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Gisele Almeida Lima Veiga

Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta

durante a gestação e parto em cadelas

São Paulo 2008

Gisele Almeida Lima Veiga

Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta

durante a gestação e parto em cadelas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Departamento:

Reprodução Animal

Área de concentração: Reprodução Animal

Orientador: Profa. Dra. Camila Infantosi Vannucchi

São Paulo 2008

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.1987 Veiga, Gisele Almeida Lima FMVZ Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no

endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas / Gisele Almeida Lima Veiga. – São Paulo : G. A. L. Veiga, 2008. 73 f. : il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Reprodução Animal, 2008.

Programa de Pós-Graduação: Reprodução Animal. Área de concentração: Reprodução Animal.

Orientador: Profa. Dra. Camila Infantosi Vannucchi.

1. Estrógeno. 2. Ocitocina. 3. Gestação. 4. Parto. 5. Cadelas. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome: VEIGA, Gisele Almeida Lima Título: Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária

Data:____/____/____

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________

Assinatura: ___________________________ Julgamento: __________________





RESUMO

VEIGA, G. A. L. Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas. [Expression of the canine estrogen and oxytocin receptor genes in the endometrium, myometrium and placenta during pregnancy and parturition]. 2008. 73 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) � Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. As diversas interações hormonais durante e gestação e parto na espécie canina são

parcialmente conhecidas. A resposta dos tecidos frente ao estímulo hormonal é

dependente da expressão gênica de seus receptores, bem como da concentração

local dos hormônios. Desta maneira, o presente estudo apresentou como objetivos:

caracterizar a expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no

endométrio, miométrio e placenta, correlacionando com as concentrações séricas

dos respectivos hormônios durante a gestação e o parto. As cadelas gestantes

foram alocadas em 4 grupos de acordo com a idade gestacional: até 20 dias de

gestação (grupo 1, n=11), de 20 a 40 dias de gestação (grupo 2, n=12), de 40 a 60

dias de gestação (grupo 3, n=12) e em pródromos do parto (grupo 4, n=11). As

cadelas dos grupos 1, 2 e 3 foram submetidas à ovário-histerectomia e as cadelas

do grupo 4, à cesariana seguida da ovário-histerectomia. Amostras de endométrio,

miométrio e placenta foram colhidas, bem como amostras de sangue para obtenção

do soro sangüíneo. A extração do RNA total e a confecção do cDNA das amostras

foram realizadas a partir de kits comerciais. As reações da PCR em tempo-real

foram realizadas para os genes (RNAm) do receptor do estrógeno α (REα) e

receptor da ocitocina (OTR), utilizando o 18S e RPS5 como controles endógenos. As

dosagens hormonais foram realizadas por radioimunoensaio. A expressão gênica do

RNAmREα e RNAmOTR diferiram de acordo com o tecido e período gestacional. No

endométrio, a expressão do RNAmREα foi constante durante toda a gestação e

parto, enquanto que o RNAmOTR foi mais expresso no grupo 4. Em relação ao

miométrio, a expressão do RNAmREα foi maior nos grupos 2 e 4, já o RNAmOTR foi

mais expresso nos grupos 3 e 4. Na placenta, o RNAmREα apresentou maior

expressão nos grupos 1 e 2, e o RNAmOTR não sofreu mudanças durante a

gestação e o parto. As concentrações séricas de ocitocina mantiveram-se

constantes, enquanto os níveis estrogênicos aumentaram a partir de 40 dias de

gestação até o início do parto. Conclui-se que a expressão gênica dos REα e OTR

diferem de maneira temporal durante a gestação e o parto nos tecidos avaliados e

as concentrações séricas de ocitocina não interferem na expressão gênica de tais

receptores, enquanto os níveis de estrógeno elevam-se ao final da gestação, sendo

possível atribuir a tal perfil a diferente modulação dos REα e OTR nos tecidos

estudados.

Palavras-chave: Estrógeno. Ocitocina. Gestação. Parto. Cadelas.

ABSTRACT

VEIGA, G. A. L. Expression of the canine estrogen and oxytocin receptor genes in the endometrium, myometrium and placenta during pregnancy and parturition [Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas]. 2008. 73 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) � Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Several hormone interactions during pregnancy and parturition in the canine species

are still unknown. Tissue response to hormonal stimulation is dependent on the

expression of its receptor gene, as well as of the local hormonal concentration.

Hence, the present study aimed to characterize the expression of the canine

estrogen and oxytocin receptor genes in the endometrium, myometrium and placenta

and its correlation with blood levels of the referred hormones during pregnancy and

parturition. Pregnant bitches were allocated into 4 groups according to the

gestational period: up to 20 days of pregnancy (Group 1, n=11), from 20 to 40 days

of pregnancy (Group 2, n=12), from 40 to 60 days of pregnancy (Group 3, n=12) and

in the early stage of labor (Group 4, n=11). Bitches from groups 1, 2 and 3 were

subjected to ovaryhisterectomy and bitches from group 4 were submitted to cesarian

section followed by ovaryhistectomy. Endometrium, myometrium and placenta

samples were colleted, as well as blood samples. Extraction of the total RNA and

cDNA synthesis were accomplished through commercial kits. The real-time PCR

reactions were performed for the estrogen-α (REα) and oxytocin (OTR) receptor

genes, using the 18S and RPS5 as control. Estrogen and oxytocin hormonal assays

were performed by radioimunoassay. The results of the mRNAREα and mRNAOTR

gene expression differed among gestational periods and tissues. In the endometrium,

RNAmREα expression was homogeneous during pregnancy and labor, whereas

group 4 presented a higher expression of RNAmOTR. In relation to the myometrium,

RNAmREα expression increased in groups 2 and 4, whilst RNAmOTR expression

was higher in groups 3 and 4. In the placenta, groups 1 and 2 presented the highest

RNAmREα expression and the RNAmOTR expression did not change during

pregnancy and parturition. Blood concentration of oxytocin remained constant, while

estrogen levels increased from 40 days of gestation to labor. In conclusion, the

expression of canine REα and OTR genes differed temporally during pregnancy and

parturition in the experimented tissues. Oxytocin blood levels did not influence the

receptor gene expression, whereas estrogen concentrations increased at the end of

the gestation, possible modulating REα and OTR expression in the canine

endometrium, myometrium and placenta.

Keywords: Estrogen. Oxytocin. Pregnancy. Parturition. Bitches.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 20

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................. 24

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................... 32

3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS ............................................... 32

3.2 COLHEITA DAS AMOSTRAS................................................................. 33

3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS.................................................. 34

3.3.1 Isolamento do RNA total................................................................... 34

3.3.1.1 Placenta....................................................................................... 34

3.3.1.2 Endométrio e miométrio............................................................ 34

3.3.2 Quantificação do RNA total............................................................ 35

3.3.3 Síntese do cDNA............................................................................ 35

3.3.4 Reação de amplificação por PCR em tempo real........................... 36

3.3.5 Dosagens hormonais...................................................................... 37

3.3.5.1 Dosagem de estrógeno............................................................. 37

3.3.5.2 Dosagem de ocitocina............................................................... 37

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................... 38

4 RESULTADOS ........................................................................................ 41

4.1

ANÁLISE DAS VARIÂNCIAS DOS CONTROLES ENDÓGENOS NOS

DIFERENTES TECIDOS..........................................................................

42

4.2 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NA

PLACENTA..............................................................................................

43

4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO

ENDOMÉTRIO........................................................................................

46

4.4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO

MIOMÉTRIO...........................................

48

4.5 ANÁLISE DAS DOSAGENS HORMONAIS............................................ 52

4.5.1 Dosagem de estrógeno................................................................ 52

4.5.2 Dosagem de ocitocina.................................................................. 52

5 DISCUSSÃO ........................................................................................... 55

6 CONCLUSÃO ......................................................................................... 62

REFERÊNCIAS ....................................................................................... 64

LISTA DE FIGURAS

Figura 1-

Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno 18S.................................................................................................

41

Figura 2-

Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno RPS5..............................................................................................

41

Figura 3- Curva de amplificação e dissociação do RNAmREα..................................................................................... 42

Figura 4- Curva de amplificação e dissociação do RNAmOTR..................................................................................... 42

Figura 5-

Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18s na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

44

Figura 6-

Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

44

Figura 7-

Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18s na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

45

Figura 8-

Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4....................................................................................................

45

Figura 9-

Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18s no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

46

Figura 10-

Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................

46

Figura 11-

Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18s no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................

47

Figura 12-

Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

47

Figura 13-

Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18s no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

48

Figura 14-

Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................

48

Figura 15-

Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18s no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................

49

Figura 16-

Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................

49

Figura 17-

Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 1.....................................................................................................

50

Figura 18-

Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 2......................................................................................................

50

Figura 19-

Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 3.....................................................................................................

51

Figura 20- Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 4......................................................................................................

