INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE- CAMPUS ARAQUARI

CURSO MEDICINA VETERINÁRIA

Elizabeth Baggio

Jean Carlo Scortegagna Vicari

Larissa Caroline Danchura

Taiany Krum de Freitas

Vanêssa Jung

PCR – REAÇÃO POLIMERASE EM CADEIA

ARAQUARI

2011

Elizabeth Baggio

Jean Carlo Scortegagna Vicari

Larissa Caroline Danchura

Taiany Krum de Freitas

Vanêssa Jung

PCR – REAÇÃO POLIMERASE EM CADEIA

O Presente trabalho de Pesquisa apresentado às Professoras da disciplina Microbiologia Veterinária, do Curso de Medicina Veterinária, no Instituto Federal Catarinense – Campus Araquari, como requisito de avaliação parcial do segundo semestre de 2011.

ARAQUARI

2011

SUMÁRIO

Introdução ................................................................................................................... 4

1. Histórico da PCR. .................................................................................................... 5

2. O que é PCR? ........................................................................................................ 6

2.1 Componentes da PCR e suas funções na reação ............................................. 7

2.1.1 DNA molde: ................................................................................................. 7

2.1.2 DNA polimerase: .......................................................................................... 7

2.1.3 Tampão e sais: ............................................................................................ 8

2.1.4 Cátion metal divalente: ................................................................................ 9

2.1.5 Desoxinucleotídeos: ..................................................................................... 9

2.1.6 Primers sintéticos: ........................................................................................ 9

2.1.7 Gel de agarose/poliacrilamida: .................................................................. 10

2.1.8 Termociclador: ........................................................................................... 10

2.1.9 Reagentes de alta densidade e corantes: .................................................. 11

2.1.10 Marcador de massa molecular (ladder): .................................................. 11

2.2 Como se faz? ................................................................................................... 11

2.3 Tipos de PCR ................................................................................................... 14

2.3.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):.................................... 14

2.3.2 Multiplex PCR: ........................................................................................... 14

2.3.3 Nested PCR: .............................................................................................. 15

2.3.4 PCR Competitiva: ...................................................................................... 15

2.3.5 AFLP: ......................................................................................................... 15

2.3.6 Hot Start: .................................................................................................... 16

2.3.7 PCR–colony: .............................................................................................. 16

2.3.8 Real-Time PCR: ......................................................................................... 16

2.3.9 Long: .......................................................................................................... 17

2.3.10 Inverse: .................................................................................................... 17

2.3.11 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorfism).................................... 17

2.4 Análise do produto da PCR .............................................................................. 18

Conclusão ................................................................................................................. 20

Referencias: .............................................................................................................. 21

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Introdução

Reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método in vitro rápido, sensível

e versátil para amplificação seletiva de seqüencias definidas de DNA (ou RNA) a

partir de amostras complexas de ácidos nucléicos.

O desenvolvimento da PCR no meio científico tem sido comparado

frequentemente com o desenvolvimento da internet. Ambas as invenções surgiram

nos últimos 20 anos, sendo difícil imaginar a vida sem eles. Ambos têm crescido

muito além dos limites do seu design original simples e criaram oportunidades

inimagináveis antes de sua invenção. É difícil acreditar que a técnica que se formou

com o projeto genoma humano é fundamental para os laboratórios de biologia

molecular. A técnica do PCR é valiosa para os cientistas, auxiliando o mapeamento

genético, detecção de doenças, estudo das funções dos genes, a identificação de

células, e analises de identificação forense. Pode ser usada para estudos de

diversidade genética em qualquer grupo de animal ou vegetal . A PCR também

revolucionou a biologia evolutiva, tornando possível analisar o DNA dos mamutes e

restos mortais de antigos humanos encontrados em pântanos.

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1. Histórico da PCR.

Na década de 60 vários pesquisadores procuraram obter a síntese de DNA in

vitro. A obtenção do DNA em tubo de ensaio foi o primeiro passo para um universo

de experimentos em genética molecular. O primeiro a conseguir Arthur Kornberg,

que identifica a “polimerase”, uma enzima que catalisa a síntese de DNA.

