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Fundamentos de Proteínas Aula 3 – Estratégias de Purificação e Análises de Proteínas BCM13042

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Page 1: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Fundamentos de Proteínas

Aula 3 – Estratégias de Purificação e Análises de Proteínas

BCM13042

Page 2: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Principais componentes moleculares da bactéria Principais componentes moleculares da bactéria E. coliE. coli

Componentes Nº de moléculas diferentes Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total% peso total

H2O 1 70Proteínas 3.000 15Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7Carbohidratos 50 3Lipídeos 40 2Outros Íons - 12 3 Mol. Monoméricas - 500

O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D

e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada

proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Page 3: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

Métodos de Isolamento de BiomoléculasMétodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

Page 4: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

ORGANELAS

LisossomosLisossomos

MitocôndriaMitocôndria

GolgiGolgi

NúcleoNúcleo

SOBRENADANTE

F 1 F 2 F 3 F 4

F 2 .1F 2 .2 F 2 .3

F 2 .3.1F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N

Precipitação com Sal/Solvente

Precipitação com Sal/Solvente

Cromatografia Troca Iônica

Cromatografia Troca Iônica(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X

1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total

Gel Filtração

MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)

O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada

uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente

numa mistura complexa.Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e

quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos

para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas.

Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma

propriedade diferente. Consequente-mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada

vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se

chegar à proteína pura.

Page 5: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

• Medida da atividade biológica - particular para cada proteína - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração.

• Medidas do conteúdo proteico (diversos) - absorbância de luz UV de 280 nm - métodos colorimétricos (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da

purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente.

A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de

cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo.

Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um

círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação.

ORGANELAS

LisossomosLisossomos

MitocôndriaMitocôndria

GolgiGolgi

NúcleoNúcleo

SOBRENADANTE

F 1 F 2 F 3 F 4

F 2 .1F 2 .2 F 2 .3

F 2 .3.1F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N

Precipitação com Sal/Solvente

Precipitação com Sal/Solvente

Cromatografia Troca Iônica

Cromatografia Troca Iônica(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X

1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total

Gel Filtração

MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)

Page 6: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Métodos para medida do conteúdo de proteína:

A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, especialmente triptofano.

A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.

Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máxomo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1

Comprimento de onda

Ab

so

rtiv

ida

de

mo

lar,

Page 7: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline

Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250

Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas.

Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina.

Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul,

Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato

Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 1. Cu2+ é chelado pela proteína [Cu2+-proteina]2. Reação redox Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína]

Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul.

Método de Lowry

Métodos para medida do conteúdo de proteína:

Page 8: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).

tecidos

células

Homogeneização (para romper tecidos e células)

por pressão(prensa francesa)

liquefação(Potter)

Homogenadoou

Extrato bruto

Material de partida

Material na fonte

por ultra-som comdetergente

Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

Page 9: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para

esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a

membrana plasmática e formando complexos solúveis

com as proteínas.Proteínas integrais da membrana

detergente micelas

Complexos não micelares

Dependendo da concentração

Detergentes podem ser iônicos e não iônicos

Detergentes não iônicos

Triton X-100(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)

SDSDodecil sulfato de

sódio

CetabCetyltrimethylammonium

bromide

Deoxicolato de sódio

Detergentes iônicos

Octilglicosídeo(octyl-b-D-glucopyranoside)

Page 10: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

sangue centrifugado: separação de plasma e células

A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. Através de sucessivas etapas de centrifução com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos.

centrifugação diferencial

homogenado

células intactaspedaços de membrananúcleos

mitocôndriaslisossomosribossomos

fraçãocitoplasmática

A centrífuga

Câmara blindadaAmostra sedimentando

refrigeração vácuo

rotorângulo

fixo

Page 11: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

R$ 3.000 US$ 70,000

CentrífugaClínica

Ultracentrífuga

Força centrífuga

1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas

200,000 g por 24 horas para separar organelas menores

ou complexos proteicos

(necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração)

Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)

Preço aproximado

Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.