51

Figura 21- Concentrações séricas de estrógeno nos grupos 1, 2, 3 e 4...................................................................................................... 52

Figura 22- Concentrações séricas de ocitocina nos grupos 1, 2, 3 e 4...................................................................................................... 53

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Idade gestacional (dias) nos grupos experimentais 1, 2, 3 e 4...................................................................................................... 33

Quadro 2- Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores e suas temperaturas de anelamento...................................................... 36

LISTA DE TABELAS Tabela 1-

Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica na placenta............................................................................................

43

Tabela 2-

Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no miométrio.........................................................................................

43

Tabela 3-

Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no endométrio......................................................................................

43

INTRODUÇÃOT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

INTRODUÇÃO

T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A

20

1 INTRODUÇÃO

A fisiologia e endocrinologia da gestação e parto nos animais domésticos

contêm eventos ainda desconhecidos, os quais estão se tornando passíveis de

reconhecimento com o emprego de novas técnicas de biologia molecular. Na

espécie canina, não se conhece detalhadamente as interações endócrinas e suas

conseqüentes alterações fisiológicas durante todo o período gestacional e no

momento do parto. A interação dos hormônios com seus receptores é responsável

por mudanças convergentes. Entretanto, a síntese e secreção, bem como a ação

hormonal não são plenamente conhecidas durante a gestação. A resposta do tecido-

alvo à ação de certos hormônios é determinada tanto pela presença de receptores

específicos quanto por sua concentração local. Nos últimos anos, poucos foram os

estudos concernentes à expressão gênica dos principais receptores hormonais

frente às mudanças uterinas que ocorrem durante a gestação e parto. Em relação à

espécie canina, não há até o momento pesquisas que elucidem tais mecanismos.

O período gestacional é caracterizado por altas concentrações de

progesterona, hormônio fundamental para a manutenção da gestação, por promover

o desenvolvimento endometrial, manter a integridade placentária, reduzir a atividade

miometrial e a sensibilidade à ocitocina, tornando o útero quiescente

(CONCANNON, 1986). Durante o curso da gestação, a produção de estrógeno

ocorre em vários tecidos e sua ação, em contraposição aos estímulos

progestacionais, contribui para o crescimento uterino necessário para o bem

sucedido desenvolvimento embrionário e fetal. A produção placentária de estrógeno,

em bovinos e mulheres gestantes, é precípua para a viabilidade fetal. Já em ovelhas,

a produção de estrógeno na placenta é induzida somente pelo cortisol fetal, como

estímulo para contração miometrial e liberação de prostaglandina no parto

(DOBSON et al., 1993; WOOD, 1999; KINDAHL, 2002). O receptor de estrógeno

(RE) e o RNAmRE estão presentes na musculatura lisa uterina e nas células ao

redor dos vasos sangüíneos do miométrio, indicando o envolvimento estrogênico na

contratilidade do miométrio e fluxo sangüíneo durante a gestação (WU et al., 1996a).

O principal evento endócrino durante o parto refere-se ao rápido aumento da

relação estrógeno/progesterona placentários. A queda dos níveis de progesterona e

INTRODUÇÃO


21

o aumento de estrógeno são possivelmente as principais causas para o

descolamento de placenta, dilatação da cérvix e aumento da contratilidade uterina

(CONCANNON, 1986). O estrógeno estimula o parto por ampliar a expressão dos

genes responsáveis pela excitabilidade e contração miometrial, aumentando no

decorrer da gestação a sensibilidade uterina à ocitocina (FUCHS, 1983). Em

ovelhas, a atuação do estrógeno associada à queda da atividade progestacional ao

final da gestação é responsável por induzir a expressão dos receptores de ocitocina

(ROT) durante o trabalho de parto (LACHER et al., 1995). O controle do RNAmROT

no útero é mediado pelo REalfa (REα), este último, por sua vez, é regulado pela

queda da progesterona (MURATA et al., 2003). Além da importante expressão no

miométrio e glândula mamária, o ROT também está presente no endométrio,

placenta, ovário, testículos, epidídimo, ductos deferentes, timo, coração e rim, bem

como no tecido cerebral (KIMURA, 2003).

A ativação dos ROT nos tecidos alvos está na dependência das

concentrações locais de ocitocina. Por esse motivo, a ação da ocitocina circulante

nos receptores miometriais é controversa em humanos, pois as concentrações

séricas permanecem baixas durante toda a gestação e parto (MITCHELL et al.,

1998). Por outro lado, as concentrações plasmáticas de ocitocina elevam-se no

período que antecede o parto em primatas, demonstrando a ação endócrina e não

autócrina ou parácrina da ocitocina (HIRST et al., 1993).

Em suínos, os altos níveis séricos de estrógeno ao final da gestação

induzem a transcrição do RNAmROT no endométrio. Neste local, a ação da

ocitocina é responsável pela liberação de PGF2α, promovendo a luteólise pré-parto

(OPONOWICZ et al., 2006). A expressão do RNAmOTR no miométrio é

extremamente importante ao final da gestação em ratas, tornando-se máxima no

parto. A ligação da ocitocina ao seu receptor promove aumento do cálcio intracelular

e consequente contração miometrial. Já na placenta, a expressão do RNAmOTR

mantém-se baixa durante toda a gestação (CHAN et al., 1993).

O estudo da expressão gênica dos receptores hormonais bem como o

perfil endócrino nas diferentes fases da gestação e parto poderão esclarecer a razão

para diferentes respostas nos vários tecidos, frente ao estímulo hormonal. A partir

destes conhecimentos, será possível a aplicação terapêutica de determinados

hormônios em situações fisiológicas ou complicações durante a gestação e o parto.

INTRODUÇÃO


22

Em face do exposto, os objetivos do presente estudo foram:

1) Determinar a expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina

no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em

cadelas.

2) Determinar as concentrações séricas de estrógeno e ocitocina ao longo da

gestação e parto.

3) Correlacionar os níveis séricos de estrógeno e ocitocina com a expressão

de seus respectivos receptores locais.

REVISÃO DE LITERATURAT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

REVISÃO DE LITERATURA


24

2 REVISÃO DE LITERATURA

A gestação e o parto são eventos caracterizados por mudanças

hormonais que resultam no desenvolvimento bem sucedido e nascimento de um ou

mais membros de uma mesma espécie (CHALLIS; LYE, 1994). Neste particular

sentido, os hormônios esteróides (progesterona e estrógeno) desempenham

importante papel na manutenção da gestação e no início do trabalho de parto, por

meio da constante modulação da excitabilidade e contratilidade miometrial

(MESIANO et al., 2002).

A secreção pituitária de hormônios luteotróficos, como o hormônio

luteinizante (LH) e a prolactina, é responsável pela manutenção dos níveis elevados

de progesterona durante a gestação (CONCANNON, 1980). A progesterona

promove o desenvolvimento endometrial e a integridade placentária e previne o

parto por reduzir a atividade miometrial e a sensibilidade à ocitocina, desta maneira,

proporciona a quiescência miometrial (CONCANNON, 1986; MESIANO et al., 2002).

Em contrapartida, o rápido aumento da relação estrógeno/progesterona placentários

é o principal evento endócrino responsável pelo desencadeamento do parto, ou seja,

a queda dos níveis de progesterona e o aumento estrogênico são provavelmente as

maiores causas de descolamento placentário, dilatação da cérvix e aumento da

contratilidade uterina (CONCANNON, 1986).

O estrógeno livre circulante pode se apresentar sob a forma de várias

substâncias biologicamente ativas, tais como os hormônios 17β-estradiol, o sulfato

de estrona e estriol (KINDAHL, 2002). Estudos prévios demonstram que na espécie

bovina à segunda metade da gestação, a produção de estrógeno é essencialmente

placentária e, portanto, a dosagem estrogênica nesta fase pode refletir a função

placentária e, conseqüentemente, a viabilidade fetal (DOBSON et al., 1993;

KINDAHL, 2002). Em ovelhas, o cortisol fetal ao final da gestação induz a ativação

das enzimas 17α-hidroxilase e 17,20-liase placentárias, resultando no aumento dos

níveis de estrógeno e diminuição da progesterona. Os referidos eventos estimulam a

contração do miométrio, associada à secreção de prostaglandina no parto (WOOD,

1999). Na espécie humana, o estrógeno também é produzido na membrana fetal e

placenta e sua concentração aumenta no momento do parto (MITCHELL et al., 1984;

CHIBBAR et al., 1995). Todavia, na espécie canina, a concentração de estrógeno



25

aumenta lentamente durante a gestação, alcançando valores máximos de 20-30

ng/mL antes do parto, inferiores aos encontrados no final do proestro

(CONCANNON, 1975). O aumento na síntese de esteróides ovarianos é

provavelmente resultado do aumento na concentração de prolactina após 30 dias de

gestação (CONCANNON, 2001). A origem do estrógeno nas cadelas parece ser

particularmente ovariana, com menor dependência placentária. Portanto, a

mensuração deste hormônio à metade da gestação não exprime informação a

respeito da gestação e, por conseguinte, da viabilidade fetal (HOFFMANN et al.,

1994; CONCANNON; VERSTEGEN, 1999; ONCLIN et al., 2002). Desta maneira, a

ovariectomia em qualquer momento do período gestacional determina a reabsorção

embrionária ou abortamento (SOKOLOWISKY, 1974).

