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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS - DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
ANDRÉ DE MACÊDO MEDEIROS
MUDANÇAS ENDÓGENAS E SUPRAFISIOLÓGICAS NOS NÍVEIS DE
ESTRÓGENO: EFEITOS SOBRE A AMNÉSIA INDUZIDA PELA
ESCOPOLAMINA EM RATAS INTACTAS
NATAL - RN
JANEIRO 2014
MUDANÇAS ENDÓGENAS E SUPRAFISIOLÓGICAS NOS NÍVEIS DE
ESTRÓGENO: EFEITOS SOBRE A AMNÉSIA INDUZIDA PELA
ESCOPOLAMINA EM RATAS INTACTAS
ANDRÉ DE MACÊDO MEDEIROS
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Regina Helena da Silva
NATAL - RN
JANEIRO 2014
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, para a
obtenção do título de Mestre em
Psicobiologia.
“Ignorance more frequently begets confidence than does knowledge: it is those who
know little, and not those who know much, who so positively assert that this or that
problem will never be solved by science.”
Charles Darwin
Agradecimentos
Nossa, nem acredito! Realmente escrever esta parte da dissertação é como entrar
numa máquina do tempo e reviver tudo o que passei. Todas as dificuldades, alegrias,
puxões de orelha, conhecimento adquirido, amigos, lugares e momentos. Alguns
inesquecíveis. Lembro-me de quando entrei para a vida científica e, especificamente,
para a neurociência. O motivo veio de dentro de casa. Cresci vendo um ente da família
se degenerar ano após ano numa cama, fazendo grunhidos, tentando falar, talvez
pedindo ajuda para sair daquela situação.
Explico melhor. Dedico minha vida acadêmica e meu empenho em memória à
minha tia, Maria, que eu não tive oportunidade de conversar, nem de aprender com suas
histórias. Infelizmente, a doença de Alzheimer acabou desfazendo esse encontro. Aquilo
me marcou porque a observava naquele estado e nada podia fazer. Ali eu já sabia que
queria ajudar a desvendar os mistérios por trás das doenças. Tia, onde você estiver, eu
estou dando o meu máximo.
É engraçado que alguém pudesse se desenvolver por essa área mesmo saindo de
um berço tão religioso. Às vezes, tendo que discutir ciência em casa e bater de frente
com algumas questões enraizadas. É complicado, é polêmico, mas com jeitinho as
coisas vão fluindo. Uma vitória que eu consegui foi que meu ponto de vista fosse
respeitado. Isso já é uma grande vitória. À minha família, hoje sou quem sou, em grande
parte, devido a vocês. Saibam que em todos os lares existem suas imperfeições, mas é o
amor que prevalece.
Os primeiros amigos que fiz nessa trajetória foram um presente. Isabella, Raí e
Anderson, obrigado por construir e unir ciência e amizade de forma tão sólida e
divertida. Vou carregar a amizade de vocês até o fim. Ao Hermany, por me apresentar
ao LEME, minha escola diária tanto profissional como pessoal. Aos amigos Ezequiel e
Priscila, pela afinidade, carinho, atenção, paciência e sensibilidade a que tiveram
comigo ao longo desses anos. A todos os queridos amigos da família LEME que ajudam
direta e indiretamente no meu crescimento. Ana, Aline, Fernanda, Luiz, Diana, Aldair,
Clarissa, Ywlliane, Ramon, Ivon, Sarah, Vanessa, Gênedy, Thieza (espero que não
tenha esquecido ninguém). Muito obrigado mesmo.
Para contar um pouco sobre este trabalho preciso voltar ao final de 2008, meu
primeiro ano no laboratório. Gostaria de trabalhar com modelos de demência, mas
naquela época, a situação do nosso laboratório não era das melhores. Fiquei
impossibilitado de pesquisar aquilo que eu tanto queria. Em conjunto com minha
orientadora, Regina, bolamos um projeto alternativo com um modelo de amnésia. O
sujeito experimental: fêmeas, é claro. Não porque sobravam fêmeas no biotério (o que
era ótimo pra mim), mas porque eram pouco estudadas mundo afora. Ainda são, só que
nos últimos anos o quadro melhorou bastante. Por que eram pouco estudadas? Talvez
por ser trabalhoso explicar tantas variações comportamentais devido às suas oscilações
hormonais.
O desafio foi aceito. Comecei exatamente no dia 19 de janeiro de 2009 meu
primeiro experimento. Entre meses de aulas e provas na graduação, fui fazendo os
experimentos sempre que podia nos meses de “férias”. Experimento I finalizado, vamos
ao experimento II em julho de 2010. Ano especial pra mim. Ano em que pude me
conhecer melhor. Experimento II finalizado em julho de 2011. Ano de conclusão de
curso resumido em ansiedade, dúvidas, indecisões de que rumo tomar e o que fazer da
vida. TCC apresentado, bem elogiado, enfim biomédico. Decido continuar minha
trajetória pela busca do conhecimento. Passo no mestrado e continuo meus
experimentos.
Experimento III finalizado em junho de 2012. Ainda faltava algo. Algo que só se
resolveu recentemente, depois de meses de angústia, sentimento de frustração e
desânimo. Agradeço durante esse período ao apoio e incentivo constantes do Dr.
Ronaldo e Dr. Geison. Muito do que disseram me fez prosseguir.
Saio do mestrado diferente de quando entrei. Diferente não só porque hoje sei
mais do que ontem, mas também porque penso diferente.
Agradeço minha construção como pesquisador aos meus mestres, conselheiros e
espelhos: Dra. Regina Helena da Silva, Dra Alessandra Mussi Ribeiro e Dr. Geison
Souza Izídio. Obrigado por cada palavra.
Por fim, agradeço ao objeto do meu estudo: minhas queridas ratinhas. Não seria
capaz de provocar sofrimento a nenhum tipo de animal, mas sem eles a ciência não
caminha.
Agora parto pra outro desafio, em uma metrópole. Vejo uma oportunidade única
de crescer ainda mais e contribuir com o que tenho. O sentimento de despedida pode até
existir, mas eu prefiro dizer que estarei ali, voltando de tempos em tempos para, em um
futuro breve, construir mais uma filial do LEME.
Resumo
Estudos com animais experimentais têm sugerido que o estrógeno ajuda a
reduzir déficits cognitivos aumentando o estado funcional do sistema colinérgico.
Porém, a maioria dos modelos que pesquisam o envolvimento desse sistema sobre a
memória não consideram as variações hormonais naturalmente presentes em animais
intactos. Neste estudo, procuramos avaliar a ação endógena e suprafisiológica do
estrógeno sobre os déficits produzidos pela escopolamina (ESC) sobre a memória
aversiva de ratas em diferentes fases do ciclo estral em uma tarefa de esquiva
discriminativa em labirinto em cruz elevado (ED-LCE). Foram utilizadas ratas Wistar,
as quais passaram por sessões de treino e teste em 3 experimentos: (I) Ratas em
diferentes fases do ciclo receberam ESC (1 mg/kg i.p) ou salina 20 minutos pré-treino;
(II) Ratas em diestro (DIE) receberam o mesmo tratamento em (I) mais valerato de
estradiol i.m (VE; 1 mg/kg) ou óleo de gergelim (VEH) 45 minutos pré-treino; (III)
Ratas em DIE receberam o mesmo tratamento em (I), mais VE ou VEH pós-treino. A
sessão de teste foi realizada 24 horas após a sessão de treino em todos os experimentos.
Os principais resultados mostraram que: (1) ESC induziu amnésia, comportamento
ansiolítico e aumento da atividade motora em todos os experimentos e (2) prejudicou a
aquisição da tarefa apenas para os animais em DIE; (3) o VE preveniu o prejuízo na
aquisição induzido pela ESC e (4) alterou o processo de consolidação da memória,
comprometendo ainda mais a evocação da tarefa quando administrado pós-treino. Os
resultados indicam que alterações nos níveis de estrógeno endógeno ou suprafisiológico
influenciam processos mnemônicos, sugerindo-se um papel da modulação da
transmissão colinérgica nesses efeitos.
Palavras-chave:
Ciclo estral; Memória; Transmissão colinérgica; Ansiedade; Esquiva discriminativa.
Abstract
Studies have suggested that estrogen prevents cognitive deficits improving the
functional status of cholinergic transmission. However, most studies do not consider the
hormonal changes naturally present in intact animals. In the present study we evaluated
the effects of physiological and supraphysiological estrogen levels variations on the
memory impairment induced by scopolamine (SCO) in female rats in the different
phases of the estrous cycle. We used the plus-maze discriminative avoidance task
(PMDAT) in order to evaluate anxiety levels and motor activity concomitantly to the
memory performance. In experiment 1, female Wistar rats in each estrous cycle phase
received SCO (1 mg/kg) or saline (SAL) i.p. 20 minutes before the training session in
the PMDAT. In experiment 2, rats in diestrous received estradiol valerate (EV; 1
mg/kg) or vehicle sesame oil (VEH) i.m., and SCO (1 mg/kg) or SAL i.p., 45 minutes
and 20 minutes before the training, respectively. In experiment 3, rats in diestrous
received SCO (1 mg/kg) or SAL i.p. 20 minutes before the training and EV (1 mg/kg)
or VEH i.m. immediately after the training session. In all experiments, a test session
was performed 24h later. The main results showed that: (1) SCO induced amnesia, anti-
anxiety like behavior and activity arousal in all experiments; (2) this cholinergic
antagonist impaired acquisition only for the animals in diestrus; (3) acute administration
of EV prevented the acquisition impairment induced by SCO and (4) interfered with
memory consolidation process. The results indicate that endogenous or
supraphysiological variations in estrogen levels modulate some aspects of cognitive
function, and suggest that these effects are possibly mediated by a modulation of the
cholinergic system.
Keywords: Estrous cycle; Memory; Cholinergic transmission; Anxiety like-behavior;
Discriminative avoidance task.
Sumário
Introdução 9
1. Memória 9
1.1. Aspectos Gerais 9
1.2. Modelos animais para o estudo de memórias associativas 10
2. Estrógeno: receptores e mecanismos de ação 12
3. Oscilações hormonais endógenas 14
4. Influência do estrógeno sobre tipos de memória 15
4.1. Memória espacial 15
4.2. Memória associativa 16
5. Estrógeno, memória e a transmissão colinérgica 16
5.1. O estrógeno e estruturas encefálicas relacionadas com a memória 17
5.2. Evidências da ação do estrógeno na transmissão colinérgica 18
5.3. Interação entre estrógeno, transmissão colinérgica e memória 19
6. Influência do estrógeno na emoção 21
7. Escopolamina 23
Justificativa 25
Objetivos 26
1. Geral 26
2. Específicos 26
Artigo científico 27
Referências Gerais 55
9
Introdução
1. Memória
1.1. Aspectos Gerais
O aprendizado e a memória são fenômenos comportamentais relacionados à
plasticidade do sistema nervoso central (ROSENZWEIG, 1996). Enquanto o
aprendizado pode ser definido como uma mudança no comportamento que resulta de
uma experiência, a memória seria a capacidade de armazenar e evocar experiências
aprendidas (LEVITAN & KACZMAREC, 1991). O fenômeno do aprendizado é visto
como o processo pelo qual os sistemas celulares e moleculares cerebrais transformam
uma informação nova em um “traço mnemônico”, que pode ser armazenado e
recuperado (SCHMIDT, 1995).
Algumas classificações dos fenômenos mnemônicos têm sido propostas e
múltiplos sistemas funcionais para formação de memórias têm sido descritos
(BADDELEY & WARRINGTON, 1970; SQUIRE & ZOLA-MORGAN, 1988;
SQUIRE et al., 1993; SQUIRE & KANDEL, 2000). Segundo a classificação de
Baddeley & Warrington (1970), a memória pode ser classificada de acordo com sua
duração. A memória de curto prazo, por exemplo, é uma forma de memória de
capacidade limitada e de curta duração, e dela fariam parte elementos de um passado
imediato, que não chegaram a deixar a consciência. Já a memória de longo prazo é mais
estável e de longa duração, sendo constituída por elementos do passado que já se
ausentaram da consciência, e que podem ser evocados por estímulos a eles relacionados.
Memórias de longo prazo não seriam formadas instantaneamente, e sim consolidadas ao
longo do tempo depois do processo de aprendizado (MCGAUGH, 1966).
Além disso, tanto o aprendizado quanto a memória podem ser classificados de
acordo com o tipo de informação processada em: declarativa, que compreende o
armazenamento de um conhecimento que pode ser conscientemente e intencionalmente
recordado (informações sobre locais, pessoas, objetos, fatos, etc.) ou de procedimento,
que se refere às habilidades motoras e perceptivas. A memória declarativa envolve
principalmente regiões diencefálicas e do lobo temporal medial, incluindo o hipocampo,
enquanto que a memória de procedimento está relacionada basicamente aos sistemas
sensoriais e motores específicos utilizados no aprendizado de cada habilidade motora
e/ou perceptiva, como por exemplo, os núcleos da base e o cerebelo (SQUIRE, 1992;
GABRIELI, 1998).
Acredita-se que a memória seja uma função cerebral que envolve diversas
regiões, tais como o córtex cerebral e várias estruturas do sistema límbico (SQUIRE,
1987; SQUIRE & KANDEL, 2000). Sabe-se que o neocórtex, por exemplo, estaria
envolvido no armazenamento da memória de longo-prazo declarativa
(JERUSALINSKY et al. 1997), enquanto que o envolvimento do corpo estriado na
memória de procedimento foi sugerido (MISHKIN et al., 1984). Além disso, parece que
diferentes componentes da memória, com diferentes significados, são processados
10
paralelamente em diferentes regiões. Estudos utilizando lesões mostraram que a
amígdala é especializada no processo de alerta e/ou informação aversiva, participando
da memória para eventos com significado emocional.
Embora os mecanismos responsáveis pela formação da memória não sejam
completamente conhecidos, acredita-se que a memória esteja associada com alterações
plásticas neuronais. Dessa forma, estudos se concentram na descoberta dos mecanismos
celulares e moleculares responsáveis por essas alterações (JODAR & KANETO, 1995).
Alguns desses estudos têm mostrado que após uma situação de aprendizado, ocorre uma
reativação neuronal dependente dessa experiência, corroborando a hipótese de que, após
sua codificação, os traços de memória precisam ser repetidos em suas respectivas redes
neurais até que a plasticidade sináptica possa efetivar a consolidação (PAVLIDES &
WINSON, 1989; RIBEIRO et al., 2004).
Os processos que envolvem a formação da memória (aquisição, consolidação e
evocação), assim como sua extinção, estão sujeitos à modulação por diversos fatores. O
contexto emocional da situação a ser codificada, armazenada e posteriormente evocada
é um dos fatores mais relevantes. De fato, inúmeros estudos demonstram que o
conteúdo emocional das informações é diretamente proporcional à probabilidade de
recordação das mesmas (LABAR & CABEZA, 2006; PHELPS, 2006). Dessa forma,
embora as memórias declarativas com ou sem conteúdo emocional sejam formadas por
meio do funcionamento do sistema do lobo temporal medial, as memórias que
envolvem estímulos com valência emocional tendem a ser mais duradouras e vívidas
(CHIRSTIANSON, 1989; PHELPS, 2006). Sugere-se que a modulação de estruturas
desse sistema pela ativação da amígdala durante o processo de consolidação seria
responsável por tal diferença (CAHILL & MCGAUGH, 1998; PHELPS, 2006).
1.2. Modelos animais para o estudo de memórias associativas
O conhecimento que se tem disponível sobre os mecanismos neurobiológicos da
memória é proveniente graças a estudos com modelos animais, desde invertebrados até
primatas não humanos, sendo a grande maioria realizada em roedores. Dessa forma,
basicamente dois tipos de aprendizado embasam os modelos animais de memória:
aprendizado não associativo e o aprendizado associativo (LEVITAN & KACZMAREC,
1991). A memória não associativa é uma forma simples de aprendizado que envolve
mudança da intensidade da resposta a um estímulo. Em sua maioria, entretanto, os
modelos de memória fazem uso do aprendizado associativo. A memória associativa
envolve um tipo de aprendizado mais complexo, no qual dois estímulos estão
associados temporalmente. Nesse caso, um estímulo normalmente neutro
(condicionado) é pareado com um estímulo efetivo (incondicionado), que pode ser tanto
reforçador como aversivo (LEVITAN & KACZMAREC, 1991). Um exemplo desse
tipo de procedimento seria a tarefa de esquiva passiva a um choque administrado em um
determinado local.
11
Nesse paradigma, ratos são colocados em um local diferente daquele no qual
receberão o estímulo aversivo (choque elétrico nas patas) e recebem tal estimulação
apenas ao se transferirem voluntariamente para o compartimento “aversivo”. A
memória é avaliada pelo aumento da latência para transferência para o compartimento
no qual o animal recebeu o choque em uma posterior reexposição. Nesse tipo de
procedimento, o desempenho do animal permite a inferência de que ocorre uma
memória de natureza declarativa para a situação específica (CAHILL & MCGAUGH,
1998).
Já o modelo de resposta de medo condicionada a um som ou contexto
(LEDOUX, 2000), utiliza o condicionamento pavloviano. Ratos são submetidos a um
pareamento de um estímulo condicionado (o som ou o contexto) com um choque
elétrico aplicado às patas (estímulo incondicionado). Após certo número de
pareamentos, passam a apresentar a resposta que normalmente apresentariam ao choque
apenas com a apresentação do som ou do contexto. A resposta, denominada freezing
(congelamento) é caracterizada por ausência total de movimentos com exceção dos
movimentos respiratórios e é uma reação de medo característica da espécie
(BLANCHARD & BLANCHARD, 1972; CANTERAS et al., 2001).
O modelo do labirinto em cruz elevado convencional baseia-se na aversão
natural de roedores a espaços abertos para a avaliação da resposta de medo espontânea
(MONTGOMERY, 1955). Constitui-se num labirinto elevado constituído por dois
braços abertos e dois braços circundados lateralmente por paredes, e validado
fisiológica, farmacológica e comportamentalmente como modelo animal de ansiedade,
sendo um dos modelos mais utilizados com esse fim (HANDLEY & MITHANY, 1984;
PELLOW et al., 1985; PELLOW & FILE, 1986; FRUSSA-FILHO et al., 1999;
CALZAVARA et al., 2005).
Outro paradigma demonstrado na literatura, a esquiva discriminativa em
labirinto em cruz elevado (ED-LCE), permite a avaliação simultânea de aspectos
mnemônicos e afetivos nos processos de aprendizagem e memória. Esse modelo é
baseado na apresentação simultânea de uma exposição a um estímulo aversivo (a ser
aprendido) e de uma situação naturalmente aversiva (para a qual a resposta de medo
seria inata). Uma vez que os diferentes fenômenos são avaliados por parâmetros
diferentes, identifica-se se os efeitos de diversos tipos de manipulações sobre a memória
aversiva estariam envolvidos com os processos específicos de aquisição, consolidação
ou evocação da memória ou se estariam mais diretamente relacionados com
modificações no componente aversivo da situação, ou ainda na resposta de medo.
Nesse modelo, ratos ou camundongos são condicionados a escolher dois braços
fechados (um aversivo e um não aversivo) ao mesmo tempo em que evitam a exposição
aos braços abertos (ao qual tendem a apresentar uma resposta de medo inata) do
labirinto em cruz elevado (SILVA, 2001). Os animais expostos à exposição pareada do
estímulo com o braço fechado específico mostram uma clara preferência pelo braço não
aversivo quando reexpostos ao labirinto na ausência do estímulo (SILVA et al., 1997;
SILVA, 2001). Dessa forma, a diminuição da exploração do braço aversivo serve como
medida para avaliar a retenção da tarefa. Isso está em consonância com diversos estudos
12
que mostraram que essa diminuição é inibida pela administração de drogas amnésicas e
potencializada pela administração de substâncias que melhoram a memória (SILVA et
al., 1997; 1999; 2000; 2002a; CLARO et al., 1999; SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000;
2002; PATTI et al., 2006). Além disso, a análise do desempenho ao longo da sessão de
treino permite a avaliação específica do processo de aquisição. Um decréscimo na
exploração do braço aversivo do começo ao final da sessão de treino indica que a tarefa
foi aprendida, e déficits de aquisição são indicados pela ausência de modificação na
exploração do braço aversivo ao longo do treino (SILVA et al., 2004).
Além das avaliações relacionadas ao aprendizado e à memória, de maneira
similar ao labirinto em cruz elevado convencional, a exploração dos braços abertos pode
ser utilizada para avaliar comportamentos relacionados ao medo inato, respondendo
corretamente a modificações induzidas por drogas ansiolíticas ou ansiogênicas (SILVA
& FRUSSA-FILHO, 2000; 2002; SILVA et al., 2002a). Um fator preponderante dentre
os modelos abordados, é que a esquiva discriminativa é capaz de dissociar os efeitos de
manipulações na memória aversiva e na resposta inata de medo (CARVALHO et al.,
2006; KAMEDA et al., 2007; MELO et al., 2012; NIIGAKI et al., 2010).
2. Estrógeno: receptores e mecanismos de ação
Os estrógenos compreendem uma classe de hormônios esteróides, que incluem
três membros biologicamente ativos: estronas, estradiol e estriol. Tais hormônios, em
especial o estradiol, podem atuar no sistema nervoso central através de diferentes
mecanismos, tais como modulação de neurotransmissores, plasticidade sináptica,
aumento do fluxo sanguíneo cerebral, proteção contra apoptose, além de ações anti-
inflamatórias e propriedades antioxidantes (CHOLERTON et al., 2002). No cérebro, os
receptores de estrógeno estão localizados em várias estruturas, entre elas o hipocampo e
a amígdala tanto de humanos (OSTERLUND et al., 2000a) quanto de roedores
(MCEWEN & ALVES, 1999). Nas últimas décadas, vários estudos têm abordado o
papel do estrógeno e de sua reposição em algumas doenças neurodegenerativas,
principalmente a doença de Alzheimer (PANIDIS et al., 2001; ZEC & TRIVEDI,
2002).
Sítios específicos de ligação conhecidos como receptores de estrógeno (REs)
foram identificados há mais 50 anos (JENSEN & JACOBSEN, 1962). Os receptores de
estrógeno são proteínas pertencentes à superfamília de receptores nucleares hidrofóbico-
ligantes e que dependem da ligação com o seu substrato (estrógeno) para desempenhar
sua principal função como fator de transcrição através da via clássica genômica
(ROLLEROVA & URBANCIKOVA, 2000). O estrógeno se liga aos REs
intracelulares, que podem estar localizados no citoplasma ou no núcleo, e,
posteriormente, irão agir em forma de homodímeros sobre o DNA como elemento de
resposta a uma proteína ativadora de ligação local. Isso resulta em transcrição e
13
tradução de novas proteínas as quais irão promover a resposta funcional da célula
(GIGUERE, 2003; FALKENSTEIN et al., 2000; O'MALLEY & MEANS, 1974).