Page 12: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Centrifugação em gradiente de densidade

Solucões de sacarose com densidades diferentss são colocadas no tubo, uma sobre a outra Amostra é colocada no

topo do gradiente

5% sacarose

20% sacarose

centrifugação

Baixa densidade

Média densidade

Alta densidade

A centrifugação em um meio com gradiente de

densidade melhora a eficiência da separação. As

partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região

com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”.

Gradientes podem ser utilizados para separar

diferentes tipos de células, organelas, ácidos

nucléicos, complexos proteicos, etc.

Gradiente separação de:

Ficoll-Hypaque leucócitosSacarose mitocôndriasCloreto de césio ácidos nucléicos

Page 13: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.

Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.

A precipitação de proteínas pode ser induzida por:- adição de sais (Precipitação salina)- adição de solventes- variação de pH (Precipitação isoelétrica)

So

lub

ilid

ad

e d

a h

emo

glo

bin

a (S

/S’)

KCl

NaCl

MgSO4

(NH4)2SO4

K2SO4

Concentração do Sal,, Molar

Salting-in X Salting-out

O gráfico ao lado ilustra o efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da hemoglobina.

Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons do sal ajudam a reforçar a camada de solvatação.

Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminue pois os íons do sal competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação.

Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas.

Page 14: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

So

lub

ilid

ad

e,

log

FibrinogênioPseudoglobulina

MioglobinaAlbumina

Hemoglobina

Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar

Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.

Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico.

Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal.

Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado.

Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.

E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.

Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina.

- precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas

possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.

Page 15: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação

das proteínas.

Os mais utilizados são etanol e acetona.

Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.

Água

DimetilformamidaMetanol

Etanol

Acetona

Clorofórmio

Benzeno

78.5 1.85

48.9 3.96

32.6 1.66

24.3 1.68

20.7 2.72

4.8 1.15

2.3 0.00

Solvente ConstanteDielétrica

MomentoDipolar

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6

Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1

Insulina bovina 5,4

Fibrinogênio humano 5,8

Gama-globulina 6,6

Colágeno 6,6

Mioglobina equina 7,0

Hemoglobina humana 7,1

Ribonuclease A bovina 7,8

Citocromo C equino 10,6

Histona bovina 10,8

Lisozima, galinha 11,0

Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada.

Page 16: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.

-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação.

Membrana de celofane

solvente

solução a ser dialisada

Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água.

Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original.

início finalt

Page 17: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

ORGANELAS

LisossomosLisossomos

MitocôndriaMitocôndria

GolgiGolgi

NúcleoNúcleo

SOBRENADANTE

F 1 F 2 F 3 F 4

F 2 .1F 2 .2 F 2 .3

F 2 .3.1F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N

Precipitação com Sal/Solvente

Precipitação com Sal/Solvente

Cromatografia Troca Iônica

Cromatografia Troca Iônica(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X

1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total

Gel Filtração

MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada.

Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento.

Quando já houve redução significa-tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas.

Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.

Page 18: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa moleculargéis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:separação de moléculas pela carga elétricagéis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquosogéis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:separação de moléculas pela capacidade de interagir com um

ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

Page 19: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?

Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:

- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.

- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).

- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é

inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas

que apresentam pouca atividade). Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às

diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.

Page 20: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Purificação da Glicoquinase hepática de Rato

EtapaEtapa Atividade Atividade EspecíficaEspecíficabb( U ( U.mg-1) .. - a

Rendimentoc( % )( % )

100 12.0 85 1223 45 140

44 33 26080 15 480

Marcha A: somente cromatografias convencionais

1. Sobrenadantede pâncreas2. (NH4)2 SO4, precipitado 25-55%

3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0, eluiçãoKCl4. troca iônica, coluna CM-cellulose, pH 5.5, eluiçãoNaCl6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose

7. gel-filtração, coluna SephacrylS-300 130

15 780Marcha B: com cromatografia de afinidade

1. Sobrenadantede pâncreas 100 12. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0, eluiçãoKCl 18 84 1953. Afinidade cromatográfica ( benzamidina~agarose ) 420 83 4.500

ÍndiceÍndicebb

PurificaçãoPurificação

aUnidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que catalizaa transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas

bAtividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteínac Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificaçãod Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.