A distribuição dos receptores hormonais nos tecidos uterinos é crucial

para predizer sua provável ação local (AMSO et al., 1994). Os receptores de

estrógeno (RE) podem ser classificados em dois subtipos (α e β) e o grau de

expressão destes receptores pode determinar a intensidade da atividade estrogênica

(TELLERIA et al., 1998). Os REα e REβ são transcritos por diferentes genes e foram

caracterizados a partir do útero de mulheres gestantes e próstata de ratos,

respectivamente (GREENE et al., 1986; KUIPER et al., 1996). Os subtipos de RE

são expressos diferencialmente em vários tecidos uterinos durante a gestação e

parto, como no endométrio e miométrio, bem como nos folículos ovarianos e no

corpo lúteo de várias espécies (KUIPER et al., 1997; SAUNDERS et al., 1997;

TESSIER et al., 2000). Telleria et al. (1998) demonstraram que em ratas o

RNAmREα é expresso nos folículos ovarianos pequenos e em crescimento, porém

com sinalização mais abundante no corpo lúteo. A expressão do RNAmREβ no

corpo lúteo é semelhante durante toda a gestação, declinando no momento do parto;

enquanto a expressão do RNAmREα é baixa ao início da gestação, apresenta

expressão máxima à metade da gestação, reduzindo no momento do parto.

Segundo Wu et al. (1996a), tanto o RE quanto o RNAmRE estão

presentes na musculatura lisa do útero e em células ao redor dos vasos sangüíneos

do miométrio, o que indica o envolvimento do estrógeno na contratilidade do

miométrio e fluxo sangüíneo durante a gestação. O aumento do RNAmRE no

miométrio é decorrente da elevação do cortisol fetal ao final da gestação em

ovelhas, fato que caracteriza maior atividade do RE e, como conseqüência, aumento

da resposta do miométrio a este hormônio durante o trabalho de parto.



26

A expressão do RNAmREα é mediada por mecanismos distintos do

RNAmREβ nas diferentes espécies. A queda dos níveis de progesterona aumenta a

síntese, transcrição e expressão do RNAmREα, enquanto que a indução do

RNAmREβ depende de outros fatores ovarianos ou fatores feto-placentários

(MURATA et al., 2003). A progesterona atua suprimindo a expressão do RNAmREα

em vários tecidos de ratos. Entretanto, tal ação inibitória não foi evidenciada no

miométrio e endométrio de ovelhas (WU et al., 1996a). A expressão dos receptores

de estrógeno, progesterona e ocitocina no endométrio de ruminantes é alterada por

produtos embrionários, como o interferon-tau (SPENCER et al., 1995 a,b;

SPENCER; BAZER, 1996). A presença do embrião impede o aumento dos

receptores de estrógeno e ocitocina no útero e impede a liberação de prostaglandina

F2α (PGF2α) (WHATES; HANON, 1993). Até o momento, não existem relatos do

mecanismo de reconhecimento materno em cadelas como há nas demais espécies.

Portanto, a regulação hormonal com referência aos esteróides e ocitocina durante a

gestação é ainda propósito de pesquisa na endocrinologia canina.

Segundo Soloff (1975), o estrógeno atua diretamente sobre a expressão

de receptores de ocitocina (OTR) em ratas e coelhas não-gestantes. O REα é o

subtipo mais predominante no útero de ratas durante a gestação e parto e, desta

maneira, é o receptor envolvido diretamente no aumento do OTR (LARCHER et al.,

1995). Os níveis de RNAmREα aumentam gradualmente no útero durante a

gestação até o parto, no entanto, a máxima expressão do RNAmOTR ocorre no

momento do parto. O fato do REα ser o receptor predominante no útero durante a

gestação e ocorrer aumento concomitante do RNAmREα e RNAmOTR no parto,

sugere que o REα é o mediador da expressão do RNAmOTR no útero (MURATA et

al., 2003).

Durante o trabalho de parto, é preciso que o miométrio altere seu estado

quiescente para o estado contrátil. Esta transição é resultado do aumento de

estímulos contráteis e ausência de mecanismos que promovam relaxamento uterino,

o que requer a queda da atividade progestacional e ativação estrogênica (CHALLIS;

LYE, 1994). A função da progesterona no parto não está totalmente estabelecida,

entretanto, foi demonstrado que na placenta de mulheres gestantes, a progesterona

bloqueia o efeito estimulatório do estrógeno no RNAm da ocitocina (CHIBBAR et

al.,1995). Em humanos, também foi evidenciado que a resposta do miométrio à



27

progesterona diminui concomitantemente ao aumento coordenado na expressão do

REα (VEGETO et al., 1993; MESIANO et al., 2002).

O estrógeno e a progesterona são os mais importantes controladores da

síntese de ocitocina e aumento de seus receptores. A progesterona apresenta efeito

positivo na síntese da ocitocina, entretanto, regula negativamente o OTR. Por outro

lado, o estrógeno apresenta tanto efeito estimulatório para a síntese de ocitocina

como para o aumento da concentração do OTR (MITCHELL et al., 1998). O número

de OTR eleva-se durante a fase folicular do ciclo e diminui na fase lútea, refletindo o

efeito positivo e negativo do estrógeno e progesterona na síntese e degradação de

receptores, respectivamente (LESSEY, 1988; NOE, 1999). Do início à metade da

fase lútea, a progesterona atua nos receptores presentes no endométrio inibindo a

expressão do RE e suprimindo a formação do OTR (McCRACKEN et al., 1984).

Entretanto, a exposição contínua do endométrio à progesterona diminui

gradualmente a expressão do seu receptor (RP). Desta maneira, a progesterona

perde a habilidade de bloquear a formação do OTR e o endométrio torna-se sensível

aos efeitos do estrógeno (NOE, 1999). O aumento do estrógeno e do RE promove

tanto a formação do OTR quanto a liberação de PGF2α, culminando com a luteólise

(SPENCER et al., 1995b).

Até a última década, muitos pesquisadores consideravam a ocitocina

como um hormônio sintetizado no núcleo paraventricular e supra-óptico do

hipotálamo, transportado pelos axônios e armazenado nos grânulos secretórios da

hipófise posterior. Quando liberado na circulação, causa contração do miométrio

durante a gestação e descida do leite durante a lactação (MITCHELL et al., 1998).

Entretanto, a função da ocitocina no trabalho de parto não requer necessariamente o

aumento de sua concentração plasmática (WU et al., 1996b). Vários estudos

demonstram que a sensibilidade do miométrio à ocitocina aumenta durante o parto.

No entanto, este evento ocorre como resultado do aumento da concentração do

OTR e da concentração local deste hormônio (FUCHS, 1983; WU et al., 1996b). O

estudo da síntese de ocitocina em um sistema parácrino no útero gestante pode

esclarecer alguns dogmas a respeito da função da ocitocina no início do trabalho de

parto em humanos (MITCHELL et al., 1998).

A ocitocina é importante no estágio expulsivo do parto e no processo de

involução uterina. Os trabalhos relativos à espécie humana demonstram que a

concentração de ocitocina é baixa na mulher não gestante e mantém-se baixa



28

durante a gestação (MITCHELL et al., 1998). As mulheres com disfunção pituitária

aparentemente evoluem para parto normal, fato que sugere importantes

controvérsias em relação ao papel desempenhado pela ocitocina no parto (CHARD,

1989). Desta forma, propõe-se que a ocitocina local (uterina ou placentária) seja

iniciadora do parto, como resultado do aumento do RNAmOT na placenta humana

(CHIBBAR, 1993; MITCHELL, 1998).

Em várias espécies, a concentração de ocitocina no plasma materno é

maior durante o parto em relação ao período precedente (HIRST et al., 1993). A

redução na metabolização da ocitocina ao final da gestação pode ser em parte

responsável pelas altas concentrações observadas no parto (MITCHELL et al.,

1997). A atividade ocitocinase é uma forma comum de degradação da ocitocina, por

meio de enzimas que quebram as ligações entre os aminoácidos que formam a

molécula de ocitocina (BURBACH; LEBOUILLE, 1982). A atividade ocitocinase em

tecidos intra-uterinos em mulheres e ratas foi demonstrada anteriormente e tais

estudos sugerem que o catabolismo da ocitocina nestes locais reduz-se antes do

parto, resultando em significativo aumento da concentração local de ocitocina

(MITCHELL; WONG, 1996; MITCHELL et al., 1997). Em ratas, o declínio de

aproximadamente 25% na atividade ocitocinase ao final da gestação é responsável

pelo significativo aumento da ocitocina no útero neste período (MITCHELL et al.,

1998). A atividade de tais enzimas não foi evidenciada em cães, o que sugere que

outros fatores possam modificar a meia vida e o metabolismo da ocitocina durante o

parto nesta espécie (OLSSON et al., 2003).