Esses receptores possuem duas isoformas, alfa e beta, as quais podem ser
encontradas em populações tanto no núcleo quanto na membrana plasmática de vários
tipos de células (RAZANDI et al., 1999). Os receptores de membrana não representam
uma população estável, já que seguem uma via de inserção pós-sequestramento da
molécula do estradiol (MYCEVYCH & DOMINGUEZ, 2009). Os receptores nucleares
de estrógeno, receptor de estrógeno alfa (REα) e receptor de estrógeno beta (REβ),
podem ser encontrados em todo o córtex cerebral, hipocampo, prosencéfalo basal e
amígdala em ratos, camundongos, primatas não-humanos e humanos (MILNER et al.,
2001, 2005; OSTERLUND et al., 2000; SHUGHRUE et al., 1997a, 1997b, 2000;
SHUGHRUE & MERCHENTHALER, 2000).
REα e REβ são expressos nas subdivisões medial e central da amígdala e em
projeções corticais e hipocampais dessa estrutura (OSTERLUND et al., 2000;
SHUGHRUE et al., 1997b). Cahill e colaboradores demonstraram uma clara
lateralização, relacionada ao sexo, do envolvimento da amígdala na memória emocional
e indicaram que as teorias da neurobiologia da memória ligada a contextos emocionais
devem levar em conta a influência do sexo (CAHILL et al., 2001). Coletivamente, os
dados citados confirmam que ambos os REs, especialmente os REβ, são expressos em
regiões do cérebro que são críticas para o aprendizado e a memória, proporcionando
assim uma oportunidade para o estrógeno modular o funcionamento dessas áreas e os
processos cognitivos ligados a elas. A hipótese de REα e REβ estarem localizados em
sítios extranucleares possibilita uma série de potenciais mecanismos através dos quais
estes receptores seriam capazes de regular a função da memória no hipocampo e na
amígdala.
Além das ações genômicas clássicas, mecanismos não-genômicos também
podem estar envolvidos com efeitos rápidos do hormônio em um curto período de
tempo sobre os REs de membrana e, assim, induzir resultados benéficos à memória (GU
et al., 1999; LEVIN, 2005; WALF & FRYE, 2008). É importante salientar que a
ativação de diversas vias de sinalização intracelular é determinante para a formação de
memórias (FITZPATRICK et al., 2002; KUROKI et al., 2000; MANNELLA &
BRINTON, 2006; SAWAI et al., 2002).
Por exemplo, em células hipocampais, o estrógeno aumenta correntes induzidas
por kainato em apenas 3 minutos (GU & MOSS, 1996). Vale mencionar que este efeito
rápido do hormônio no reforço da memória pode ocorrer durante uma janela de tempo
de duas horas (LUINE et al., 2003; PACKARD, 1998). Além disso, ações rápidas
podem envolver outros alvos de membrana e/ou a ativação de várias vias de transdução
de sinal, como a proteína quinase de ativação mitógena, a quinase regulada por sinal
extracelular, a fosfatidilinositol-3-quinase ou a cascata de adenilato ciclase (BEYER et
al., 2002; KELLY & LEVIN, 2001; MOSS & GU, 1999; NILSEN et al., 2002;
TORAN-ALLERAND et al., 2002; WADE et al., 2001; WATTERS et al., 1997). É de
se esperar, portanto, que o estrógeno atue em alvos de membrana e/ou vias de
14
transdução de sinal no hipocampo e na amígdala para modular os processos cognitivos
associados com componentes afetivos.
Já se sabe que o estrógeno é classificado como um hormônio neuromodulador.
Entretanto, recentemente, autores propuseram o estrógeno como neurotransmissor
(BALTHAZART & BALL, 2006). Para ser considerada como tal, a substância em
questão precisa ser sintetizada em neurônios pré-sinápticos e liberada em seu terminal,
ligar-se a um receptor de membrana pós-sináptico e, posteriormente, ser degradada ou
inativada. O estradiol mostrou atingir esse critério devido a algumas características: (1)
a identificação da enzima aromatase (responsável por sua síntese a partir da
testosterona) presente densamente em botões pré-sinápticos e na superfície de vesículas
sinápticas, além de altas concentrações do hormônio no terminal; (2) a aromatase pode
ser ativada rapidamente por fosforilação dependente de cálcio, além de ser modulada
por outras vias de neurotransmissão como a glutamatérgica; (3) existem receptores
membranares pós-sinápticos específicos para a molécula de estradiol, como os já
supracitados REα e REβ e os novos candidatos, RE-X, RE46 e a GPR30 e, finalmente,
(4) a eliminação ou inativação da atividade do estradiol pode ser mediada através do
complexo de citocromos por metabolização oxidativa, conjugação, hidroxilação,
glucoronização, sulfonação, metilação, e ainda por meio da COMT, a qual transforma
catecolestrógenos em metoxiestrógenos, estes com baixíssimos níveis de atividade
(BALTHAZART & BALL, 2006; BALTHAZART et al., 2006; CORNIL, 2009).
3. Oscilações hormonais endógenas
Na puberdade, em mulheres, os ovários começam a produzir os hormônios
sexuais em resposta a sinais hormonais do cérebro. No início do ciclo menstrual, os
níveis de estrógeno e progesterona são baixos. Com a maturação dos folículos
ovarianos, o nível de estrógeno aumenta e atinge seu pico antes da ovulação, e, em
seguida, diminui ao nível basal antes do próximo ciclo. Já o nível de progesterona
começa a subir logo após a ovulação e permanecerá elevada durante a segunda metade
do ciclo, diminuindo ao nível basal um pouco antes do próximo ciclo – a menos que
ocorra a fertilização e implantação do óvulo fertilizado.
Em roedores de laboratório, como ratos (Rattus norvegicus) e camundongos
(Mus musculus), este ciclo é denominado ciclo estral e difere do ciclo menstrual pela
duração, e especialmente pela ausência da fase lútea e por não haver descamação da
parede uterina (WISE, 2000). No entanto, as oscilações hormonais cíclicas são bastante
semelhantes entre os ratos, camundongos e humanos, incluindo os picos de estradiol e
progesterona antes da ovulação (MCCARTHY & BECKER, 2002).
O ciclo estral de roedores tem duração de 4 a 6 dias e é composto por 4 fases
distintas: Metaestro (M), Diestro (D), Proestro (P) e Estro (E). A elevação e a queda dos
níveis de estrógeno ocorrem, respectivamente, durante a fase de P e na transição de P
para E. Na fase de E, os níveis de progesterona se elevam e diminuem na transição para
15
o M. Os níveis hormonais mais baixos são encontrados ao decorrer das fases de M e D
(BECKER et al., 2005; POMPILI et al., 2010).
Essa variação é acompanhada por alterações na morfologia e fisiologia do
hipocampo e o estudo da modulação da memória pelo estrógeno pode desvendar tais
alterações, por exemplo, na densidade da coluna dendrítica na sub-região CA1 do
hipocampo, a qual é aproximadamente 30% maior durante o P quando comparada ao E
(WOOLLEY et al., 1990; WOOLLEY & MCEWEN, 1992). Trabalhos posteriores
demonstraram que outros aspectos da fisiologia do hipocampo flutuam de uma forma
cíclica. Por exemplo, tanto a potenciação de longa duração (LTP – sigla em inglês para
long term potentiation) em CA1 (WARREN et al., 1995) quanto a neurogênese no giro
denteado (TANAPAT et al., 1999) estão aumentadas durante a fase de P em relação ao
E.
4. Influência do estrógeno sobre tipos de memória
4.1. Memória espacial
Existem na literatura inúmeros estudos, em humanos e roedores, abordando o
papel dos hormônios sexuais sobre o comportamento e sobre processos cognitivos,
como a aprendizagem e a memória. A maioria desses trabalhos mostra efeitos positivos
sobre a memória, mesmo quando se há previamente prejuízos associados (GIBBS &
AGGARWAL, 1998; TINKLER & VOYTKO, 2005). Em modelos animais, hormônios
sexuais são capazes de influenciar a memória principalmente através de vias neuronais
relacionadas com o hipocampo (MCEWEN, 2002). Particularmente, o estrógeno
modula a aprendizagem e a memória avaliadas em tarefas hipocampo-dependentes
(MCEWEN, 2002; ZEC & TRIVEDI, 2002), e este efeito está possivelmente associado
com o aumento da liberação de acetilcolina no hipocampo (DUMAS et al, 2006, 2008).
Algumas pesquisas têm mostrado que o desempenho de roedores em tarefas
espaciais dependentes do hipocampo varia ao longo do ciclo estral. Por exemplo, ratas
na fase de proestro escolhem uma estratégia de lugar hipocampo-dependente, enquanto
ratas em estro preferem estratégia de resposta estriado-dependente para resolver uma
tarefa de labirinto em “T” (KOROL et al., 2004). Esse resultado é consistente com
estudos envolvendo ratas ovariectomizadas e tratadas com estradiol, em tarefas
similares de memória espacial (KOROL et al., 2002). O valerato de estradiol, um
análogo do estradiol utilizado neste estudo, também demonstrou ter ações positivas na
memória de curto e longo prazo (VAZQUEZ-PEREYRA et al., 1995).
Em camundongos, o desempenho em uma tarefa de memória espacial é melhor
na fase de proestro quando comparado ao estro (FRICK & BERGER-SWEENEY,
2001). Em mulheres, algumas habilidades cognitivas, especialmente a memória verbal,
variam de acordo com o ciclo menstrual, e está correlacionada positivamente com os
níveis séricos de estrógeno (ROSENBERG & PARK, 2002; SHERWIN, 2003). Além
disso, a ativação hipocampal está correlacionada com os níveis de estradiol no ciclo
menstrual (DREHER et al., 2007). Esses estudos fornecem evidências de que a
16
oscilação natural de hormônios esteroides sexuais influencia a cognição hipocampo-
dependente em mamíferos.
Outro foco de investigação do estrógeno sobre memória envolve o estudo da
atividade de estruturas como hipocampo e amígdala, uma vez que os processos que
abrangem memórias contextuais e de teor emocional dependem fundamentalmente
dessas estruturas (CAHILL & MCGAUGH, 1998; LEDOUX, 2000).
4.2.Memória associativa
Tanto a amígdala quanto o hipocampo têm sido considerado importantes
componentes do sistema límbico envolvidos com a memória associada a
comportamentos afetivos (LEDOUX, 2000; WALKER et al., 2003). Manipulações
nestas regiões com hormônios sexuais em ratos machos produzem robustas alterações
em comportamentos relacionados a ansiedade/medo e depressão (BITRAN et al., 1999,
2000; EDINGER & FRYE, 2004, 2005; FRYE & WALF, 2002, 2004a, b; RHODES &
FRYE, 2001; WALF & FRYE, 2003; WALF et al., 2005), sugerindo um papel dessas
regiões do cérebro nos efeitos de hormônios esteroides sobre ansiedade e depressão.
Em modelos de memória associativa, o desempenho das funções cognitivas pode
estar intimamente relacionado com outros fenômenos comportamentais. De fato, alguns
estudos têm proposto que o medo e a memória não seriam apenas fenômenos
relacionados, mas que a ansiedade (uma sensação subjetiva de medo) seria, na verdade,
um passo necessário para que ocorresse a formação da memória (MATHEWS, 1990).
Paralelamente, fatores de natureza cognitiva (como por exemplo, memórias de
experiências anteriores) podem determinar a maneira e intensidade com que são
expressas as respostas de medo (BLANCHARD & BLANCHARD, 1987), nas quais
muitos modelos animais de memória se baseiam. Nesse sentido, a avaliação específica
do efeito de diferentes manipulações sobre processos relacionados à memória em
modelos animais pode estar seriamente prejudicada se a manipulação em questão
apresentar qualquer ação sobre os níveis de ansiedade (medo) no momento dos testes
experimentais (SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000; 2002; SILVA et al., 2002a).
Como descrito acima (ver seção 1.2), um dos modelos utilizados atualmente no
estudo de memória e sua relação com ansiedade, em roedores, é a esquiva
discriminativa em labirinto em cruz elevado (ED-LCE). Esse paradigma possibilita
fazer uma avaliação simultânea de aspectos mnemônicos e emocionais nos processos de
aprendizagem e memória, identificando se os efeitos de diversos tipos de manipulações
sobre a memória aversiva estariam envolvidos com os processos específicos de
aquisição, consolidação ou evocação da memória, ou se estariam mais diretamente
relacionados com modificações no componente aversivo da situação, ou ainda na
resposta de medo (SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000; SILVA et al., 1999).
5. Estrógeno, memória e a transmissão colinérgica
17
5.1. O estrógeno e estruturas encefálicas relacionadas com a memória
O entendimento de como o estrógeno modula a memória tem sido um grande
desafio, uma vez que muitas áreas encefálicas estão envolvidas com sua formação. Uma
das estruturas mais extensivamente estudadas na área de aprendizado e memória tem
sido o hipocampo, e atualmente muitos estudos têm investigado os efeitos de vários
hormônios sobre essa estrutura (SPENCER et al, 2008; WOOLLEY, 2007) assim como
a importância desta região do cérebro nos diferentes tipos de memória.
Localizado bilateralmente no lobo temporal medial, o hipocampo é fundamental
para vários tipos de memórias que envolvem informação espacial e contextual, e
também é indispensável na consolidação de memórias – mas não para o armazenamento
de longo prazo de tais memórias (EICHENBAUM, 1997, 2002; SQUIRE, 1992). Além
disso, a vulnerabilidade do hipocampo ao envelhecimento e à doença de Alzheimer
(DETOLEDO-MORRELL et al, 2007; DRISCOLL & SUTHERLAND, 2005) torna
essa região do cérebro de particular interesse para o estudo da influência do estrógeno e
da função cognitiva relacionada à idade.
O hipocampo é um dos alvos para o estrógeno no sistema nervoso central. Este
hormônio, marcado radioativamente e injetado em ratas, mostrou uma alta concentração
no hipocampo (PFAFF & KEINER, 1973). A administração de estrógeno aumenta a
atividade hipocampal como evidenciado pela maior expressão para do gene imediato, c-
fos (RUDICK & WOOLLEY, 2000). Além disso, o estrógeno também altera a
plasticidade do hipocampo. Por exemplo, os níveis de fator neurotrófico derivado do
cérebro (BDNF – do inglês brain-derived neurotrophic factor) flutuam ao longo do
ciclo estral e estão aumentados em ratas ovariectomizadas após a administração de
estrógeno (GIBBS, 1998, 1999). A densidade das espinhas dendríticas no hipocampo é
maior em ratas naturalmente receptivas, ou em decorrência da reposição de estrógeno
após a ovariectomia (GOULD et al., 1990; MACLUSKY et al., 2005; WOOLLEY et
al., 1990; WOOLLEY & MCEWEN, 1993). Comportamentos que dependem da função
hipocampal são sensíveis ao tratamento com estrógeno, de forma que sua administração
já mostrou melhorar o desempenho em várias tarefas cognitivas dependentes do
hipocampo (BOWMAN et al., 2002; FRICK et al., 2002; FRYE et al., 2005; FRYE &
RHODES, 2002; GIBBS et al., 2004; LI et al., 2004; LUINE et al., 2003; PACKARD,
1998; RHODES & FRYE, 2004).
O prosencéfalo basal, através do qual o hipocampo recebe informações
subcorticais, e os córtices entorrinal e perirrinal, através dos quais o hipocampo recebe
informações corticais, também são particularmente importantes em tarefas mnemônicas,
além do fato de serem vulneráveis aos efeitos negativos do envelhecimento e da doença
de Alzheimer (HOF & MORRISON, 2004). Outras regiões do cérebro desempenham
papéis importantes em diferentes tipos de aprendizagem e memória, por exemplo, a
amígdala na memória emocional, o estriado no aprendizado direcionado a resposta e o
córtex pré-frontal na memória operacional e função executiva. Embora estas regiões do
18
cérebro formem redes intricadas que inclui o hipocampo, cada uma tem funções
distintas de memória separadas do hipocampo (EICHENBAUM, 2002; SQUIRE, 2004).
A amígdala é uma região límbica que também é sensível ao tratamento com
estrógeno. Em primeiro lugar, as células da amígdala mostram altas concentrações de
estrógeno marcado radioativamente após injeção sistêmica em ratas (PFAFF &
KEINER, 1973). Segundo, a administração de estrógeno aumentou a imunorreatividade
para proteína c-fos na amígdala medial (GRECO et al., 2003a, b; INSEL, 1990).
Terceiro, o número de sinapses dendríticas em neurônios da amígdala são aumentadas
pelo tratamento com estrógeno (NISHIZUKA & ARAI, 1982), além do que a densidade
de espinhas dendríticas na amígdala medial flutua ao longo do ciclo estral (RASIA-
FILHO et al., 2004). Outra evidência importante é que o estrógeno altera as respostas
comportamentais de roedores em tarefas afetivas que envolvem a amígdala. Efeitos
semelhantes da injeção subcutânea e intra-amígdala de estrógeno em ratas
ovariectomizadas são observados em modelos de medo e nocicepção, de tal forma que
em ambos os modelos o hormônio tornou a resposta ao estresse, induzida após a
exposição aguda ao odor de predador, mais efetiva (WALF & FRYE, 2003). Em outro
estudo, a infusão de estrógeno intra-amígdala aumentou o número de entradas e o tempo
gasto no centro do campo aberto e o tempo gasto nos braços abertos do labirinto em
cruz elevado (FRYE & WALF, 2004a). Estes dados sugerem que a amígdala também é
um local do sistema nervoso central sensível ao estrógeno e que pode ser juntamente
com o hipocampo, alvo para os efeitos moduladores desse hormônio sobre os processos
cognitivos, especialmente aqueles relacionados a fatores emocionais.
5.2. Evidências da ação do estrógeno na transmissão colinérgica
A transmissão colinérgica está presente desde os organismos mais primitivos
(bactérias, algas, protozoários, esponjas). Além disso, todos os componentes dessa via
(receptores, complexos enzimáticos e a própria acetilcolina) estão presentes em diversas
células não neuronais, como por exemplo, células embrionárias, epiteliais, endoteliais,
musculares e imunológicas onde a sinalização se faz de maneira semelhante a observada
em neurônios (WESSLER & KIRKPATRICK, 2008). Os primeiros estudos sobre os
efeitos do estrógeno no sistema colinérgico demonstram que o estradiol aumenta a
atividade da colina acetiltransferase (ChAT) na área pré-óptica e na amígdala
corticomedial de ratas ovariectomizadas (LUINE et al., 1975). Além disso, a atividade
da colina acetiltransferase (enzima que sintetiza a acetilcolina) e a liberação de
acetilcolina no hipocampo, neocórtex e prosencéfalo basal são também reforçadas pelo
estrógeno (GIBBS, 2000a; MARRIOTT & KOROL, 2003). Entretanto, o envolvimento
do sistema colinérgico sobre os efeitos do estrógeno e a função sobre o hipocampo
ainda não estão completamente estabelecidos. Um estudo apontou que o sistema
colinérgico muscarínico medeia a ação hormonal sobre a memória e a ligação de
glutamato ao receptor NMDA no hipocampo (DANIEL & DOHANICH, 2001). Este
relato mostrou que a presença de antagonista do receptor muscarínico do tipo 2 bloqueia
19
tanto o aumento de ligação do glutamato ao receptor NMDA induzido pelo estradiol,
quanto prejudica a memória operacional em ratas ovariectomizadas. Estudos posteriores
mostraram que o estrógeno aumenta a liberação de acetilcolina estimulada pelo potássio
no hipocampo (MARRIOTT & KOROL, 2003; GIBBS et. al., 2004), sugerindo que o
aumento da estimulação colinérgica pode mediar alguns efeitos do estrógeno nessa
região do cérebro. Além disso, outros trabalhos têm examinado o REα e o transportador
de acetilcolina vesicular (VAChT) em CA1 e mostraram que VAChT está co-localizado
com os REα nos terminais axonais e nas espinhas dendríticas (TOWART et al., 2003).
Isto sugere que o estrógeno ligado a estes receptores pode afetar a liberação e a captação
vesicular local da acetilcolina, além de influenciar a expressão do receptor NMDA e a
função hipocampal.
Além disso, o estrógeno pode influenciar indiretamente a plasticidade
hipocampal e neocortical através do aumento do sinal colinérgico nas projeções dos
neurônios do prosencéfalo basal para o hipocampo e córtex (GIBBS & AGGARWAL,
1998; WU et. al., 1999). Dentre os diversos efeitos do estrógeno sobre estes neurônios,
sabe-se que os níveis de mRNA da ChAT no prosencéfalo basal flutuam durante o ciclo
estral e são aumentados em resposta à administração de estrógeno e progesterona após
ovariectomia (GIBBS, 1996; GIBBS et al., 1994; LUINE, 1985). A atividade da ChAT
no neocórtex, hipocampo e no prosencéfalo basal, mais a liberação de acetilcolina,
também são reforçadas pelo estrógeno (FRICK et al., 2002a; GIBBS, 2000a; GIBBS et
al., 1997). A relação desta modulação da função hipocampal e neocortical pelos
neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal é crítica para o envelhecimento, uma vez
que alterações patológicas nestes neurônios estão associadas com a disfunção da
memória na doença de Alzheimer (AULD et al., 2002; PAPPAS et al., 2000; PERRY et
al., 1978; WHITEHOUSE et al., 1982). A neurotransmissão colinérgica hipocampal
também mostrou modular a função da amígdala na escolha de informações emocionais
relevantes, levando à seleção adaptativa do melhor estímulo que prediz um evento
aversivo (CALANDREAU et. al., 2006). Ainda, parece que a transmissão colinérgica
intacta na amígdala basolateral é necessária para a aquisição e/ou consolidação da
memória (CARBALLO-MÁRQUEZ et al., 2009).
Outras investigações sugerem que a privação dos níveis de estrógeno pode
causar a longo prazo uma diminuição do estado funcional dos neurônios colinérgicos do
prosencéfalo basal que se projetam para o córtex e hipocampo (GIBBS, 1998). Além
disso, estudos mostraram que o estrógeno aumenta a liberação de acetilcolina
estimulada por potássio no hipocampo (GIBBS et al., 1997) e que a administração
aguda de estrógeno foi capaz de potencializar os efeitos de agonistas colinérgicos na
aprendizagem de tarefas de esquiva, quando administrado diretamente no hipocampo
(FARR et al., 2000). Todos estes resultados indicam que estrógeno pode mediar
processos de memória através do sistema colinérgico.
5.3. Interação entre estrógeno, transmissão colinérgica e memória
20
A importância da interação entre o estrógeno e a função colinérgica também tem
sido demonstrada no desempenho de animais em tarefas de aprendizagem e memória. A
administração de estrógeno em ratas ovariectomizadas até 72 horas antes do teste
neutralizou completamente os efeitos negativos da escopolamina (antagonista
muscarínico) sobre a aprendizagem em tarefas de alternância (DOHANICH et al.,
1994). A reposição do hormônio em ratas ovariectomizadas também aumentou a
aquisição de tarefas de memória espacial e anulou parcialmente os efeitos
anticolinérgicos da administração de escopolamina sobre o hipocampo (GIBBS, 1999).
