
3.3 Considerações éticas
Este trabalho faz parte do projeto “Estudo do gene da p53 em amostras de
câncer do colo do útero do estado do Rio Grande do Norte” já aprovado pelo comitê
de Ética da UFRN. As amostras foram coletadas sob termo de consentimento livre
expresso. As identidades das pacientes e doadoras serão preservadas em sigilo
quanto à divulgação cientifica dos dados. Foram utilizadas técnicas para o manuseio
e estocagem de amostras biológicas seguras e legalmente aceitas pela legislação
brasileira, de acordo com as normas e padrões de biossegurança indicados pelos
órgãos responsáveis, unicamente para os fins determinados por este projeto.
3.4 Obtenção de amostras
As amostras de tecido do tumor utilizadas neste projeto foram obtidas de
mulheres previamente diagnosticadas com câncer de colo do útero que foram
submetidas a conização ou histerectomia no Hospital Dr. Luiz Antônio em Natal, RN.
As amostras de sangue periférico de mulheres voluntárias saudáveis utilizadas como
Barbosa, R.N.F 27
referências foram coletadas de alunas do curso de Farmácia da UFRN. Todas as
amostras foram obtidas de tecido fresco e armazenadas a -20oC.
3.5 Extração de DNA do material
O DNA das amostras de tecido das pacientes com câncer de colo do útero e
do sangue periférico total das mulheres saudáveis já se encontrava extraído e faz
parte do banco de amostras do projeto “Estudo do gene da p53 em amostras de
câncer do colo do útero do estado do Rio Grande do Norte”. Amostras de
aproximadamente 0,5 cm3 do tecido de tumor de cada paciente foram congeladas
em nitrogênio liquido e pulverizadas em almofariz de porcelana. Em seguida foram
submetidas à técnica de extração de DNA com degradação de proteínas pela
proteinase K, segundo Sambrook et al. (1992). O DNA das amostras de sangue
periférico total foi extraído conforme Salazar et al (1998) com modificações (Bezerra
& Galvão, 2006), onde o Triton-X 100 foi utilizado como agente lítico celular ao invés
do “Nonidet P 40”. O método não envolveu qualquer solvente orgânico, inclusive a
proteinase K. Todas as amostras de DNA extraídas foram ressuspendidas em água
de Milli-Q autoclavada, incubadas a 65ºC por 15 minutos e estocadas a -20ºC até o
momento do uso.
3.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) para região entre os éxons 8 a 11
As amostras de DNA das pacientes e das mulheres saudáveis foram
submetidas à PCR utilizando pares de iniciadores específicos (primers) para cada
região, em reações separadas.
A seqüência dos iniciadores para cada região considerada, a temperatura de
anelamento, a região flanqueada do gene, o tamanho do produto esperado após a
amplificação e as referências estão mostrados na Tabela 1. A Figura 6 mostra as
posições no gene da p53 para o anelamento dos iniciadores.
Barbosa, R.N.F 28
Tabela 1. Seqüências dos iniciadores utilizados, temperatura de anelamento e tamanho dos produtos formados após a reação da PCR para cada região analisada.
Região Seqüência dos iniciadoresRegião
Flanqueada1Tm2
Tamanho
do
produto
REF.
Éxons
8 a 9
(+)5’ACTGCCTCTTGCTTCTCTTTTCC3’(-)R-5’CGGATTTTGAGTGTTAGACT3’
14417-14811 55 439 pb [1]
Éxon
10
(+)5’CAGGTACTGTGTATATACTTACTT3’
(-)R-5’GAATCCTATGGCTTTCCAAC3’17525-17745 56 256 pb [2]
Éxon
11
(+)R-5’GACCCTCTCACTCATGTGAT 3’
(-)5’AAGCTGGTATGTCCTACTCC 3’18546-18898 60 393 pb [3]
1. Posição dos nucleotídeos no gene TP53; 2. Tm = Temperatura de melting(anelamento) em ºC; [1] (Guldeberg et al., 1993); [2] (+) Rines et al., 1998, (-) Modificado de Ichimura et al., 2000); [3] (Rines et al., 1998).