Em 1983, Kary Banks Mullis, pesquisador da Cetus Corporation, em

Emervylle, Califórnia, imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase

iniciasse e terminasse seu trabalho em trechos pré-determinados do DNA. Através

deste sistema seria possível amplificar milhões de vezes um pequeno trecho de um

longo segmento de DNA. Mullis percebeu que possuía uma importante ferramenta

em mãos, tentou publicar seus experimentos nas duas revistas científicas mais

importantes do mundo, a Science e a Nature, ambas negaram a publicação,

resignado, conseguiu publicar então seu artigo sobre amplificação do gene da

betaglobina humana na Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor. A

idéia da PCR foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985.

A Cetus Corporation pagou a Mullis para desenvolver a patente PCR 10.000

dólares, que a corporação venderia mais tarde por 300.000.000 de dólares.

Frustrado tanto pelo tamanho do prêmio e como as restrições a sua pesquisa , Mullis

deixou a Cetus em 1986, tornando –se um consultor de pesquisa privado. Em 1989,

a revista Science escolheu a molécula usada na PCR, a Taq polimerase, como a

primeira molécula do ano.

Em 1991 a PCR se tornou comum em laboratórios do mundo todo e

referências ao uso da técnica já somavam milhares nas revistas cientificas. Na

década de 90 foi referenciada em pelos menos 10.000 publicações cientificas por

ano.

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Em 1993 , Mullis ganhou o Prêmio Nobel em Química. Cientistas da Cetus

desenvolveram uma versão comercial do PCR e uma máquina chamada do

termociclador, com a adição de elementos químicos do DNA, chamados

nucleotídeos, e um catalisador bioquímico chamado polimerase, a máquina

realizaria o processo automaticamente em um pedaço alvo de DNA.

2. O que é PCR?

PCR ou Reação de Cadeia Polimerase é uma técnica de Biologia Molecular

que tem como função amplificar uma porção específica do material genético por

meio de uma enzima termostátil in vitro. Ela faz uma amplificação exponencial

seletiva de uma quantidade reduzida de material genético de uma única célula, que

pode variar de poucos pares de bases a muitos pares de bases.

Através desse processo o DNA molde sofre uma amplificação controlada por

enzimas obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. Essa

técnica explora a função natural da enzima chamada de taq- polimerase extraída da

bactéria Thermus aquaticus que é capaz de sintetizar DNA a partir de seus

precursores no sentido 5’ – 3’. Essa Bactéria além de ser capaz de sintetizar o DNA

teve grande importância neste processo, pois antes da sua utilização o grande

problema para a execução da técnica era o aumento da temperatura, o que foi

controlado por esta.

O molde utilizado pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla como o

DNA genômico, podendo se utilizar uma gota de sangue, um fio de cabelo,

fragmentos de pele e órgãos ou até uma célula do epitélio bucal. Esse método tem

como princípios básicos a utilização de oligonucleotídeos (primers) e regiões

específicas da molécula de DNA e a ação da DNA polimerase. Esses primers são

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utilizados para direcionar a síntese do DNA em ciclos repetidos. A cada ciclo as fitas

servem de molde para a geração de novas fitas e o numero de ciclos é determinado

pelos objetivos e condições utilizadas.

2.1 Componentes da PCR e suas funções na reação:

2.1.1 DNA molde:

É a informação que se deseja amplificar. Tora reação de PCR parte de um

DNA molde, extraído da amostra que está sendo utilizada. Pode ser utilizada uma

amostra de DNA ou de RNA. No caso de uma amostra de RNA esta deverá

primeiramente ser convertida em uma fita de cDNA (DNA complementar). O ideal é

que o ácido nucléico esteja livre de impurezas como proteínas, lipídios, outros

ácidos nucléicos ou reagentes de extração, e em uma concentração mínima de

5µg/mL, porém quantidades menores também podem ser utilizadas (VIEIRA).