Em uma tarefa de labirinto radial, a administração crônica de estrógeno em ratas
ovariectomizadas melhorou a memória operacional e impediu os efeitos amnésticos da
escopolamina (FADER et al., 1999). Ainda nesse sentido, a administração de estrógeno
atenuou os efeitos negativos da escopolamina e do lorazepam (ansiolítico
benzodiazepínico) sobre a aquisição e retenção da memória na tarefa de esquiva passiva
em múltiplos treinos e, curiosamente, essa ação parece ser específica para níveis séricos
baixos ou intermediários, mas não altos, de estrógeno (GIBBS et al., 1998). Uma dose
única suprafisiológica de estrógeno foi capaz de potencializar os efeitos de agonistas
colinérgicos e glutamatérgicos no aprendizado de tarefas de esquiva quando
administrada diretamente no hipocampo (FARR et al., 2000). Estudos em macacos
rhesus também mostraram que os efeitos do estrógeno na atenção visuo-espacial
parecem ser modulados por receptores colinérgicos muscarínicos (TINKLER &
VOYTKO, 2005).
Existem fortes ligações sugerindo que a capacidade da reposição de estrógeno
em melhorar a função colinérgica pode estar relacionada com a idade (SAVONENKO
& MARKOWSKA, 2003). Investigações em modelos animais têm mostrado que, em
longo prazo, a perda de estrógeno no cérebro produz uma diminuição do estado
funcional dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal, particularmente aqueles
projetados para o hipocampo e o córtex (GIBBS, 1998). Além disso, nessa
investigação, o tratamento hormonal de seis meses restaurou parcialmente os níveis de
mRNA de ChAT no septo medial, enquanto que outros trabalhos (GIBBS, 2000;
MARKOWSKA & SAVONENKO, 2002) têm mostrado que, se o tratamento hormonal
em ratos tiver um atraso de 9 ou 10 meses após a ovariectomia, os efeitos benéficos do
estrógeno não são mais vistos. É, portanto, mais uma evidência de que existe um
período de tempo para se observar essa ação (GIBBS & GABOR, 2003). Dessa forma, a
habilidade do estrógeno em melhorar a função colinérgica do prosencéfalo basal parece
diminuir com a idade a partir da perda do suporte hormonal endógeno. Daniel e
colaboradores relataram que, se o estrógeno for administrado imediatamente após
ovariectomia, as melhorias podem ser observadas na aquisição em tarefas de memória
operacional, mas não se a administração de estrógeno for prorrogada (tratamento
crônico) (DANIEL et al., 2006). No entanto, alguns estudos têm demonstrado que, em
primatas não humanos, o estrógeno tem beneficiado o desempenho cognitivo, mesmo
quando a administração é adiada após a ovariectomia ou após a menopausa, mesmo por
vários anos (LACREUSE, 2006; LACREUSE et al., 2002; RAPP et al., 2003). A razão
para esta discrepância não é clara, mas o comprimento do período crítico pode ser
21
bastante diferente dependendo do tempo de vida natural do animal. Para os seres
humanos, ela pode se estender por vários anos.
Após uma revisão prévia de dados epidemiológicos, clínicos e da literatura
animal examinou-se a existência de um período crítico, isto é, uma melhor faixa de
idade para os efeitos benéficos do estrógeno sobre a cognição ocorrer (RESNICK &
HENDERSON, 2002; MAKI, 2006; SHERWIN, 2007). Estes estudos examinaram a
capacidade de proteção do estrógeno em atenuar o comprometimento cognitivo
relacionado com o processo de envelhecimento neuronal e com a perda gradual da
transmissão colinérgica (como ocorre em casos de demência) ao avançar da idade em
mulheres. Entretanto, a hipótese do período crítico não foi corroborada quando se
analisou o efeito da terapia com estrógeno sobre o desempenho da memória sem que
houvesse algum comprometimento na transmissão colinérgica, seja por causas naturais
ou induzidas farmacologicamente, indicando que para se obter os efeitos benéficos do
estrógeno em certas faixas etárias, o sistema colinérgico deve estar temporariamente
comprometido. Estes achados podem ajudar a explicitar melhor a idéia de que os
benefícios do estrógeno específicos à idade possam estar relacionados ao sistema
colinérgico.
Dumas e colaboradores mostraram que 1 mg de estrógeno por dia foi eficaz em
atenuar a ação de anticolinérgicos em testes de atenção e em testes de memória verbal e
não verbal em mulheres (DUMAS et al., 2006). Também sugeriu-se que fatores
adicionais podem desempenhar um papel na presença ou ausência da interação entre o
estrógeno e a transmissão colinérgica incluindo a dose, idade, a genética, a história de
queixas cognitivas e a morfologia do cérebro, os quais mostraram-se relacionados com
o grau de responsividade cognitiva tanto para o tratamento com estrógeno, quanto para
o desafio com drogas anticolinérgicas (KOZAUER et al., 2007; SAYKIN et al., 2006;
WISHART et al., 2006).
Estudos anteriores têm mostrado que indivíduos idosos tendem a serem mais
sensíveis ao bloqueio colinérgico do que indivíduos mais jovens (NEWHOUSE et al.,
1988; SUNDERLAND et al., 1988), porém esses estudos foram realizados com
amostras pequenas e não examinaram explicitamente a meia-idade em relação as
mulheres mais velhas ou aquelas em terapia hormonal. Assim, a questão de saber se a
idade interage com o estado hormonal para modular a sensibilidade colinérgica não está
completamente solucionada e isso pode ser determinante para a integridade do sistema
colinérgico.
6. Influência do estrógeno na emoção
A literatura mostra que a memória emocional é dependente do componente
afetivo, tais como o comportamento de medo e ansiedade e da natureza dos eventos
(positivo ou negativo), além do circuito neural do reforço emocional, o qual inclui a
amígdala, hipocampo e o córtex pré-frontal (MATHEWS, 1990; LABAR & CABEZA,
2006). Além disso, a hipótese de que o estrógeno pode influenciar o desempenho de
22
ratas em tarefas cognitivas envolvendo contextos emocionais aversivos
concomitantemente com os comportamentos de medo e ansiedade tem sido pobremente
avaliado (FRYE E WALF, 2004a).
O estrógeno também tem sido associado a comportamentos de medo e
ansiedade. Por exemplo, alterações nos níveis de estrógeno endógeno pode aumentar a
susceptibilidade das mulheres aos transtornos de ansiedade. No entanto, em fêmeas de
roedores, as diferenças em comportamentos de ansiedade em algumas tarefas
comparadas a machos são ainda controversas (JOHNSTON & FILE, 1991;
ZIMMERBERG & FARLEY, 1993). Além disso, as diferenças sexuais no
comportamento de roedores são mais evidentes quando as alterações endógenas dos
níveis de estrógeno durante o ciclo estral são consideradas (CONTRERAS et al., 2000;
MARVAN et al., 1996).
Há relatos, ainda, de que as alterações nos níveis endógenos de estrógeno, ao
longo do ciclo menstrual podem aumentar a suscetibilidade a transtornos de ansiedade e
depressão – e na maioria dos casos, esses transtornos se apresentam em comorbidade.
Essas oscilações também podem fazer com que mulheres tornem-se mais susceptíveis à
manifestação de transtornos do humor, tais como o transtorno disfórico pré-menstrual e
o transtorno de depressão pós-parto (BEBBINGTON et al., 1981; BLOCH et al., 2003;
JENKINS, 1987; RUBINOW & SCHMIDT, 1995; WEISSMAN & KLERMAN, 1977).
Dalton (1959) relatou que aproximadamente 50% das mulheres que foram admitidas em
hospitais psiquiátricos por uma variedade de sintomas, estavam em seu período
menstrual, e a incidência de suicídio foi maior nesta fase do ciclo. Alguns estudos
relatam maior incidência de suicídio entre as mulheres durante a fase lútea comparada a
fase folicular (BACA-GARCIA et al., 2000). Além disso, sintomas de depressão pós-
parto geralmente ocorrem dentro da primeira semana após o parto, período em que há
um rápido declínio nos níveis de estrógeno após um longo período em que os níveis
desses hormônios mantiveram-se elevados, durante a gestação (DEAN & KENDELL,
1981). Embora estes dados sugiram que mudanças nos níveis de estrógeno podem ser
subjacentes ao aumento da susceptibilidade das mulheres a desenvolver transtornos
afetivos, essas mudanças ocorrem concomitantemente com alterações nos níveis de
progesterona, andrógenos, e seus metabólitos, que também podem alterar o humor
(ROCA et al., 2003).
Para avaliar se o complexo estrógeno-REs está agindo no hipocampo ou
amígdala na redução da ansiedade, Frye e Rhodes investigaram os efeitos do bloqueio
desses receptores na amígdala medial e no hipocampo dorsal no comportamento de ratas
naturalmente receptivas, em tarefas como o campo aberto e labirinto em cruz elevado
(FRYE & RHODES, 2002). O bloqueio dos receptores de estrógeno no hipocampo
mostrou reduzir a exploração no centro do campo aberto e braço aberto do labirinto,
demonstrando caráter ansiogênico, enquanto que na amígdala, tal bloqueio não alterou o
comportamento de ansiedade dos animais testados. Este dado sugere que os REs
intracelulares no hipocampo, mas não na amígdala, são críticos para os efeitos
ansiolíticos do estrógeno, além de mostrar que os receptores de estrógeno,
especificamente o REβ, são alvos para os efeitos funcionais do estrógeno. Porém
23
existem outros possíveis mecanismos pelos quais este hormônio pode influenciar o
comportamento de ansiedade. A evidência de que o antagonismo aos REs na amígdala
não altera o comportamento da ansiedade de ratas naturalmente receptivas sugere que o
estrógeno, nesta estrutura, poderia agir através de outros substratos. Um dos alvos pode
ser o sistema opióide, visto que o estrógeno indicou aumentar os níveis de mRNA de
proencefalina no hipotálamo ventromedial de ratas (LAUBER et al., 1990; ROMANO
et al., 1988) e de mRNA para pré-proencefalina na amígdala medial (SINCHAK et al.,
2000), reforçando a receptividade sexual e diminuindo o comportamento de ansiedade
dos roedores.
Outra possibilidade a considerar é que há uma convergência de ações rápidas
através dos REs intracelulares e os efeitos mediados pela membrana no hipocampo e
amígdala. Trabalhos in vivo e in vitro demonstram que o estrógeno pode agir nos REs
de membrana, potencializando seus efeitos através de REs nucleares, os quais requerem
a ativação de proteínas quinase (KOW & PFAFF, 2004; VASUDEVAN et al., 2001).
Dessa forma, é possível que alterações no comportamento de ansiedade mediadas pelo
estrógeno envolvam a ligação deste aos receptores de membrana e a ativação da cascata
de moléculas sinalizadoras na amígdala que dependem de uma interação com REs
intracelulares no hipocampo.
7. Escopolamina
Existem evidências que déficits precisam estar previamente presentes para que
os efeitos benéficos do estrogénio ocorram (GIBBS & AGGARWAL, 1998; TINKLER
& VOYTKO, 2005). A este respeito, a escopolamina é um antagonista colinérgico não
seletivo do receptor muscarínico usado para provocar alterações cognitivas em testes
comportamentais (WALLENSTEIN & VAGO, 2001; SILVA et al., 1999). Wink e
colaboradores descreveram que os processos de envelhecimento que afetam a
integridade do hipocampo são semelhantes aos produzidos pela administração de
escopolamina e a perda de estímulos colinérgicos é comparável à senescência (WINK et
al., 2006). Além disso, a reposição de estrógeno em ratas ovariectomizadas melhora a
aquisição da memória e completamente neutraliza os efeitos negativos da escopolamina
sobre a aprendizagem em tarefas que avaliam memórias operacional e espacial (GIBBS,
1999; FADER et al., 1999).
A escopolamina, primariamente descoberta em grandes concentrações em ervas
e plantas com propriedades alucinógenas, tem sido frequentemente empregada na
clínica, principalmente para inibir os efeitos da ativação do sistema parassimpático
(BROWN & TAYLOR, 1996; SAFER & ALLEN, 1971). Curiosamente, a observação
clínica da utilização da escopolamina como pré-medicação para anestesia deu ascensão
aos estudos com amnésia, estimulando pesquisas sobre os efeitos do bloqueio
colinérgico sobre a memória humana (HARDY & WAKELY, 1962; KOPELMAN,
1986).
24
Atualmente, em pesquisas na área da neuropsicofarmacologia, a escopolamina
tem sido utilizada na indução de déficits cognitivos semelhantes àqueles associados à
demência em humanos e animais (EBERT & KIRCH, 1998; FLOOD & CHERKIN,
1986). No entanto, as propriedades amnésticas da escopolamina já têm sido notadas
desde o início do último século (GAUS, 1906; THOMPSON & COTTERILL, 1909).
O uso da escopolamina como um modelo farmacológico de amnésia se tornou
muito popular após postulação da hipótese colinérgica na disfunção de memória durante
o envelhecimento (BARTUS et al., 1982, FLOOD & CHERKIN, 1986). Esta hipótese
de que o princípio do declínio das funções cognitivas está relacionado à idade foi
predominantemente associada a um decréscimo na integridade da neurotransmissão
colinérgica. Os primeiros experimentos que investigaram os efeitos centrais da
escopolamina em animais foram descritos em 1950 (BOREN & NAVARRO, 1959;
HEARST, 1959), com o objetivo de avaliar o papel do sistema colinérgico em tipos de
comportamentos não específicos, como a taxa de resposta em tarefas operantes. Os
estudos experimentais iniciais que avaliaram os efeitos da escopolamina sobre as
funções cognitivas do homem foram publicados no início dos anos setenta (CROW &
GROVE-WHITE, 1973; SAFER & ALLEN, 1971; DRACHMAN & LEAVITT, 1974).
Posteriormente, estudos utilizaram a escopolamina para validar os modelos de teste da
função cognitiva (ENNACEUR & MELIANI, 1992) e investigar o papel do sistema
colinérgico na cognição (CHUDASAMA et al., 2004). Outros experimentos
sustentaram a noção de que existem deficiências na cognição causadas pela
escopolamina através de pesquisas envolvendo uma ampla variedade de tarefas
cognitivo-comportamentais (HODGES JR. et al., 2009; CHINTOH et al., 2003;
ESTAPÉ & STECKLER, 2002; FLOOD & CHERKIN, 1986; HUGHES et al., 2004;
ISON & BOWEN, 2000; NOMURA et al., 1994; ROBINSON et al., 2004; SAMBETH
et al., 2007), entretanto outros autores questionam tal modelo de comprometimento
cognitivo, interpretando as ações negativas sobre o comportamento como decorrentes de
interferências no aprendizado, memória operacional, de curto-prazo e, outros, ainda
propõem que tais ações não são específicas à memória e sim a níveis atencionais e
perceptuais (COLLERTON, 1986; HAN et al., 2000).
Outro tema importante em que a escopolamina tem sido frequentemente
utilizada é de servir como teste pré-clínico de novas substâncias que são projetados para
tratar a disfunção cognitiva (SNYDER et al., 2005). Neste sentido, se um composto é
eficaz em reverter ou prevenir déficits cognitivos gerados pela escopolamina em
animais, é provável que ele também possa melhorar a função cognitiva em testes
clínicos. Uma das vantagens do modelo de escopolamina é que ele fornece uma maneira
simples e rápida para testar as propriedades de novos medicamentos em melhorar a
cognição. No entanto, é prudente relatar que este tipo de abordagem na triagem pré-
clínica de novas substâncias pode ter uma validade preditiva limitada, tendendo a
produzir falsos positivos, ou seja, drogas que mostraram neutralizar o efeito negativo da
escopolamina sobre a cognição em pesquisas pré-clínicas, muitas vezes não têm a
mesma eficácia em estudos clínicos (SARTER, 2006).
25
Justificativa
Muito do conhecimento existente sobre a influência de hormônios sobre a
memória foi obtido por meio de modelos animais. Um dos métodos utilizados ao
investigar os mecanismos envolvidos com a memória é induzir farmacologicamente
quadros de déficit cognitivo através de administração prévia de escopolamina, um
antagonista colinérgico muscarínico que provoca amnésia em modelos comportamentais
(HODGES JR. et al., 2009). De fato, é relatado que a transmissão colinérgica é
essencial durante os processos mnemônicos, e o estrógeno poderia estar regulando essa
via de transmissão (DUMAS et al. 2006, 2008).
Alguns estudos demonstram que a prevalência da doença de Alzheimer é maior
em mulheres do que em homens (LAUNER et al., 1999; ZANDI et al., 2002a). Embora
não esteja claro se a redução significativa dos níveis hormonais durante a meia idade
está associada a esta maior prevalência, vários estudos têm demonstrado a existência de
diferenças sexuais a nível molecular (MIZUNO & GIESE, 2010), celular (BARKER &
GALEA, 2008) e comportamental (JONASSON, 2005; RIBEIRO et al., 2010),
incluindo o processo de envelhecimento cerebral (GIBBS, 1998). Assim, a perda de
estrógeno, entre outros fatores, poderia desempenhar um papel na maior incidência de
demência em mulheres, destacando a importância da realização de estudos pré-clínicos
e clínicos em mulheres nessa faixa etária. No entanto, estudos em modelos animais são
geralmente realizados com animais ovariectomizados, e não levam em conta as
alterações hormonais naturalmente presentes em fêmeas gonadalmente intactas (FRICK,
2009). Uma vez bem conhecido que ao longo do ciclo estral há oscilações nos níveis de
estrógeno, e que aspectos mnemônicos e emocionais do comportamento podem ser
influenciados por essas variações hormonais, pode-se então levantar a hipótese de que
nas diferentes fases do ciclo, o estrógeno poderia atuar modulando os efeitos amnésticos
da escopolamina, e dessa forma, regular o desempenho dos animais durante a tarefa.
Os dados da literatura supracitados sugerem que os efeitos positivos do
estrógeno no desempenho cognitivo são mediados através de estimulação ou
manutenção da função colinérgica. Assim, a presença de uma disfunção nessa via de
transmissão, como a produzida por fármacos anticolinérgicos, poderia dificultar a
manifestação da melhora cognitiva pelo hormônio. Uma das principais motivações para
o uso de estrógeno, em termos de preservação da função cognitiva, é que suas ações
sustentariam e/ou preservariam a integridade do sistema colinérgico, e então, reduziriam
os efeitos do envelhecimento e/ou o peso de condições patológicas adicionais
envolvidas com o prejuízo ao funcionamento do sistema colinérgico, como a doença de
Alzheimer. Dessa forma, procuramos investigar se as oscilações dos níveis fisiológicos,
durante as fases do ciclo estral de ratas, e suprafisiológicos de estrógeno modulariam a
resposta cognitiva em face ao comprometimento, induzido pela administração de
escopolamina, da memória associada a uma tarefa de contexto aversivo (ED-LCE). É
também importante ressaltar que a maioria dos estudos que investigam a relação entre o
estrógeno e o sistema colinérgico utiliza ratas ovariectomizadas, enquanto que nosso
estudo procurará investigar essa questão em ratas intactas.
26
Objetivos
1. Geral
Avaliar os efeitos das variações hormonais ao longo do ciclo estral sobre o
aprendizado e memória de ratas intactas e a possível participação do sistema colinérgico
nesses efeitos, usando a esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado.
2. Específicos
2.1. Verificar a indução do efeito amnéstico característico da escopolamina durante
as diferentes fases do ciclo estral;
2.2. Investigar a ação de níveis suprafisiológicos de estrógeno sobre os efeitos
mnemônicos da escopolamina;
2.3. Avaliar concomitantemente os níveis de ansiedade e a atividade motora dos
animais durante a tarefa de memória, visando identificar possíveis interações
desses fatores com o desempenho do animal na tarefa.
Observação: O trabalho realizado será apresentado a seguir na forma de artigo
científico.
27
ESTROGEN LEVELS MODIFY SCOPOLAMINE-INDUCED AMNESIA IN
GONADALLY INTACT RATS
André de Macêdo Medeiros1; Geison Souza Izídio
2; Diego Silveira Sousa
1; Priscila Tavares
Macedo1; Anatildes Feitosa Silva
1; Victor Kenji Medeiros Shiramizu
3; Alicia Cabral
1;
Alessandra Mussi Ribeiro1; Regina Helena Silva
1*
1Memory Studies Laboratory, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
2Behavioral Genetics Laboratory, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil
3Behavioral Endocrinology Laboratory, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
*Corresponding author: Regina H. Silva
Memory Studies Laboratory
Department of Physiology
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Av. Salgado Filho, s/n - Caixa Postal 1511 - CEP 59078-970 - Natal, RN, Brazil
fax: (55) 84 3211 9206 e-mail: [email protected]
List of abbreviations:
PMDAT – Plus-maze discriminative avoidance task
SCO – Scopolamine
EV – Estradiol valerate
SAL – Saline
VEH – Vehicle sesame oil
MET – Metestrus
DIE – Diestrus
PRO – Proestrus
EST – Estrus
%TAV – Percentage of time in aversive arm
%TOA – Percentage of time in open arm
NO – Nitric oxide
ER – Estrogen receptor
ER – Estrogen receptor
WHI – Women`s Health Initiative
NAV – Non-aversive arm
AV – Aversive arm
OA – Open arm
RIA – Radioimmunoassay
MW – Molecular weight
28
Abstract:
Previous studies suggested that estrogen plays a role in cognitive function by
modulating the cholinergic transmission. However, most of the studies dealing with this
subject have been conducted using ovariectomized rats. In the present study we
evaluated the effects of physiological and supra-physiological variation of estrogen
levels on scopolamine-induced amnesia in gonadally intact female rats. We used the
plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT) in order to evaluate anxiety levels
and motor activity concomitantly to the memory performance. In experiment 1, female
Wistar rats in each estrous cycle phase received scopolamine (1 mg/kg) or saline i.p. 20
minutes before the training session in the PMDAT. In experiment 2, rats in diestrus
received estradiol valerate (1 mg/kg) or sesame oil i.m., and scopolamine (1 mg/kg) or
saline i.p., 45 minutes and 20 minutes before the training, respectively. In experiment 3,
rats in diestrus received scopolamine (1 mg/kg) or saline i.p. 20 minutes before the
training, and estradiol valerate (1 mg/kg) or sesame oil i.m. immediately after the
training session. In all experiments, a test session was performed 24h later. The main
results showed that: (1) scopolamine impaired retrieval and induced anxiolytic and
hiperlocomotor effects in all experiments; (2) this cholinergic antagonist impaired
acquisition only in animals in diestrus; (3) acute administration of estradiol valerate
prevented the learning impairment induced by scopolamine and (4) interfered with
memory consolidation process. The results suggest that endogenous variations in
estrogen levels across the estrous cycle modulate some aspects of memory mediated by
the cholinergic system. Indeed, specifically in diestrus, a stage with low estrogen levels,
the impairment produced by scopolamine on the acquisition was counteracted by
exogenous administration of the hormone, whereas the posttraining treatment
potentiated the negative effects of scopolamine during the consolidation phase of
memory.
Keywords:
Estrous cycle; Memory; Cholinergic transmission; Anxiety-like behavior;
Discriminative avoidance task
29
1. Introduction
In the last decades, numerous studies have addressed the role of estrogen and its
replacement in some neurodegenerative disorders, mainly Alzheimer's disease
(PANIDIS et al., 2001; ZEC & TRIVEDI, 2002). Estrogen has been shown to reduce
cognitive impairments through different mechanisms, such as modulation of
neurotransmitters, synaptic plasticity, increase of cerebral blood flow, protection against
apoptosis, anti-inflammatory actions and antioxidant properties (for review, see
CHOLERTON et al., 2002). In the brain, the estrogen receptors are located in several
structures, including the hippocampus and the amygdala of both humans
(OSTERLUND et al., 2000a) and rodents (MCEWEN & ALVES, 1999).