Figura 6. Posição para anelamento de cada par de iniciadores no gene da p53. Os números dentro das caixas indicam os éxons e os que estão ao final das linhas pontilhadas o nucleotídeo na posição 3’ de cada iniciador. Cada linha entre os éxons representa um íntron. A indicação diferencial no E11 sinaliza o termino da região codificante.
Para cada conjunto de iniciadores foi adicionado um grampo GC denominado
R na extremidade 5’ de um dos iniciadores para otimização da resolução na
eletroforese com gradiente de desnaturação dos produtos amplificados. Sua
seqüência é:
Barbosa, R.N.F 29
5’CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCGCCCGCCGG3’ em todos os
casos. Os iniciadores sintetizados com grampos foram purificados por PAGE
(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida) pelo fabricante.
Para cada reação com volume final de 25
MgCl2, 0,2mM dNTP e 0,5 U de Taq DNA polimerase (5U/µL).
As condições de PCR foram: Desnaturação inicial por 7 minutos a 95 ºC
seguida de 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, temperaturas de pareamento descritas na
Tabela 1 por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto. Ao término dos ciclos as amostras foram
ainda submetidas a um ciclo de extensão final a 72ºC por 10 minutos.
3.7 Determinação do perfil de desnaturação
Para determinar o perfil de dissociação de cada fragmento amplificado de
forma a otimizar a detecção de mutações e polimorfismos em cada seqüência
analisada, foi utilizado o programa computacional MELT94 (Lerman & Silverstein,
1987). Os dados obtidos foram visualizados na forma de gráficos gerados pelo
programa Microsoft Excel ®.
3.8 Eletroforese em gel dos produtos amplificados
A confirmação da amplificação de cada produto e a posterior análise para
pesquisa de alterações por DGGE envolveu três etapas, como mostra o esquema na
Figura 7.
Para visualização dos produtos amplificados (Etapa 1), alíquot
misturadas ão da amostra (20% sacarose, 0,05 mM de EDTA, 5%
de azul de bromofenol e 5% de xilenocianol), aplicados em gel de poliacrilamida 8%
não desnaturante e submetidos a eletroforese a 100V em tampão TBE 1X (Tris-
Borato-EDTA) (duração: 1h30min) (Sambrook et al.., 1992)
Barbosa, R.N.F 30
Figura 7. Etapas para confirmação da amplificação de cada produto e análise por DGGE.
Para determinar a faixa de variação do gradiente de desnaturação a ser
utilizado para cada região (Etapa 2), foi feita uma reação de eletroforese em gel com
gradiente de desnaturação perpendicular ao campo elétrico (Figura 8). Neste teste,
80µL dos produtos amplificados de amostras de sangue periférico de mulheres
saudáveis para cada região do gene foram misturados com 80µL de tampão de
amostra e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 7,5% com gradiente de
desnaturação de formamida e uréia 0% - 70% perpendicular ao sentido da corrente
elétrica (70V, 60ºC, 7 horas), em tampão TAE 1X (Tris-Acetato-EDTA) (Myers et al.,
1985), segundo recomendações do fabricante do equipamento de DGGE (C.B.S.
Scientific Company, Inc). Este teste permitiu verificar o ponto médio de desnaturação
do produto amplificado para cada amostra e determinar o gradiente de desnaturação
a ser utilizado (10 a 15% abaixo e acima do ponto médio de desnaturação, segundo
Myers et al., 1985).
Barbosa, R.N.F 31
Figura 8. Esquema mostrando a disposição para aplicação do produto amplificado com o gradiente de desnaturação perpendicular ao sentido da corrente elétrica (lado esquerdo da figura) e um perfil mostrando o ponto médio típico para uma seqüência com dois domínios de desnaturação (lado direito da figura).