2.1.2 DNA polimerase:

É a enzima responsável pelo processo de amplificação do DNA alvo. A DNA

polimerase a adição dos desoxinucleotídeos em sequencias complementares ao

DNA molde, gerando assim novas cadeias de DNA iguais ao DNA molde. Para esta

tarefa ela utiliza também os primers sintéticos, que acoplam-se ao DNA molde e

marcam os pontos de inicio da adição de nucleotídeos (VIEIRA, Aula 1).

A DNA polimerase mais utilizada é a Taq polimerase, uma polimerase isolada

da bactéria Thermus aquaticus, que habita fontes termais. Existe também a Tth

polimerase, isolada em Thermus thermophilus.

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A taq é uma enzima chamada non-proofreading, o que quer dizer que podem

haver alguns erros na sequência do fragmento final. Enzimas desta classe

percorrem a fita de DNA apenas uma vez, dando a chance de que algum erro

durante a duplicação não seja reparado. Além disso ela também adiciona uma

adenina as extremidades 3’ do DNA, o que pode dificultar o uso posterior do

amplificado(VIEIRA, Aula 2).

Para estes casos existem as enzimas da classe proofreading, que além de

percorrerem a fita mãe pelo menos duas vezes, em geral não adicionam

nucleotídeos extras nas bordas das cadeias-filhas. Deste grupo pode-se destacar a

Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis) (VIERIA, Aula 2).

2.1.3 Tampão e sais:

Os tampões têm por função manter o pH da solução ideal para a atividade da

enzima e para a conservação do DNA molde. Os sais proporcionam força iônica

para a atividade enzimática e influenciam a cinética de hibridização do DNA

(RABELO).

As soluções-tampão são geralmente fornecidas juntamente com a DNA

polimerase, e possuem composições específicas de acordo com cada fabricante, por

questões de maior especificidade. Basicamente estas soluções contêm íons

diversos, Na+, Cl-, K+ entre outros. Alguns tampões contêm ainda detergentes,

inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas, proteínas estabilizantes

(BSA – albumina sérica bovina) e algumas substâncias que agem na desnaturação

da cadeia molde, quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases (VIEIRA, Aula

1. RABELO).

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2.1.4 Cátion metal divalente:

Reagente de grande importância na reação. Um dos mais utilizados é o

MgCl2, um doador muito estável de íons Mg+2, que são co-fatores indispensáveis

para a atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam também outros íons metálicos

como cofatores. Um exemplo é a Tth polimerase. Na presença de Mg2= ela possui

atividade DNA polimerásica. Porém na presença de Mn2+ ela apresenta atividade de

uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir de uma cadeia de RNA

(VIEIRA Aula 1).

2.1.5 Desoxinucleotídeos:

Os desoxinucleotídeos são a matéria prima da reação de PCR. São

compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5’ da

desoxirribose. São adicionados pela DNA polimerase complementarmente a fita

molde, para compor as cópias do DNA. Adiciona-se na reação uma mistura de todos

os nucleotídeos em concentrações iguais (VIEIRA Aula 1. RABELO)

2.1.6 Primers sintéticos:

São oligonicleotídeos curtos e de fita simples. Possuem sequência linear e

complementar ao DNA alvo (sequência de DNA que se procura e deseja amplificar).

Os primers acoplam-se ao DNA molde nos pontos onde o DNA é complementar à

sua sequência de bases, e a partir daí servem como ponto de inicio (sítios de

iniciação) para a DNA polimerase realizar a adição de nucleotídeos, no processo de

amplificação do DNA ((CORRÊA & POSSIK. RABELO).

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2.1.7 Gel de agarose/poliacrilamida:

Utilizados como matriz de separação dos fragmentos de DNA durante a

corrida eletroforética. A utilização de uma matriz ou outra depende do tamanho dos

fragmentos que se procura, devido à diferença no tamanho dos poros de cada gel. O

gel de agarose pode ser utilizado para separar fragmentos de 0,2 kb a 50 kb (1 kb =

1000 pares de bases), e a poliacrilamida para fragmentos menores, de até 1 kb

(CORRÊA & POSSIK. SILVA, 2001).