Estrogens are a group of steroid hormones that includes three biologically
significant compounds: estrone, estradiol and estriol. Estradiol valerate (EV), an
analogue of estradiol, was shown to improve some types of memory (HOSSEINI et al.,
2010; VÁZQUEZ-PEREYRA et al., 1995). Besides their classical genomic actions,
estrogens also activate non-genomic mechanisms through intracellular signaling
pathways that are critical for memory processes (FITZPATRICK et al., 2002; KUROKI
et al., 2000; MANNELLA & BRINTON, 2006; SAWAI et al., 2002). These
mechanisms are probably involved with the short-term beneficial effects of estradiol on
memory acquisition (LEVIN, 2005; WALF & FRYE, 2008). This rapid effect of the
hormone on memory can be achieved during a two-hour time window (LUINE et al.,
2003; PACKARD, 1998).
Many cellular and behavioral acute effects appear to require physiological
concentrations of estrogen higher than normal (CORNIL, 2009). Behavioral studies
have also revealed that rapid changes in estrogen bioavailability, resulting from a single
injection of a high dose of estradiol, modify the expression of some behaviors (sexual
behavior and pain threshold) within less than 1 hour. These data indicate that the action
of estrogen in the brain can occur in different time ranges (short to long-term), possibly
combining non-genomic and genomic actions (BALTHAZART et al., 2006).
In animal models, sexual hormones have shown to influence memory mainly
through neuronal pathways related to the hippocampus (MCEWEN, 2002). Particularly,
estrogen influences learning and memory evaluated in hippocampus-dependent tasks
(MCEWEN, 2002; ZEC & TRIVEDI, 2002). In addition, this effect is possibly
associated with increased acetylcholine release in the hippocampus (DUMAS et al.,
30
2006, 2008). Other investigations have suggested that a long-term deprivation of
estrogen decreases the functional status of the basal forebrain cholinergic projections to
the cortex and hippocampus (GIBBS, 1998). Further, both the activity of choline
acetyltransferase and the release of acetylcholine in the neocortex, hippocampus and
basal forebrain are enhanced by estrogen (GIBBS, 2000a; MARRIOTT & KOROL,
2003). Lastly, studies showed that estrogen increases the acetylcholine release
stimulated by potassium in the hippocampus (GIBBS et al., 1997) and potentiates the
effects of cholinergic agonists in avoidance tasks when administered directly into the
hippocampus (FARR et al., 2000). All these findings indicate that estrogen may mediate
memory processes through modulation of the cholinergic system.
It has been suggested that a previous impairment has to be present for the
estrogen’s beneficial effects to occur (GIBBS & AGGARWAL, 1998; TINKLER &
VOYTKO, 2005). In this respect, scopolamine (SCO) is a muscarinic receptor
antagonist that classically induces cognitive impairments in behavioral tests (SILVA et
al., 1999; WALLENSTEIN & VAGO, 2001). Wink and coworkers described that the
loss of cholinergic stimuli produced by the administration of SCO is comparable to the
one underlying the aging processes (WINK et al., 2006). Furthermore, the replacement
with estrogen in ovariectomized rats enhances memory acquisition and counteracts the
negative effects of SCO on working and spatial memory tasks (FADER et al., 1999;
GIBBS, 1999). In this respect, studies in animal models are usually conducted with
ovariectomized animals, and do not take into account the natural hormonal changes in
gonadally intact females (FRICK, 2009).
Estrogen has also been shown to influence fear and anxiety-related behaviors. For
example, endogenous changes in estrogen levels may increase women’s susceptibility to
anxiety disorders (WALF & FRYE, 2006). In this respect, the literature shows that
memory can be dependent on affective contents, such as anxiety level (SILVA &
FRUSSA-FILHO, 2000) and the emotional valence (negative or positive) of the events
(LABAR & CABEZA, 2006). Further, the neural circuit for emotional reinforcement
includes brain regions that are also related to memory formation, i.e. amygdala,
hippocampus and prefrontal cortex (LABAR & CABEZA, 2006; MATHEWS, 1990).
Thus, the hypothesis that estrogen can influence female rats performance in cognitive
tasks with emotional contexts by modulating anxiety-like behavior should be considered
(FRYE & WALF, 2004a).
31
The aim of the present study was to investigate the effects of physiological and
supra-physiological variations of estrogen levels on SCO-induced amnesia in gonadally
intact female rats. We used the plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT;
SILVA et al., 1999; SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000) in order to evaluate anxiety
levels and motor activity concomitantly to the learning and memory performances.
2. Methods
2.1.Animals
Three-month-old female Wistar rats (250-300g) were housed with free access to
food and water, in a number of 4 or 5, under controlled conditions of temperature (23-
24°C) and a 12 h light/12 h dark cycle (lights on 06:30 am). The rats were handled
according to the Brazilian law for the use of animals in scientific research (Law Number
11.794) and all procedures described were approved by the local ethical committee
(CEUA/UFRN nº 036/2010). Prior to the procedures all the animals were gently
handled for 10 min/day during 3 days.
2.2.Drugs
Scopolamine hidrobromide (SCO, Sigma, USA) was diluted in saline solution
and given i.p. at 1 mg/kg. This dose choice was based on previous studies showing
scopolamine-induced impairment in rodent memory models (BARBOSA et al., 2010;
CLARO et al., 2006), including in the task used here (CLARO et al., 1999; SILVA et
al., 1999). Estradiol valerate (EV, Sigma, USA) was dissolved with absolute ethanol
and sesame oil and left overnight for evaporation. Afterwards, the compound was
diluted to the correct concentration with sesame oil and given i.m. at 1 mg/kg. Estradiol
levels are considered supra-physiological at doses above 0.5 mg/ml in rodents
(CORNIL et al., 2006). Saline solution (SAL) (0.9% NaCl) or vehicle sesame oil (VEH)
in a volume of 1 ml/kg were administered to controls for SCO or EV treatments,
respectively.
2.3.Estrous Cycle
32
Before the beginning of the experiments, the estrous cycle was monitored by the
analysis of vaginal smears under a light microscopy for three complete cycles of 4-5
days. Vaginal secretions were collected by the gentle introduction of plastic pipettes
with distillated water in a volume of 0.1 ml. Only animals with regular cycling were
included in the experiments (approximately 95%). The four stages of estrous cycle were
determined according to the following characteristics: estrus (EST) - predominance of
cornified cells; proestrus (PRO) - predominance of epithelial nucleated cells; diestrus
(DIE) - predominance of leucocytes and metestrus (MET) - similar proportion of
nucleated cells, leucocytes and cornified cells (MARCONDES et al., 2001; POMPILI et
al., 2010).
2.4.Plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT)
The apparatus employed was a modified elevated plus-maze, made of wood,
containing two enclosed arms (50 × 15 × 40 cm), an aversive (AV) and a non-aversive
(NAV), opposite to two open arms (OA; 50 × 15 cm). The task consisted of two
sessions: training and testing, each lasting 10 minutes. In the training session, each rat
was placed in the center of the apparatus with body orientation toward the intersection
between the open arms. Every time the animal entered with the four paws into the
aversive enclosed arm, aversive stimuli were turned on until the animal left the arm. The
aversive stimuli were a 100-W light and an 80 dB noise produced by a lamp and
speakers placed over the aversive enclosed arm. In the test session, the animals were
again placed in the apparatus, but without presentation of the aversive stimulation (Fig.
1). All behavior experiments were performed between 1:00 and 5:00 p.m. The sessions
were recorded with a digital camera placed over the apparatus and the behavioral
quantification was performed by a video-tracking software (Anymaze®, Stoelting,
USA).
The percent time spent in aversive arm [%TAV = time in NAV/(time in NAV +
AV) x 100] was used to assess aversive memory (%TAV overall, when the entire
session was considered, and %TAV in time blocks, when the variable was analyzed
throughout the sessions). The whole sessions durations were divided into three blocks:
initial (from start to third minutes), middle (fourth to seventh minutes) and final (eighth
to tenth minutes) in order to evaluate learning in the training session, as well as retrieval
33
(first block) and extinction in the test session. Anxiety-like behavior was evaluated by
the percent time spent in open arms [%TOA = time in OA/(time in OA + NAV + AV) x
100] and motor activity was evaluated by total distance travelled (m) in the whole
apparatus in both sessions. The analysis of the habituation index [distance in training
session/distance in test session (TR/TE)] was used to evaluate the habituation to the
apparatus (nonassociative learning).
Figure 1. Schematic diagram of the behavioral task and experiments I, II and III. VEH, oil vehicle; SAL,
saline; SCO, scopolamine; EV, estradiol valerate; OA, open arms; AV, aversive enclosed arm; NAV,
non-aversive enclosed arm.
2.5.Experimental Procedure
A summary of the behavioral task and experimental procedure can be seen in Figure
1.
2.5.1. Experiment I: Influence of estrous cycle on the scopolamine-induced
memory deficit
Female rats in each phase of the estrous cycle (n = 9-13 per phase) received 1
mg/kg SCO or SAL (0.9% NaCl) 20 minutes before the training session in the PMDAT.
The test session was performed 24h later, without pharmacological treatment.
2.5.2. Experiment II: Effects of pre-training estrogen on the scopolamine-induced
memory deficit
34
In this experiment, all animals were in DIE phase. Forty-five minutes before the
training in the PMDAT, the animals received a pre-treatment with 1 mg/kg EV or VEH.
Twenty-five minutes later, the animals received the same treatment described in
experiment I. The experimental groups (n = 8-9) were: VEH/SAL, VEH/SCO, EV/SAL
and EV/SCO. The training was performed after 20 minutes, and the test session was
conducted 24h later.
2.5.3. Experiment III: Effects of posttraining estrogen on the scopolamine-induced
memory deficit
In experiment III, all animals were in DIE phase. Female rats received the same
treatment as describe in experiment I. Immediately after the training session, 1 mg/kg
EV or VEH were administered. The experimental groups (n = 7-8) were: SAL/VEH,
SCO/VEH, SAL/EV and SCO/EV. The test session was performed 24h later.
2.6.Determination of estradiol levels
Female rats were euthanized to assess bioavailability of estradiol at different time
points of the experimental protocol. All animals were in DIE phase. Control group
received treatment with VEH (n = 5) and experimental groups received treatment with 1
mg/kg EV. Blood samples were collected by decapitation in tubes containing EDTA
immediately (control group) and 45 minutes (n = 8), 6 hours (n = 8) or 24 hours (n = 9)
after the hormone injection (experimental group).
The samples were placed in tubes containing EDTA and centrifuged at 3000 rpm
for 10 minutes. Plasma was collected and stored at -20 °C until the assays. The
concentration of plasma estradiol was determined by double antibody
radioimmunoassay (RIA) using MP Biomedicals kits (Orangeburg, NY, EUA). The
lower limits of detection were 5.0 pg/ml. The intra-assay coefficients of variation were
4.3%. All samples were measured in duplicate and, when needed, at different
dilutions. To prevent inter-assay variation, all samples of the same experiment were
35
assayed in the same RIA. Data from estradiol concentration were adjusted by the
dilution factor and expressed in pg/ml.
2.7.Statistical analysis
All data were checked for normality using the Kolmogorov-Smirnov test.
Multivariate analyses of variance (two-way ANOVA) for the treatment x cycle phase
(experiment I), pre-treatment x treatment (experiment II) and post-treatment x treatment
(experiment III) were applied to %TAV, %TOA, as well as distance traveled in the
apparatus in each behavioral session. Moreover, one-way ANOVA was performed to
analyze estrogen levels at different time points after administration. Duncan’s post hoc
was run for group comparisons.
The %TAV throughout the sessions was compared by ANOVA with repeated
measures (three-way ANOVA) for time blocks x phase x treatment (experiment I), time
blocks x pre-treatment x treatment (experiments II) and time blocks x post-treatment x
treatment (experiment III). In experiment I, further analysis was performed using two-
way ANOVA (time blocks x treatment for each cycle phase). We used Bonferroni’s for
post hoc analysis.
Comparisons from habituation index were performed using Kruskal-Wallis one-
way analysis of variance, followed by Mann-Whitney's U-test. All results were
considered significant at p ≤ 0.05.
3. Results
3.1.Experiment I: Influence of estrous cycle on the scopolamine-induced memory
deficit
3.1.1. Learning and Memory
In the training session, two-way ANOVA for %TAV during the whole session did
not reveal treatment [F(1,78) = 1.72; p = 0.19], cycle phase [F(3,78) = 2.02; p = 0.11] or
interaction [F(3,78) = 0.54; p = 0.65] effects (Fig. 2A). Three-way ANOVA for %TAV
in time blocks showed a significant within-subject time effect [F(2,156) = 19.68; p <
0.001], no interaction effects and a marginally significant between-subject treatment
effect [F(1,78) = 3.39; p = 0.069]. Further, a two-way ANOVA for %TAV in time
36
blocks was performed to each cycle phase, revealing significant within-subject time
effects in: MET [F(2,38) = 21.39; p < 0.001], DIE [F(2,40) = 4.15; p = 0.023], PRO
[F(2,40) = 3.53; p = 0.038] and EST [F(2,38) = 3.41; p = 0.046]. Bonferroni’s post hoc
showed that %TAV was significantly decreased in the second or in the third blocks
when compared to the initial block for both treatments (SAL or SCO) in MET, PRO and
EST phases. An interaction between time and treatment [F(2,40) = 3.55; p = 0.038] was
detected only for the DIE phase, indicating a learning deficit induced by SCO treatment
in this cycle phase (Fig. 2C).
In the test session, two-way ANOVA for %TAV during the whole session revealed
a significant effect of treatment [F(1,78) = 20.53; p < 0.001]. Duncan’s post hoc showed
a significant increase in %TAV for SCO compared to SAL animals in MET, PRO and
EST phases, but not in DIE (Fig. 2B). When %TAV was analyzed in time blocks, three-
way ANOVA indicated significant within-subject time effect [F(2,156) = 3.06; p =
0.05], interaction (time block x phase x treatment) [F(6,156) = 2.16; p = 0.049] and a
between-subject treatment effect [F(1,78) = 14.59; p < 0.001]. Bonferroni’s post hoc
revealed a marginally significant increase in the third block compared to the initial
block between groups. The fact that no significant difference for treatment was found in
%TAV during the whole session in DIE is due to increased values of SAL animals in
this phase, which can be explained by the gradual increase of %TAV across blocks in
this group (Fig. 2D).
When the habituation index was analyzed, Kruskal-Wallis ANOVA detected a
significant phase effect [H(3) = 7.96; p = 0.047]. PRO/SAL animals showed increased
habituation compared to the MET/SAL (U = 17.5; p = 0.041; Table 1) and DIE/SAL (U
= 13.5; p = 0.017; Table 1) groups, but not to the EST/SAL group (U = 27.0; p = 0.228;
Table 1). Further, PRO/SAL habituation index was also increased compared to the
PRO/SCO group (U = 14.5; p = 0.003; Table 1).
37
Figure 2. Effects of saline (SAL) or 1 mg/kg scopolamine (SCO) treatment across estrous cycle phases
(MET: metestrus; DIE: diestrus; PRO: proestrus; EST: estrus) on learning and memory in the plus-maze
discriminative avoidance task. Mean ± SE for percent time spent in aversive enclosed arm (%TAV) overall (A, B) and in time blocks (C, D) in the training and test sessions. *p < 0.05 compared to SAL
(two-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc); °p < 0.05 compared to the first time block (repeated
measures ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc); #p < 0.05 compared to SAL (repeated measures
ANOVA).
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
MET DIE PRO EST
%TA
V o
vera
ll
Training Session SAL
SCOA
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
MET DIE PRO EST
%TA
V o
vera
ll
Test Session SAL
SCO
* * *
B
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
SAL SCO SAL SCO SAL SCO SAL SCO
MET DIE PRO EST
%TA
V (
tim
e b
lock
s)
Training Session Block 1
Block 2
Block 3
#
° °
° ° °
° ° ° °
C
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
SAL SCO SAL SCO SAL SCO SAL SCO
MET DIE PRO EST
%TA
V (
tim
e b
lock
s)
Test Session Block 1
Block 2
Block 3
# #
# #
D
38
3.1.2. Anxiety-like behavior and locomotion
A significant treatment effect for %TOA was revealed by two-way ANOVA in the
training session [F(1,78) = 5.31; p = 0.024], indicating an increase of open arm
exploration by SCO animals in all cycle phases. However, Duncan’s post hoc did not
detect differences between groups (Table 2). A marginally treatment effect was pointed
out in the test session by two-way ANOVA [F(1,78) = 3.76; p = 0.056].
The analysis of distance traveled by two-way ANOVA displayed significant
treatment effect in the training session [F(1,78) = 7.93; p = 0.006]. Duncan’s post hoc
show increase in motor activity of SCO animals compared to SAL in MET and PRO
phases (Table 2). A significant estrous cycle phase effect was detected for distance
traveled in the test session [F(3,78) = 5.58; p = 0.002]. Duncan’s post hoc
showed that locomotion is higher in DIE than all other phases (Table 2).
3.2.Experiment II: Effects of pre-training estrogen effects on scopolamine-induced
memory deficit
3.2.1. Learning and Memory
Two-way ANOVA for %TAV during the whole training session revealed a
significant effect of treatment [F(1,30) = 10.54; p = 0.003]. Duncan’s post hoc showed
that %TAV was increased in VEH/SCO compared to VEH/SAL animals, while the
EV/SCO group did not differ from controls (Fig. 3A). The analyses for %TAV in time
blocks were in accordance to the analysis for the whole session (data not shown).
In the test session, two-way ANOVA detected a significant effect of treatment
[F(1,30) = 5.56; p = 0.025] in %TAV during the whole session, indicating that the
effects of SCO on retrieval occurs regardless pretreatment. Duncan’s post hoc did not
detect differences between groups for this parameter (Fig. 3B), which was corroborated
by the analyses of %TAV in time blocks (data not shown).
Kruskal-Wallis ANOVA did not show significant effects [H(3) = 1.82, p = 0.60]
for the habituation index (Table 1).
39
Figure 3. Effects of the pre-treatment with oil vehicle (VEH) or 1 mg/kg estradiol valerate (EV) and
treatment with saline (SAL) or 1 mg/kg scopolamine (SCO) on learning and memory in the plus-maze
discriminative avoidance task. Mean ± SE for percent time spent in aversive enclosed arm (%TAV)
overall in the training (A) and test (B) sessions. *p < 0.05 compared to VEH/SAL (two-way ANOVA
followed by Duncan’s post hoc).
3.2.2. Anxiety-like behavior and locomotion
Two-way ANOVA revealed a significant effect of treatment for %TOA in both
training [F(1,30) = 17.13; p < 0.001] and test sessions [F(1,30) = 4.99; p = 0.033].
Additionally, in the training session, Duncan’s post hoc showed significant increase in
%TOA for VEH/SCO and EV/SCO groups compared to VEH/SAL and EV/SAL,
respectively (Table 2).
The analysis of distance traveled by two-way ANOVA revealed significant effect
of treatment in the training [F(1,30) = 7.36; p = 0.011] and test [F(1,30) = 14.47; p =
0.001] sessions. Duncan’s post hoc showed increase in motor activity of VEH/SCO and
EV/SCO animals compared to VEH/SAL and EV/SAL, respectively, in the test session
(Table 2).
3.3.Experiment III: Effects of posttraining estrogen effects on scopolamine-induced
memory deficits
3.3.1. Learning and Memory
In the training session, a significant effect of treatment [F(1,26) = 12.85; p =
0.001] was detected for %TAV during the whole session by two-way ANOVA.
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0%
TAV
ove
rall
Training Session VEH/SALVEH/SCOEV/SALEV/SCO
*
A
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
%TA
V o
vera
ll
Test Session VEH/SALVEH/SCOEV/SALEV/SCO
B
40
Duncan’s post hoc showed that %TAV was increased in SCO/VEH and SCO/EV
compared to SAL/VEH and SAL/EV groups, respectively (Fig. 4A), which
corroborated the analyses of time blocks (data not shown).
Two-way ANOVA showed significant effects of treatment [F(1,26) = 21.01; p <
0.001] and post-treatment [F(1,26) = 5.30; p = 0.029] for %TAV during the whole test
session. Duncan’s post hoc revealed that SCO/VEH presented increased %TAV
compared to SAL/VEH and SAL/EV. Also, SCO/EV showed increased %TAV
compared to all other groups, suggesting that animals post-treated with EV presented
impaired performance (Fig. 4B). These effects were also found when %TAV was
analyzed in time blocks (data not shown).
The analysis of habituation index by Kruskal-Wallis ANOVA did not show
significant differences between groups [H(3) = 5.55; p = 0.135; Table 1].
Figure 4. Effects of the treatment with saline (SAL) or 1 mg/kg scopolamine (SCO) and posttraining
treatment with oil vehicle (VEH) or 1 mg/kg estradiol valerate (EV) on learning and memory in the plus-
maze discriminative avoidance task. Mean ± SE for percent time spent in aversive enclosed arm (%TAV)
overall in the training (A) and test (B) sessions. p < 0.05 *compared to SAL/VEH and SAL/EV and
**compared to all other groups (two-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc).
3.3.2. Anxiety-like behavior and locomotion
A significant effect of treatment was detected for %TOA by two-way ANOVA in
the training [F(1,26) = 29.82; p < 0.001] but not in the test session [F(1,26) = 3.29; p =
0.081], corroborating the increase of open arm exploration induced by SCO showed in
the other experiments. Duncan’s post hoc showed significant increase in %TOA for
SCO/VEH and SCO/EV compared to the SAL/VEH and SAL/EV groups, respectively
(Table 2).
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
%TA
V o
vera
ll
Training Session SAL/VEHSCO/VEHSAL/EVSCO/EV
* *
A
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
%
TAV
ove
rall
Test Session SAL/VEHSCO/VEHSAL/EVSCO/EV
*
**
B
41
Two-way ANOVA for distance traveled revealed a significant effect of treatment
in the training [F(1,26) = 9.83; p = 0.004] and test [F(1,26) = 8.52; p = 0.007] sessions.
Duncan’s post hoc showed increase in motor activity of SCO/VEH and SCO/EV
animals compared to SAL/VEH in both sessions (Table 2).
3.4.Estradiol levels
One-way ANOVA detected a between-subject effect [F(3,29) = 10.05; p <
0.001] to the estradiol levels at different time ranges. Duncan’s post hoc showed an
increase of the estradiol concentration after 45 minutes, which remained for 24 hours,
with a peak after 6 hours, compared to control group in DIE phase (Fig. 5).
Figure 5. Estradiol concentration at different time ranges in plasma after injection of 1mg/kg estradiol
valerate (EV). Mean ± SE for estradiol concentration adjusted by dilution factor (1:10). p < 0.001 *compared to control group in DIE phase and **compared to all other groups (one-way ANOVA
followed by Duncan’s post hoc).