Após essa etapa os produtos de amplificação para cada região foram
submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 7,5% contendo um gradiente de
desnaturação (determinado na Etapa 2) paralelo ao sentido da corrente elétrica
(Figura 9), em tampão TAE 1x, por um período de tempo adequado para cada
região (Etapa 3). Foram utilizados 5µL do produto a
de tampão da amostra 1X (70V, 60oC, Duração: 15 horas). Em cada gel foram
aplicados 14 produtos de PCR amplificados a partir de tecido de tumor e uma
amostra amplificada a partir de sangue periférico de mulher saudável.
Barbosa, R.N.F 32
Figura 9. Esquema mostrando a disposição para aplicação do produto amplificado com gradiente de desnaturação paralelo ao sentido da corrente elétrica (lado esquerdo da figura) e exemplo de perfil migratório onde as amostras de produto amplificado de tumor (a e) têm o mesmo comportamento que um produto amplificado de sangue periférico de mulher saudável (f) (lado direito da figura).
Os géis em cada etapa foram submetidos à coloração em solução de brometo
de etídio ão TBE 1X; Sambrook et al., 1992). Em virtude da
dificuldade em manusear o gel com gradiente desnaturante no recipiente de
coloração com brometo de etídio, este gel foi corado pela prata (0,2% em solução
fixadora: 10% etanol absoluto e 0,5% ácido acético glacial; Sanguinetti et al., 1994).
Em seguida os géis foram expostos a luz ultravioleta ou luz comum,
respectivamente, para visualização e registro dos resultados.
Barbosa, R.N.F 33
4 RESULTADOS
Os conjuntos de iniciadores e condições de eletroforese e DGGE utilizados
neste trabalho estão descritos na literatura (ver Tabela 1) onde se mostraram
eficientes na detecção de mutações no TP53 a partir de amostras de câncer e,
portanto, validando seu uso.
Os gráficos obtidos a partir do programa MELT94 e gerados a partir do
programa Microsoft Excel® sugerem que os fragmentos amplificados são adequados
para análise por DGGE. Não é desejável que a dupla fita se dissocie totalmente
durante a corrida porque, quando ocorre a dissociação total, os fragmentos
dissociados podem desaparecer e não serem visualizados. Assim, se a temperatura
de fusão do domínio de mais baixa temperatura de fusão for mais alta que a
temperatura de dissociação das duplas fitas dos fragmentos de DNA a resolução das
mutações torna-se impossível ou altamente dependente do tempo de eletroforese.
Assim o comprimento e composição do grampo podem ser ajustados de forma a
assegurar que a probabilidade de dissociação seja negligenciável (Guldberg et al,
1997).
Das 80 amostras de DNA obtidas de tumor algumas não apresentaram
amplificação. A relação dessas amostras pode ser vista na Tabela 2, cuja
numeração segue a ordem do ANEXO I.
Tabela 2. Relação de amostras que não amplificaram
Éxons 8 e 9 Éxon 10 Éxon 11
Am20 Am24 Am32
Am55 Am27 Am46
Am58 Am76 Am51
Am76
Nos géis de eletroforese em poliacrilamida não desnaturantes e DGGEs foram
colocados tanto produtos amplificados a partir do DNA extraído de tumor como uma
amostra amplificada a partir de sangue periférico. Após a coloração dos géis de
DGGE foi possível comparar o perfil migratório das amostras provenientes de tumor
ao das amostras provenientes de sangue periférico.
Barbosa, R.N.F 34
4.1 Análise da região do éxon 11.
Os resultados obtidos a partir das oito amostras de DNA mulheres saudáveis
submetidas à PCR para região do éxons 11 podem ser vistos na Figura 10. O
produto observado apresentou um peso molecular de aproximadamente 400 pb para
o éxon 11, correspondendo ao esperado (Ichimura et al., 2000).
Figura 10. Resultado da eletroforese dos 8 produtos de PCR para o éxon 11 do TP53 das amostras de mulheres saudáveis, após coloração com nitrato de prata. As colunas de 1 a 8 mostram os produtos amplificados. B: controle negativo da reação. M: marcador molecular de 100 pb
O perfil de dissociação previsto pelo programa MELT94 para região analisada
do éxon 11 está mostrado na Figura 11.
