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LABORATÓRIO DE ANÁLISES E DOPAGEMInstituto do Desporto de Portugal

ESTIMATIVA DA INCERTEZA DE MEDIÇÃO EM

LABORATÓRIOS DE ANÁLISE DE DOPAGEM

Helder Lopes

RELACRE: Lisboa, 25 de Novembro de 2003


Acreditação de acordo com a norma NP EN ISO/IEC 17025

Acreditação de acordo com o International Standard for Laboratories

AGÊNCIA MUNDIAL ANTIDOPAGEM / COMITÉ OLÍMPICOINTERNACIONAL

Controlo “Doping” no Desporto

Controlo de drogas de abuso

Diagnóstico clínico de praticantesdesportivos

APRESENTAÇÃOCriado em 1984

Helder Lopes



Espectrometria de massa (GC/MS;GC/MS-MS; LC/MS-MS)

Matriz - Urina humana

Quantificação por curva de calibração

METODOLOGIA

Métodos validados internamente

Análise das amostras em triplicados independentes

Controlos positivos (amostras fortificadas) em cadasequência analisados em triplicados independentes

Material de referência (padrões de calibração), controlos e amostras sofrem omesmo tratamento em cada sequência de análises

Não existem materiais de referência certificados adequados

Helder Lopes



Requisitos do ponto 5.4.6 - “Estimativa da incerteza” da Norma

NP EN ISO/IEC 17025

Requisitos específicos do International Standard for Laboratories (ISL)

ESTIMATIVA DA INCERTEZA - Requisitos

“Uncertainty of quantitative results should be addressed during the validation ofthe assay through measurement of Repeatability, Intermediate Precision andBias, where possible”.

“The expression of uncertainty should use the expanded uncertainty using acoverage factor (k), to reflect a level of confidence of 95 %”.

“The estimate of uncertainty should not be included on the Test Report but mustbe included in the Laboratory Documentation Packages”.

Helder Lopes



Requisitos específicos do International Standard for Laboratories (ISL)

ESTIMATIVA DA INCERTEZA - Requisitos

“The mean value for the B sample is required to exceed the threshold limitincluding consideration of uncertainty”.

A amostra é positiva e o atleta punidoapenas no caso 4.

Limite legal (threshold limit)1

43

2Concentração

Helder Lopes



Especificar a mensuranda

Identificar as fontes de incerteza

Estudo de precisão

Estudo de recuperação (Bias)

Estudo de outras fontes de incerteza

Planear o procedimento de controlointerno da qualidade

Planear o desenho experimental devalidação

Início

Fim

Implementar o método

Actualizar e refinar a estimativa daincerteza de medição

Actualizar as estimativas de precisão erecuperação do método

Determinar a incerteza combinada e aincerteza expandida


OutrosidadeRastreabilAnalíticaAmostra ffCC ××=

Recuperação (Bias)

Repetibilidade

Efeitos de temperatura

Tolerância

Padrões de calibração

Volume

Massa

Pureza

INCERTEZA

Precisão intermédiaPreparação da amostra

Derivatização

Volume

PI

Extracção Hidrólise

Intrumento

Volume de injecção

Curva de calibração

Integração

Carry over

Operador

Outras

Tolerância Repetibilidade

Efeitos de temperatura

Diluição

Correcção da densidade

Pré-tratamento da amostra

FONTES DE INCERTEZA

Helder Lopes



ESTIMATIVA DA INCERTEZA

Precisãointermédia

Recuperação(Bias)

Outras(Diluição, pré-

tratamento,homogeneidade, etc)

Incerteza



Estudo de precisão





Início

Fim






Rastreabilidade

Helder Lopes



ESTIMATIVA DA INCERTEZA

Precisãointermédia

Recuperação(Bias)

Outras(Diluição, pré-

tratamento,homogeneidade, etc)

Incerteza

EURACHEM/CITAC Guide

Quantifying uncertainty in analytical measurement,EURACHEM/CITAC (2000)

VAM project

Development and harmonisation of measurementuncertainty principles LGC/VAM (2000)

www.vam.org.uk

www.measurementuncertainty.org



Estudo de precisão





Início

Fim






Helder Lopes



ESTUDO DE PRECISÃO Especificar a mensuranda


Estudo de precisão





Início

Fim





Planeamento ExperimentalAmostras fortificadas a dois ou três níveis de concentração analisadas emtriplicados em dias diferentes, por operadores diferentes, durante, no mínimotrês meses.