0
1000
2000
3000
4000
5000
Control 45 min 6 hs 24 hs
[Est
rad
iol]
pg/
ml
Estradiol levels
* *
**
42
Table 1. Effects of estrous cycle, treatment with SCO (1 mg/kg), pre- and post-treatment with EV (1
mg/kg) in plus-maze discriminative avoidance task. Median (minimum; maximum values) for habituation
index (distance in training/distance in test sessions – TR/TE). *p < 0.05 compared to MET/SAL (U =
17.5; p = 0.041) and DIE/SAL (U = 13.5; p = 0.017) groups (Kruskal-Wallis ANOVA followed by Mann-
Whitney’s U-test); #p < 0.05 compared to PRO/SCO group (U = 14.5; p = 0.003; Mann-Whitney’s U-
test).
Experiments Habituation Index
I. Estrous Cycle
MET-SAL 1.0 (0.7;1.4)
MET-SCO 1.25 (0.6;3.3) DIE-SAL 0.7 (0.2;2.0)
DIE-SCO 0.9 (0.2;2.6) PRO-SAL 1.5 (0.8;10.8)*# PRO-SCO 1.0 (0.4;1.1) EST-SAL 1.0 (0.8;11.3) EST-SCO 0.9 (0.4;10.2)
II. Pre-training
VEH-SAL 1.0 (0.7;2.0)
VEH-SCO 1.0 (0.3;1.8) EV-SAL 1.2 (0.4;8.6)
EV-SCO 1.1 (0.6;1.7)
III. Posttraining
SAL-VEH 3.3 (1.2;4.3)
SCO-VEH 1.8 (1.0;6.2)
SAL-EV 2.05 (1.1;3.9)
SCO-EV 1.45 (0.5;1.8)
43
Experiments %TOA Distance (m)
I. Estrous Cycle
Training Session
MET-SAL 8.0 ± 2.1 16.2 ± 2.4 MET-SCO 30.3 ± 8.9 26.3 ± 2.5* DIE-SAL 8.9 ± 1.8 20.6 ± 2.0 DIE-SCO 30.6 ± 10.1 24.0 ± 3.9 PRO-SAL 12.9 ± 5.4 14.7 ± 1.9 PRO-SCO 16.0 ± 6.6 18.8 ± 1.7*
EST-SAL 16.7 ± 4.1 16.9 ± 2.9 EST-SCO 18.5 ± 8.2 21.5 ± 2.8
Test Session
MET-SAL 17.2 ± 9.2 15.1 ± 1.9 MET-SCO 6.6 ± 1.6 23.1 ± 3.2 DIE-SAL 9.6 ± 2.0 32.9 ± 6.8# DIE-SCO 12.6 ± 2.1 26.5 ± 4.5# PRO-SAL 9.7 ± 4.8 10.2 ± 1.9 PRO-SCO 9.4 ± 2.4 22.6 ± 1.8
EST-SAL 20.1 ± 7.2 15.4 ± 3.4 EST-SCO 5.4 ± 1.4 21.4 ± 2.6
II. Pre-training
Training Session
VEH-SAL 14.8 ± 3.1 18.8 ± 1.9 VEH-SCO 59.1 ± 0.9* 26.5 ± 4.9
EV-SAL 22.5 ± 6.8 18.0 ± 2.2 EV-SCO 48.2 ± 0.7* 28.0 ± 3.4
Test Session VEH-SAL 19.5 ± 5.0 18.9 ± 2.8 VEH-SCO 28.4 ± 8.1 27.7 ± 1.7* EV-SAL 15.7 ± 5.2 13.3 ± 3.3 EV-SCO 27.9 ± 6.3 24.8 ± 1.5*
III. Posttraining
Training Session
SAL-VEH 5.6 ± 2.4 10.9 ± 2.4
SCO-VEH 71.3 ± 1.1* 30.8 ± 5.0* SAL-EV 16.6 ± 5.2 19.1 ± 2.2 SCO-EV 51.6 ± 2.1* 25.5 ± 5.4*
Test Session
SAL-VEH 2.4 ± 1.0 5.2 ± 2.0 SCO-VEH 12.4 ± 5.0 17.0 ± 3.8* SAL-EV 8.1 ± 4.3 11.5 ± 3.0
SCO-EV 12.4 ± 3.8 18.3 ± 3.3*
Table 2. Effects of estrous cycle, treatment with SCO (1 mg/kg), pre- and post-treatment with EV (1
mg/kg) in plus-maze discriminative avoidance task. Mean ± SE for percent time spent in open arms
(%TOA) and distance travelled in both training and test sessions. *p < 0.05 compared to SAL control
groups (two-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc); #p < 0.05 compared to other phases (two-way
ANOVA and Duncan’s post hoc).
44
Scopolamine (1 mg/kg)
Experiments Learning Memory Anxiety Activity
I. Estrous Cycle
MET↑
DIE↓
PRO↑
EST↑
MET↓
DIE↓
PRO↓
EST↓
MET↓
DIE↓
PRO↓
EST↓
MET↑
DIE↑
PRO↑
EST↑
II. Pré-training EV DIE↑ DIE↓ DIE↓ DIE↑
III. Posttraining EV DIE↓ DIE↓↓ DIE↓ DIE↑
Table 3. Overview of the estrous cycle stages (MET: metestrus; DIE: diestrus; PRO: proestrus; EST:
estrus) and estradiol valerate (EV; 1mg/kg) effects on scopolamine-induced amnesia, anxiolytic and
stimulant motor actions in the plus-maze discriminative avoidance task. Arrows represent increase (↑) or
decrease (↓) in each behavioral parameter.
4. Discussion
Our results showed that the treatment with SCO impaired retrieval, which
corroborates the well-known amnestic effect of this substance. Indeed, in the test
session, animals at different stages of the estrous cycle failed to avoid the aversive
enclosed arm. Treatment with SCO also impaired acquisition, but only in animals
in DIE phase. In addition, SCO induced anxiolytic effects and increased motor activity.
Finally, EV pre-training prevented the SCO-induced acquisition impairment in DIE
phase, whereas posttraining EV potentiated the SCO-induced anterograde amnesia. An
overview of the results is displayed in Table 3.
In the present study, learning of the task in the different phases of the cycle in
females was investigated by the analysis of %TAV in time blocks along the training
session. Saline groups in all cycle phases learned the task by showing a decrease of
%TAV throughout the session. SCO did not provoke deficits in the task acquisition in
MET, PRO and EST animals, but this impairment was observed in DIE animals (figure
2C). It should be noted that DIE is a phase with low estrogen levels (BECKER et al.,
2005; MARCONDES et al., 2001). In line with our results, Wallenstein & Vago (2001)
showed that the acquisition and consolidation of contextual fear conditioning was
impaired by intrahippocampal administration of SCO in female rats. However, in that
study, the estrous cycle was not analyzed. When the estrous cycle is taken into account
in different types of tasks, fluctuating endogenous levels of estrogen (KOROL et al.
45
2004) or sex (SCHMIDT et al., 2009) can influence learning by modulating the choice
or shift of strategy during acquisition of the task.
Previous studies have shown an effect of estrous cycle per se on memory
performance (FRICK & BERGER-SWEENEY, 2001; KOROL et al. 2004; MILAD et
al., 2009). However, this is not unequivocal because there are also some studies
indicating lack of differences in the performance across the cycle (FRYE 1995; HEALY
et al., 1999; WARREN & JURASKA, 1997). Although in our study we did not observe
a general significant effect of estrous cycle, differences between stages do appear when
the stages are compared separately, as discussed above. Further, the analysis of the
habituation index showed better habituation of the control animals in the proestrus
phase, i.e. a faster response to the contextual recognition of the apparatus (Table 1).
This result could be related to the estrogen peak typical of this phase during the
acquisition of the task. It should be considered that the hormone levels would modulate
aspects of learning and memory related to hippocampus-dependent or independent tasks
(habit memory, stimulus-response, spatial and working memory, attention levels). Thus,
these effects could involve various structures (hippocampus, dorsal striatum and
amygdala) and convey the value of multiple memory systems that could be involved in
the behavioral changes observed (see PACKARD & GOODMAN, 2012 for review).
Regarding the effects of SCO, previous studies using this paradigm did not
evaluate learning across the training session (CLARO et al., 1999; SILVA et al., 1999).
However, some studies with other behavioral tasks suggested that SCO affects more
specifically attention than learning and memory (MIRZA & STOLERMAN, 2000;
SARTER et al., 2003). In addition, most researches assessed the impairment induced by
this drug especially on working and short-term memories (BURESOVÁ & BURES,
1982; STEVENS, 1981). Hence, the impaired acquisition promoted by the cholinergic
antagonist could be a result of its effects on attention, working memory, or short-term
memory, all aspects of the learning process. Conversely, at the same dose range which
was used here, SCO did not impair the acquisition in spatial and contextual tasks
(DECKER et al., 1990). However, it is important to point out that all these previous
studies used male rats. Further, the action of SCO is probably dependent on the type of
task used, the time of injection, training experience, dose ranges and sex.
In the test session of the first experiment, SCO increased %TAV when compared
to saline-treated animals, indicating amnestic effects. In agreement with our data,
46
previous studies using male rodents in this task showed that SCO also induced amnesia
(SILVA et al., 1999). Although a general treatment effect was revealed (regardless the
stage of estrous cycle), the difference between treatments was not shown for rats in DIE
when %TAV overall was analyzed (see figure 2B). This would raise the possibility that
SCO was not effective in inducing amnesia during this cycle stage. However, while all
SCO-treated groups seem to show the same amount of aversive arm exploration, saline-
treated rats in DIE show higher %TAV than rats in other phases. When the %TAV was
analyzed in time blocks throughout the test session (figure 2D), a progressive increase
in aversive arm exploration was shown by DIE animals. This suggests that these
animals retrieved the task (low levels of exploration in the first block), but presented
memory extinction across the session. Conversely, SCO-treated animals in DIE show
high levels of aversive arm exploration from the beginning of the session onwards,
which corroborates the presence of the amnestic effect of SCO in the other cycle phases.
In a recent study, in which estrous cycle was not considered, we observed that
females present lower extinction in the PMDAT when compared to males (RIBEIRO et
al., 2010). As shown by Milad et al. (2009), the extinction of an aversive task by female
rats seems to depend on the estrous cycle phase in which the subject is being tested. In
the present work, DIE females have shown extinction of the task, unlike the rats in the
other phases. This suggests that the lack of extinction by this gender (observed in the
study of Ribeiro et al., 2010) is related to the hormonal status.
In the second experiment, the impairing effect of SCO on acquisition was shown
again. All groups (except VEH/SCO) avoided the aversive arm in the training session
(figure 3A), indicating that the acute administration of EV was able to prevent the SCO-
induced impaired acquisition in animals with lower endogenous hormone levels. Gibbs
and coworkers (1998) made a point of the ability for estrogen to attenuate the effect of
SCO only when the analysis was limited to animals with serum levels of estradiol less
than 200 pg/ml, whereas higher levels of estradiol were ineffective. This is not what
was seen in our study, in which estrogen levels reached ten times that amount (i.e. 2000
pg/ml, see figure 5). Nevertheless, these results are in line with the hypothesis that there
is a relationship between cholinergic transmission, estrogen and mnemonic system.
Some studies have addressed the importance of both endogenous (GIBBS, 1996b) and
exogenous (FADER et al., 1999) estrogen-cholinergic interaction. Most of them focused
on spatial tasks, and showed that this hormone is able to prevent SCO-induced deficits,
47
including those on the acquisition (GIBBS, 1999). Other studies have mentioned this
interaction in areas related to emotion, such as the amygdala (LUINE et al., 1975).
Previous studies from our lab demonstrated that the performance of animals in this task
can be influenced by pharmacological manipulations in the amygdala (MUNGUBA et
al., 2011; RIBEIRO et al., 2011), which corroborate a possible role of this area in the
effects described here.
The learning impairment induced by SCO occurred once again in the training
session of the third experiment (figure 4A). In the test session, an effect of posttraining
treatment with EV was detected, indicating that there was an increase in %TAV (figure
4B), mainly in the EV/SCO group. In contrast to what was found in experiment II, in
which estrogen precluded the deleterious action of the SCO on the acquisition,
posttraning treatment with estrogen potentiated the retrieval deficit caused by SCO.
This result is probably the outcome of hormonal influence during memory
consolidation. It has been demonstrated that estradiol influences the memory storage in
a time-dependent manner and that the memory enhancing effect of peripheral
posttraining injection of estradiol in ovariectomized rats is blocked by SCO
(PACKARD, 1998).
Regarding the possible mechanisms involved in the results showed here,
Hasselmo (2006) presented the role of acetylcholine in learning and memory on a
cortical dynamics perspective. In his model, during memory codification (learning),
high levels of acetylcholine would be necessary in order to (1) enhance the magnitude
of afferent input to cortex through the action at nicotinic receptors and (2)
concomitantly suppress the magnitude of feedback excitation (through glutamate
release) in the cortex via presynaptic inhibition by muscarinic receptors (which would
prevent the interference by retrieval of previous events). Conversely, during memory
consolidation, low acetylcholine levels would result in a weaker influence of afferent
inputs relative to the strength of excitatory feedback, which allows a longer lasting
memory. Considering this hypothesis and the fact that estrogen is able to increase
acetylcholine release and choline acetyltransferase activity in the neocortex (GIBBS,
2000a; MARRIOTT & KOROL, 2003), the high levels of acetylcholine during learning
could offset the negative action of SCO, while this increase during consolidation would
surpass the amnestic effect of the drug.
48
From another standpoint, the WHI (Women’s Health Initiative) showed an
increased risk of stroke and dementia in women on hormone therapy and predicted that
estrogen treatment would not be capable of preventing cognitive impairment in elderly
patients. Thus, it is important to consider the possibility that administration of estrogen
may have a negative impact on the brain (AZCOITIA et al., 2011; SHUMAKER et al.,
2003). As mentioned above, the dose of estradiol is a critical factor for the direction of
their effects on behavior. Indeed, high doses (as used in the present study) can impair
performance on various tasks that assess learning and memory (BARHA et al., 2010;
GALEA et al., 2001; HOLMES et al., 2002). Besides a possible role of the interaction
with the cholinergic system (discussed above), recent studies bring out the role of nitric
oxide (NO) system (SADEGHIAN et al., 2012) and brain tissue oxidative damage
(KHODABANDEHLOO et al., 2013) in the involvement of the memory deficits caused
by high doses of EV.
The variation of the effects of estrogen on cognitive function could be related to
the mechanism of action. Studies showed that EV is able to up-regulate ERβ and does
not affect ERα expression in the hippocampus and cortex (JIN et al., 2005). In another
study, ERα and the muscarinic acetylcholine receptors were up-regulated in the
hippocampus after ovariectomized animals compared to rats in proestrus. This effect
was abolished when estradiol was chronically replaced immediately after the
ovariectomy (CARDOSO et al., 2004; CARDOSO et al., 2010). In this sense, ERα
knockout mice were less vulnerable to the negative effects of a large dose of estradiol.
Thus, it is suggested that in wild type females the damage triggered by high hormone
levels would be mediated via this receptor (RISSMAN, 2008).
There is evidence that high concentrations of estrogen are presumably produced in
the brain by local aromatase activity (see Cornil et al., 2006 for review). Based on the
fact that exogenous high doses would mimic the natural situation in the target brain
areas during behavioral studies, Cornil et al. (2006) proposed that supra-physiological
circulating concentrations would be necessary to assess the rapid effects of steroid
hormones. Thus, to analyze hormone bioavaibility, we measured estradiol levels at
different time points after injections (figure 5). The concentrations reached are
equivalent to 5.61 (45 minutes and 24 hours) and 11.22 nM (6 hours), based on the
molecular weight of EV (MW = 356.5). These concentrations are required to induce
effective activation of several non-genomic signaling pathways. Hovewer, as some
49
genomic effects can be initiated within 30 minutes, it is not possible to determine the
mode of action of the effects observed (CORNIL et al., 2006).
Concerning anxiety-like behavior, although %TOA was increased by the
administration of SCO (Table 2), estrogen administration did not modify this anxiolytic
effect. This suggests that the modulation of cholinergic function by this hormone is
specific to learning (Exp. II) and memory (Exp. III) processes. It is known that changes
in the endogenous and exogenous levels of both estrogen and progesterone can alter
anxiety behavior in rodents (BECKER et al., 2005; FRYE et al., 2000; MARCONDES
et al., 2001; MARVAN et al., 1996; MORA et al., 1996; POMPILI et al., 2010).
Further, Aguiar et al. (2006) observed a decrease of anxiety in adult female rats treated
with EV. In the case of the present study, although no significant differences between
the estrous cycle phases were observed (Table 2), a gradual increase in %TOA during
training session can be observed in the phases with higher hormone levels (i.e. proestrus
and estrus).
As far as the effects of SCO per se on anxiety are concerned, a reproducible
anxiolytic effect was observed across experiments. In this respect, while few studies
have also reported that SCO has anxiolytic activity (DE-MELLO & CAROBREZ,
2002), others have suggested anxiogenic effects (HUGHES et al., 2004; SMYTHE et
al., 1996; ZARRINDAST et al., 2011). On the other hand, it has been also reported that
SCO affects visual and auditory discrimination as well as interferes with the sensory
processing (KLINKENBERG & BLOKLAND, 2010). A research addressed this
question using light/dark preference in the elevated plus-maze (DE ARAUJO
GODINHO et al., 2007). The results showed that the effects on anxiety may be
confused for visual discrimination deficits caused by the muscarinic antagonist,
establishing false positives. Thus, it is still controversial if cholinergic transmission
effectively participates in the reduction of anxiety-related behaviors. In addition, most
experiments (except the one from HUGHES et al., 2004) were conducted using males
and do not bring the matter of hormonal influence on such behavior (TOUFEXIS et al.,
2006). To our knowledge, we report for the first time that SCO promotes an anxiolytic
effect in female rats. In a human study comparing genders, women presented larger
antianxiety and antidepressant response following SCO treatment than men. The authors
proposed that the interaction among cholinergic, glutamatergic transmissions and
estrogen could be involved in the regulation of this response (FUREY et al., 2010). In
50
our study, the anxiolytic effect of SCO appeared more prominent (although not
significantly different) in the metestrus and diestrus (see Table 2), suggesting a possible
interaction of the SCO with the hormonal status.
Another general consequence of SCO treatment was the increase in motor
activity, evaluated by the distance travelled (Table 2). Overall, SCO has been shown to
increase motor activity in several studies (RENFRO et al., 1972; SIPOS et al., 1999).
Some brain areas such as the hippocampus, striatum, prefrontal cortex (DAY et al.,
1991) and amygdala (NOMURA et al., 1994) appear to be correlated with the motor
enhancement produced by cholinergic blockage. In contrast, experiments using working
memory tasks have reported no effect, or even decreased motor activity (ANISMAN &
KOKKINIDIS, 1975; FEIGLEY, 1974). Again, the function of SCO on exploratory
behavior seems to depend on experimental factors (type of task, drug dose, injection
time etc.).
In addition, we found an effect of estrous cycle phases on the motor activity. Rats
in DIE phase explored more the apparatus during the test session, regardless of
treatment. A possible explanation would be that the animals did not habituate to the
apparatus (displayed by a lowest habituation index, see Table 1), lacking a natural
reduction of exploratory drive in a known environment.
Regarding a methodological issue, it is relevant to verify if non-specific
alterations (in anxiety levels or motor behavior, for example) are interfering with
measurements related to learning and memory shown in the present study. In this sense,
we have not found any statistical correlations between the parameters that measure
different behaviors (data not shown), which suggests dissociation of memory outcomes
and other non-specific effects. However, the interpretation of these effects as one-
dimensional is not unequivocal. As recent reviewed by KLINKENBERG &
BLOKLAND (2010), SCO is a well-known amnestic drug producing cognitive
impairments in several behavior tasks. However, the cognitive-behavioral effect of
systemic administration of this muscarinic antagonist is not very selective and may not
result from a specific effect on learning and memory processes. Thus, it is likely that
effects on learning and memory performance which are observed after higher doses are
mediated by (1) primary effects on attention and sensory/stimulus discrimination, (2)
non-specific effects on behavior (e.g., motor activity, anxiety), and (3) peripheral side-
effects (e.g., pupil dilation, salivation). Nevertheless, in the present study, neither the
51
anxiolytic effect nor the motor increase induced by SCO were modified by estrogen
administration, suggesting that the modulation of cholinergic function by this hormone
was specific to learning (Exp. II) and memory (Exp. III) processes. Further, the
possibility of confounding effects compromising the interpretation of memory
investigations highlights the relevance of the use of the plus-maze discriminative
avoidance task to concomitantly dissociate cognitive and non-cognitive aspects of
several pharmacological manipulations (CARVALHO et al., 2006; KAMEDA et al.,
2007; MELO et al., 2012; NIIGAKI et al., 2010).
5. Conclusion
The results suggest endogenous variations in estrogen levels across the estrous
cycle modulate aspects of cognitive function mediated by the cholinergic system.
Indeed, SCO induced acquisition impairment specifically in DIE, a stage with low
estrogen levels, and this impairment was counteracted by previous exogenous
administration of the hormone. Moreover, the posttraining treatment with estrogen
potentiated the memory impairment induced by the cholinergic antagonist. We suggest
different time courses and balance between non-genomic and genomic actions influence
the regulation and functioning of cholinergic system during the stages of memory.
Nevertheless, there is evidence of the interaction between estradiol and other
neurotransmitter systems, and a participation of these systems in the results reported
here cannot be ruled out.
6. Conflict of Interest
There is no conflict of interest in this research.
7. Acknowledgments
The authors would like to thank Luiz Eduardo Mateus Brandão e Diana Aline
Nôga Morais Ferreira for indispensable aid in sample collection. We are very grateful to
Dr. Janete Aparecida Anselmo Franci to allow imunoassay procedures and Dr. Maria
Bernardete Cordeiro de Sousa for continuous encouragements. This research was
supported by fellowships from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
52
Tecnológico (CNPQ); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES); Pró-reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(PROPESQ/UFRN) and Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do
Norte (FAPERN).
8. References
Aguiar R.B., Dickel O.E., Cunha R.W., Monserrat J.M., Barros D.M., Martinez P.E., 2006. Estradiol valerate and tibolone: effects
on memory. Pharmacol Biochem Behav. 85, 689–96.
Anisman H., Kokkinidis L., 1975. Effects of scopolamine, d-amphetamine and other drugs affecting catecholamines on spontaneous
alternation and locomotor activity in mice. Psychopharmacologia. 45, 55–63.
Azcoitia I., Arevalo M.A., Nicola A.F., Garcia-Segura L.M., 2011. Neuroprotective actions of estradiol revisited. Trends in
Endocrinology and Metabolism. 22(12), 467-473.
Balthazart J., Cornil C.A., Taziaux M., Charlier T.D., Baillien M., Ball G.F., 2006. Rapid changes in production and behavioral
action of estrogens. Neuroscience. 138, 783–791.
Barbosa F.F., Pontes I.M., Ribeiro A.M., Silva R.H., 2010. Extending possible applications of an episodic-like memory task in rats.
Behav Brain Res. 215(2), 326-331.