1 2 3 4 5 6 7 8 B M
~ 400pb
Barbosa, R.N.F 35
Figura 11. Perfil de dissociação do produto de amplificação do éxon 11 do TP53. A posição dos nucleotídeos de 1-40 mostra a região do grampo GC (5’). A região flanqueada no gene corresponde aos nucleotídeos18546-18898.
As condições de gradiente de desnaturação para os produtos de PCR do éxon
11 já haviam sido descritas para esta região (Rines et al., 1998).
Foi realizada a DGGE dos produtos de amplificação de amostras normais para
definir o padrão de migração dos fragmentos. Inicialmente, foi utilizado um gradiente
de desnaturação variando de 20% - 70%, como descrito previamente (Rines et al.,
1998). Durante cerca de 17 horas foi aplicada uma tensão elétrica de
aproximadamente 70V. Em seguida, foi feita coloração com nitrato de prata. Os
resultados obtidos podem ser visualizados na Figura 12.
Após análise do gel, foi observado que o padrão de fragmentos considerados
inespecíficos não foi visto em todas as amostras deste gel (Linhas 2 e 5 da Figura
12, por exemplo). Uma forma de verificar se estes fragmentos correspondem a um
polimorfismo desta região é pela formação de heterodúplices. Foi, então, realizada
uma reação de desnaturação dos produtos de PCR por 10 minutos a 95ºC e
posteriormente foram mantidos em gelo por 30 minutos. Em seguida, estes produtos
foram novamente submetidos à eletroforese em gel com gradiente de desnaturação,
nas mesmas condições citadas anteriormente. Nenhum perfil diferente foi observado,
excluindo, portanto, a hipótese de polimorfismo nestas amostras.
As amostras apresentaram o mesmo padrão de migração, sugerindo que a
seqüência é a mesma e qualquer dessas amostras pode ser usada como controle.
Barbosa, R.N.F 36
Figura 12. Resultados da DGGE corada com nitrato de prata. São mostrados cincoamostras de mulheres saudáveis (1-5) e o controle negativo (B). A seta cheia indica produtos inespecíficos que também são visualizados na eletroforese convencional. A seta vazia mostra o local esperado do fragmento.
Para confirmação das condições da reação previamente descritas (Rines et al.,
1998), foi feito um ensaio de DGGE com gradiente perpendicular para verificar qual
variação de desnaturação poderia ser utilizada para análise desta região. O resultado
obtido pode ser visto na Figura 13. Foi observado que o ponto médio de
desnaturação para o produto de amplificação do éxon 11 foi aproximadamente 45%.
A partir do ponto médio de desnaturação sugere-se utilizar uma faixa de
variação de 10% a 15% acima e abaixo deste valor (Myers et al., 1985). Portanto,
após determinar o ponto médio de desnaturação (45%), o protocolo foi alterado, de
modo que se passou a utilizar uma faixa de desnaturação entre 30% e 60%. Estes
valores estão dentro do gradiente previsto para análise desta região segundo descrito
na literatura (Rines et al., 1998). Após testar vários intervalos de tempo, ficou
estabelecida uma duração de 15 horas para reação de DGGE desta região.
1 2 3 4 5 B
Barbosa, R.N.F 37
Figura 13. Resultado da DGGE perpendicular corado com brometo de etídio. Foram aplicados 80µL de produto da PCR para o éxon 11 de uma amostra de uma mulher considerada saudável. A faixa de variação do gradiente de desnaturação está esquematizada na parte inferior da figura.
Dessa forma, o produto de amplificação para o éxon 11 de 76 amostras de
DNA, extraídas de tecido proveniente de câncer cervical, foram submetidos a DGGE
com uma faixa de desnaturação variando entre 30% e 60% por 15 horas a 70V. O
resultado obtido está ilustrado na Figura 14. Nenhum perfil de migração alterado,
sugestivo de mutação ou polimorfismo, foi observado nas amostras analisadas.
0% 35% 70%
Barbosa, R.N.F 38
Figura 14. Resultado da DGGE corada com brometo de etídio. São mostrados 10produtos de PCR das amostras provenientes de tecido de tumor (câncer de colo do útero) (1-10) e o controle negativo (B). A seta preta mostra o local esperado do fragmento.