Page 21: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Con

cen

traç

ãoTempo ou volume

Coletor de frações

Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica

Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.

Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:

Tempo 1

Mais tampão é colocado na

coluna, forçando os

componentes da amostra a

interagirem com a resina

Componentes da amostra se

separam e saem da coluna com

diferentes volumes de

tampão

Tempo 2 Tempo n

Líquido que sae

da coluna é

recolhido em tubos

de um coletor de

frações

Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada

com a resina, com base em propriedades moleculares como:

• massa molecular• carga elétrica• solubilidade• afinidade

Amostra com diferentes

componentes

Resina embebida

em tampão

Tempo zero

Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira

usual de se representar o resultado de uma

cromatografia.

Page 22: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecularCromatografia de gel filtração ou peneira molecular

grãos (beads) da resina com poros

grão da resina poroso

proteína grande

proteína pequena

Tampão “empurra” moléculas através da resina

tubos

Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). Proteínas menoresProteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadasnão são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

Moléculas com massas diferentes

Fluxo do tampão

Page 23: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Ab

sorb

ânci

a a

280

nm

volume

Med

ida

da

ativ

. bio

lógi

ca

Moléculas maiores

Moléculas menores

Kav

Mas

sa m

olec

ular

(kD

)

20 40 60 80 100 120 mL

25 50 75 100 125 mL volume de eluição

A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo

Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a

gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.

Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.

O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.

Curva de calibração

traçado da medida de atividade biológica nas frações

Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao.

Ler a massa correspondente

Observar a

escala log

Page 24: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Resinas para Gel-Filtração

Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600

Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1 - 6Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400

Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000

NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO(kD)

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories

Moléculas pequenas

Moléculas pequenas

Proteínas

Proteínas

Células, partículas sub-celulares

Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas

indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação.

Page 25: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr.

Kav = Ve-Vo Vt-Vo

Ve – volume de eluição de uma certa proteínaVt – volume total da colunaVo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina

onde:

O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de 5.000 a 600.000 d.Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva.

Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração.

Page 26: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

DEAE CM

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Page 27: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

--

-

----

DEAE-celulose - pH < 10CM-celulose - pH > 4

Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6

Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1

Insulina bovina 5,4

Fibrinogênio humano 5,8

Gama-globulina 6,6

Colágeno 6,6

Mioglobina equina 7,0

Hemoglobina humana 7,1

Ribonuclease A bovina 7,8

Citocromo C equino 10,6

Histona bovina 10,8

Lisozima, galinha 11,0

Salmina, salmão 12,1

PIácido

+

básico

-neutro

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Page 28: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Como funciona a Cromatografia de Troca IônicaComo funciona a Cromatografia de Troca Iônica

Adsorção

Eluição

+++

+

++

+

+

Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna

Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

Na+Cl- +

A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:

1) adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga;

2) eluição das proteínas adsorvidas.

+++

+

++

+

+

+

+ +

No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):

Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina.

Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.

Page 29: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Carboximetil~celulose(trocadora de cátions)

Dietilaminoetil~celulose(trocadora de ânions)

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca IônicaDuas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

_

=

=_

+++

++

(+)

(+)

(+)

(+)

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluição NaCl

Não retidas

DEAEDEAE++

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluição NaCl

+

(-)

(-)

(-)+

++

_ =

=_(-)

Não retidas

CMCM

Page 30: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Tipos de Resina de troca Iônica

Tipos de Resina de troca iônica

NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES

Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+(CH3)3 Troca aniônica

resina de polistirenoDowex 50 Fortemente básica Ø - SO3

-H Troca Catiônicaresina de polistireno

DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH2CH2N+(C2H5)2 ácidas e neutras

CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH2COOH básicas e neutras

Q-Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração

básico e troca iônica de proteínas ácidas e neutras

SP -Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtraçãoácido e troca iônica de proteínas

básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sepharose e Source: GE LifeSciences Bio- Gel: Bio Rad Laboratories

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3

—CH2-SO3-

Page 31: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Cromatografia de afinidade:

Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre

Desprezar proteínas não

retidas

Lavagem

Eluição

pH 2,0 ou sal

Antígeno A puro

Anti-A interage apenas com a

proteína A

-

Mistura de proteínas

Coluna empacotada com ess gel

Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A

Adsorção

Complexo Ag-AC é desfeito

Um dos métodos mais eficientes para a

purificação de proteínas, possibilitando um alto

rendimento com número reduzido de etapas.