A liberação da ocitocina é pulsátil, com amplitude de curta duração e meia

vida plasmática de poucos minutos (THORTON et al., 1990). Pesquisas demonstram

aumento na freqüência de pulsos da ocitocina até o começo do parto (DAWOOD et

al., 1978; OTSUKI et al., 1983; FUCHS et al., 1991). Em humanos e ratas, altas

concentrações de ocitocina plasmática correlacionam-se com altas concentrações

de estradiol. Por este motivo, o tratamento com estradiol em mulheres pode

aumentar a concentração de ocitocina plasmática (AMICO et al., 1981; YAMAGUCHI

et al., 1979).

Chann et al. (1993) postulam a existência de dois subtipos de receptores

de ocitocina no útero de ratas, os quais estão relacionados com a formação de

junções do tipo gap entre as células miometriais e com a liberação de prostaglandina

no endométrio e placenta. O aumento do RNAmOTR e do OTR foi demonstrado no



29

endométrio e miométrio de ovelhas durante o parto, sugerindo expressão

semelhante nestes tecidos (WU et al., 1996b). O OTR apresenta diferentes funções

no endométrio e miométrio, pois sua ativação promove a contração do miométrio por

elevação do cálcio intracelular e no endométrio resulta na liberação de PGF2α.

Portanto, a ocitocina pode estimular a contração do miométrio por dois mecanismos

paralelos. O primeiro envolve a ação direta do OTR nas células do miométrio,

resultando em mudança na concentração de cálcio intracelular e aumento da

contratilidade uterina (CHALLIS et al., 1994). O segundo mecanismo envolve a

estimulação indireta da contração uterina por meio da síntese de prostaglandina pelo

endométrio (FUCHS, 1983; RIEMER et al., 1986;). Por outro lado, em ratas, tal

homologia não foi observada, sendo o OTR expresso no miométrio, mas não no

endométrio (LARCHER et al., 1995). A expressão do RNAmOTR durante a luteólise

em porcas é mais acentuada no miométrio, em comparação com o início da

gestação (FRANCZAK et al., 2005; OPONOWICZ et al., 2006). Tais evidências

sugerem que o controle da expressão do OTR no útero de porcas dependente da

célula uterina (OPONOWICZ et al., 2006). A existência de dois subtipos de

receptores de ocitocina no útero é um fator importante a se levar em consideração

ao se optar por antagonistas de ocitocina como agentes tocolíticos no tratamento

clínico do parto prematuro. Para serem eficientes, os antagonistas da ocitocina

precisam bloquear a ação uterotônica e a liberadora de prostaglandina.

A ação exata da ocitocina durante o parto ainda permanece

desconhecida, pois estudos recentes demonstram a expressão gênica da ocitocina

também em tecidos periféricos (MITCHELL et al., 1997). A expressão do OTR foi

caracterizada não apenas no miométrio e glândula mamária, mas também no

endométrio, placenta, ovário, testículo, epidídimo, ductos deferentes, timo, coração e

rim, assim como no cérebro de diversas espécies animais (KIMURA, 1999; GIMPLE,

2001). Portanto, além da função endócrina da ocitocina no parto, sugere-se também

ação parácrina ou autócrina (MITCHELL et al., 1997). O primeiro relato da síntese de

ocitocina em tecidos periféricos foi realizado no corpo lúteo ovino, ao serem

observadas altas concentrações locais deste hormônio (WATHES et al., 1982). O

corpo lúteo e a hipófise armazenam e liberam ocitocina. Todavia, a presença de

OTR no corpo lúteo denota função autócrina (SERNIA et al., 1989). Chibbar et al.

(1993) demonstraram a presença do RNAm da ocitocina em tecidos intra-uterinos

em mulheres ao final da gestação: no âmnion e córion, mas principalmente na



30

placenta. O aumento do RNAmOTR e da ocitocina na placenta ao final da gestação

associado à proximidade anatômica com os tecidos alvos (endométrio e miométrio)

confirmam a hipótese de um sistema parácrino intra-uterino regulatório no momento

do parto (MITCHELL et al., 1998). A ativação do OTR na placenta induz a liberação

de PGF2α, promovendo contrações uterinas, relaxamento cervical e luteólise

(MITCHELL et al., 1998). No parto, a concentração do OTR no miométrio de ratas

aumenta abruptamente. Por outro lado, na placenta, as concentrações permanecem

baixas, indicando que o OTR no miométrio e na decídua são regulados por

mecanismos independentes (CHAN et al., 1993).

Durante a gestação, a concentração uterina do OTR aumenta de 6 a 80x

no momento de parto (FUCHS, 1983). Em humanos, a expressão do RNAmOTR no

miométrio aumenta em 100x com a idade gestacional de 32 semanas e 300x no

parto, comparando-se ao útero não gestante (KIMURA, 1996). Por outro lado, em

ratas, os níveis de RNAmOTR aumentam mais de 25x durante a gestação: 4,5x

durante os primeiros 21 dias de gestação, chegando a 6x entre o 21° dia e o início

do parto (LARCHER et al., 1995). Em ovelhas, o aumento no RNAmOTR é 3x maior

no corno gravídico, comparado ao não gravídico, sugerindo que a distensão uterina

ou outros fatores locais podem regular a concentração do OTR (WU et al., 1996b).

Em humanos, há descrição da síntese de ocitocina fetal ao final da

gestação, com ação reconhecida no início do trabalho de parto (CHARD, 1989). A

ocitocina atua no cérebro fetal como agente vasodilatador no endotélio de vasos

íntegros. Os episódios de baixa oxigenação no período perinatal levam à formação

de radicais peróxidos e, consequentemente, lesão no endotélio vascular. No

endotélio alterado, a ocitocina atua como agente vasoconstrictor, resultando em

isquemia e danos neurológicos (BARI et al., 1997). As ações cardiovasculares

maternas e fetais da ocitocina podem acarretar, em última análise, danos cerebrais

aos neonatos, fato que impõe cuidados extremos à utilização empírica da ocitocina

em partos distócicos.

MATERIAL E MÉTODOST – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

MATERIAIS E MÉTODOS


32

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS

Para o desenvolvimento deste estudo, foram selecionadas 46 cadelas

gestantes, com idade reprodutiva entre 1 e 6 anos, sem discriminação em relação à

raça, clinicamente saudáveis e sem histórico de alterações reprodutivas ou

obstétricas.

Os animais eram provenientes da rotina de atendimento em clínicas

veterinárias particulares. Apenas fêmeas para as quais os proprietários objetivaram

interromper a gestação indesejada foram inclusas neste estudo, respeitando as

normas de utilização de animais em experimentos, adotadas a partir da Comissão de

Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo.

As cadelas foram alocadas em 4 grupos de acordo com a idade

gestacional, determinada por exame ultra-sonográfico, histórico reprodutivo e

mensuração do comprimento crown-rump fetal, segundo Evans (1993).

Grupo 1: fêmeas em fase inicial (0-20 dias) de gestação (n = 11);

Grupo 2: fêmeas com idade gestacional entre 20 e 40 dias (n = 12);

Grupo 3: fêmeas com idade gestacional superior a 40 dias (n = 12);

Grupo 4: fêmeas em fase preparatória ou pródromos do parto (n = 11).

A distribuição dos animais segundo o tempo gestacional nos diferentes

grupos experimentais está elencada no quadro 1.



33

Cadelas GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

1 17 24 42 Pródromos do parto


3 18 25 42 Pródromos do Parto






9 20 35 55 Pródromos do Parto



12 ---- 39 60 ----

Quadro 1 � Idade gestacional (dias) nos grupos experimentais 1, 2, 3 e 4

3.2 COLHEITA DAS AMOSTRAS

Para a análise da expressão gênica dos receptores de estrógeno e

ocitocina, foram colhidas amostras de endométrio, miométrio e placenta das fêmeas

dos grupos 1, 2 e 3 submetidas à interrupção da gestação por ovário-histerectomia.

As fêmeas do grupo 4 foram submetidas à operação cesariana seguida

imediatamente pela ovário-histerectomia. Após o procedimento cirúrgico, os

fragmentos de tecido foram transferidos para tubos com capacidade para 1 mL e

mantidos a -196°C até o processamento.

As amostras sangüíneas foram colhidas durante a intervenção cirúrgica,

por punção da veia jugular, após jejum alimentar de 12 horas. As amostras de

sangue total foram centrifugadas a 1500 xg por 10 minutos e o soro assim obtido foi

transferido para tubos plásticos resistentes ao congelamento. As amostras de soro

foram armazenadas em freezer a -20°C até o processamento.