4.2 Análise da região do éxon 10.
Os resultados obtidos a partir das amostras de DNA de mulheres saudáveis
submetidas à PCR para região do éxon 10 podem ser vistos na Figura 15. O produto
observado apresentou um peso molecular de aproximadamente 250 pb,
correspondendo ao esperado (Rines et al., 1998). Em seguida foram realizadas
reações de PCR para as amostras de câncer cervical.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B 11
Barbosa, R.N.F 39
Figura 15. Resultado da eletroforese dos 8 produtos de PCR para o éxon 10 do TP53 das amostras de mulheres saudáveis, após coloração com solução de brometo de étidio. As colunas de 1 a 8 mostram os produtos amplificados. B: controle negativo da reação. M: marcador molecular de 100 pb
O perfil de dissociação para região analisada do éxon 10 previsto pelo
programa MELT94 está mostrado na Figura 16.
Éxon 10
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
1 19 37 55 73 91 109
127
145
163
181
199
217
235
253
271
Posição dos Nucleotídeos
Tem
per
atu
ra
Figura 16. Perfil de dissociação do produto de amplificação do éxon 11 do TP53. A posição dos nucleotídeos de 231-271 mostra a região do grampo GC (3’). A região flanqueada no gene corresponde aos nucleotídeos 17525-17745.
Para determinar o gradiente desnaturante a ser utilizado, foi realizado um teste
usando DGGE com gradiente perpendicular corado com brometo de etídio. O
resultado obtido pode ser visto na Figura 17. O gradiente de desnaturantes a ser
utilizado foi determinado como sendo de 30-70%, estando dentro do gradiente
previsto (Ichimura et al., 2000).
1 2 3 4 5 6 7 8 M B
200pb
Barbosa, R.N.F 40
Figura 17. Resultado da DGGE perpendicular corado com brometo de etídio. Foram aplicados 80µL de produto da PCR para o éxon 10 de uma amostra de uma mulher saudável. A faixa de variação do gradiente de desnaturação está esquematizada na parte inferior da figura.
O produto de amplificação para o éxon 10 das 77 amostras de DNA foi
submetido a DGGE com uma faixa de desnaturação variando entre 30% e 70% por
15 horas a 70V. Por questão de facilidade no manuseio e sensibilidade passou-se a
fazer coloração com nitrato de prata. A Figura 18A ilustra o resultado do DGGE para
o produto das amostras de mulheres saudáveis e a Figura 18B ilustra o resultado do
DGGE para o produto das amostras de câncer cervical. Nenhum perfil de migração
alterado, sugestivo de mutação ou polimorfismo, foi observado nas amostras
analisadas.
0% 50% 100%
Barbosa, R.N.F 41
Figura 18. Resultado da DGGE para o éxon 10 corada com nitrato de prata. São mostrados (A) 7 produtos de PCR das amostras de mulheres saudáveis e (B)15produtos de PCR das amostras provenientes de tecido de tumor (câncer de colo do útero) e o controle negativo B.
4.3 Análise da região dos éxons 8 e 9.
Os resultados obtidos a partir das amostras de DNA mulheres saudáveis
submetidas à PCR para região dos éxons 8 e 9 podem ser vistos na Figura 19. O
produto observado apresentou um peso molecular de aproximadamente 440 pb
correspondendo ao esperado (Cabelguenne et al., 2000). Em seguida 77 amostras de
câncer cervical foram amplificadas por PCR.
O teste usando DGGE com gradiente perpendicular, corado com nitrato de
prata, foi realizado para confirmar o gradiente de desnaturação. O valor do gradiente
desnaturante a ser utilizado foi determinado como sendo de 20-70%, correspondendo
ao descrito na literatura (Cabelguenne et al., 2000).