A separação de moléculas tem como

base a interação específica do analito

(molécula-alvo) com um ligante imobilizado na

matriz. Forças envolvidas nessa

interação podem ser não covalentes

(eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H)

ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto).

Ex: cromatografia de imunoafinidade

Page 32: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Ligante

grupo-específico

Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG

Proteína G Região Fc de IgG

Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-

Cibacron Blue Várias enzimas, albumina

lisina Plasminogênio, RNA ribossomal

arginina proteinases tipo tripsina

benzamidina proteinases tipo tripsina

calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina

heparina Fatores de coagulação, lipases, hormônios, receptores estoróides, etc

Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos de His expostos

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo- análogos de substratos ou inibidores de enzimas- agonistas ou antagonistas de receptores- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos- ligantes com “tag” ou “marcação”

- glutationa-S-transferase- poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

8-AEA-cAMP

8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate

(ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP)

Sítios de ligação das proteínas A, G e L à

imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por

cromatografia de afinidade

Page 33: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador diminue esse risco.

Estratégias para acoplamento de ligantes à resina Reagente Alvo no ligante

Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante

Ligação reversível não covalente

ligante

Molécula-alvo (analito)

Preparo da resina de afinidade:

Passo 1. Ativação da resina

Passo 2. Acoplar o ligante

Page 34: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Papelou placa de sílica

Amostra na origem

tempo 0 t 1 t2 tn

direção do fluxo do solvente

Compostos separados

Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)

Cromatografia de Partição

Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.

Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc.

Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico.

Fase estacionária (suporte sólido) X

Fase móvel(líquido ou gás)

Consiste de 2 sistemas:

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Fase Estacionária: sílica (mineral apolar)

Fase Móvel: Solvente aquoso ou água

Suporte: SÍLICA (camada delgada ou TLC)

Suporte: PAPEL

Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose)

Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico)

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

distância de migração da substância

distância de migração do solventeRf =

Page 35: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography

Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias.

Característica diferencial da cromatografia convencional: • partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) • aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas

de resina em um mesmo volume da coluna • fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna

Desenho básico de um HPLC

bombas Injetor de amostra

Coluna e forno

Coletor de frações

Detector

Controle e análise dos dados

Duas bombas permitem eluição em gradiente

Detector: índice de refração, absorbância UV ou Vis, fluorescência, etc.

Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa

Page 36: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

CN Fenil NH2 C4 C8 C18

Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia

Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas)

Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água

- acetonitrila, metanol, propanol

Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C

Fase estacionária Função

C18 –Si (CH3)2 C18 H37 C8 –Si (CH3)2 C8 H17 tC2 –Si C2 H5

Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2 Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH

Abs

orbâ

ncia

a 2

14 n

m

Tempo ou volume de retenção

% d

e ac

eton

itri

la

100Moléculas não retidas

Moléculas retidas

Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila

Page 37: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

aminoácido

Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos.

A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. A área do pico quantifica o aminoácido.

A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar

(hidrólise) as ligações peptídicas.

A mistura resultante é submetida a métodos cromatográficos (fase reversa, troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min)

fluor

escê

ncia

Page 38: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados:

a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com

fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a

hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é

identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o

próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.

b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos

correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.

Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e

proteômica.

Page 39: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Método de Edman - sequenciamento de proteínas com

PITCPITC (fenil-isotiocianato)

ciclo 1

ciclo 2

hidrólise com ácido trifluoroacético

hidrólise ácida

vai para novo ciclo

análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)

(1)

(2)

(3)

acoplamento

acoplamento

Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:

1. Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);

2. Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);

3. Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína.

Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade

para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína.

Page 40: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.

Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.

ProteínaTotal 150 a.a

sequência obtida a partir da proteína intacta

30 aa

Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.

proteína inteira

peptídeos método A

peptídeos método B

Page 41: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas

Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos.

Isso significa 2 etapas de MS acopladas. Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases.Os fragmentos são então separados e analisados por MS.

hélio ou argônio

A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.

Page 42: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Espectro MS/MS do peptídeo tríptico

GLSDGEWQQVLNVWGK.

AA Codes Mono. AA Codes  Mono.

Gly G 57.021464 Asp D 115.02694

Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858

Ser S 87.032029 Lys K 128.09496

Pro P 97.052764 Glu E 129.04259

Val V 99.068414 Met M 131.04048

Thr T 101.04768 His H 137.05891

Cys C 103.00919 Phe F 147.06841

Leu L 113.08406 Arg R 156.10111

Ile I 113.08406 CMC 161.01467

Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333

- - - Trp W 186.07931

Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer

a seqüência do peptídeos

Page 43: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Síntese de peptídeos Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004

COOHbloq

H2Nbloq

1. DNA recombinante

1. Química: uso de reagente químico para ativar o ácido carboxílico de um Nα-acil-aminoácido, o qual sofre o ataque nucleofílico do grupo α- amino de outro aminoácido

- indicado para sequências de até 20 aa. - estereo-isômeros, purificação dos produtos

3. Biocatálise: reversão da proteólise - diminuição da atividade da água no meio

reacional reverte a ação de enzimas proteolíticas

- termolisina, pepsina, subtilisina, tripsina, etc - vantagens:, não forma misturas racêmicas e

sub-produtos, condições brandas

Page 44: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Síntese de peptídeos

Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila, estável ao ácido trifluoroacético (TFA) e lábil a bases orgânicas – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes lábeis ao TFA e estáveis a bases orgânicas

Boc (t-butiloxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila lábil ao (TFA) – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes estáveis a este ácido e lábeis a ácidos inorgânicos fortes ou hidrogenólise.

Page 45: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Síntese de peptídeos

Robert B. Merrifield – Prêmio Nobel em Química em 1984

Page 46: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Síntese de peptídeos

Page 47: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

ELETROFORESE ELETROFORESE

1. pH / tampão

2. Suporte- papel : corrente alta (calor)

uso para peptídeos e aminoácidos

- agarose: ácidos nucléicos ImunoeletroforeseProteínas nativas

- poliacrilamida: proteínasac. nucleicos

não desnaturante ou nativadesnaturante e redutor

peso molecularcomposição de subunidades

focalização isoelétrica: PIbidimensional

CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO

SUPORTE X pH MEIO

++++

++++

Page 48: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

+

_

Reação de eletrólise da água

• Uso de tampão concentrado

• Uso de indicador de pH como marcador de corrida: azul de bromofenol

Page 49: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

polyacrylamide

persulfate

+

• 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas• [ ] mais baixas – gel muito mole –

suporte com agarose• Gradiente de acrilamida – aumenta poder de

resolução

cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

Page 50: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

ProteínaProteína Ponto Isoelétrico

Pepsina < 1.0

Ovalbumina(galinha) 4.6

Albumina Sérica(humana) 4.9

Tropomiosina 5.1

Insulina (bovina) 5.4

Fibrinogênio (humano) 5.8

Globulina 6.6

Colágeno 6.6

Mioglobina(cavalo) 7.0

Hemoglobina (humana) 7.1

Ribonuclease A (bovina) 7.8

Citocromoc (cavalo) 10.6

Histona (bovina) 10.8

Lisozima (galinha) 11.0

Salmina(salmon) 12.1

155.000

330.000

18.000

64.000

Separação na eletroforese nativa é influenciada pela carga, massa e forma da molécula

Page 51: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

A B

C

C

C

A

A

B

B

SDS (dodecil sulfato de sódio

+

2-mercaptoetanol

Efeitos do SDS

• desnaturação uniformiza a forma das proteínas;

• mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo;

• facilita o efeito de redutores

Page 52: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

SDS-PAGE Salmonella tiphymurium

Page 53: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Determinação da massa molecular de proteínasCurva de calibração de SDS-PAGE a 15%

Mobilidade relativa (Rf)

Mas

sa m

olec

ular

(kD

)

Mobilidade relativa =

distância percorrida pela banda Xdistância percorrida pelo marcador da corrida

97.4

87.0

45.0

29.0

21.012.5 6.5

(-)

(+)

Page 54: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

•migração através de um gradiente de pH

•proteínas “focalizam” nos seus P.I.

Anfólitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados (patenteados)

Gel não tamponado polimerizado com anfólitos

1ª corrida: anfólitos criam gradiente

2ª corrida: amostras são aplicadas

Após a corrida: pedaços do gel são analisados quanto ao seu pH.

3.0

4.0

5.0

6.0 pH

pH

+Marcadores de P.I. conhecidos

_

Aplicações:

-Determinação do PI

-Isoformas da mesma proteína:- glicosilação- fosforilação- mutações pontuais

Eletroforese – focalização isoelétrica

Page 55: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

1a.dimensão: focalização isoelétrica

2a.dimensão: SDS-PAGE (perpendicular a 1a.)

PM x 103

Eletroforese Bidimensional

-

P IP I

+

3

3.5

4

4.5

5

5.5

Origem

5 4 3 2678910

Page 56: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

PROTEOMA:• análise simultânea de até 5.000 proteínas

• permite comparação de todas as proteínas expressas por uma célula em dois momentos diferentes:

• análise do efeito de hormônios, • análise do efeito de drogas; • estados fisiológicos (desenvolvimento);• condições patológicas diversas (vírus, bactérias,etc.)

Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de Escherichia coli

Proteínas com mesmo pI

Proteínas com a mesma massa

Page 57: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

sem fervura das amostraspode ter SDS no gel de separação

•Conformação nativa, oligomerização

•Zimogramas: estudos de enzimas, afinidade

• Gel copolimerizado (gelatina, amido, etc)• Gel overlay (gel de agarose)• Proteínas nativas ou renaturadas no gel por

remoção lenta do SDS por troca com detergente não iônico

Gel nativo:

Page 58: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Antígeno B do Echinococcus granulosus

Multímeros de subunidades de 8 kDa

15% SDS-PAGE

Monteiro et al., 2011PLoS Neglected Tropical Diseases

Urease de Canavalia ensiformis (hexâmero de 90 kDa)

3% PAGE

Efeito de Cu2+ - precipitação

Follmer & Carlini, 2005Arch. Biochem. Biophys.

Ni2+ Cu2+ Zn2+ Hg2+

Rhipicephalus microplus Cys-endopeptidase

12% SDS-PAGE- copolimerizado com 0.1 % hemoglobina - após corrida, retirada do SDS troca por Triton X-100 (3h) - incubação a pH 4,0, 18h/37oC.

Estrela et al, 2010 Comp. Biochem. Physiol

Tolfo Bittencourt et al., 2004 Res. Microbiol

8.5% non-denaturing gels- atividade das SODs revelada Inibição da redução do NBT em presença de TEMED e riboflavina

Superoxide dismutases from Metarhizium. anisopliae

Page 59: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Métodos imunoquímicos aplicados a proteínas

estrutura e propriedades de imunoglobulinas

anticorpos policlonais e monoclonais: produção e purificação imunodiagnóstico: aglutinação X lise

imunoprecipitação: difusão em gel, imunoeletroforese

ELISA, Western blot

imunohistoquímica e imunofluorescência

Page 60: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Anticorpos são imunoglobulinas.