34

3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

Os fragmentos de endométrio, miométrio e placenta foram destinados à análise da expressão gênica pela PCR em tempo real. Já o soro sangüíneo foi utilizado para as determinações de ocitocina e estrógeno.

3.3.1 Isolamento do RNA total

Foram utilizados dois métodos de extração de RNA, de acordo com o tipo de tecido:

3.3.1.1 Placenta

Para a extração do RNA total das placentas, foi utilizado o reagente TRIzol (Invitrogen®). Os fragmentos do tecido congelado foram macerados e a eles adicionado 1 mL do reagente TRIzol (isoticianato de guanidina + fenol). As amostras foram incubadas por 5 minutos, para em seguida ser adicionado 200 µL de clorofórmio. A mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos, incubada por 2 minutos a temperatura ambiente e centrifugada por 15 minutos a 4°C a 1200 xg. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e foram adicionados 500 µL de isopropanol. A mistura foi incubada por 10 minutos, centrifugada a 4°C a 1200 xg por 10 minutos e o sobrenadante foi removido por decantação. O sedimento foi, então, lavado com etanol a 70%, seco e ressuspendido em 40 µL de água DEPC.

3.3.1.2 Endométrio e miométrio

Para a extração do RNA total das amostras de endométrio e miométrio foi utilizado o sistema Illustra RNAspin Mini RNA Isolation (GE Healthcare ®), conforme

as instruções do fabricante. Os fragmentos dos tecidos congelados foram



35

macerados e adicionou-se 350 µL de buffer RA1 e 3,5 µL de β-mercaptoetanol. A

mistura foi agitada vigorosamente em vórtex até a formação de uma solução homogênea e, em seguida, transferida para um filtro e centrifugada a 8000 xg

durante 30 segundos. Após o descarte do filtrado, adicionou-se 350 µL de

Membrane Desalting Buffer e centrifugado a 11000 xg por 1 minuto. O filtrado foi novamente descartado, para então ser adicionado 95 µL de uma mistura de DNAse, a qual foi incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos. Após este período,

foram adicionados 200 µL de Buffer RA2 e, em seguida, a solução foi centrifugada a 11000 xg durante 1 minuto. O filtro foi colocado em um novo tubo coletor e foram adicionados 600 µL de Buffer RA3, procedendo-se nova centrifugação a 11000 xg

durante 1 minuto. Foram adicionados 250 µL de Buffer RA3 ao filtro e centrifugados durante 2 minutos a 11000 xg. O filtro foi transferido para um novo tubo coletor e então acrescentados 100 µL de água (livre de RNAses) e centrifugado a 11000 xg

durante 1 minuto.

3.3.2 Quantificação do RNA total

O RNA total foi quantificado após diluição em água (livre de RNAses) na proporção de 1:100, em aparelho de biofotometria Eppendorf® modelo Vi 1.35.

3.3.3 Síntese do cDNA

Após quantificação, 1 µg de RNA total foi utilizado para a síntese da

primeira fita de cDNA pela reação de transcrição reversa utilizando-se o sistema

SuperScriptTM II reverse transcriptase (Invitrogen®) na presença de oligo dT.

Inicialmente, o RNA total adicionado de 1 µL de oligo dT e água DEPC q.s.p 12 µL

foi exposto a 70°C durante 10 minutos em termociclador modelo PTC-100. Em

seguida a solução foi mantida a -20°C durante 1 minuto. Foram adicionados 2 µL de

First Strand Buffer, 2 µL de MgCl2 25mM, 1 µL de dNTP e 2 µL de 0,1 M DTT, para

então proceder a exposição a 42°C durante 5 minutos. Finalmente, foi adicionado



36

1 µL da enzima Super script II e a reação foi mantida a 42°C por 50 minutos e 70°C

por 15 minutos. O cDNA obtido foi acondicionado a -20°C.

3.3.4 Reação de amplificação por PCR em tempo real

Os cDNAs foram submetidos à amplificação dos genes constitutivos 18S

e RPS5 (utilizados como controle endógeno), bem como ao OTR e REα com

oligonucleotídeos iniciadores desenhados a partir de seqüências anteriormente

depositadas no GenBank (www.ncbi.nml.nih.gov) (Quadro 2):

SEQUÊNCIA Oligonucleo-

tídeos FORWARD REVERSE

Tm (°C)

RPS5 5�TCACTGGTGARACCCCCT3� 5�CCTGATTCACACGGCGTAG3� 61

18S 5�TGGTTGATCCTGCCAGTAGCA3� 5�ATGAGCCATTCGCAGTTTCACT3� 60

REα 5�GGTCTTGGTGTTGGGTGTG3� 5�GGACATATTCCTCACGCTCC3� 59

OTR 5�GAACTTGTACAGCGCTTCCTC3� 5�GACAAAGGTGGATGAGTTGCTC3� 59

Quadro 2 � Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores e suas temperaturas de

anelamento

As reações de PCR em tempo real foram realizadas em equipamento

Eppendorf® Mastercycle Realplex utilizando o kit Platinum® SYBR Greener PCR

Master Mix (Invitrogen®). Todas as reações foram realizadas em 25 µL de volume

total e submetidas a 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos, seguida de

45 ciclos divididos em 15 segundos a 95°C e temperatura específica de anelamento

por 60 segundos (Quadro 2). Os experimentos foram realizados em duplicata.

Para o cálculo da expressão relativa dos genes alvo foi usada a fórmula

desenvolvida por Pfaffl (2006), descrita a seguir:

Eficiência relativa = (Ealvo) ∆Ct alvo (controle-amostra) / (Eendógeno) ∆Ct endógeno (controle�amostra)



37

A eficiência das reações para os diferentes genes foi determinada pela

amplificação das amostras em diluições seriadas. Tais valores foram utilizados para

o cálculo da eficiência relativa (gene alvo/gene endógeno), considerando-se que:

Eficiência = 10 -1/slope

A eficiência calculada segundo a fórmula acima para as reações nos

distintos genes foram: 1,98 (18S), 2,05 (RPS5), 2,08 (REα) e 1,94 (OTR).

3.3.5 Dosagens hormonais

3.3.5.1 Dosagem do estrógeno

As amostras foram processadas utilizando o conjunto diagnóstico

comercial para dosagem de estradiol sérico da DSL-4400 (Diagnostic Systems

Laboratories, Webster, Texas, USA) por radioimunoensaio marcado com 125I,

desenvolvido para quantificação hormonal em soro humano; previamente validado

para a espécie canina. A sensibilidade da reação e os coeficientes de variação inter

e intra-ensaio foram 1,85 pg/ml (95%), 7,32% e 0,05%, respectivamente. O protocolo

utilizado seguiu o recomendado pelo fabricante e os padrões de qualidade

empregados estavam de acordo com o utilizado na rotina do Laboratório de

Dosagens Hormonais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo.

3.3.5.2 Dosagem de ocitocina

Para determinação hormonal, o volume de 1 mL do soro foi adicionado de

acetona e éter petroleum e as concentrações de ocitocina foram mensuradas pela

técnica de radioimunoensaio, conforme descrição de Elias et al. (1997). A



38

sensibilidade da reação e os coeficientes de variação inter e intra-ensaio foram

0,9 pg/ml, 7,0% e 12,6%, respectivamente. Os padrões de qualidade empregados

estavam de acordo com o utilizado na rotina do Laboratório de Neuroendocrinologia

do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo.

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram analisados por meio do programa SAS System for

Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2000). Por meio do aplicativo Guided

Data Analisys, os dados foram testados quanto à normalidade dos resíduos e

homogeneidade das variâncias. Caso não obedecessem a estas premissas, foram

transformados em logaritmo na base 10 (Log10X) ou Raiz quadrada (RQ X). Para

descrição dos resultados, foram empregados os erros padrões e as médias (média ±

erro padrão da média) dos dados originais.

Neste experimento, as variáveis classificatórias utilizadas foram as fases

da gestação (grupos 1, 2, 3 e 4) e o gene em estudo nos tecidos. Neste caso, foi

avaliada a interação entre o tempo da gestação e a expressão do gene. As variáveis

REα/18S (miométrio) e REα/RPS5 (endométrio) obedeceram às premissas após a

transformação para raiz quadrada e exclusão de amostras que se comportaram

como outliers. As variáveis OTR/RPS5 (miométrio), OTR/18S (miométrio), REα/18S

(endométrio), OTR/RPS5 (endométrio), OTR/18S (endométrio), REα/18S (placenta),

REα/RPS5 (placenta), OTR/RPS5 (placenta) e OTR/18S (placenta) obedeceram às

premissas após transformação para logaritmo na base 10 e exclusão de outliers. A

variável REα/RPS5 (miométrio) obedeceu às premissas apenas após exclusão de

outliers. As amostras consideradas outliers foram:

! duas amostras no grupo 1 e uma amostra no grupo 3 para REα/RPS5

(miométrio);

! uma amostra no grupo 3 para REα/18S (miométrio);

! uma amostra no grupo 4 para REα/RPS5 (endométrio);

! uma amostra no grupo 2 e uma amostra no grupo 3 para REα/18S

(endométrio);



39

! uma amostra no grupo 4 para OTR/RPS5 (endométrio);

! uma amostra no grupo 2 e uma amostra no grupo 3 para OTR/18S

(endométrio);

! uma amostra no grupo 2 e uma amostra no grupo 3 para REα/RPS5

(placenta);

! uma amostra no grupo 2, uma amostra no grupo 3 e duas amostras no

grupo 4 para OTR/RPS5 (placenta).