A
1 B 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 B 15
B
Barbosa, R.N.F 42
Figura 19. Resultado da eletroforese dos 8 produtos de PCR para os éxons 8 e 9 do TP53 das amostras de mulheres saudáveis, após coloração com nitrato de prata. As colunas de 1 a 8 mostram os produtos amplificados. B: controle negativo da reação. M: marcador molecular de 100 pb
O perfil de dissociação previsto pelo programa MELT94 para região analisada
do éxon 10 está mostrado na Figura 20.
Éxons 8 e 9
020.000
40.00060.000
80.000100.000
1 26 51 76 101
126
151
176
201
226
251
276
301
326
351
376
401
426
Posição dos Nucleotídeos
Te
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Figura 20. Perfil de dissociação do produto de amplificação do éxon 11 do TP53. A posição dos nucleotídeos de 386-426 mostra a região do grampo GC. A região flanqueada no gene corresponde aos nucleotídeos 14417-14811.
O produto de amplificação para os éxons 8 e 9 das 77 amostras de DNA foi
submetido a DGGE com uma faixa de desnaturação variando entre 20% e 70% por
15 horas a 70V. A Figura 21A mostra o resultado do DGGE para o produto das
amostras de mulheres saudáveis e a Figura 21B mostra o resultado do DGGE para o
produto das amostras de câncer cervical. Nenhum perfil de migração alterado,
sugestivo de mutação ou polimorfismo, foi observado nas amostras analisadas.
1 2 3 4 5 6 7 8 B M
500pb
Barbosa, R.N.F 43
A B
Figura 21. Resultado da DGGE para os éxons 8 e 9 corada com nitrato de prata. São mostrados (A) 8 produtos de PCR das amostras de mulheres saudáveis e (B) 6produtos de PCR das amostras provenientes de tecido tumoral (câncer de colo do útero) e o controle negativo B.
B 1 2 3 4 5 6 7 8 1 B 2 3 4 5 6
Barbosa, R.N.F 44
5 DISCUSSÃO
Métodos baseados em PCR seguidos de análise por eletroforese são
tradicionalmente usados na detecção de mutações (Nollau & Waegner, 1997;
Holmila & Husgafvel-Pursiainen, 2006). São consideradas técnicas simples e não
requerem altos investimentos em equipamentos ou reagentes. Um dos métodos mais
utilizados para triagem de mutações é a análise do polimorfismo de conformação de
fita simples após PCR (PCR-SSCP). Nesta técnica, ácidos nucléicos de fita simples
formam estruturas secundárias sob certas condições. Essa estrutura depende da
composição de bases, e alterações na seqüência podem causar diferenças na
mobilidade eletroforética sob condições não desnaturantes.
A técnica de eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE) é
considerada mais sensível que PCR-SSCP (Moyret et al 1994). Por exemplo, análise
por PCR-SSCP de fragmentos com tamanho entre 150-200pb permite que sejam
identificadas 80-90% das mutações presentes nestas regiões. Fragmentos com
tamanho superior a 200 pb apresentam um potencial menor para que as mutações
sejam detectadas. No sistema DGGE, fragmentos de 50 a 1000 pb podem ser
analisados com uma eficiência de aproximadamente 100% para detecção de
mutações, desde que a reação esteja otimizada, incluindo o uso de grampo GC, e
ocorra formação de heterodúplices (Nollau & Wagener, 1997).
Apesar de nenhuma destas técnicas fornecerem informações sobre o tipo e
localização exata da alteração, a triagem de mutações no gene TP53 por DGGE
mostrou ser também mais sensível quando comparada à detecção por
seqüenciamento direto dos produtos amplificados (Holmila & Husgafvel-Pursiainen,
2006). Segundo estes autores, cerca de 88% das mutações presentes em amostras
de câncer de pulmão previamente analisadas puderam ser detectadas por DGGE
enquanto 71% foram detectadas por seqüenciamento. Além disso, uma amostra
deve conter pelo menos 12-50% de DNA alterado para que a mutação seja
identificada por seqüenciamento direto, enquanto o limite de detecção para o DGGE
é de 3-6% de seqüências com mutações (Nollau & Waegner, 1997). Sugere-se,
então, que as amostras com mutações sejam identificadas através de triagem por
DGGE como etapa prévia ao seqüenciamento a fim de reduzir o tempo de análise e
o custo das reações.
