instruções de utilização do surveyor scan kit exons 3 & 4 ... · 3 princípios do teste de...

1 Fabricante

Instruções de Utilização do

SURVEYOR® Scan KRAS Kit

Exons 3 & 4 CE IVD

para Sistemas de DHPLC

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Índice 1 Fabricante ....................................................................................................................................... 3 2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD ....................................................................... 3 2.1 Utilização Prevista ....................................................................................................................................... 3 2.2 Indicações de Utilização .............................................................................................................................. 3 3 Princípios do Teste de Detecção de Mutações com o SURVEYOR Scan KRAS .................... 4 3.1 KRAS e NRAS ................................................................................................................................................ 4 3.2 Análise de amostras de pacientes utilizando os Kits SURVEYOR Scan ........................................................ 4 3.3 SURVEYOR Nuclease .................................................................................................................................... 5 4 Rastreabilidade dos Controlos do Kit ......................................................................................... 5 5 Componentes ................................................................................................................................. 6 5.1 Número de Amostras que podem ser testadas com um Kit ....................................................................... 7 5.2 Sequenciação de DNA ................................................................................................................................. 7 6 Reagentes e Equipamentos Adicionais Necessários ................................................................ 8 7 Preparação dos Reagentes........................................................................................................... 8 8 Armazenamento e Tempo de Permanência na Prateleira ......................................................... 8 9 Advertências e Precauções .......................................................................................................... 8 10 Recolha, Manuseamento e Armazenamento da Amostra Primária ........................................ 9 11 Procedimento de Teste ............................................................................................................. 10 11.1 Detecção de Mutações Somáticas com os Kits de Análise SURVEYOR Scan - Uma Visão Geral ............. 10 12 Instruções Passo-a-Passo ........................................................................................................ 11 12.1 Configuração/Calibração inicial do Sistema DHPLC ................................................................................ 11 12.2 Considerações antes da Análise de Amostras KRAS ................................................................................ 11 12.3 Considerações sobre o Modelo ............................................................................................................... 11 12.4 Considerações sobre o Fluxo de Trabalho ............................................................................................... 12 12.5 Protocolo de Amplificação ...................................................................................................................... 14 12.6 Programa do Termociclador para Protocolo de Amplificação ................................................................ 16 12.7 Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR .......................................................................................... 16 12.8 Digestão da SURVEYOR Nuclease ............................................................................................................ 17 13 Procedimentos de Controlo da Qualidade .............................................................................. 18 13.1 Controlo de Qualidade do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD ............................................... 18 13.2 Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo .................................................................................................... 19 14 Interpretação dos Resultados .................................................................................................. 19 14.1 Análise do KRAS Exons 3 e 4 utilizando a SURVEYOR Nuclease .............................................................. 19 14.2 Revisão de dados dos resultados do SURVEYOR Scan ............................................................................ 19 14.3 Exemplos de Resultados .......................................................................................................................... 21 15 Características de Desempenho .............................................................................................. 24 15.1 Nível de Detecção de Mutações utilizando os Kits SURVEYOR Scan ....................................................... 24 15.2 Confirmação de Sequências .................................................................................................................... 24 15.3 Limitações do Procedimento de Teste .................................................................................................... 24 Apêndice A ...................................................................................................................................... 26 A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR Scan ..................................................................... 26 A.2 Selos de ADN de controlo ......................................................................................................................... 26 A.3 Requisitos de desnaturação do sistema HPLC (DHPLC) ............................................................................ 27 A.4 Preparação do laboratório para testes PCR .............................................................................................. 28 A.5 Referências Bibliográficas ......................................................................................................................... 29 Apêndice B ...................................................................................................................................... 30 Guia de Resolução de Problemas .................................................................................................................... 30 Detalhes para Encomendas ........................................................................................................... 36 Detalhes de Contacto ..................................................................................................................... 36 Tradução Disclaimer ...................................................................................................................... 36 Licenças, Marcas Comerciais e Direitos de Autor ...................................................................... 37

1 Fabricante

Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD para Sistemas de DHPLC Página 3

1 Fabricante

Fabricante M Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA

Tel.: 1-402-452-5400

Representante na Comunidade

Europeia

P Transgenomic Limited

40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel.: +44-141-892-8800

2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD

2.1 Utilização Prevista

Apenas para uso profissional. O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD da Transgenomic é um teste de diagnóstico in vitro que detecta mutações somáticas nos Exons 3 & 4 do gene KRAS. Estas mutações são indicadas pelos picos de clivagem da SURVEYOR Nuclease e incluem as mutações com potencial conhecido de significância clínica. Este kit foi concebido para utilização num laboratório de diagnósticos clínicos por pessoal adequadamente treinado, que testa DNA extraído a partir de tecidos embebidos em parafina e fixados com formalina.