Os resultados foram testados utilizando-se a análise de variância para

medidas repetidas (ANOVA). O teste de Tukey foi utilizado como teste de

comparações múltiplas complementar à ANOVA para identificação da origem das

diferenças.

Para verificar a estabilidade dos controles endógenos (RPS5 e 18S) em

cada tecido (miométrio, endométrio e placenta), as variâncias dos dois controles

foram comparadas por meio do teste Brown and Forsythe.

O nível de significância utilizado para rejeitar H0 (hipótese de nulidade) foi

de 5%, isto é, para um nível de significância menor que 0,05, considerou-se que

ocorreram diferenças estatísticas entre as variáveis classificatórias (tratamentos)

para uma determinada variável resposta.

RESULTADOST – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

RESULTADOS


41

4 RESULTADOS

Os resultados da análise de expressão gênica relativa, representados por

médias e desvios padrão, foram calculados a partir dos valores de Ct (Cycle

Threshold) que representa o número de ciclos necessários para reação atingir o

limiar da fase exponencial, permitindo a quantificação exata e reprodutível da

fluorescência na reação de PCR em tempo real. Exemplos das curvas de

amplificação e dissociação para cada gene em estudo estão demonstrados nas

figuras 1, 2, 3 e 4.

Figura 1 � Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno 18S

Figura 2 � Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno RPS5

RESULTADOS


42

Figura 3 � Curva de amplificação e dissociação do RNAmREα

Figura 4 � Curva de amplificação e dissociação do RNAmOTR

4.1 ANÁLISE DAS VARIÂNCIAS DOS CONTROLES ENDÓGENOS NOS

DIFERENTES TECIDOS

A variância (desvio padrão) dos genes constitutivos utilizados como

controle endógeno (18S e RPS5) não diferiram estatisticamente na placenta e no

miométrio (Tabelas 1 e 2, respectivamente). Entretanto, no endométrio, o gene 18S

apresentou variância superior (em p=0,07) ao gene RPS5, denotando tendência

estatística a serem diferentemente expressos (Tabela 3).

RESULTADOS


43

Tabela 1 � Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica na placenta � São Paulo - 2008

CONTROLE ENDÓGENO VARIÂNCIA

18S 1,79a

RPS5 2,14a

a sem diferença estatística (p=0,70)

Tabela 2 � Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no miométrio � São Paulo - 2008


18S 1,46a

RPS5 1,26a

a sem diferença estatística (p=0,45)

Tabela 3 � Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no endométrio � São Paulo - 2008


18S 3,49a

RPS5 2,91b

a,b diferença em p=0,07

4.2 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NA PLACENTA

A expressão do RNAmREα na placenta não diferiu estatisticamente ao

longo da gestação, considerando-se o controle endógeno 18S (Figura 5). Ao analisar

o REα em relação ao RPS5 (Figura 6), nota-se que a expressão gênica do

RNAmREα é estatisticamente inferior no grupo 3, porém semelhante à placenta de

cadelas ao início da gestação e durante o parto (grupo 4).

RESULTADOS


44

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4

GRUPOS

RE/1

8S

Figura 5 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18S na placenta nos

grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4

GRUPOS

RE/R

PS5

Figura 6 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 na placenta nos


Comparando-se todas as fases da gestação (grupos 1, 2 e 3) e o parto

(grupo 4), não houve diferença estatística na expressão do RNAmOTR na placenta,

tanto para o controle 18S (Figura 7) como o RPS5 (Figura 8).

3,21±3,08a

6,29±3,68 a

0,52±0,44 a

2,40±2,67 a

2,38±3,03ab

4,19±3,14a

0,83±0,65b

2,00±1,30ab

RESULTADOS


45

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4

GRUPOS

OTR

/18S

Figura 7 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18S na placenta nos


0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4

GRUPOS

OTR

/RPS

5

Figura 8 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 na placenta nos


1,54±0,47a

2,69±2,53a

0,99±1,14a

1,93±1,84a

0,93±0,63a

0,51±0,34a

0,74±0,44a

1,38±0,86a

RESULTADOS


46

4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO ENDOMÉTRIO

Ao analisar a expressão do RNAmREα no endométrio, não houve

diferença estatística entre os grupos em relação ao controle 18S (Figura 9) e ao RPS5 (Figura 10).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 2 3 4

GRIPOS

RE/1

8S

Figura 9 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18S no endométrio nos


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1 2 3 4

GRUPOS

RE/R

PS5

Figura 10 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no endométrio

nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)

0,40±0,34a

0,45±0,55a

0,37±0,39a

0,24±0,28a

0,42±0,29a

0,72±0,53a0,73±0,57a 0,83±0,55a

RESULTADOS


47

Considerando-se a expressão do RNAmOTR em relação ao 18S no

endométrio, evidencia-se estatisticamente maior expressão no grupo 4 somente em

relação ao grupo 2 (Figura 11). Já com referência ao RPS5, o grupo 4 é

estatisticamente superior aos grupos 1, 2 e 3 (Figura 12). Como o controle endógeno

RPS5 apresentou maior estabilidade no endométrio em relação ao 18S, os

resultados do OTR/RPS5 são considerados mais fidedignos.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4

GRUPOS

OTR

/18S

Figura 11 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18S o endométrio nos


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4

GRUPOS

OTR

/RPS

5

Figura 12 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no endométrio

nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos

(p<0,05)

0,73±0,86ab

1,07±0,16b

1,18±1,41ab 1,28±1,20a

1,07±1,75a

0,78±0,67a

1,34±1,71a

4,03±3,47b

RESULTADOS


48

4.4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO MIOMÉTRIO

O grupo 1 apresentou estatisticamente menor expressão do RNAmREα

em relação ao 18S no miométrio, comparando-se os grupos 2 e 4 (Figura 13). Em relação ao RPS5, não houve diferença na expressão do REα no miométrio ao longo da gestação e parto (Figura 14).

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4

GRUPOS

RE/1

8S

Figura 13 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18S no miométrio nos


0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4

GRUPOS

RE/R

PS5

Figura 14 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no miométrio nos


1,26±1,41a

3,65±2,16b

2,86±1,17ab

3,69±2,34b

0,99±0,43a

1,33±0,64a

1,13±0,49a 0,85±0,64a

RESULTADOS


49

Referindo-se a expressão do RNAmOTR no miométrio em relação ao 18S

e RPS5, evidencia-se diferença significativa dos grupos 3 e 4 em comparação aos

grupos 1 e 2 (Figuras 15 e 16). Nota-se que o OTR é estatisticamente mais expresso

no miométrio ao final da gestação e no parto.

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4

GRUPOS

OTR

/18S

Figura 15� Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18S no miométrio nos

grupos 1, 2, 3 e 4, a,b,c indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4

GRUPOS

OTR

/RPS

5

Figura 16 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no miométrio nos


0,60±0,46a

3,66±4,51b

8,90±5,39c

15,05±9,40c

0,93±0,35a

1,06±1,07a

3,42±1,73b 3,14±2,24b

RESULTADOS


50

Ainda, é possível verificar que a expressão do RNAmOTR no miométrio é

crescente ao longo da gestação, havendo diferença estatística entre os grupos 1, 2 e

3 (Figura 15).

As figuras 17 a 20 demonstram o grau de expressão do RNAmREα e

RNAmOTR nos tecidos avaliados de acordo com a fase gestacional.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Placenta Endométrio Miométrio

TECIDOS

REOTR

Figura 17 � Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio

e miométrio até 20 dias de gestação (Grupo 1)

0

1

2

3

4

5

6

7


TECIDOS

REOTR


miométrio de 20 a 40 dias de gestação (Grupo 2)

18S

RPS5 18S

RPS5

18S

18S

RESULTADOS


51

0123456789

10


TECIDOS

REOTR

Figura 19 � Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio de 40 a 60 dias de gestação (Grupo 3)

0

2

4

6

8

10

12

14

16


TECIDOS

REOTR


e miométrio durante o parto (Grupo 4)

RPS5 18S

18S

18S

18S

RPS5

RESULTADOS


52

4.5 ANÁLISE DAS DOSAGENS HORMONAIS

4.5.1 Dosagem de estrógeno

O grupo 4 apresentou concentrações de estrógeno estatisticamente

superiores aos grupos 1 e 2 (Figura 21). Não houve diferença estatística entre os

grupos 1, 2 e 3, bem como entre os grupos 3 e 4.