Cadeia H (pesada) – 50.000 dCadeia L (leve) – 25.000 d

Porção N-terminal das cadeias L e H ~ 120 aminoácidos variáveis restante da cadeia é constante

Cadeia H Cadeia LImunoglobulina

classe Sub-classe

ou IgG IgG1

ou IgG2

ou IgG3

ou IgG4

ou IgA IgA1

ou IgA2

ou IgM

ou IgD

ou IgE

Função Estrutura

anticorpo

antígeno

Complexo antígeno-anticorpo

Page 61: Estrategias Purificacao Analises Proteínas
Page 62: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Mecanismos através dos quais

os anticorpos executam as

funções de defesa:

- Neutralização (Ag solúveis)

- Opsonização (Ag particulados)

- Imunecomplexo (todos Ags)

Page 63: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Produção de Anticorpos: imunização ativa

Propagação clonal de linfócitos B ou plasmócitos

Um linfócito B sempre produzirá imunoglobulinas para o mesmo antígeno, mas poderá variar a classe de anticorpos produzidos

Page 64: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Anticorpos policlonais versus Anticorpos monoclonais

Há vários determinante antigênico ou epitopo em uma proteína - tamanho: 5 a 6 aminoácidos - podem ser sequenciais ou conformacionais

Page 65: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Reconhecimento de apenas um determinante antigênico

tipo único de imunoglobulina Vantagens e desvantagens

Produção de Anticorpos

Monoclonais

Page 66: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Imunoprecipitação

Complexos Ag-Ac insolúveis

- Precipitado é máximo na Zona de equivalência

- Excesso de Ag ou de AcFazem complexos solúveis

Page 67: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Imunoprecipitação em gel de agarose

Page 68: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Imunodifusão dupla

Permite comparar antígenos e detectar determinantes antigênicos em comum

Identidadetotal

Identidade parcial

Ausência deidentidade

Page 69: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

   Recombinant Protein L

 Native Protein A

 Recombinant Protein A

 Recombinant  Protein G

 Protein  A/G

 Source  Peptostreptococci  Staphylococcus aureus

 Bacillus  Streptococci  Bacillus

 Molecular Weight  35,800  42,000  44,600  22,000  50,449

 Number of Binding Sites for IgG

 4  4  5  2  4

 Albumin Binding Site  no  no  no  no  no

 Optimal Binding pH  7.5  8.2  8.2  5  5-8.2

 Binds to  VLκ  Fc  Fc  Fc  Fc

Proteínas bacterianas com afinidade por Imunoglobulinas

- Servem como ligantes em matrix de afinidade- Servem como 2º.ligantes em testes imunoenzimáticos

bead

Page 70: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Imunobeads: adsorção complexo Ag:Ac

Page 71: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Ensaios Imunoenzimáticos ou ELISA

+ 1º.Ac + Ag

placaAg

Ac 1º.

Ac 2º.

ES

cor

ELISAsandwich + 2º.Ac + S cor

Padronização do ELISA

Concentração do Ag ou Ac

Ab

s (i

nte

nsi

dad

e d

a co

r)

Page 72: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

ELISA Competitivo é adequado para identificação e quantificação tanto do antígeno como do anticorpo.

Para a determinação de Ag, o Ag presente na amostra compete com Ag marcado com uma enzima, para se ligar ao Ac imobilizado. A cor desenvolvida na revelação é indiretamente proporcional à concentração de Ag na amostra.

O Radioimunoensaio (RIA) baseia-se no mesmo princípio, utilizando Ag marcado com um radioisótopo para competir com o Ag frio presente na amostra.

(1)

(2)

- Quanto maior a concentração do antígeno a ser medido, maior será o deslocamento do antígeno marcado, permitindo a quantificação.

Variante para pesquisa do Ac

Page 73: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

Western blot

Anticorpo secundário marcado com: - enzima - radioativo - fluorescente

Page 74: Estrategias Purificacao Analises Proteínas

MAP2-(neurons) and GFAP-(astrocytes) positive cells in hippocampal cell culture

GluR1 clusters in hippocampal cultured neurons

Presynaptic terminals showned by immunostainig of specifically presynaptic protein Synapsin in cultured hippocampal neuron

Imunofluorescência:

-anticorpos marcados com diferentes fluoróforos vermelho (rodamina), verde (fluoresceína)