Este kit, número de catálogo 710106, é fornecido numa caixa individual que contém os componentes abaixo indicados. Estas Instruções de Utilização estão disponíveis para transferência no endereço http://world.transgenomic.com/files/literature/482407-PT.pdf.

2.2 Indicações de Utilização

Os clínicos podem utilizar o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD com Sistemas de DHPLC para ajudar a decidir se os tumores de cancro colo-rectal dos pacientes podem não responder a terapêuticas anti-EGFR (epidermal growth factor receptor - receptor do factor de crescimento epidérmico), como por exemplo, panitumumab.

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD destina-se a ser utilizado para a análise dessas amostras determinadas como sendo KRAS Exon 2 Wild-Type após a análise com o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD. Este kit deve ser também utilizado juntamente com o SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD.

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD não deve ser utilizado no diagnóstico do cancro colo-rectal ou de qualquer outro cancro.

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD é um teste que detecta a presença de potenciais mutações somáticas nos Exons 3 & 4 do gene KRAS, mas não confirma a identidade da sequência da mutação. Para confirmar com precisão a mutação detectada, seriam necessárias análises adicionais, tais como a sequenciação de DNA.

Embora os resultados das análises efectuadas com este kit indiquem o estado de mutação do paciente, outros factores clínicos, incluindo mutações no KRAS Exon 2 e NRAS Exons 2, 3 & 4, devem ser tidos em consideração. Os resultados obtidos utilizando o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD não devem constituir o único método utilizado na tomada de decisões relativamente ao tratamento de quaisquer pacientes com cancro colo-rectal.

É importante salientar que a utilização de DHPLC para identificar amostras com resultado positivo relativamente a uma mutação do gene KRAS com este kit só deve ser usada como orientação e que todas as mutações têm de ser confirmadas através de análises adicionais, tais como a sequenciação de ADN.

http://world.transgenomic.com/files/literature/482407-PT.pdf

3 Princípios do Teste de Detecção de Mutações com o SURVEYOR Scan KRAS



3.1 KRAS e NRAS

Os agentes terapêuticos que têm como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) têm-se mostrado eficazes no tratamento do cancro colo-rectal. A investigação realizada até ao momento indica que aproximadamente 40% dos tumores colo-rectais transportam mutações somáticas do gene KRAS e os estudos clínicos demonstraram que as mutações do KRAS exon 2 (codões 12 e 13) prevêem uma ausência de resposta a terapêuticas anti-EGFR. Estudos exploratórios recentes demonstraram que a população de pacientes podem ser redefinida de forma mais precisa como pacientes cujos tumores mCRC com uma mutação adicional nos KRAS exons 3 e 4 ou NRAS exons 2, 3 e 4 também não apresentaram qualquer tendência de resposta a terapêuticas anti-EGFR

1-7. Este kit foi concebido para utilização na

análise de diagnóstico de mutações somáticas dos KRAS Exons 3 e 4.

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD é um teste para detectar todas as sequências e pequenas alterações de inserção/eliminação nos Exons 3 e 4 do gene KRAS. As mutações nos codões 59, 61, 117 e 146 do gene KRAS têm sido associadas à falta de eficácia de panitumumab. São fornecidos Positive Controls neste kit para mutações nos codões 61, 117 e 146.

Este kit usa a tecnologia SURVEYOR Nuclease da Transgenomic que, quando aliada a DHPLC, permite uma detecção simples e sensível de potenciais mutações. É capaz de detectar uma mistura de 2-5% de mutante num fundo de DNA não-mutante. Os estudos de validação demonstraram uma concordância extremamente elevada com a sequenciação em amostras de cancro colo-rectal bem caracterizadas. A utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD irá diminuir o peso do trabalho de sequenciação por parte do utilizador e ajudar na chamada de sequências quando o software de sequenciação automática não consegue determinar a presença de mutações de baixo nível.

Devido à elevada sensibilidade deste teste em relação à sequenciação de Sanger, recomenda-se que a preparação do laboratório seja optimizada para evitar a contaminação cruzada de amostras ou controlos. Para um exemplo de uma preparação ideal do laboratório, consulte Apêndice A.4 Preparação do laboratório para testes PCR.

3.2 Análise de amostras de pacientes utilizando os Kits SURVEYOR Scan

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD só deve ser utilizado no contexto de um dos fluxos de trabalho indicados abaixo.