1,7

1,8

1,9

2

2,1

2,2

2,3

2,4

1 2 3 4

GRUPOS

[ ] E

stró

geno

pg/

ml

Figura 21 � Concentrações séricas de estrógeno nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica

diferença significativa entre grupos (p<0,05)

4.5.2 Dosagem de ocitocina As concentrações de ocitocina não diferiram estatisticamente ao longo da

gestação (grupos 1, 2 e 3) e parto (grupo 4) (Figura 22).

1,94±0,11a 1,99±0,08a 2,00±0,08b

2,14±0,16b

RESULTADOS


53

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4

GRUPOS

[ ] O

cito

cina

pg/

ml

Figura 22 � Concentrações séricas de ocitocina nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica

diferença significativa entre grupos (p<0,05)

18,13±15,25a

20,95±28,05a

15,29±17,78a

17,64±26,46a

DISCUSSÃOT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

DISCUSSÃO


55

5 DISCUSSÃO

As novas técnicas de biologia molecular são, atualmente, as principais

ferramentas para decifrar as diversas interações hormonais e as conseqüentes

mudanças fisiológicas nas espécies animais. Para a espécie canina, a perspectiva

das pesquisas direcionadas à fisiologia e endocrinologia da gestação e parto inclui a

determinação dos principais órgãos ou tecidos envolvidos na síntese, secreção e

ação dos hormônios reprodutivos, bem como a exata localização de seus

respectivos receptores. Pouco se conhece a respeito dos efeitos e mudanças

decorrentes da interação hormônio-receptor nos tecidos alvo. Desta maneira, o uso

de hormônios para terapia de intercorrências durante a gestação e parto é realizada

de maneira empírica para a espécie canina.

A fase inicial da gestação em cadelas é caracterizada pelo período de

implantação embrionária e placentação, as quais ocorrem a partir do 16° e 20° dias

após o pico de LH, respectivamente (CONCANNON et al., 2001; MIGLINO et al.,

2006). O desenvolvimento e funcionamento normal da placenta são fundamentais

para manter a vida pré-natal e desencadear o parto (AL-BLADER, 2006). Em muitas

espécies de mamíferos, o estrógeno placentário possui também ações autócrina e

parácrina e, por conseguinte, caracteriza-o como principal responsável pelo

crescimento e diferenciação da própria placenta (SCHULER et al., 2002). Os

resultados deste experimento demonstram aumento significativo na expressão do

RNAmREα na placenta durante o terço inicial e médio da gestação (grupo 1 e 2), em

comparação ao período final (grupo 3). Tal resultado sugere que no período

gestacional compreendido entre os dias 17 e 40, momento no qual há importante

desenvolvimento placentário, a ação autócrina ou parácrina do estrógeno é mais

notável que a endócrina, uma vez que os níveis séricos de estrógeno nesta fase

mantiveram-se constantes. A expressão do RNAmREα na placenta sugere a síntese

do REα e comprova a necessidade da ação estrogênica no tecido placentário, pois

este hormônio participa da multiplicação e hipertrofia celular bem como do

desenvolvimento da vascularização placentária, importantes para o progresso da

gestação. Frente a tais resultados, estudos futuros são necessários para comprovar

a presença do REα na placenta e determinar a síntese placentária deste hormônio,

por meio da determinação de sua concentração local na espécie canina.

DISCUSSÃO


56

A expressão do RNAmREα na placenta sofreu decréscimo significativo

após 40 dias de gestação (grupo 3) e permaneceu baixa até o parto (grupo 4). Deste

resultado, especula-se que no referido período a placenta canina seja pouco

responsiva aos estímulos estrogênicos, pois os níveis séricos deste hormônio

elevam-se de forma significativa. Tais achados podem ser corroborados por estudos

em outras espécies, como roedores, bovinos e humanos (SAUERWEIN et al., 1989;

BUKOWISKY et al., 2003; Al-BLADER, 2006). Em ratas, o aumento dos níveis

estrogênicos durante o transcorrer da gestação resulta em diminuição do RE na

placenta (AL-BLADER, 2006). O autor sugere que este seja um mecanismo protetor

contra os efeitos deletérios do estrógeno ao final da gestação, caracterizados por

retardo no desenvolvimento placentário e secundariamente limitação do crescimento

fetal, evidenciados por Bartholomeusz et al. (1999), após a aplicação exógena de

estradiol em ratas gestantes. Desta maneira, sugere-se que a elevação progressiva

dos níveis estrogênicos, evidenciados neste estudo a partir de 40 dias de gestação,

não influenciam a atividade placentária e, consequentemente, o desenvolvimento

fetal. Neste período, a placenta apresenta menor capacidade de resposta aos

estímulos do estrógeno, em decorrência da baixa expressão do RNAmREα. O

decréscimo na expressão do RNAmREα na placenta associado aos níveis elevados

de estrógeno circulante após 40 dias de gestação indicam que a placenta canina

responde exclusivamente a estímulos estrogênicos de forma temporal e autócrina,

respectivamente.

Não há, até a atualidade, pesquisas que demonstrem a expressão do

RNAmOTR na placenta, bem como a ação da ocitocina neste tecido durante a

gestação e parto na espécie canina. A placenta é considerada um dos órgãos de

síntese da ocitocina, responsável por estimular a produção de PGF2α endometrial,

resultando em lise do corpo lúteo e início do parto. Considerações acerca da ação

mediadora positiva do REα sobre o RNAmOTR no útero foram descritas em diversos

estudos (LARCHER et al.,1995; MURATA et al., 2003). Neste experimento, o perfil

da expressão do RNAmOTR na placenta não se assemelhou ao RNAmREα, pois a

elevação significativa do REα no grupo 2 não foi acompanhada pelo OTR. Ainda, os

altos níveis de estrógeno ao final da gestação não foram capazes de aumentar a

expressão do RNAmOTR na placenta. A expressão homogênea do RNAmOTR

observada neste experimento pode ser atribuída ao bloqueio progestacional para a

síntese do OTR. Tais resultados não excluem a possibilidade de ser o estrógeno o

DISCUSSÃO


57

principal mediador do RNAmOTR na placenta, mecanismo descrito para outras

espécies. Chan et al. (1993) postulam que a existência de receptores de ocitocina na

placenta e endométrio está relacionada à liberação de PGF2α. Ainda, na placenta de

ratas, o OTR permanece em concentrações mínimas ou não detectadas durante a

gestação e o parto (CHAN et al., 1993). Desta forma, acredita-se que a modulação

dos receptores de ocitocina no miométrio e na placenta/endométrio ocorra por

mecanismos distintos, razão pelo qual os níveis estrogênicos não influenciaram a

expressão do RNAmOTR na placenta. Portanto, a possibilidade de existir uma

modulação negativa do RNAmOTR pela progesterona deve ser melhor estudada em

futuros experimentos de controle hormonal da gestação.

Anterior ao período de implantação embrionária, é essencial que ocorra o

reconhecimento materno da gestação, pois a falha neste mecanismo poderá

culminar em reabsorção embrionária. Nos ruminantes, o embrião é responsável pela

produção do interferon-tau, capaz de inibir os receptores de estrógeno e ocitocina

endometriais e, consequentemente, a liberação de hormônios luteolíticos como a

PGF2α (SPENCER et al., 1995 a,b; SPENCER; BAZER, 1996). Na espécie suína, o

estrógeno produzido pela placenta é o hormônio mais importante entre o 10° e 15°

dias de gestação, pois atua no endométrio promovendo reconhecimento materno da

gestação (GEISERT et al., 1982). A ação parácrina do estrógeno placentário no

epitélio endometrial aumenta a expressão de fatores de crescimento, incluindo o

IGF-1 e FGF-7, os quais estimulam o desenvolvimento e proliferação celular

(SPENCER; BAZER, 2004).

O reconhecimento materno da gestação ainda é um mecanismo incerto

na espécie canina. Estudos recentes demonstram que, semelhante ao que ocorre

em suínos, substâncias embrionárias e uterinas como o IGF-1 e IFN-γ também são

sintetizadas durante a implantação embrionária em cadelas (SCHÄFER-SOMI et al.,

2008). A expressão endometrial do RNAmREα no presente estudo ocorreu de

maneira constante durante todo o período gestacional. Sugere-se que o estrógeno

placentário possa atuar de maneira parácrina no endométrio de cadelas gestantes,

promovendo hiperplasia e hipertrofia de glândulas endometriais. A existência de um

mecanismo de reconhecimento materno da gestação em cadelas semelhante à

espécie suína não pode ser desconsiderada, pois o endométrio é passível de

responder ao estrógeno placentário por via parácrina, ao exibir receptores

estrogênicos durante toda gestação. A determinação das concentrações placentárias

DISCUSSÃO


58

de estrógeno, bem como sua ação parácrina no endométrio deverão contribuir para

caracterizar o mecanismo de reconhecimento materno na espécie canina.