Barha C.K., Dalton G.L., Galea, L.A., 2010. Low doses of 17a-Estradiol and 17b-Estradiol facilitate, whereas higher doses of
estrone and 17a- and 17b-Estradiol impair contextual fear conditioning in adult female rats. Neuropsychopharmacology. 35, 547–
559.
Becker J.B., Arnold A.P., Berkley K.J., Blaustein J.D., Eckel L.A., Hampson E., Herman J.P., Marts S., Sadee W., Steiner M.,
Taylor J., Young E., 2005. Strategies and Methods for Research on Sex Differences in Brain and Behavior. Endocrinology. 146,
1650–1673.
Buresová O., Bures J., 1982. Radial maze as a tool for assessing the effect of drugs on the working memory of rats.
Psychopharmacology. 77, 268–271.
Cardoso C.C., Pereira R.T.S., Koyama C.A., Porto C.S., Abdalla F.M.F., 2004. Effect of estrogen on muscarinic acetylcholine
receptors in rat hippocampus. Neuroendocrinology. 80, 379–386.
Cardoso C.C., Ricardo V.P., Frussa-Filho R., Porto C.S., Abdalla F.M.F., 2010. Effects of 17β-estradiol on expression of muscarinic
acetylcholine receptor subtypes and estrogen receptor α in rat hippocampus. European Journal of Pharmacology. 634, 192–200.
Carvalho R.C., Patti C.C., Takatsu-Coleman A.L., Kameda S.R., Souza C.F., Garcez-do-Carmo L., Abílio V.C., Frussa-Filho R.,
Silva R.H., 2006. Effects of reserpine on the plus-maze discriminative avoidance task: dissociation between memory and motor
impairments. Brain Res. 29; 1122(1): 179-83.
Cholerton B., Gleason C.E., Baker L.D., Asthana S., 2002. Estrogen and Alzheimer’s disease. Drugs Aging. 19(6), 405-427.
Claro F.T., Silva R.H., Frussa-Filho R., 1999. Bovine brain phosphatidylserine attenuates scopolamine-induced amnesia. Physiol
Behav. 67(4), 551-4.
Claro F.T., Patti C.L., Abílio V.C., Frussa-Filho R., Silva R.H., 2006. Bovine brain phosphatidylserine attenuates scopolamine
induced amnesia in mice. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 30(5), 881-6.
Contreras C.M., Molina M., Saavedra M., Martinez-Mota L., 2000. Lateral septal neuronal firing rate increases during proestrus-
estrus in the rat. Physiol Behav. 68, 279–284.
Cornil C.A., Balla G.F., Balthazart J., 2006. Functional significance of the rapid regulation of brain estrogen action: Where do the
estrogens come from? Brain Research. 1126, 2–26.
Cornil C.A., 2009. Rapid regulation of brain oestrogen synthesis: the behavioural roles of oestrogens and their fates. Journal of
Neuroendocrinology. 21, 217–226.
Day J., Damsma G., Fibiger H.C., 1991. Cholinergic activity in the rat hippocampus, cortex and striatum correlates with locomotor
activity: an in vivo microdialysis study. Pharm, Biochem and Behav. 38, 723–729.
de Araújo Godinho M.A., Meneghini L., Lucinda A.M., Borges F.R., Sakae D.Y., Marino Neto J., Paschoalini M.A., de Lima
T.C., Faria M.S., 2007. An approach to evaluate the ability of rats to discriminate different levels of illumination in the plus-
maze test: effects of scopolamine. Behav Brain Res. 180(1), 86-94.
Decker M.W., Gill T.M., McGaugh J.L., 1990. Concurrent muscarinic and beta-adrenergic blockade in rats impairs place-learning in
a water maze and retention of inhibitory avoidance. Brain Research. 513, 81–85.
De-Mello N., Carobrez A.P., 2002. Elevated T-maze as an animal model of memory: effects of scopolamine. Behav Pharmacol. 13,
139–48.
Dumas J.A., Hancur-Bucci C., Naylor M., Sites C., Newhouse P.A., 2008. Estradiol Interacts with the Cholinergic System to Affect
Verbal Memory in Postmenopausal Women: Evidence for the Critical Period Hypothesis. Horm Behav. 53(1), 159–169.
Dumas J.A., Hancur-Bucci C., Naylor M., Sites C., Newhouse P.A., 2006. Estrogen treatment effects on anticholinergic-induced
cognitive dysfunction in normal post-menopausal women. Neuropsychopharmacology. 31, 2065–2078.
Fader A.J., Johnson P.E.M., Dohanich G.P., 1999. Estrogen improves working but not reference memory and prevents amnestic
effects of scopolamine on a radial-arm maze. Pharm, Biochem and Behav. 62, 711–717.
Farr S.A., Banks W.A., Morley J.E., 2000. Estradiol potentiates acetylcholine and glutamate-mediated post-trial memory processing
in the hippocampus. Brain Research. 864, 263-269.
Feigley D.A., 1974. Effects of scopolamine on activity and passive avoidance learning in rats of different ages. J of Comparat
Physiol Psychol. 87, 26–36.
Fitzpatrick J.L., Mize A.L., Wade C.B., Harris J.A., Shapiro R.A., Dorsa D.M., 2002. Estrogen-mediated neuroprotection against β-
amyloid toxicity requires expression of estrogen receptor α or β and activation of the MAPK pathway. J Neurochem. 82, 674–682.
Frick K.M., Berger-Sweeney J., 2001. Spatial reference memory and neocortical neurochemistry vary with the estrous cycle in
C57BL/6 mice. Behav Neurosci. 115:229–37.
Frick K.M., 2009. Estrogens and age-related memory decline in rodents: what have we learned and where do we go from here?
Horm Behav. 55, 2–23.
53
Frye C.A., Petralia S.M., Rhodes M.E., 2000. Estrous cycle and sex differences in performance on anxiety tasks coincide with
increases in hippocampal progesterone and 3a,5a-THP. Pharmacol Biochem Behav 2000. 67, 587–596.
Frye C.A., Walf A.A., 2004a. Estrogen and/or progesterone systemically or to the amygdala can have anxiety, fear, and pain
reducing effects in ovariectomized rats. Behav Neurosci. 118, 306–313.
Furey M.L., Khanna A., Hoffman E.M., Drevets W.C., 2010. Scopolamine produces larger antidepressant and antianxiety effects in
women than in men. Neuropsychopharmacology. 35(12), 2479-88.
Galea L.A., Wide J.K., Paine T.A., Holmes M.M., Ormerod B.K., Floresco S.B., 2001. High levels of estradiol disrupt conditioned
place preference learning, stimulus response learning and reference memory but have limited effects on working memory. Behav
Brain Res. 126, 115–126.
Gibbs R.B., 1996b. Fluctuations in relative levels of choline acetyltransferase mRNA in different regions of the rat basal forebrain
across the estrous cycle: Effects of estrogen and progesterone. J. Neurosci. 16, 1049–1055.
Gibbs R.B., Hashash A., Johnson D.A., 1997. Effects of estrogen on potassium-stimulated acetylcholine release in the hippocampus
and overlying cortex of adult rats. Brain Res. 749, 143-146.
Gibbs R.B., Burke A.M., Johnson D.A., 1998. Estrogen replacement attenuates effects of scopolamine and lorazepam on memory
acquisition and retention. Horm Behav. 34, 112–125.
Gibbs R.B., Aggarwal P., 1998. Estrogen and basal forebrain cholinergic neurons: implications for brain aging and Alzheimer's
disease-related cognitive decline. Horm Behav. 34, 98–111.
Gibbs R.B., 1998. Impairment of basal forebrain cholinergic neurons associated with aging and long-term loss of ovarian function.
Exp Neurol. 151, 289–302.
Gibbs R.B., 1999. Estrogen replacement enhances acquisition of a spatial memory task and reduces deficits associated with
hippocampal muscarinic receptor inhibition. Horm Behav. 36, 222–233.
Gibbs R.B., 2000a. Effects of gonadal hormone replacement on measures of basal forebrain cholinergic function. Neuroscience.
101, 931-938.
Hasselmo M.E., 2006. The role of acetylcholine in learning and memory. Curr Opin Neurobiol. 16(6): 710-5.
Holmes M.M., Wide J.K., Galea L.A.M., 2002. Low levels of estradiol facilitate, whereas high levels of estradiol impair working
memory performance on the radial arm maze. Behav Neurosc. 116, 928-934.
Hosseini M., Headari R., Oryan S., Alreza Hadjzadeh M., Saffarzadeh F., Khazaei M., 2010. The effect of chronic administration of
L-arginine on the learning and memory of estradiol-treated ovariectomized rats tested in the morris water maze. Clinics. 65(8), 803-
807
Hughes R.N., Desmond C.S., Fisher L.C., 2004. Room novelty, sex, scopolamine and their interactions as determinants of general
activity and rearing, and light–dark preferences in rats. Behav Processes. 67, 173–181.
Jin, M., Jin, F., Zhang, L., Chen, Z., Huang, H., 2005. Two estrogen replacement therapies differentially regulate expression of
estrogen receptors alpha and beta in the hippocampus and cortex of ovariectomized rat. Brain Res Mol Brain Res. 142, 107–114.
Johnston A.L., File S.E., 1991. Sex differences in animal tests of anxiety. Physiol Behav. 49, 245–250.
Kameda S.R., Frussa-Filho R., Carvalho R.C., Takatsu-Coleman A.L., Ricardo V.P., Patti C.L., Calzavara M.B., Lopez
G.B., Araujo N.P., Abílio V.C., Ribeiro Rde A,D'Almeida V., Silva R.H., 2007. Dissociation of the effects of ethanol on memory,
anxiety, and motor behavior in mice tested in the plus-maze discriminative avoidance task. Psychopharmacology (Berl). 192(1): 39-
48.
Khodabandehloo F., Hosseini M., Rajaei Z., Soukhtanloo M., Farrokhi E., Rezaeipour M., 2013. Brain tissue oxidative damage as a
possible mechanism for the deleterious effect of a chronic high dose of estradiol on learning and memory in ovariectomized rats.
Arq Neuropsiquiatr. 71(5), 313-319.
Klinkenberg I., Blokland A., 2010. The validity of scopolamine as a pharmacological model for cognitive impairment: a review of
animal behavioral studies. Neurosci Biobehav Rev. 34(8), 1307-50.
Korol D.L., Malin E.L., Borden K.A., Busby R.A., Couper-Leo J., 2004. Shifts in preferred learning strategy across the estrous
cycle in female rats. Horm Behav. 45, 330– 338.
Kuroki Y., Fukushima K., Kanda Y., Mizuno K., Watanabe Y., 2000. Putative membrane-bound estrogen receptors possibly
stimulate mitogen-activated protein kinase in the rat hippocampus. Eur J Pharmac. 400, 205–209.
LaBar K.S., Cabeza R., 2006. Cognitive neuroscience of emotional memory. Nature. 7, 54–64.
Levin E.R., 2005. Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen. Mol Endocrinol. 19, 1951–1959.
Luine V.N., Jacome L.F., Maclusky N.J., 2003. Rapid enhancement of visual and place memory by estrogens in rats.
Endocrinology. 144, 2836–2844.
Luine V.N., Khylchevskaya R.I., McEwen B.S., 1975. Effect of gonadal steroids on activities of monoamine oxidase and choline
acetylase in rat brain. Brain Res. 86, 293–306.
Mannella P., Brinton R.D., 2006. Estrogen receptor protein interaction with phophatidylinositol 3-kinase leads to activation of
phosphorylated Akt and extracellular signal-regulated kinase 1/2 in the same population of cortical neurons: A unified mechanism
of estrogen action. J Neurosci. 26, 9439– 9447.
Marcondes F.K., Miguel K.J., Melo L.L., Spadari-Bratfisch R.C., 2001. Estrous cycle influences the response of female rats in the
elevated plus-maze test. Physiol Behav. 74, 435–440.
Marriott L.K., Korol D.L., 2003. Short-term estrogen treatment in ovariectomized rats augments hippocampal acetylcholine release
during place learning. Neurobiol Learn Mem. 80, 315-322.
Marvan M.L., Chavez-Chavez L., Santana S., 1996. Clomipramine modifies fluctuations of forced swimming immobility in
different phases of the rat estrous cycle. Arch Med Res. 27, 83–86.
Mathews A., 1990. Why worry? The cognitive function of anxiety. Behav Res Ther. 28, 455-568.
McEwen B., 2002. Estrogen Actions Throughout the Brain. Recent Prog Horm Res. 57, 357-384.
McEwen B.S., Alves S.E., 1999. Estrogen actions in the central nervous system. Endocr Rev. 20, 279–307.
Melo T.G., Izídio G.S., Ferreira L.S., Sousa D.S., Macedo P.T., Cabral A., Ribeiro A.M., Silva R.H., 2012. Antidepressants
differentially modify the extinction of an aversive memory task in female rats. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 37(1):
33-40.
Milad M.R., Igoe S.A., Lebron-Milad K., Novales J.E., 2009. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear
extinction. Neuroscience. 164: 887–895.
Mirza N.R., Stolerman I.P., 2000. The role of nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors in attention. Psychopharmacology.
148, 243–250.
54
Mora S., Dussaubat N., Diaz-Veliz G., 1996. Effects of the estrous cycle and ovarian hormones on behavioral indices of anxiety in
female rats. Psychoneuroendocrinology. 21, 609–620.
Munguba H., Cabral A., Leão A.H., Barbosa F.F., Izídio G.S., Ribeiro A.M., Silva R.H., 2011. Pre-training anandamide infusion
within the basolateral amygdala impairs plus-maze discriminative avoidance task in rats. Neurobiol Learn Mem. 95(4), 527-33.
Niigaki S.T., Silva R.H., Patti C.L., Cunha J.L., Kameda S.R., Correia-Pinto J.C., Takatsu-Coleman A.L., Levin R., Abílio
V.C., Frussa-Filho R., 2010. Amnestic effect of cocaine after the termination of its stimulant action. Prog Neuropsychopharmacol
Biol Psychiatry. 34(1): 212-8.
Nomura Y., Nishiyama N., Saito H., Matsuki N., 1994. Role of cholinergic neurotransmission in the amygdala on performances of
passive avoidance learning in mice. Biol & Pharmac Bulletin. 17, 490–494.
Osterlund M.K., Gustafsson J.A., Keller E., Hurd Y.L., 2000a. Estrogen receptor beta (ERbeta) messenger ribonucleic acid (mRNA)
expression within the human forebrain: distinct distribution pattern to ERalpha mRNA. J. Clin. Endocrinol Metab. 85, 3840–3846.
Packard M.G., Goodman J., 2012. Emotional arousal and multiple memory systems in the mammalian brain. Front in Behav
Neurosci. 6:14.
Packard M.G., 1998. Posttraining Estrogen and Memory Modulation. Horm Behav 1998. 34, 126–139.
Panidis D.K., Matalliotakis I.M., Rousso D.H., Kourtis A.I., Koumantakis E.E., 2001. The role of estrogen replacement therapy in
Alzheimer’s disease. Europ J of Obstet & Gynecol and Reprod Biology. 95, 86-91.
Pompili A., Tomaz C., Arnone B., Tavares M.C., Gasbarri A., 2010. Working and reference memory across the estrous cycle of rat:
A long-term study in gonadally intact females. Behav Brain Research. 213, 10–18.
Renfro C.T., Freedman P.E., Rosen A.J., 1972. The concurrent effects of scopolamine on spontaneous motor activity and the
acquisition of an active avoidance response. Neuropharmacology. 11, 337–346.
Ribeiro A.M., Barbosa F.F., Godinho M.R., Fernandes V.S., Munguba H., Melo T.G., Silva R.H., 2010. Sex differences in aversive
memory in rats: Possible role of extinction and reactive emotional factors. Brain and Cognition. 74: 145–151.
Ribeiro A.M., Barbosa F.F., Munguba H., Costa M.S., Cavalcante J.S., Silva R.H., 2011. Basolateral amygdala inactivation impairs
learned (but not innate) fear response in rats. Neurobiol Learn Mem. 95(4), 433-40.
Rissman E.F., 2008. Roles of oestrogen receptors alpha and beta in behavioural neuroendocrinology: beyond Yin/Yang. J
Neuroendocrinol. 20(6), 873-9.
Sadeghian R., Fereidoni M., Soukhtanloo M., Azizi-Malekabadi H., Hosseini M., 2012. Decreased nitric oxide levels in the
hippocampus may play a role in learning and memory deficits in ovariectomized rats treated by a high dose of estradiol. Arq
Neuropsiquiatr. 70(10), 874-879.
Sarter M., Bruno J.P., Givens B., 2003. Attentional functions of cortical cholinergic inputs: What does it mean for learning and
memory? Neurobiol of Learn and Mem. 80, 245–256.
Sawai T., Bernier F., Fukushima T., Hashimoto T., Ogura H., Nishizawa Y., 2002. Estrogen induces a rapid increase of calcium-
calmodulin-dependent protein kinase II activity in the hippocampus. Brain Res. 950, 308–311.
Schmidt B., Jacobson T.K., Markus E., 2009. Hippocampal and striatal dependent navigation: Sex differences are limited to
acquisition. Horm Behav. 56, 199–205.
Shumaker S.A., Legault C., Rapp S.R., Thal L., Wallace R.B., Ockene J.K., Hendrix S.L., Jones B.N. 3rd, Assaf A.R., Jackson
R.D., Kotchen J.M., Wassertheil-Smoller S.,Wactawski-Wende J.; WHIMS Investigators, 2003. Estrogen plus progestin and the
incidence of dementia and mild cognitive impairment in postmenopausal women: the Women’s Health Initiative Memory Study. J.
Am. Med. Assoc. 289, 2651–2662.
Silva R.H., Felicio L.F., Frussa-Filho R., 1999. Ganclioside GM1 attenuates scopolamine-induced amnesia in rats and mice.
Psychopharmacology. 141, 111–117.
Silva R.H., Frussa-Filho R., 2000. The plus-maze discriminative avoidance task: A new model to study memory-anxiety
interactions. Effects of chlordiazepoxide and caffeine. J Neurosc Methods. 102, 117–125.
Sipos M.L., Burchnell V., Galbicka G., 1999. Dose–response curves and time-course effects of selected anticholinergics on
locomotor activity in rats. Psychopharmacology. 147, 250–256.
Smythe J.W., Murphy D., Bhatnagar S., Timothy C., Costall B., 1996. Muscarinic antagonists are anxiogenic in rats tested in the
black–white box. Pharmac, Biochem and Behav. 54, 57–63.
Stevens R., 1981. Scopolamine impairs spatial maze performance in rats. Physiol Behav. 27, 385–386.
Tinkler G.P., Voytko M.L., 2005. Estrogen modulates cognitive and cholinergic processes in surgically menopausal monkeys. Prog
Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 29, 423–431.
Toufexis, D.J., Myers, K.M., Davis, M., 2006. The effect of gonadal hormones and gender on anxiety and emotional learning. Horm
Behav. 50, 539-549.
Vázquez-Pereyra F., Rivas-Arancibia S., Loaeza-Del Castillo A., Schneider-Rivas S., 1995. Modulation of short term and long term
memory by steroid sexual hormones. Life Sci. 56, 255-60.
Walf A.A., Frye C.A., 2006. A review and update of mechanisms of estrogen in the hippocampus and amygdala for anxiety and
depression behavior. Neuropsychopharmacology. 31(6), 1097-111.
Walf A.A., Frye C.A., 2008. Rapid and estrogen receptor beta mediated actions in the hippocampus mediate some functional effects
of estrogen. Steroids. 73, 997–1007.
Wallenstein G.V., Vago D.R., 2001. Intrahippocampal scopolamine impairs both acquisition and consolidation of contextual fear
conditioning. Neurobiol Learn Mem. 75, 245-252.
Wink A.M., Bernard F., Salvador R., Bullmore E.T., Suckling J., 2006. Age and cholinergic effects on hemodynamic and functional
coherence of the human hippocampus. Neurobiol Aging. 27, 1395–1404.
Zarrindast M.R., Sroushi A., Bananej M., Vousooghi N., Hamidkhaniha S., 2011. Involvement of the dopaminergic receptors of the
rat basolateral amygdala in anxiolytic-like effects of the cholinergic system. Eur J Pharmacol. 672, 106-12.
Zec R.F., Trivedi M.A., 2002. The effects of estrogen replacement therapy on neuropsychological functioning in postmenopausal
women with and without dementia: a critical and theoretical review. Neuropsychol Rev. 12(2), 65-109.
Zimmerberg B., Farley M.J., 1993. Sex differences in anxiety behavior in rats: role of gonadal hormones. Physiol Behav. 54, 1119–
1124.
Contributors:
AMM wrote the paper; AMM, GSI, AMR and RHS designed the experiments; AMM, DSS, PTM, AFS
and VKMS performed the experiments; RHS, AC and AMR contributed to writing and theoretical
discussions; RHS coordinated the study.
55
Referências Gerais
AULD DS, KORNECOOK TJ, BASTIANETTO S, QUIRION R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system:
Relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol, v.68, p.209-245, 2002.
BACA-GARCIA E, DIAZ-SASTRE C, DE LEON J, SAIZ-RUIZ J. The relationship between menstrual cycle phases and suicide
attempts. Psychosom Med, v.62, p.50-60, 2000.
BADDELEY AD; WARRINGTON EK. Amnesia and the distinction between long and short-term memory. J. Verbal Learn. Verbal
Behav., 9: 176-189, 1970.
BALTHAZART J, BALL GF. Is brain estradiol a hormone or a neurotransmitter? Trends in Neurosci, v.29, p.241-249, 2006.
BALTHAZART J, CORNIL CA, TAZIAUX M, CHARLIER TD, BAILLIEN M, BALL GF. Rapid changes in production and
behavioral action of estrogens. Neuroscience, v.138, p.783–791, 2006.
BARKER JM, GALEA LA. Repeated estradiol administration alters different aspects of neurogenesis and cell death in the
hippocampus of female, but not male, rats. Neuroscience, v.152, p.888–902, 2008.
BARTUS RT, DEAN RL, BEER B, LIPPA AS. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science, v.217, p.408-
417, 1982.
BEBBINGTON P, HURRY J, TENNANT C, STURT E, WING JK. The epidemiology of mental disorders in Camberwell. Psychol
Med, v.11, p.561-579, 1981.
BEYER C, IVANOVA T, KAROLCZAK M, KUPPERS E. Cell type-specificity of nonclassical estrogen signaling in the
developing midbrain. J Steroid Biochem Mol Biol, v.81, p.319-325, 2002.
BITRAN D, DUGAN M, RENDA P, ELLIS R, FOLEY M. Anxiolytic effects of the neuroactive steroid pregnanolone (3a-OH-5b-
pregnan-20-one) after microinjection in the dorsal hippocampus and lateral septum. Brain Res, v.850, p.217-224, 1999.
BITRAN D, FOLEY M, AUDETTE D, LESLIE N, FRYE CA. Activation of peripheral mitochondrial benzodiazepine receptors in
the hippocampus stimulates allopregnanolone synthesis and produces anxiolytic-like effects in the rat. Psychopharmacology, v.151,
p.64-71, 2000.