Barbosa, R.N.F 45
A proteína p53 encontra-se alterada em cerca de 50% dos casos de cânceres
(Chène & Bechter, 1999). A maioria das mutações encontradas é do tipo sentido
trocado, estando em resíduos localizados no domínio de ligação ao DNA. Para o
câncer de colo do útero poucas mutações têm sido descritas no gene TP53. O
principal mecanismo sugerido para inativação da p53 é através da expressão de
proteínas virais tais como a E6 do papiloma vírus humano (HPV) que promove sua
degradação. Entretanto, a grande maioria dos estudos onde o TP53 foi analisado no
câncer de colo do útero, têm analisado apenas os éxons 5 a 8 por se tratar da região
mais freqüentemente alterada na maioria dos tumores (Olivier et al., 2002).
Neste trabalho foram analisadas amostras de 80 pacientes diagnosticadas
com câncer de colo do útero, cujas classificações e indicação da presença do HPV
estão no ANEXO I. Foi realizada classificação de acordo com presença do HPV e o
diagnóstico histopatologico. Destas, 28,75% eram negativas para HPV e 68,75 foram
positivas. Em relação ao diagnóstico: carcinoma in situ: 50%, carcinoma invasivo:
27,5%, adenocarcinoma: 5%, adenocarcinoma invasivo: 2,5%, NICIII: 6,25%, NICII:
1,25% e amostras não determinadas: 7,5% (Fernandes 2004).
Foi utilizada a técnica de DGGE para pesquisar mutações ou polimorfismos
nos éxons 8, 9, 10 e 11 do gene TP53 nestas amostras. Nenhuma alteração foi
verificada no padrão de migração eletroforética nas amostras amplificadas a partir do
DNA extraído de tumor quando comparado aquele das amostras amplificadas a partir
de DNA do sangue periférico de mulheres saudáveis, apontando a ausência de
mutações ou polimorfismos nas regiões analisadas.
Na literatura não estão descritas mutações na região entre os éxons 9 e 11
mas, no éxon 8, que faz parte do domínio de ligação ao DNA, já foram descritas
mutações em 16 códons, para casos de câncer de colo do útero. Estas mutações
envolvem deleções, trocas GC>AT (principalmente em ilhas CpG), GC>CG, GC>TA,
AT>GC e AT>CG. Em todos os casos, ocorrem trocas de aminoácidos
(http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002).
Além disso, na região envolvendo os éxons 8 e 9 dois polimorfismos estão
descritos (Olivier et al., 2002) nas posições intrônicas 14.676 (C>T) e 14.766 (T>C). A
freqüência do polimorfismo C>T varia de 0,005 (população de afro-descendentes,
caucasianos e hispânicos) até 0,021 (população oeste da ásia) (SNP data base ID:
ss48297325, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). O polimorfismo T>C foi descrito em
Barbosa, R.N.F 46
uma população italiana (n=103) e é responsável por um sitio de restrição para enzima
AVA I (Graziani et al., 1999).
No éxon 10 está descrito um polimorfismo no nucleotídeo 17.657 (Códon 360,
G>C) cuja freqüência vária de 0,005 (população de afro-descendentes, caucasianos e
hispânicos) até 0,021 (populações afro-descendentes) (SNP data base ID:
ss48297344, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). Um outro polimorfismo dentro da
região próxima ao éxon 10 localiza-se no nucleotídeo 17.699 no íntron (A>C) e é
descrito no banco de dados do IARC, tratando-se de uma superposição em relação a
seqüência do TP53 depositada no GenBank que foi descrita em estudos
populacionais. (SNP data base ID: ss4044398, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).
Atualmente, um banco de dados na internet (http://www.iarc.fr) com
informações sobre a p53 é mantido pelo Instituto de Pesquisas Avançadas em
Câncer (IARC – Institute of Advanced Research on Cancer). O banco de dados de
mutações contém publicações onde foram investigadas alterações no gene TP53 em
linhagens celulares e cânceres humanos. A Tabela 3 apresenta dados sobre o
número de amostras estudadas, número de amostras com mutações, prevalência,
local do estudo, técnica de triagem, material analisado, éxons analisados em cada
trabalho e seqüenciamento das mutações já descritas em câncer de colo do útero.