O estudo ao longo do tempo permite a avaliação da contribuição combinadade diversos factores que contribuem para a precisão do método,nomeadamente:

• o tipo de urina

• operador

• condições de funcionamento do equipamento

• curva de calibração

• flutuações de temperatura e humidade

• lotes de reagentes

• mudanças de fases móveis, etc.

Estudo de precisão

Helder Lopes





Estudo de precisão





Início

Fim






O uso de replicados permite a avaliação conjunta de outras fontes deincertezas relacionadas com a repetibilidade do método, nomeadamente:• volume de injecção• integração dos sinais cromatográficos• homogeneidade das amostras• repetibilidade do detector•Volume de padrão interno, etc.

Estudo de precisão

Helder Lopes





Estudo de precisão





Início

Fim






O uso de dois ou três níveis de concentração permite estudar precisão dométodo ao longo da gama de trabalho.

IncertezaControlo daqualidade

Validação

Estudo de precisão

Helder Lopes





Estudo de precisão





Início

Fim





Tratamento dos resultados(ANOVA)

Tabela ANOVAFonte de Variação MQ Graus de liberdade

Entre grupos ( )1

1

2

−

−=∑=

p

xxnMS

p

ii

run

p-1

Dentro de grupos ( ))1(

1 1

2

−

−=∑∑= =

np

xxMS

p

i

n

jiij

r

p(n-1)

Total pn-1

p é o nº de sequências de análises de cada nível de concentração. n é o número de replicados em cada sequência.

R representa um replicado individual (replicado j) obtido na sequência i. representa a média de n replicados

obtidos na sequência i, e finalmente, é a média das média de p sequências.

ijx ixx

Estudo de precisão

Helder Lopes





Estudo de precisão





Início

Fim





Tratamento dos resultados(ANOVA)

Cálculo das estimativas de precisãoPrecisão Expressão

Repetibilidade (sr)rr MSs =

Precisão Entre Grupos (srun)nMSMSs rrun

run−

=

Precisão intermédia (sI) ( ) ( )22runrI sss +=

Estudo de precisão

Helder Lopes


UP = SI

A.Maroto; R. Boqué; J. Riu; F. Rius Analytica Chimica Acta (2001) 133-145.

ISO 5725-3 - Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 3: Intermediatemeasures of the precision of a standard measurement method ISO (1994).


ESTUDO DE RECUPERAÇÃO “Bias”Especificar a mensuranda


Estudo de precisão





Início

Fim





“Bias” Rastreabilidade

MRC

Ensaios interlaboratoriais

Métodos de referência

Amostras fortificadas Modelo 1

Modelo 2


Helder Lopes





Estudo de precisão





Início

Fim





Planeamento Experimental - MODELO 1Amostras fortificadas a dois ou três níveis de concentração analisadas emtriplicados em dias diferentes, por operadores diferentes, durante, no mínimotrês meses.

O mesmo planeamento e os mesmos dados do estudo deprecisão

ESTUDO DE RECUPERAÇÃO “Bias”


Helder Lopes


O modelo 2 utiliza os dados dos ensaios interlaboratoriais para estimar aincerteza associada à recuperação (Bias). Esta metodologia não é abordadanesta apresentação.




Estudo de precisão





Início

Fim





Tratamento dos resultados - MODELO 1

Spike

iObsi CC

R =p

RR

p

ii∑

== 1Recuperação Recuperação Média

psU obs

R =%Incerteza associada àrecuperação média

RExp U

Rt

%

1−=

Se tExp < tCrit, então não é significativamente diferente de 100 % e U écalculado com base na seguinte equação:

R R

RU

U RR

%=Incerteza de recuperação

tCrit: valor crítico bi-caudal para p-1graus de liberdade e 95 % de confiança.sobs é o desvio padrão de p valores de Ri obtidos em condições de precisão intermédia. Ri é a recuperação média detrês replicados obtidos em condições de repetibilidade.Cobs: Concentração observada; Cspike: Concentração esperada.