Neste trabalho, a expressão do RNAmERα no endométrio ocorreu de

maneira similar em todas as fases da gestação e no início do parto. Sabe-se que a

progesterona atua no endométrio inibindo a ação dos receptores de estrógeno e,

consequentemente, a formação dos receptores de ocitocina (MCCRACKEN et al.,

1984) Tal mecanismo é de fundamental importância para a manutenção da

gestação, pois impede a ação da ocitocina endometrial e, em última análise, a

síntese de agentes luteolíticos. Entretanto, a ação contínua da progesterona no

endométrio durante todo período gestacional promove decréscimo dos seus

receptores (RP), sensibilizando progressivamente o endométrio aos estímulos

estrogênicos. Desta forma, ao final da gestação há aumento dos receptores de

estrógeno e estimulação dos receptores de ocitocina endometriais (NOE, 1999). No

presente estudo, o aumento dos níveis circulantes de estrógeno ao final da gestação

não foi acompanhado por acréscimo na expressão do RNAmREα no endométrio. Em

ratas gestantes, a indução do RNAmOTR no útero parece ser mediada pelo REβ e

não pelo REα (MURATA et al., 2003). Os dois subtipos de receptores são

modulados por mecanismos distintos. Por exemplo, a ovariectomia em ratas

gestantes não influencia os níveis de REα, enquanto resulta em aumento do REβ.

Atribui-se a fatores ovarianos ou feto-placentários a mediação dos REβ uterinos.

Portanto, o aumento da expressão do RNAmOTR no endométrio de cadelas

gestantes ao final da gestação pode ser influenciado primariamente pelo REβ e não

pelo REα. Portanto, futuros estudos são necessários para elucidar a participação do

REβ no endométrio de cadelas gestantes.

Em ruminantes, ao final da gestação, os níveis elevados de estrógeno e

do RE promovem tanto a indução dos receptores de ocitocina quanto a liberação de

PGF2α, culminando em luteólise (SPENCER et al., 1995b). Os resultados deste

trabalho vão ao encontro dos estudos prévios em ruminantes. Ao início do parto

(grupo 4), constatou-se altas concentrações séricas de estrógeno, simultaneamente

ao acréscimo significativo na expressão do RNAmOTR no endométrio. Tais

evidências tornam possível afirmar que em cadelas, a expressão do RNAmOTR é

decorrente da ação estrogênica ao final da gestação, semelhante ao descrito nas

demais espécies. O aumento do receptor de ocitocina no endométrio determina a

DISCUSSÃO


59

síntese e liberação da PGF2α, responsável pela lise do corpo lúteo e início do

trabalho de parto.

Ao final do período gestacional, o evento endócrino crucial é determinado

pela diminuição dos níveis de progesterona e aumento de estrógeno, resultando na

síntese do receptor de ocitocina durante o trabalho de parto (CHALLIS, 1971;

LACHER et al., 1995). Em mulheres gestantes, o parto também é precedido por

maior expressão do REα no miométrio, simultaneamente à queda dos níveis de

progesterona (VEGETO et al., 1993; MESIANO et al., 2002). Por outro lado, a

expressão do RNAmREα no miométrio de cadelas gestantes mantém-se constante a

partir de 20 dias de gestação. Tal resultado pode ser comparado ao obtido no

endométrio, em relação à expressão do RNAmREα. A indução da síntese do

RNAmOTR a partir do REα não pôde ser comprovada neste estudo, embora a

concentração sérica de estrógeno tenha elevado-se significativamente ao final da

gestação. Conforme sugerido anteriormente, acredita-se que a modulação do

receptor de ocitocina em cadelas gestantes possa ocorrer precipuamente por meio

do REβ e de forma menos intensa pelo REα.

A expressão do RNAmOTR no miométrio foi demonstrada durante toda a

gestação e parto. No entanto, a expressão máxima pôde ser observada nos grupos

3 e 4, ou seja, ao final da gestação e início do trabalho de parto. Disto demonstra o

aumento progressivo da sensibilidade miometrial frente ao estímulo da ocitocina

para desencadeamento das contrações uterinas. A significativa elevação dos níveis

séricos de estrógeno nos grupos 3 e 4, concomitantemente ao acréscimo

significativo na expressão do RNAmOTR no miométrio, reforça a importante ação

mediadora do estrógeno nos receptores de ocitocina e, consequentemente, no início

do parto. Ainda, é importante ressaltar que o aumento do RNAmRE no miométrio é

decorrente do aumento do cortisol fetal ao final da gestação em ovelhas,

aumentando a sensibilidade uterina aos estímulos estrogênicos (WU et al., 1996a).

Entretanto, tal mecanismo não pôde ser elucidado em cadelas com os resultados do

presente trabalho.

Em mulheres, a concentração de ocitocina plasmática mantém-se baixa

durante toda a gestação e no parto. No entanto, o tratamento com estradiol resulta

em acréscimo dos níveis circulantes de ocitocina (AMICO et al., 1981; MITCHELL et

al., 1998). Recentemente, Klarenbeek et al. (2007) demonstraram que as

concentrações de ocitocina em cadelas ao final da gestação permanecem baixas,

DISCUSSÃO


60

podendo oscilar e aumentar somente no estágio expulsivo do parto, mas não

necessariamente no momento da expulsão fetal. Os resultados do presente estudo

vão ao encontro dos relatos prévios, pois as concentrações de ocitocina mantiveram-

se constantes durante toda a gestação e o parto. Apesar da confirmada produção

placentária de ocitocina como mecanismo de indução da luteólise (CHAN et al.,

1993), nota-se que os níveis circulantes deste hormônio não se alteram ao longo da

gestação. Tais observações sugerem que a ocitocina circulante na espécie canina

possui influência mínima para o início do parto. Por este motivo, pode-se considerar

que a ativação dos receptores de ocitocina miometriais dimana da ação parácrina da

ocitocina de origem placentária.

Nas reações de PCR em tempo real neste trabalho, utilizou-se dois genes

denominados constitutivos como controles endógenos (18S e RPS5). As variações

dos resultados encontrados em alguns tecidos denotam diferenças entre os

controles selecionados. Por se tratar de genes constitutivos, variações representam

instabilidade gênica em tecidos específicos. No miométrio e na placenta, os genes

18S e RPS5 não revelaram diferenças importantes para a interpretação dos dados.

Portanto, considera-se que ambos são estáveis nestes tecidos. Por outro lado, os

referidos genes no endométrio geraram distintas interpretações, mas também

evidenciou-se diferenças em suas variâncias. O gene constitutivo RPS5, por

apresentar menor desvio padrão, pode ser considerado mais estável para o

endométrio em relação ao 18S. Portanto, para avaliações futuras da expressão

gênica no endométrio de cadelas, sugere-se o emprego do gene endógeno RPS5.

Considerações importantes a respeito da fisiologia reprodutiva da cadela

foram abordadas no presente estudo. Os novos conhecimentos podem auxiliar

futuras pesquisas voltadas para o estudo da reprodução canina. Da mesma forma,

podem contribuir para a aplicação prática dos hormônios frente às possíveis

alterações maternas ou fetais durante a gestação e parto. Todavia, ainda persistem

lacunas para explicar as diversas interações hormonais e estabelecer padrões

endócrinos. Futuros estudos devem ser conduzidos para elucidar tais

questionamentos e contribuir para o conhecimento técnico-científico nesta espécie.

CONCLUSÃOT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

CONCLUSÃO


62

6 CONCLUSÃO

Nas condições deste estudo e com base nos resultados apresentados

pode-se concluir que:

1. A expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina nos tecidos

estudados é modulada segundo o período gestacional e o parto:

Endométrio ! O RNAmREα é expresso de maneira constante durante a gestação e

parto. ! O RNAmOTR possui maior expressão ao início do trabalho de parto.

Miométrio ! O RNAmREα possui maior expressão entre 20 e 40 dias de gestação e

ao início do trabalho de parto. ! O RNAmOTR é mais expresso entre 40 e 60 dias de gestação e ao

início do trabalho de parto.

Placenta ! O RNAmREα possui maior expressão até 40 dias de gestação.

! O RNAmOTR é expresso de maneira constante durante a gestação e ao início do trabalho de parto.

2. As concentrações séricas de ocitocina mantêm-se constantes durante todo período gestacional e no início do parto, enquanto os níveis estrogênicos elevam-se a partir de 40 dias de gestação até o parto.

3. É possível atribuir ao aumento dos níveis circulantes de estrógeno a maior

expressão do RNAmOTR no miométrio e endométrio ao final da gestação.

As concentrações séricas de ocitocina não influenciam o início do parto na espécie canina, bem como a modulação da expressão dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta.

REFERÊNCIAST – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A

REFERÊNCIAS


64

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