Apesar de ser mais efetiva na separação de fragmentos menores, ela

apresenta alguns problemas, como o fato de, em solução, ser neurotóxica (CORRÊA

& POSSIK).

A agarose é um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha e

formado por resíduos de D e L galactose unidos por ligações glicosídicas α (1 � 3) e

β (1 � 4), é um material gelatinoso e semelhante à gelatina incolor. O gel de

agarose pode ser reciclado após o uso e utilizado na preparação de outros géis

(CORRÊA & POSSIK).

2.1.8 Termociclador:

Este equipamento comanda os ciclos de temperatura necessários para o

processo de amplificação do DNA. Ele é responsável por controlar as elevações e

reduções de temperatura e controlar o tempo de duração de cada ciclo. Cada etapa

do processo demanda uma temperatura e um tempo específico (SILVA, 2001).

A maioria dos termocicladores segue o padrão: aquecimento por resistência

elétrica e refrigeração por ventoinhas e serpentina preenchida por etileno glicol. Os

termicicladores mais sofisticados possuem um bloco de aquecimento composto por

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uma liga metálica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente

elétrica aplicada (VIEIRA, Aula 1. SILVA, 2001).

2.1.9 Reagentes de alta densidade e corantes:

Estas substâncias geralmente estão presentes no tampão. Os reagentes de

alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol). Sua função é garantir que a amostra de

DNA entre nos poços pela força da gravidade. Já os corantes facilitam a aplicação

da amostra no gel e auxiliam no monitoramento da corrida (CORRÊA & POSSIK).

2.1.10 Marcador de massa molecular (ladder):

O ladder é uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e

concentrações conhecidos, gerados a partir da digestão de plasmideos com enzimas

de restrição. Ele permite inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos

presentes na amostra analisada (CORRÊA & POSSIK).

2.2 Como se faz?

Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento

prévio da sequência do ácido nucléico que se deseja amplificar, dita “sequência

alvo.” A partir disto, desenham-se dois iniciadores (“primers”) para dar partida ao

processo de síntese em um local específico. Um “primer” serve para sintetizar a

sequência alvo no sentido 3’- 5’e outro para o sentido inverso isto é, 5’-3.’ O “primer”

é uma pequena sequência de nucleotídeos que hibridiza no início da sequência alvo

que se quer amplificar e da qual ele é complementar. Ao reconhecer o “primer,” a

polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na

sequência de DNA que será replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de

deoxinucleosídeos trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que são quatro

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componente químicos diferentes que atuam como se fossem tijolos na construção

da molécula de DNA.

O primeiro passo para a realização de um PCR é a coleta da amostra

biológica. Para tanto, é importante levar em consideração o que se deseja

pesquisar. Por exemplo: se um paciente apresenta uma lesão na pele, deve ser

recolhida uma amostra da mesma e não do sangue do paciente.

O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado.

Esta extração segue um critério de metodologia básico, que varia dependendo da

amostra utilizada. Basicamente utilizam-se substâncias desproteinizantes como o

fenol-clorofórmio, capazes de desnaturar e retirar as proteínas que estão acopladas

ao DNA. A adição posterior de etanol, então, fará com que o material genético

precipite no tubo que posteriormente será solubilizado em tampão apropriado para o

uso na reação.

O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reação. A mistura de

reação contém as substâncias necessárias para fazer novas cópias de DNA no

processo da PCR. Então, dentro de um tubo são colocados:

1) solução tampão para manter a mistura de reação no pH e condições iônicas

ideais para a reação.

2) os deoxinucleotídeos já mencionados;

3) os “primers.”

4) a Taq Polimerase

5) o DNA extraído da amostra.

O quarto passo consiste na reação em si que é feita em uma máquina

especial, chamada de termociclador, que aquece e resfria o tubo em vários ciclos

consecutivos para amplificar o DNA.