BLANCHARD DC, BLANCHARD RJ. Innate and conditioned reactions to threat in rats with amygdaloid lesions.J Comp Physiol
Psychol. 1972;81(2):281-90.
BLANCHARD RJ, BLANCHARD DC. An ethoexperimental approach to the study of fear. Psychol. Rev., 37: 302-316, 1987.
BLOCH M, DALY RC, RUBINOW DR. Endocrine factors in the etiology of postpartum depression. Compr Psychiatr, v.44, p.234-
246, 2003.
BOREN JJ, NAVARRO AP. The action of atropine, benactyzine, and scopolamine upon fixed-interval and fixed-ratio behavior. J of
the Exp Analysis of Beh, v.2, p.107-115, 1959.
BOWMAN RE, FERGUSON D, LUINE VN. Effects of chronic restraint stress and estradiol on open field activity, spatial memory,
and monoaminergic neurotransmitters in ovariectomized rats. Neuroscience, v.113, p.401-410, 2002.
BROWN JH, TAYLOR P. Muscarinic receptor agonists and antagonists. The Pharmacological Basis of Therapeutics, pp. 141-160,
1996.
CAHILL L, HAIER RJ, WHITE NS, FALLON J, KILPATRICK L, LAWRENCE C, POTKIN SG, ALKIRE MT. Sex-Related
Difference in Amygdala Activity during Emotionally Influenced Memory Storage. Neurobiol Learn Mem, v.75, p.1-9, 2001.
CAHILL L, MCGAUGH JL Mechanisms of emotional arousal and lasting declarative memory. Trends Neurosci, v.21, p.294-299,
1998.
CALANDREAU L, TRIFILIEFF P, MONS N, COSTES L, MARIEN M, MARIGHETTO A, MICHEAU J, JAFFARD R,
DESMEDT A. Extracellular Hippocampal Acetylcholine Level Controls Amygdala Function and Promotes Adaptive Conditioned
Emotional Response. J Neurosci, v.26 (52), p.13556-66, 2006.
CALZAVARA MB, PATTI CL, LOPEZ GB, ABILIO VC, SILVA RH, FRUSSA-FILHO R. Role of learning of open arm
avoidance in the phenomenon of one-trial tolerance to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in mice. Life Sci. 2005;76(19):2235-
46.
CANTERAS NS, RIBEIRO-BARBOSA ER, COMOLI E. Tracing from the dorsal premammillary nucleus prosencephalic systems
involved in the organization of innate fear responses. Neurosci Biobehav Rev. 2001;25(7-8):661-8.
CARBALLO-MÁRQUEZ A, VALE-MARTÍNEZ A, GUILLAZO-BLANCH G, MARTÍ-NICOLOVIUS M. Muscarinic
transmission in the basolateral amygdala is necessary for the acquisition of socially transmitted food preferences in rats. Neurobiol
Learn Mem, v.91(1), p.98-101, 2009.
CARVALHO R.C., PATTI C.C., TAKATSU-COLEMAN A.L., KAMEDA S.R., SOUZA C.F., GARCEZ-DO-CARMO
L., ABÍLIO V.C., FRUSSA-FILHO R., SILVA R.H., 2006. Effects of reserpine on the plus-maze discriminative avoidance task:
dissociation between memory and motor impairments. Brain Res. 29; 1122(1): 179-83.
CHINTOH A, FULTON J, KOZIEL N, AZIZ M, SUD M, YEOMANS JS. Role of cholinergic receptors in locomotion induced by
scopolamine and oxotremorine-M. Pharm, Biochem and Behavior, v.76, p.53-61, 2003.
CHOLERTON B, GLEASON CE, BAKER LD, ASTHANA S. Estrogen and Alzheimer’s disease. Drugs Aging, v.19, p.405-427,
2002.
CHRISTIANSON S.The Handbook of Emotion and Memory: Research and Theory. Lawrence Erlbaum Associates, London, 1992
CHUDASAMAY, DALLEY JW, NATHWANI F, BOUGER P, ROBBINS, TW. Cholinergic modulation of visual attention and
working memory: dissociable effects of basal forebrain 192-IgG-saporin lesions and intraprefrontal infusions of scopolamine.
Learning and Memory, v.11, p.78-86, 2004.
CLARO FT, SILVA RH, FRUSSA-FILHO R. Bovine brain phosphatidylserine attenuates scopolamine-induced amnesia. Physiol
Behav. 1999;67(4):551-4.
COLLERTON D. Cholinergic function and intellectual decline in Alzheimer’s disease. Neuroscience, v.19, p.1 -28, 1986.
CONTRERAS CM, MOLINA M, SAAVEDRA M, MARTINEZ-MOTA L. Lateral septal neuronal firing rate increases during
proestrus-estrus in the rat. Physiol Behav, v.68, p.279–284, 2000.
CORNIL CA. Rapid regulation of brain oestrogen synthesis: the behavioural roles of oestrogens and their fates. Journal of
Neuroendocrinology 2009; 21: 217–226
CROW TJ, GROVE-WHITE IG. An analysis of the learning deficit following hyoscine administration to man. British J of Pharm,
v.49, p.322-327, 1973.
DALTON K. MENSTRUATION AND ACUTE PSYCHIATRIC ILLNESSES. Br Med J, v.34, p.148-149, 1959.
DANIEL JM, DOHANICH GP. Acetylcholine mediates the estrogen-induced increase in NMDA receptor binding in CA1 of the
hippocampus and the associated improvement in working memory. J Neurosci, v.21, p.6949-6956, 2001.
56
DANIEL JM, HULST JL, BERBLING JL. Estradiol replacement enhances working memory in middle-aged rats whien initiated
immediately after ovariectomy but not after a long-term period of ovarian hormone deprivation. Endocrinology, v.147, p.607-614,
2006.
DE TOLEDO-MORRELL L, STOUB TR, WANG C. Hippocampal atrophy and disconnection in incipient and mild Alzheimer’s
disease. Prog Brain Res, v.163, p.741-753, 2007.
DEAN C, KENDELL RE. The symptomatology of puerperal illnesses. Br J Psychiatr, v.139, p.128-133, 1981.
DOHANICH GP, FADER AJ, JAVORSKY DJ. Estrogen and estrogen-progesterone treatments counteract the effect of
scopolamine on reinforced T-maze alternation in female rats. Behavioral Neuroscience, v.108, p.988-992, 1994.
DRACHMAN DA, LEAVITT J. Human memory and the cholinergic system: a relationship to aging? Archives in Neurology, v.30,
p.113-121, 1974.
DREHER JC, SCHMIDT PJ, KOHN P, FURMAN D, RUBINOW D, BERMAN KF. Menstrual cycle phase modulates reward-
related neural function in women. Proc Natl Acad Sci USA, v.104, p.2465-2470, 2007.
DRISCOLL I, SUTHERLAND RJ. The aging hippocampus: Navigating between rat and human experiments. Rev Neurosci, v.16,
p.87-121, 2005.
DUMAS JA, HANCUR-BUCCI C, NAYLOR M, SITES C, NEWHOUSE PA. Estradiol Interacts with the Cholinergic System to
Affect Verbal Memory in Postmenopausal Women: Evidence for the Critical Period Hypothesis. Horm Behav, v.53(1), p.159-169,
2008.
DUMAS JA, HANCUR-BUCCI C, NAYLOR M, SITES C, NEWHOUSE PA. Estrogen treatment effects on anticholinergic-
induced cognitive dysfunction in normal post-menopausal women. Neuropsychopharmacology, v.31, p.2065-2078, 2006.
EBERT U, KIRCH W. Scopolamine model of dementia: electroencephalogram findings and cognitive performance. Europ J Clinic
Invest, v.28, p.944-949, 1998.
EDINGER KL, FRYE CA. Testosterone’s analgesic, anxiolytic, and cognitive-enhancing effects may be due in part to actions of its
5a-reduced metabolites in the hippocampus. Behav Neurosci, v.118, p.1352-1364, 2004.
EDINGER KL, FRYE CA. Testosterone’s anti-anxiety and analgesic effects may be due in part to actions of its 5a-reduced
metabolites in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology, v.30, p.418-430, 2005.
EICHENBAUM H. Declarative memory: Insights from cognitive neurobiology. Annual Review of Psychology, v.48, p.47-572,
1997.
EICHENBAUM, H. The Cognitive Neuroscience of Memory. Oxford University Press; New York, NY: 2002.
ENNACEUR A, MELIANI K. Effects of physostigmine and scopolamine on rats’ performances in object recognition and radial
maze tests. Psychopharmacology, v.109, p.321-330, 1992.
ESTAPÉ N, STECKLER T. Cholinergic blockade impairs performance in operant DNMTP in two inbred strains of mice. Pharm,
Biochem and Behavior, v.72, p.319-334, 2002.
FADER AJ, JOHNSON PEM, DOHANICH GP. Estrogen improves working but not reference memory and prevents amnestic
effects of scopolamine on a radial-arm maze. Pharm Biochem and Behavior, v.62, p.711-717, 1999.
FALKENSTEIN E, TILLMAN HC, CHRIST M, FEURING M, WEHLING M. Multiple actions of steriod hormones: a focus on
rapid, nongenomic effects. Pharmacol Rev, v.52, p.513-556, 2000.
FARR SA, BANKS WA, MORLEY JE. Estradiol potentiates acetylcholine and glutamate-mediated post-trial memory processing in
the hippocampus. Brain Research, v.864, p.263-269, 2000.
FITZPATRICK JL, MIZE AL, WADE CB, HARRIS JA, SHAPIRO RA, DORSA DM. Estrogen-mediated neuroprotection against
β-amyloid toxicity requires expression of estrogen receptor α or β and activation of the MAPK pathway. J Neurochem, v.82, p.674–
682, 2002.
FLOOD JF, CHERKIN A. Scopolamine effects on memory retention in mice: a model of dementia? Behav and Neural Biol, v.45,
p.169-184, 1986.
FRICK KM, BERGER-SWEENEY J. Spatial reference memory and neocortical neurochemistry vary with the estrous cycle in
C57BL/6 mice. Behav Neurosci, v.115, p.229-237, 2001.
FRICK KM, BURLINGAME LA, DELANEY SS, BERGER-SWEENEY J. Sex differences in neurochemical markers that
correlate with behavior in aging mice. Neurobiol Aging, v.23, p.145-158, 2002a.
FRICK KM, FERNANDEZ SM, BULINSKI SC. Estrogen replacement improves spatial reference memory and increases
hippocampal synaptophysin in aged female mice. Neuroscience, v.115, p.547–558, 2002.
FRICK KM. Estrogens and age-related memory decline in rodents: what have we learned and where do we go from here? Horm
Behav, v.55, p.2–23, 2009.
FRUSSA-FILHO R, BARBOSA-JUNIOR H, SILVA RH, DA CUNHA C, MELLO CF. Naltrexone potentiates the anxiolytic
effects of chlordiazepoxide in rats exposed to novel environments. Psychopharmacology 1999;147(2):168-73.
FRYE CA, RHODES ME, DUDEK B. Estradiol to aged female or male mice improves learning in inhibitory avoidance and water
maze tasks. Brain Res, v.1036, p.101-108, 2005.
FRYE CA, RHODES ME. Enhancing effects of estrogen on inhibitory avoidance performance may be in part independent of
intracellular estrogen receptors in the hippocampus. Brain Res, v.956, p.285-293, 2002.
FRYE CA, WALF AA. Changes in progesterone metabolites in the hippocampus can modulate open field and forced swim test
behavior of proestrous rats. Horm Behav, v.41, p.306-315, 2002.
FRYE CA, WALF AA. Estrogen and/or progesterone systemically or to the amygdala can have anxiety, fear, and pain reducing
effects in ovariectomized rats. Behav Neurosci, v.118, p.306-313, 2004a.
FRYE CA, WALF AA. Hippocampal 3a,5a-THP may alter depressive behavior of pregnant and lactating rats. Pharmacol Biochem
Behav, v.78, p.531-540, 2004b.
GABRIELI JDE. Cognitive neuroscience of human memory. Ann. Rev. Psychol., 49: 87-115, 1998.
GAUS CJ. Geburten in kunstlichem Dämmerschlaff. Archiv für Gynäkologie, v.78, p.579-631, 1906.
GIBBS RB, AGGARWAL P. Estrogen and basal forebrain cholinergic neurons: Implications for brain aging and Alzheimer’s
disease-related cognitive decline. Horm Behav, v.34, p.98-111, 1998.
GIBBS RB, GABOR R, COX T, JOHNSON DA. Effects of raloxifene and estradiol on hippocampal acetylcholine release and
spatial learning in the rat. Psychoneuroendocrinology, v.29, p.741-748, 2004.
GIBBS RB, GABOR R. Estrogen and Cognition: Applying Preclinical Findings to Clinical Perspectives. J of Neuroscience
Research, v.74, p.637-643, 2003.
GIBBS RB, HASHASH A, JOHNSON DA. Effects of estrogen on potassium-stimulated acetylcholine release in the hippocampus
and overlying cortex of adult rats. Brain Res, v.749, p.143-146, 1997.
57
GIBBS RB, WU D, HERSH LB, PFAFF DW. Effects of estrogen replacement on the relative levels of choline acetyltransferase,
trkA, and nerve growth factor messenger RNAs in the basal forebrain and hippocampal formation of adult rats. Exp Neurol, v.129,
p.70-80, 1994.
GIBBS RB. Effects of gonadal hormone replacement on measures of basal forebrain cholinergic function. Neuroscience, v.101,
p.931-938, 2000a.
GIBBS RB. Effects of gonadal hormone replacement on measures of basal forebrain cholinergic function. Neuroscience, v.101,
p.931-938, 2000.
GIBBS RB. Estrogen replacement enhances acquisition of a spatial memory task and reduces deficits associated with hippocampal
muscarinic receptor inhibition. Hormones & Behavior, v.36, p.222-233, 1999.
GIBBS RB. Fluctuations in relative levels of choline acetyltransferase mRNA in different regions of the rat basal forebrain across
the estrous cycle: Effects of estrogen and progesterone. J Neurosci, v.16, p.1049-1055, 1996.
GIBBS RB. Impairment of basal forebrain cholinergic neurons associated with aging and long-term loss of ovarian function. Exp
Neurology, v.151, p.289-302, 1998.
GIGUERE V. Steroid homorne receptor signaling. Handbook of Cell Signaling. Academic Press: San Diego, CA, v.3, p.35-38,
2003.
GOULD E, WOOLLEY CS, FRANKFURT M, MCEWEN BS. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal
pyramidal cells in adulthood. J Neurosci, v.10, p.1286-1291, 1990.
GRECO B, BLASBERG ME, KOSINSKI EC, BLAUSTEIN JD. Response of ERa-IR and ERb-IR cells in the forebrain of female
rats to mating stimuli. Horm Behav, v.43, p.444-453, 2003a.
GRECO B, LUBBERS LS, BLAUSTEIN JD. Estrogen receptor b messenger ribonucleic acid expression in the forebrain of
proestrous, pregnant, and lactating female rats. Endocrinology, v.144, p.1869-1875, 2003b.
GU Q, KORACH KS, MOSS RL. Rapid action of 17b-estradiol on kainate-induced currents in hippocampal neurons lacking
intracellular estrogen receptors. Endocrinol, v.140, p.660-666, 1999.
GU Q, MOSS RL. 17b-estradiol potentiates kainate-induced currents via activation of the cAMP cascade. J Neurosci, v.16, p.3620-
3629, 1996.
HAN CJ, PIERRE-LOUIS J, SCHEFF A, ROBINSON JK. A performance-dependent adjustment of the retention interval in a
delayed non-matching-to-position paradigm differentiates effects of amnestic drugs in rats. Eur J Pharmacol, v.403, p. 87-93, 2000.
HANDLEY SL.; MITHANI S. Effects of alpha2-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of fear-
motivated behavior. Nauyn Schmiedeberg Arch. Pharmacol., 327: 1-5, 1984.
HARDY TK, WAKELY D. The amnesic properties of hyoscine and atropine in pre-anaesthetic medication. Anaesthesia, v.17,
p.331-336, 1962.
HEARST E. Effects of scopolamine on discriminated responding in the rat. The J of Pharm and Exp Thera, v.126, p.349-358, 1959.
HODGES JR. DB, LINDNER MD, HOGAN JB, JONES KM, MARKUS EJ. Scopolamine induced deficits in a battery of rat
cognitive tests: comparisons of sensitivity and specificity. Behav Pharmacology, v.20, p.237-251, 2009.
HOF PR, MORRISON JH. The aging brain: Morphomolecular senescence of cortical circuits. TINS, v.27, p.607-613, 2004.
HUGHES RN, DESMOND CS, FISHER LC. Room novelty, sex, scopolamine and their interactions as determinants of general
activity and rearing, and light–dark preferences in rats. Behav Processes, v.67, p.173-181, 2004.
INSEL TR. Regional induction of c-fos-like protein in rat brain after estradiol administration. Endocrinology, v.126, p.1849-1853,
1990.
ISON JR, BOWEN GP. Scopolamine reduces sensitivity to auditory gaps in the rat, suggesting a cholinergic contribution to
temporal acuity. Hearing Research, v.145, p.169-176, 2000.
JENKINS R. Sex differences in depression. Br J Hosp Med, v.38, p.485-486, 1987.
JENSEN EV, JACOBSEN HI. Basic guides to the mechanism of estrogen action. Recent Prog Horm Res, v.18, p.387-414, 1962.
JERUSALINSKY D; KORNISIUK E; IZQUIERDO I. Cholinergic neurotransmission and synaptic plasticity concerning memory
processing. Neurochem. Res., 22: 507-515, 1997.
JODAR L; KANETO H. Synaptic plasticity: stairway to memory. Jpn. J. Pharmacol., 68:359-387, 1995.
JOHNSTON AL, FILE SE. Sex differences in animal tests of anxiety. Physiol Behav, v.49, p.245–250, 1991.
JONASSON Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological
data. Neurosci Behav Rev, v.28, p.811–825, 2005.
KAMEDA S.R., FRUSSA-FILHO R., CARVALHO R.C., TAKATSU-COLEMAN A.L., RICARDO V.P., PATTI
C.L., CALZAVARA M.B., LOPEZ G.B., ARAUJO N.P., ABÍLIO V.C., RIBEIRO RDE A,D'ALMEIDA V., SILVA R.H., 2007.
Dissociation of the effects of ethanol on memory, anxiety, and motor behavior in mice tested in the plus-maze discriminative
avoidance task. Psychopharmacology (Berl). 192(1): 39-48.
KELLY MJ, LEVIN ER. Rapid actions of plasma membrane estrogen receptors. Trends Endocrinol Metab, v.12, p.152-156, 2001.
KLÖCKER N, HANSCHKE W, TOUSSAINT S, VERSE T. Scopolamine nasal spray in motion sickness: A randomised,
controlled, and crossover study for the comparison of two scopolamine nasal sprays with oral dimenhydrinate and placebo. Europ J
of Pharm Sciences, v.13(2), p.227-232, 2001.
KOPELMAN MD. The cholinergic neurotransmitter system in human learning and memory: a review. The Quarterly J of Exp
Psycho, v.38A, p.535-573, 1986.
KOROL DL, KOLO LL. Estrogen-induced changes in place and response learning in young adult female rats. Behav Neurosci,
v.116(3), p.411-20, 2002.
KOROL DL, MALIN EL, BORDEN KA, BUSBY RA, COUPER-LEO J. Shifts in preferred learning strategy across the estrous
cycle in female rats. Horm Behav, v.45, p.330-338, 2004.
KOW LM, PFAFF DW. The membrane actions of estrogens can potentiate their lordosis behavior-facilitating genomic actions. Proc
Natl Acad Sci, v.101, p.12354-12357, 2004.
KOZAUER NA, MIELKE MM, CHUEN CHAN GK, REBOK GW, LYKETSOS CG. Apolipoprotein E genotype and lifetime
cognitive decline. International Psychogeriatrics, v.22, p.1-15, 2007.
KUROKI Y, FUKUSHIMA K, KANDA Y, MIZUNO K, WATANABE Y. Putative membrane-bound estrogen receptors possibly
stimulate mitogen-activated protein kinase in the rat hippocampus. Eur J Pharmac, v.400, p.205–209, 2000.
LABAR KS, CABEZA R. Cognitive neuroscience of emotional memory. Nature, v.7, p.54–64, 2006.
LACREUSE A, WILSON ME, HERNDON JG. Estradiol, but not raloxifene, improves aspects of spatial working memory in aged
ovariectomized rhesus monkeys. Neurobiology of Aging, v.23, p.589-600, 2002.
LACREUSE A. Effects of ovarian hormones on cognitive function in nonhuman primates. Neuroscience, v.138, p.859-867, 2006.
58
LAUBER AH, ROMANO GJ, MOBBS CV, HOWELLS RD, PFAFF DW. Estradiol induction of proenkephalin messenger RNA in
hypothalamus: dose–response and relation to reproductive behavior in the female rat. Brain Res Mol Brain Res, v.8, p.47-54, 1990.
LAUNER LJ, ANDERSEN K, DEWEY ME, LETENNEUR L, OTT A, AMADUCCI LA, BRAYNE C, COPELAND JRM,
DARTIGUES JF, KRAGH-SORENSEN P, LOBO A, MARTINEZ-LAGE JM, STIJNEN T, HOFMAN A. Rates and risk factors
for dementia and Alzheimer’s disease. Neurology, v.52, p.78–84, 1999.
LEDOUX JE. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci, v.23, p.155-184, 2000.
Levin ER. Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen. Mol Endocrinol, v.19, p.1951–1959, 2005.
LEVITAN IB; KACZMAREK LK. Learning and memory. In: Levitan, I.B.; Kaczmarek, L.K., eds. The Neuron: Cell and Molecular
Biology, Oxford: Oxford University Press, 1991, pp 395-423
LI C, BRAKE WG, ROMEO RD, DUNLOP JC, GORDON M, BUZESCU R. Estrogen alters hippocampal dendritic spine shape
and enhances synaptic protein immunoreactivity and spatial memory in female mice. Proc Natl Acad Sci, v.101, p.2185-2190, 2004.
LUINE VN, JACOME LF, MACLUSKY NJ. Rapid enhancement of visual and place memory by estrogens in rats. Endocrinology,
v.144, p.2836-2844, 2003.
LUINE VN, KHYLCHEVSKAYA RI, MCEWEN BS. Effect of gonadal steroids on activities of monoamine oxidase and choline
acetylase in rat brain. Brain Res, v.86, p.293-306, 1975.
LUINE VN. Estradiol increases choline acetyltransferase activity in specific basal forebrain nuclei and projection areas of female
rats. Exp Neurol, v.89, p.484-490, 1985.
MACLUSKY NJ, LUINE VN, HAJSZAN T, LERANTH C. The 17a and 17b isomers of estradiol both induce rapid spine synapse
formation in the CA1 hippocampal subfield of ovariectomized female rats. Endocrinology, v.146, p.287-293, 2005.
MAKI PM. Hormone therapy and cognitive function: Is there a critical period for benefit? Neuroscience, v.138, p.1027-1030, 2006.