Dos trabalhos que identificaram mutações no TP53, 17 apresentaram
prevalência de mutações menor que 10%. Um único estudo mostrou uma alta taxa
de mutação no TP53 (42,11%). Neste estudo, foram analisadas 19 amostras de
mulheres com carcinoma cervical primário com baixa ou nenhuma carga viral em
relação à infecção por HPV. Além disso, a elevada expressão da p53 nestas
amostras foi significativamente associada à presença de mutação (p < 0,007)
(Helland et al., 1998). Apenas seis trabalhos analisaram todos os éxons. Destes,
quatro utilizaram a técnica de análise por PCR-SSCP, um realizou seqüenciamento
direto de 28 amostras e um utilizou ensaio com leveduras. A maioria dos estudos
analisou apenas os éxons de 5 a 8.
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001
Barbosa, RNF 48
Esses dados mostram que mutações encontradas no TP53 em câncer
de colo do útero estão distribuídas pelos códons (Figura 22) de forma similar
ao encontrado em outros tipos de câncer, onde a maioria das mutações
descritas encontra-se na região do domínio central. Além de mutações de
sentido trocado, são descritas mutações silenciosas, sem sentido, mutação em
sítio de processamento de mRNA e mudanças na fase de leitura (Figura 23).
Análise do perfil das mutações mostra que a principal troca é do tipo GC>AT
em ilhas CpG (31,4%) (Figura 24).
Figura 22. Distribuição por códons de 96 subistituições de bases descritas no TP53 em câncer de colo do útero (http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002, versão R11).
Barbosa, RNF 49
Figura 23. Prevalência dos tipos de 105 mutações descritas no TP53 em câncer de colo do útero (http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002, versão R11).
Figura 24. Tipos de alterações envolvidas em 105 mutações descritas no TP53em câncer de colo do útero (http://www.iarc.fr – Olivier et al., 2002, versão R11).
As mutações na região de formação do tetrâmero parecem ter um
significativo potencial oncogênico (Chène, 1998; Chène & Bechter, 1999). A
correta estrutura do tetrâmero tem um importante papel auxiliando a ligação da
p53 com diversas estruturas celulares como DNA e microtúbulos (Trostel, et al.,
Barbosa, RNF 50
2006). Dessa forma, alterações no gene que afetem este processo podem
comprometer, por exemplo, a ligação da p53 ao DNA ou sua localização
celular. Modificações nos prováveis sítios de acetilação da região analisada
podem, ainda, interferir com o processo de ubiquitinação da p53 e, portanto,
regular a sua degradação (Nakamura, et al., 2000).
Quando mutações deletérias foram induzidas no domínio de
oligomerização foi observado que a proteína de ligação ao fator de crescimento
semelhante a insulina 3 (IGFBP3 – Insuline-like growth factor biding protein 3),
induzida pela proteína p53 truncada, apresentou um importante papel na
apoptose (Harms & Chen, 2005). Além disso, foi mostrado que outros genes
são também regulados diferencialmente pela p53 que apresenta defeito na
região C-terminal. Estes dados mostram que pode existir um mecanismo pelo
qual a integridade da região C-terminal da proteína p53 influencia na regulação
diferencial da expressão gênica, tornando-se um determinante do destino
celular. Dessa forma, sugere-se que mutações nesta região sejam menos
selecionadas nos tumores porque não levam a formação de proteínas
oncogênicas ou são incompatíveis com a viabilidade celular.
As demais regiões do TP53 estão sendo analisadas pelo grupo para
completar o projeto “Estudo do gene da p53 em amostras de câncer do colo do
útero do estado do Rio Grande do Norte”. Serão analisadas as regiões dos
éxons 5, 6 e 7 incluindo o íntron entre eles e uma região do íntron 4, onde está
localizado um promotor alternativo.
Barbosa, RNF 51
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