ESTUDO DE RECUPERAÇÃO “Bias”


Helder Lopes



3 - OUTRAS FONTES DEINCERTEZA Especificar a mensuranda


Estudo de precisão





Início

Fim





Incerteza associada aos padrões de calibração (UC.Cal)

Incerteza associada à diluição da amostra (UDil)

Incerteza associada a factores de correcção do resultado final(ex: correcção em relação à densidade da amostra)

Incerteza associada ao pré-tratamento da amostra


Etc.

Helder Lopes



INCERTEZA COMBINADA Especificar a mensuranda


Estudo de precisão





Início

Fim





( ) ( ) ( ) ( )22.

22OutrasCalCRPComb UUUUU +++=

Incerteza combinada

As incertezas padrão relativas são combinadas directamente. As incertezasexpressas em valor absoluto são divididas pela concentração da amostra.

INCERTEZA EXPANDIDAIncerteza expandida

CombExp UkU ×=




Actualizar a estimativa de precisão erecuperação do método


Helder Lopes



EXEMPLOS

( ) ( ) ( ) ( )22.

22OutrasCalCRPComb UUUUU +++= CombExp UkU ×=

Incerteza de pré-tratamento econservação da amostra

Helder Lopes


Método PU(%)

RU(%)

CalCU .

(%)OutrosU(%)

UComb(%)

UExp(%) k=2 Observações

Cafeína(HPLC-UV-DAD) 4,0 % 1,7 % 1,9 % ----- 4,7 % 9,4 % Aplicável para concentrações

superiores a 12 µg/mL

Cannabis(GC/MS-MS) 10,8 % 1,7 % 2,1 % 6,7 % 13,0 % 26% Aplicável para concentrações

entre 15 a 50 ng/mL


TESTE DO MODELO - Cafeína

QUATRO ENSAIOS INTERLABORATORIAIS

Nº de laboratórios Entre 22 a 28 laboratórios de análises de dopagem a nível mundial

Gama de trabalho 12 a 25 µg/mL

Reprodutibilidade 4,0 a 4,7 % (Coeficiente de variação de todos os participantes)

Z-Score - 0,05; 0,4; 0,6 e - 0,8

O intervalo de incertezas inclui tanto o valor teórico como o valor médio de todosos participantes.

Helder Lopes



TESTE DO MODELO - Cannabis

X 3 ≈ 20 a 30 %

Cartas de controlo (CV %) Entre 7 a 9 % para 15 e 50 ng/mL

Previsão inicial obtida por julgamento profissional ≈ 20 %

O uso de ensaios interlaboratoriais para validar o modelo de estimativa daincerteza não é adequado devido à grande variedade de métodos entre osparticipantes nos ensaios interlaboratorias de determinação de cannabis

Helder Lopes



CONCLUSÕES1. O modelo cumpre os requisitos aplicáveis

2. Minimiza o esforço e recursos necessários àestimativa de incertezas

3. Aplicação geral aos métodos quantitativos típicos delaboratórios de análises de dopagem

4. Permite facilmente a actualização contínua do cálculo daincerteza através da actualização regular (eg. semestral) dasestimativas das fontes principais de incerteza.

5. A principal desvantagem do modelo reside no facto de ser efectuada uma avaliação dacontribuição combinada de diversos factores sem discriminar quais dos factores são de factosignificativos para o balanço final da incerteza.

Helder Lopes



Laboratório de Análises e Dopagem

Av. Prof. Egas Moniz (Estádio Universitário) 1600-190 Lisboa

Tel: 217 954 000 Fax: 217 977 529 [email protected]

BIBLIOGRAFIA1. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, ISO (1993)

3. VAM project 3.2.1 - Development and harmonisation of measurement uncertainty principles LGC/VAM (2000)

5. A.Maroto; R. Boqué; J. Riu; F. Rius Analytica Chimica Acta (2001) 133-145.

4. ISO 5725-3 - Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 3: Intermediate measuresof the precision of a standard measurement method ISO (1994).

2. EURACHEM/CITAC Guide - Quantifying uncertainty in analytical measurement, EURACHEM/CITAC (2000)

Helder Lopes


sem título de diapositivo - idesporto.pt em analises de dopagem.pdf · determinar a incerteza...

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