MANNELLA P, BRINTON RD. Estrogen receptor protein interaction with phophatidylinositol 3-kinase leads to activation of
phosphorylated Akt and extracellular signal-regulated kinase 1/2 in the same population of cortical neurons: A unified mechanism
of estrogen action. J Neurosci, v.26, p.9439– 9447, 2006.
MARKOWSKA AL, SAVONENKO AV. Effectiveness of Estrogen Replacement in Restoration of Cognitive Function after Long-
Term Estrogen Withdrawal in Aging Rats. J of Neuroscience, v.22, p.10985-10995, 2002.
MARRIOTT LK, KOROL DL. Short-term estrogen treatment in ovariectomized rats augments hippocampal acetylcholine release
during place learning. Neurobiol Learn Mem, v.80, p.315-322, 2003.
MARVAN ML, CHAVEZ-CHAVEZ L, SANTANA S. Clomipramine modifies fluctuations of forced swimming immobility in
different phases of the rat estrous cycle. Arch Med Res, v.27, p.83–86, 1996.
MATHEWS A. Why worry? The cognitive function of anxiety. Behav. Res. Ther., 28: 455-568, 1990.
MCCARTHY MM, BECKER JB. Neuroendocrinology of sexual behavior in the female. Behavioral Endocrinology. MIT Press;
Cambridge, MA, p.117-151, 2002.
MCEWEN B. Estrogen actions throughout the brain. Recent Prog Horm Res, v.57, p.357-384, 2002.
MCEWEN BS, ALVES SE. Estrogen actions in the central nervous system. Endocr Rev, v.20, p.279–307, 1999.
MCGAUGH JL. Time-dependent processes in memory storage. Science. 1966;153(742):1351-8.
MELO T.G., IZÍDIO G.S., FERREIRA L.S., SOUSA D.S., MACEDO P.T., CABRAL A., RIBEIRO A.M., SILVA R.H., 2012.
Antidepressants differentially modify the extinction of an aversive memory task in female rats. Prog Neuropsychopharmacol Biol
Psychiatry. 37(1): 33-40.
MICEVYCH P, DOMINGUEZ R. Membrane estradiol signaling in the brain. Frontiers in Neuroendocri, v.30, p.315–327, 2009.
MILNER TA, AYOOLA K, DRAKE CT, HERRICK SP, TABORI NE, MCEWEN BS, WARRIER S, ALVES SE. Ultrastructural
localization of estrogen receptor beta immunoreactivity in the rat hippocampal formation. J Comp Neurol, v.491, p.81 -95, 2005.
MILNER TA, MCEWEN BS, HAYASHI S, LI CJ, REAGAN LP, ALVES SE. Ultrastructural evidence that hippocampal alpha
estrogen receptors are located at extranuclear sites. J Comp Neurol, v.429, p.355-371, 2001.
MISHKIN M; MALAMUT B; BACHEVALIER J. Memories and habits: two neural systems. In: Lynch, G.; McGaugh, J.L.;
Weinberger, N.M., eds. Neurobiology of learning and memory. New York, Guilford Press, 1984, pp65-77.
MIZUNO K, GIESE KP. Towards a molecular understanding of sex differences in memory formation. Trends in Neurosciences,
v.33, p.285–291, 2010.
MONTGOMERY KC. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. J. Comp. Physiol.
Psychol., 48: 254-260, 1955.
MOSS RL, GU Q. Estrogen: mechanisms for a rapid action in CA1 hippocampal neurons. Steroids, v.64, p.14-21, 1999.
NEWHOUSE PA, SUNDERLAND T, TARIOT PN, WEINGARTNER H, THOMASON K, MELLOW AM. The effects of acute
scopolamine in geriatric depression. Archives of General Psychiatry, v.45, p.906-912, 1988.
NIIGAKI S.T., SILVA R.H., PATTI C.L., CUNHA J.L., KAMEDA S.R., CORREIA-PINTO J.C., TAKATSU-COLEMAN
A.L., LEVIN R., ABÍLIO V.C., FRUSSA-FILHO R., 2010. Amnestic effect of cocaine after the termination of its stimulant action.
Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 34(1): 212-8.
NILSEN J, CHEN S, BRINTON RD. Dual action of estrogen on glutamate-induced calcium signaling: mechanisms requiring
interaction between estrogen receptors and src/mitogen activated protein kinase pathway. Brain Res, v.930, p.216-234, 2002.
NISHIZUKA M, ARAI Y. Synapse formation in response to estrogen in the medial amygdala developing in the eye. Proc Natl Acad
Sci, v.79, p.7024-7026, 1982.
NOMURA Y, NISHIYAMA N, SAITO H, MATSUKI N. Role of cholinergic neurotransmission in the amygdala on performances
of passive avoidance learning in mice. Biol & Pharm Bulletin, v.17, p.490-494, 1994.
O’MALLEY BW, MEANS AR. Female steroid hormones and target cell nuclei. Science, v.183, p.610-620, 1974.
of oestrogens and their fates. J of Neuroendocri, v.21, p.217–226, 2009.
OSTERLUND MK, GUSTAFSSON JA, KELLER E, HURD YL. Estrogen receptor beta (ERbeta) messenger ribonucleic acid
(mRNA) expression within the human forebrain: distinct distribution pattern to ERalpha mRNA. J. Clin. Endocrinol Metab, v.85,
p.3840–3846, 2000a.
OSTERLUND MK, KELLER E, HURD YL. The human forebrain has discrete estrogen receptor alpha messenger RNA expression:
high levels in the amygdaloid complex. Neuroscience, v.95, p.333-42, 2000.
PACKARD MG. Posttraining estrogen and memory modulation. Horm Behav, v.34, p.126-139, 1998.
PANIDIS DK, MATALLIOTAKIS IM, ROUSSO DH, KOURTIS AI, KOUMANTAKIS EE. The role of estrogen replacement
therapy in Alzheimer’s disease. Europ J of Obstet & Gynecol and Reprod Biology, v.95, p.86-91, 2001.
PAPPAS BA, BAYLEY PJ, BUI BK, HANSEN LA, THAL LJ. Choline acetyltransferase activity and cognitive domain scores of
Alzheimer’s patients. Neurobiol Aging, v.21, p.11-17, 2000.
59
PARROTT AC. Transdermal scopolamine: a review of its effects upon motion sickness, psychological performance, and
physiological functioning. Aviation, Space and Environmental Med, v.60(1), p.1-9, 1989.
PATTI CL, KAMEDA SR, CARVALHO RC, TAKATSU-COLEMAN AL, LOPEZ GB, NIIGAKI ST, ABILIO VC, FRUSSA-
FILHO R, SILVA RH. Effects of morphine on the plus-maze discriminative avoidance task: role of state-dependent learning.
Psychopharmacology. 2006;184(1):1-12.
PAVLIDES C, WINSON J. Influences of hippocampal place cell firing in the awake state on the activity of these cells during
subsequent sleep episodes. J Neurosci. 1989; 9(8):2907-18.
PELLOW S; CHOPIN P, FILE SE; BRILEY M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of
anxiety in the rat. J. Neurosci. Meth., 14: 149-167, 1985.
PELLOW S; FILE SE.. Anxyiolitic and anxiogenic drug effects on exploratory activity in an elevated plus-maze: a novel test of
anxiety in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav., 24: 525-529, 1986.
PERRY EK, TOMLINSON BE, BLESSED G, BERGMANN K, GIBSON PH, PERRY RH. Correlation of cholinergic
abnormalities with senile plaques and mental test scores in senile dementia. Brit Med Journal, v.25, p.1457-1459, 1978.
PFAFF D, KEINER M. Atlas of estradiol-concentrating cells in the central nervous system of the female rat. J Comp Neurol, v.151,
p.121-158, 1973.
PHELPS EA. Emotion and cognition: insights from studies of the human amygdala. Annu Rev Psychol. 2006;57:27-53.
POMPILI A, TOMAZ C, ARNONE B, TAVARES MC, GASBARRI A. Working and reference memory across the estrous cycle of
rat: A long-term study in gonadally intact females. Behav Brain Res, v.213(1), p.10-8, 2010.
RAPP PR, MORRISON JH, ROBERTS JA. Cyclic Estrogen Replacement Improves Cognitive Function in Aged Overiectomized
Rhesus Monkeys. The Journal of Neuroscience, v.23, p.5708-5714, 2003.
RASIA-FILHO AA, FABIAN C, RIGOTI KM, ACHAVAL M. Influence of sex, estrous cycle and motherhood on dendritic spine
density in the rat medial amygdala revealed by the Golgi method. Neuroscience, v.126, p.839-847, 2004.
RAZANDI M, PEDRAM A, GREENE GL, LEVIN ER. Cell membrane and nuclear estrogen receptors derive from a single
transcript: studies of ERalfa and ERbeta expressed in CHO cells. Mol Endocrinol, v.13, p.307-319, 1999.
RESNICK SM, HENDERSON VW. Hormone therapy and risk of Alzheimer disease: A critical time. JAMA, v.288, p.2170-2172,
2002.
RHODES ME, FRYE CA. Estrogen has mnemonic-enhancing effects in the inhibitory avoidance task. Pharmacol Biochem Behav,
v.78, p.551-558, 2004.
RIBEIRO S, GERVASONI D, SOARES ES, ZHOU Y, LIN SC, PANTOJA J, LAVINE M,NICOLELIS MA. Long-lasting
novelty-induced neuronal reverberation during slow-wave sleep in multiple forebrain areas. PLoS Biol. 2004;2(1):E24.
ROBINSON L, HARBARAN D, RIEDEL G. Visual acuity in the water maze: sensitivity to muscarinic receptor blockade in rats
and mice. Behav Brain Research, v.151, p.277-286, 2004.
ROCA CA, SCHMIDT PJ, ALTEMUS M, DEUSTER P, DANACEAU MA, PUTNAM K. Differential menstrual cycle regulation
of hypothalamic–pituitary–adrenal axis in women with pre-menstrual syndrome and controls. J Clin Endocrinol Metab, v.88,
p.3057-3063, 2003.
ROLLEROVA E, URBANCIKOVA M. Intracellular estrogen receptors, their characterization and function (Review). Endocr
Regul, v.34(4), p.203-218, 2000.
ROMANO GJ, HARLAN RE, SHIVERS BD, HOWELLS RD, PFAFF DW. Estrogen increases proenkephalin messenger
ribonucleic acid levels in the ventromedial hypothalamus of the rat. Mol Endocrinol, v.2, p.1320-1328, 1988.
ROSENBERG L, PARK S. Verbal and spatial functions across the menstrual cycle in healthy young women.
Psychoneuroendocrinology, v.27, p.835-841, 2002.
ROSENZWEIG MR. Aspects of the search for neural mechanisms of memory. Ann. Rev. Psychol., 47: 1 -32, 1996.
RUBINOW DR, SCHMIDT PJ. The neuroendocrinology of menstrual cycle mood disorders. Ann NY Acad Sci, v.771, p.648-659,
1995.
RUDICK CN, WOOLLEY CS. Estradiol induces a phasic Fos response in the hippocampal CA1 and CA3 regions of adult female
rats. Hippocampus, v.10, p.274-283, 2000.
SAFER DJ, ALLEN RP. The central effects of scopolamine in man. Biological Psychiatry, v.3, p.347-355, 1971.
SAMBETH A, RIEDEL W, SMITS L, BLOKLAND A. Cholinergic drugs affect novel object recognition in rats: Relation with
hippocampal EEG? Europ J of Pharm, v.572, p.151-159, 2007.
SARTER M. Preclinical research into cognition enhancers. Trends in Pharm Sciences, v.27(11), p.602-608, 2006.
SAVONENKO AV, MARKOWSKA AL. The cognitive effects of ovariectomy and estrogen replacement are modulated by aging.
Neuroscience, v.119, p.821-830, 2003.
SAWAI T, BERNIER F, FUKUSHIMA T, HASHIMOTO T, OGURA H, NISHIZAWA Y. Estrogen induces a rapid increase of
calcium-calmodulin-dependent protein kinase II activity in the hippocampus. Brain Res, v.950, p.308–311, 2002.
SAYKIN AJ, WISHART HA, RABIN LA, SANTULLI RB, FLASHMAN LA, WEST JD. Older adults with cognitive complaints
show brain atrophy similar to that of amnestic MCI. Neurology, v.67, p.834-842, 2006.
SCHMIDT R. Cell-adhesion molecules in memory formation. Behav. Brain Res., 66: 65-72, 1995
SHERWIN BB. Estrogen and cognitive functioning in women. Endocr Rev, v.24, p.133-151, 2003.
SHERWIN BB. The critical period hypothesis: can it explain discrepancies in the oestrogen-cognition literature. J of
Neuroendocrinology, v.19, p.88-81, 2007.
SHUGHRUE P, SCRIMO P, LANE M, ASKEW R, MERCHENTHALER I. The distribution of estrogen receptor-β mRNA in
forebrain regions of the estrogen receptor-α knockout mouse. Endocrinology, v.138, p.5649-5652, 1997a.
SHUGHRUE PJ, LANE MV, MERCHENTHALER I. Comparative distribution of estrogen receptor-α and -β mRNA in the rat
central nervous system. J Comp Neurol, v.388, p.507-525, 1997b.
SHUGHRUE PJ, MERCHENTHALER I. Evidence for novel estrogen binding sites in the rat hippocampus. Neuroscience, v.99,
p.605-612, 2000.
SHUGHRUE PJ, SCRIMO PJ, MERCHENTHALER I. Estrogen binding and estrogen receptor characterization (ERα and ERβ) in
the cholinergic neurons of the rat basal forebrain. Neuroscience, v.96 (1), p.41-49, 2000.
SILVA RH, BELLOT RG, VITAL MA, FRUSSA-FILHO R. Effects of long-term ganglioside GM1 administration on a new
discriminative avoidance test in normal adult mice.Psychopharmacology. 1997;129(4):322-8.
SILVA RH, BERGAMO M, FRUSSA-FILHO R. Effects of neonatal ganglioside GM1 administration on memory in adult and old
rats. Pharmacol Toxicol. 2000;87(3):120-5.
60
SILVA RH, CHEHIN AB, KAMEDA SR, TAKATSU-COLEMAN AL, ABILIO VC, TUFIK S, FRUSSA-FILHO R. Effects of
pre- or post-training paradoxical sleep deprivation on two animal models of learning and memory in mice. Neurobiol Learn Mem.
2004;82(2):90-8.
SILVA RH, FRUSSA-FILHO R. Naltrexone potentiates both amnestic and anxiolytic effects of chlordiazepoxide in mice. Life Sci.
2002; 72(6):721-30.
SILVA RH, KAMEDA SR, CARVALHO RC, RIGO GS, COSTA KL, TARICANO ID, FRUSSA-FILHO R. Effects of
amphetamine on the plus-maze discriminative avoidance task in mice. Psychopharmacology. 2002a; 160(1):9-18.
SILVA RH, FELICIO LF, FRUSSA-FILHO R. Ganglioside GM1 attenuates scopolamine-induced amnesia in rats and mice.
Psychopharmacology, v.141(2), p.111-117, 1999.
SILVA RH, FRUSSA-FILHO R. The plus-maze discriminative avoidance task: a new model to study memory-anxiety interactions.
Effects of chlordiazepoxide and caffeine. J Neurosci Methods, v.102(2), p.117-125, 2000.
SILVA RH. Esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado: um novo modelo animal para o estudo das interações entre
memória e ansiedade. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. UNIFESP, São Paulo, 2001.
SINCHAK K, ECKERSELL C, QUEZADA V, NORELL A, MICEVYCH P. Preproenkephalin mRNA levels are regulated by
acute stress and estrogen stimulation. Physiol Behav, v.69, p.425-432, 2000.
SNYDER PJ, BEDNAR MM, CROMER JR, MARUFF P. Reversal of scopolamine- induced deficits with a single dose of
donepezil, an acetylcholinesterase inhibitor. Alzheimer’s & Dementia, v.1(2), p.126-135, 2005.
SPENCER JL, WATERS EM, ROMEO RD, WOOD GE, MILNER TA, MCEWEN BS. Uncovering the mechanisms of estrogen
effects on hippocampal function. Front Neuroendo, v.29, p.219-237, 2008.
SQUIRE LR, KANDEL ER (2000) Memory: from mind to molecules. W.H. Freeman and Company, New York.
SQUIRE LR, KNOWLTON B, MUSEN G. The structure and organization of memory. Annu Rev Psychol. 1993; 44:453-95.
SQUIRE LR. Memory and brain. Oxford: Oxford University Press, 1987.
SQUIRE LR. Memory and the hippocampus: A synthesis from findings with rats, monkeys, and humans. Psychological Review,
v.99, p.195-231, 1992.
SQUIRE LR. Memory systems of the brain: A brief history and current perspective. Neurobiol Learn Mem, v.82, p.171-177, 2004.
SQUIRE LR; ZOLA-MORGAN M. The medial temporal lobe memory systems. Science, 253: 1380-1386, 1988.
SUNDERLAND T, TARIOT PN, NEWHOUSE PA. Differential responsivity of mood, behavior, and cognition to cholinergic
agents in elderly neuropsychiatric populations. Brain Research Reviews, v.13, p.371-389, 1988.
TANAPAT P, HASTINGS NB, REEVES AJ, GOULD E. Estrogen stimulates a transient increase in the number of new neurons in
the dentate gyrus of the adult female rat. J Neurosci, v.19, p.5792-5801, 1999.
THOMPSON HT, COTTERILL D. Note on the use of scopolamine–morphine combination as an anaesthetic adjunct. Edinburgh
Med J, v.3, p. 548-554, 1909.
TINKLER GP, VOYTKO ML. Estrogen modulates cognitive and cholinergic processes in surgically menopausal monkeys.
Progress in Neuropsychopharm & Biol Psychiatry, v.29, p.423-431, 2005.
TORAN-ALLERAND CD, GUAN X, MACLUSKY NJ, HORVATH TL, DIANO S, SINGH M. ER-X: a novel, plasma membrane-
associated, putative estrogen receptor that is regulated during development and after ischemic brain injury. J Neurosci, v.22, p.8391-
8401, 2002.
TOWART LA, ALVES SE, ZNAMENSKY V, HAYASHI S, MCEWEN BS, MILNER TA. Subcellular relationships between
cholinergic terminals and estrogen receptor-alpha in the dorsal hippocampus. J Comp Neurol, v.463, p.390-401, 2003.
VASUDEVAN N, KOW LM, PFAFF DW. Early membrane estrogenic effects required for full expression of slower genomic
actions in a nerve cell line. Proc Natl Acad Sci, v.98, p.12267-12271, 2001.
WADE CB, ROBINSON S, SHAPIRO RA, DORSA DM. Estrogen receptor ERa and ERb exhibit unique pharmacologic properties
when coupled to activation of the mitogen-activated protein kinase pathway. Endocrinology, v.142, p.2336-2342, 2001.
WALF AA, FRYE CA. Anti-nociception following exposure to trimethylthiazoline, peripheral or intra-amygdala estrogen and/ or
progesterone. Behav Brain Res, v.144, p.77-85, 2003.
WALF AA, FRYE CA. Rapid and estrogen receptor beta mediated actions in the hippocampus mediate some functional effects of
estrogen. Steroids, v.73, p.997–1007, 2008.
WALF AA, SUMIDA K, FRYE CA. Inhibiting 5a-reductase in the amygdala attenuates anti-anxiety and anti-depressive behavior of
naturally-receptive and hormone-primed ovariectomized rats. Psychopharmacology (in press), 2005.
WALKER DL, TOUFEXIS DJ, DAVISM. Role of the bed nucleus of the stria terminalis versus the amygdala in fear, stress, and
anxiety. Eur J Pharmacol, v.463, p.199-216, 2003.
WALLENSTEIN GV, VAGO DR. Intrahippocampal scopolamine impairs both acquisition and consolidation of contextual fear
conditioning. Neurobiol of Learning and Memory, v.75, p.245-252, 2001.
WARREN SG, HUMPHREYS AG, JURASKA JM, GREENOUGH WT. LTP varies across the estrous cycle: Enhanced synaptic
plasticity in proestrus rats. Brain Res, v.703, p.26-30, 1995.
WATTERS JJ, CAMPBELL JS, CUNNINGHAM MJ, KREBS EG, DORSA DM. Rapid membrane effects of steroids in
neuroblastoma cells: effects of estrogen on mitogen activated protein kinase signalling cascade and c-fos immediate early gene
transcription. Endocrinology, v.138, p.4030-4033, 1997.
WEISSMAN MM, KLERMAN GL. Sex differences and the epidemiology of depression. Arch Gen Psychiatr, v.34, p.98-111, 1977.
WESSLER I, KIRKPATRICK CJ. Acetylcholine beyond neurons: the non-neuronal cholinergic system in humans. British J of
Pharmacol, v.154, p. 1558-1571, 2008.
WHITEHOUSE PJ, PRICE DL, STRUMBLE RG, CLARK AW, COYLE JT, DELONG MR. Alzheimer’s disease and senile
dementia: Loss of neurons in the basal forebrain. Science, v.215, p.1237-1239, 1982.
WINK AM, BERNARD F, SALVADOR R, BULLMORE ET, SUCKLING J. Age and cholinergic effects on hemodynamic and
functional coherence of the human hippocampus. Neurobiology of Aging, v.27, p.1395–1404, 2006.
WISE, PM. New understanding of the complexity of the menopause and challenges for the future. Proceedings of the International
Symposium on the Biology of Menopause; Norwell, MA, p.1-8, 2000.
WISHART HA, SAYKIN AJ, RABIN LA, SANTULLI RB, FLASHMAN LA, GUERIN SJ. Increased Brain Activation During
Working Memory in Cognitively Intact Adults With the APOE {epsilon} 4 Allele. Am J Psychiatry, v.163, p.1603-1610, 2006.
WOOLLEY CS, GOULD E, FRANKFURT M, MCEWEN BS. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult
hippocampal pyramidal neurons. J Neurosci, v.10, p.4035-4039, 1990.
WOOLLEY CS, MCEWEN BS. Estradiol mediates fluctuation in hippocampal synapse density during the estrous cycle in the adult
rat. J Neurosci, v.12, p.2549-2554, 1992.
WOOLLEY CS. Acute effects of estrogen on neuronal physiology. Ann Rev Pharmcol Toxicol, v.47, p.657-680, 2007.
61
WU X, GLINN MA, OSTROWSKI NL, SU Y, NI B, COLE HW, BRYANT HU, PAUL SM. Raloxifene and estradiol benzoate
both fully restore hippocampal choline acetyltransferase activity in ovariectomized rats. Brain Res, v.847, p.98-104, 1999.
ZANDI PP, CARLSON MC, PLASSMAN BL, WELSH-BOHMER KA, MAYER LS, STEFFENS DC, BREITNER JCS. Hormone
replacement therapy and incidence of Alzheimer disease in older women. JAMA, v.288, p.2123–2129, 2002a.
ZEC RF, TRIVEDI MA. The effects of estrogen replacement therapy on neuropsychological functioning in postmenopausal women
with and without dementia: a critical and theoretical review. Neuropsychology Review, v.12, p.65-109, 2002.
ZIMMERBERG B, FARLEY MJ. Sex differences in anxiety behavior in rats: role of gonadal hormones. Physiol Behav, v.54,
p.1119–1124, 1993.