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Primeiramente, o tubo é aquecido a 90-96 graus para que o DNA seja

desnaturado (separação das fitas). Em seguida, a temperatura do termociclador

diminui para permitir a hibridização ou anelamento; nesta fase, os “primers” se ligam,

especificamente, às suas sequências complementares no DNA. A próxima etapa é a

síntese pela polimerase. Após diversos ciclos (geralmente em torno de 30 ciclos) o

DNA estará amplificado em milhões de cópias.

Os problemas técnicos podem surgir. O mais importante é a contaminação da

amostra com material genético estranho que pode gerar cópias de DNA não

relacionadas ao DNA que está sendo investigado e o resultado pode levar a

conclusões erradas. Para diminuir os riscos deste tipo de contaminação ao mínimo

possível, os laboratórios devem ter cuidado no manuseio da amostra, utilizando

luvas, tubos descartáveis etc...O laboratório deve ter áreas separadas para cada

etapa do processo: para o preparo da amostra, da mistura de reação, realização do

processo da reação e análise.

Outro problema pode ser a presença, na amostra, de substâncias que,

conhecidamente, inibem a reação (como exemplo a hemoglobina). Para isso a

amostra deve ser devidamente tratada para “limpá-las” destas substâncias.

O passo final é a análise do produto de reação. Esta pode ser feita através

de gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose,

corado por brometo de etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é

visualizado como uma banda, a ser analizada de acordo com o seu peso molecular.

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2.3 Tipos de PCR

Existem vários tipos de reações de PCR que possuem processos e

finalidades singulares. A descrição dos principais processos de reação em cadeia da

polimerase está descritos a seguir:

2.3.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):

É um processo constituído de duas etapas: uma transcrição reversa e a

amplificação propriamente dita. O diferencial deste procedimento é que a amostra

fornece apenas um molde de RNA, sendo necessário converter esse RNA em cDNA

(DNA complementar) antes de realizar a amplificação. A reação em cadeia da

transcriptase reversa é muito útil, pois avaliando o mRNA podemos detectar quais

proteínas estão sendo efetivamente expressas.

O primeiro passo da reação consiste na síntese de uma fita de DNA utilizando

como template uma fita de RNA numa reação catalisada por uma transcriptase

reversa. Geralmente esta enzima pode ser extraída de dois vírus: AMV (Avian

Mieloblastosis Vírus) ou M-MuLV (Moloney Murine Laeukemia Vírus). Também são

utilizados primers, inespecíficos e que se nunca apresentam aos pares, compostos

de varias timinas consecutivos (6 a 35), que são aneladas às regiões Poly-A do

RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo tem-se o cDNA necessário para a

realização da PCR.

2.3.2 Multiplex PCR:

Nesta reação mais de um segmento genômico é amplificado, cada um com

seu par de primers específicos. Este processo é útil para a introdução de um

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controle de reação e para simplificar alguns experimentos, como a investigação de

paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados.

2.3.3 Nested PCR:

É a variação de PCR na qual são utilizados dois pares de primers para

amplificar um mesmo fragmento. Para melhorar a especificidade e a eficiência da

reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando

até mesmo sequencias localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro

produto, a amplificação da real sequencia-alvo. Estas duas etapas podem ser

realizadas concomitantemente ou em duas reações separadamente (Semi-Nested

PCR).

2.3.4 PCR Competitiva:

Nesta reação além do DNA molde, é adicionado à reação outro trecho de

DNA, que possui seqüência, tamanho e concentração conhecidos (controle). As

extremidades deste pedaço de DNA são complementares também aos primers que

irão amplificar a sequência-alvo. O resultado é a amplificação de dois trechos de

DNA: a de interesse e a controle. A amplificação de controle serve de padrão para a

quantificação do DNA-alvo.

Desta forma, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as

condições da reação, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado.

2.3.5 AFLP:

Análise do polimorfismo dos fragmentos amplificados ou AFLP PCR foi

originalmente descrita em 1993. AFLP é um método muito sensível baseado na

reação de PCR para detecção de polimorfismos no DNA. Também é usado para

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genotipagem individual de um grande número de loci usando um número mínimo de

reações de PCR.

2.3.6 Hot Start:

PCR Hot Start é o processo que permite a inibição da atividade da polimerase

durante a preparação para a reação de PCR. Através da limitação da atividade da

polimerase antes da ciclagem do PCR, a Hot Start PCR reduz amplificações não

especificas e aumenta o rendimento-alvo do produto da PCR.

Este tipo de PCR é realizado pelo uso de modificações químicas incluídas,

métodos de barramento com ceras e inibição por anticorpos direcionados à enzima

Taq.

2.3.7 PCR–colony:

O PCR-colony baseia-se na seleção de clones de bactérias (E. Coli),

leveduras ou produtos de plasmídeos. As colônias selecionadas de bactérias ou

leveduras são colhidas com um palito estéril ou pipeta de uma placa de crescimento

(agarose). Este é então inserido no máster mix PCR ou pré-introduzido na água

autoclavada. A PCR é então conduzida para determinar se a colônia contém o

fragmento de DNA ou plasmídeo de interesse.

2.3.8 Real-Time PCR:

O PCR em tempo real é caracterizado pelo período de tempo, quando a

amplificação do produto da PCR de interesse é detectada antes mesmo da

verificação da quantidade final do produto da PCR acumulada depois da reação, que

continha um grande número de ciclos. Este tipo de PCR, através do monitoramento

da quantidade de fluorescência emitida durante a reação de PCR, funciona como um

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indicador de quantidade de amplificação de PCR que ocorre durante cada ciclo de

PCR. Portanto, em novas maquinas de PCR é possível acompanhar a reação em

“tempo real”.

A PCR em tempo real ainda contém uma gama dinâmica muito maior de até

107 vezes, em comparação a 1000 vezes na RT-PCR convencional, resultando em

uma quantificação mais precisa. A faixa dinâmica de um ensaio determina o quanto

a concentração-alvo pode variar e ainda assim ser codificado.

2.3.9 Long:

Long PCR é a reação que é mais extensa ou mais longa que o padrão da

PCR, ou seja, mais de 5 kilobases. É geralmente útil somente se for de alta

precisão, assim, misturas especiais de polimerases proficiente juntamente com

polimerases precisas são muitas vezes misturadas.

Este processo PE frequentemente usado para clonar genes maiores ou

grandes segmentos de DNA que a PCR convencional não consegue realizar.

2.3.10 Inverse:

PCR inversa ou também chamada IPCR, foi descrito pela primeira vez em

1988. A PCR padrão possui a limitação de que é necessário conhecer as regiões

laterais de sentido 5’ e 3’ do fragmento de DNA de interesse. A PCR inversa permite

a condução da reação de PCR com a informação apenas de uma sequencia interna.

2.3.11 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorfism):

É uma reação em que os organismos podem ser diferenciados pela análise de

padrões derivados da clivagem do seu DNA, ou seja, os comprimentos dos

fragmentos produzidos pela clivagem de uma endonuclease de restrição de dois

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organismo diferentes vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de

restrição.

Para esta técnica é utilizada a metodologia de “Shouthern Blotting”, descrita e

1975, onde após a restrição enzimática os fragmentos de DNA genômico são

sujeitos a eletroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte solido

de nitrocelulose através do arrastamento por capilaridade. Após hibridização com

sondas radioativas este processo possibilita a identificação, entre milhares de

fragmentos de restrição obtidos, de sequências bem determinadas.

2.4 Análise do produto da PCR :

O produto da reação em cadeia da polimerase é analisado através da técnica

de eletroforese em gel. Esta se vale do principio de que a carga global de uma fita

de DNA é negativa, desta forma, uma solução que possua íons livres e que tenha

moléculas de DNA em suspensão pode ser purificada ao se aplicar uma dada

voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao

catodo(positivo), atraente de moléculas de carga negativa.

O objetivo desta técnica é separar os fragmentos por tamanho, já que a

reação gera fragmentos de mesma extensão. A solução é “peneirar” o resultado da

PCR por peneiras moleculares. As cadeias são “empurradas” através da peneira

pela corrente elétrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas serão retidas

ou liberadas. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é

comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos

percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular (Ladders =

Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis,

normalmente equidistante entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na

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prática que ele mostrará várias bandas, cada uma maior 50 pares de base do que a

anterior (50bp, 100bp,150bp, 200bp, 250bp...).

Existem dois tipos de eletroforese: Baseada em géis de agarose ou em géis

de poliacrilamida. As duas formam tramas de poros de tamanhos variáveis,

possibilitando a separação dos fragmentos, sendo que estas substâncias são

dissolvidas numa solução-tampão eletrolítica, obrigatoriamente a mesma que

recobrirá o gel na cuba de eletroforese e possibilitará a passagem de corrente

elétrica. Para impedir que a amostra comece a flutuar no tampão de corrida antes

que a voltagem seja aplicada no sistema, esta sofre uma mistura com outra

substancia tampão, com o objetivo de aumentar sua viscosidade.

Para a visualização do andamento da corrida utiliza-se um corante no tampão

da amostra. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol

(Corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampão

de corrida apropriado para cada reação.

Na cuba de eletroforese aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel

(entre 10 e 200V) e corrente de 50 a 3000mA. Quanto maior a concentração de gel

maior a capacidade de distinguir tamanhos próximos (definição), normalmente usa-

se 0,5 a 3% de agarose. A visualização dos produtos no gel após a corrida se dá

pela reação de ligação do DNA com brometo de Etídio que possui a capacidade de

inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescência quando excitado

com radiação ultravioleta. Utiliza-se 10µg/mL de EtBr no gel liquefeito antes da

corrida.

Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nível de dificuldade de realização,

a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas

quanto ao tamanho, e não quanto à sequência.

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Conclusão

Técnicas precisas de diagnóstico são de suma importância para a prática

clínica e pesquisas na área da saúde, pois se bem desenvolvidas fornecem

informações precisas. Com o advento do teste PCR pode-se estudar o padrão de

expressão gênica, fazer seqüenciamento direto de produtos amplificados, detecção

de mutações em genes, diagnóstico de doenças infecciosas, detecção de bactérias,

vírus, protozoários e parasitos, elucidar relações evolutivas entre espécies e auxiliar

na Medicina Forense.

A PCR pode amplificar qualquer sequência específica de DNA, a partir de

amostras de diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos

corporais, cabelo e cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina).

Amostras de microorganismos, células animais ou vegetais, alguns deles com

milhares, possivelmente até milhões, de anos de idade podem, também, ser

detectadas.

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Referencias:

BARTLETT, John M. S e STIRLING, David. PCR Protocols. 2ª edition. Humana

Press.

CORRÊA, Elisete Marcia. POSSIK, Patrícia Abraão. A análise de DNA por

eletroforese.

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http://educacao.genesisdbm.com.br/educacao_pcr.shtml. Acesso 23/09/2011.

PCR. Disponível em: < http://www.pcrstation.com/real-time-pcr/>. Acesso em:

21/09/2011.

RABELO, Jorge. Reação em cadeia da polimerase (PCR). Universidade Católica

de Salvador – disciplina de genética evolutiva e humana.

SILVA, Flávio Henrique. Biologia Molecular. Escola brasileira de inteligência

artificial e bioinformática InBio, São Carlos – SP: 2001. (Apostila digital)

Sistema web para projeto de PCR. Disponível em: <http://inf.unisul.br/~ines/workco

mp/cd/pdfs/2409.pdf>. Acesso em: 21/09/2011.

Técnicas de analise de DNA aplicadas a diagnéstico. Disponível em:

<medicina.med.up.pt/bcm/trabalhos/tecnicasdeanalisede%20dna.doc>. Acesso em:

24/09/2011.

22

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VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicação e padronização de reações –

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VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicação e padronização de reações –

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Protozoologia – IMTSP/ Laboratório de Biologia Molecular – IPEN. Disponível

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