Figura 1 Fluxos de trabalho do Kit de detecção de mutações SURVEYOR Scan para o rastreio de KRAS e NRAS

Amostra de paciente

Testes KRAS Exons 2, 3 e 4 e NRAS Exons 2, 3 e 4

Reportar relatório

Fluxo de trabalho A

Amostra de paciente

Teste KRAS Exon 2

Reportar relatório

Testes KRAS Exons 3 e 4 e NRAS Exons 2, 3 e 4

Resultado Codão KRAS 12 ou 13 de

tipo selvagem

Resultado Mutação do Codão

KRAS 12 ou 13

Reportar relatório

Fluxo de trabalho B



Para uma sugestão sobre como configurar 96 poços para análise de todos os KRAS e NRAS Exons 2-4 consulte Apêndice A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR Scan.

3.3 SURVEYOR Nuclease

A SURVEYOR Nuclease da Transgenomic é uma endonuclease específica para mismatch (desigualdade) do ADN, que consegue procurar mutações conhecidas e desconhecidas e polimorfismos em heterodúplices de ADN

8. A enzima cliva o ADN com elevada especificidade em

locais com desigualdade de bases-substituição e outras distorções. Esta endonuclease do ADN corta ambas as cadeias de uma heterodúplice de ADN na extremidade 3’ do sítio de mismatch. As desigualdades de inserção/deleção e todas as desigualdades de bases-substituição são reconhecidas, mas a eficiência da clivagem varia em função da sequência da desigualdade.

A SURVEYOR Nuclease tem sido utilizada em diversos contextos para detectar com precisão uma vasta gama de mutações e polimorfismos nos genes. Em particular, a SURVEYOR Nuclease tem sido utilizada para verificar a presença de mutações conhecidas numa série de genes associados ao cancro renal, cancro dos pulmões, cancro da cabeça e do pescoço, leucemia, cancro do endométrio e na previsão de resultados da radioterapia

9,10,11.

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD foi concebido para a clivagem de mismatches nos KRAS Exons 3 e 4 para análise subsequente pelo DHPLC.

Nota: se uma amostra for 100% de ADN mutante, não podem ser formados quaisquer heterodúplices e a amostra aparentará ser “Wild-Type”. No entanto, as amostras de biopsia tumoral conterão células Wild-Type devido à heterogeneidade do tumor e/ou à contaminação do tecido normal; note que entre 2 a 5% de amostras de Wild-Type podem ser detectados por este kit com traços idênticos a 2-5% de ADN mutante.

Nota: apenas deve ser utilizada para este teste a DNA Polymerase fornecida com este kit.

Nota: Siga as instruções específicas no manual do sistema DHPLC.

Para utilizar este kit com êxito, recomendamos vivamente que leia este manual com atenção e que siga cuidadosamente as instruções e orientações fornecidas. Os utilizadores principiantes devem realizar as experiências de controlo descritas na secção Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo.

Se tiver mais questões ou necessitar de assistência, contacte-nos através do número (888) 233-9283 (apenas América do Norte), +1 (402) 452-5400 ou +44 (0) 141 892 8800 (Europa) e solicite “Apoio sobre KRAS”. Em alternativa, pode enviar-nos um e-mail para o endereço:

[email protected]

4 Rastreabilidade dos Controlos do Kit Os controlos fornecidos com este kit são clones plasmídicos das sequências do KRAS Exons 3 e 4. Todos os clones foram sequenciados para verificar a fidelidade da sequência por comparação com a NCBI Reference Sequence: NG_007524.1.

Os controlos têm um "selo" genético. Consulte Apêndice A.2 Selos de ADN de controlo; estas

Figura 2. Modo de acção da SURVEYOR Nuclease. A endonuclease reconhece uma mismatch e cliva na extremidade 3’ de cada base na mismatch. Isto cliva a cadeira dupla de ADN, deixando saliente uma única base de 3’.

mailto:[email protected]

4 Rastreabilidade dos Controlos do Kit


variações da sequência KRAS Wild-Type, numa região onde não se espera ocorrerem mutações, podem ser utilizadas para resolver questões de contaminação de amostras através de Positive Controls. Consulte o Apêndice B - Guia de resolução de problemas, Problema 8, para um exemplo de um rastreio SURVEYOR Scan de tal contaminação.

O “KRAS Control Wild-Type” foi criado através da síntese e clonagem do KRAS Exons 3 e 4 utilizando a sequência de referência NCBI acima.

O “KRAS Positive Control Exon 3” foi criado pela síntese do KRAS Exon 3 utilizando a sequência de referência acima mas contendo a mutação G61H. A sequenciação de ADN confirmou que a única alteração da sequência se encontra no codão 61 com uma alteração Q61H, CAA>CAC. Este clone é em seguida misturado com ADN do KRAS Control Wild-Type para criar uma mistura de heterozigotos.

O “KRAS Positive Control Exon 4A” foi criado pela síntese do KRAS Exon 4 utilizando a sequência de referência acima mas contendo a mutação K117N. A sequenciação de ADN confirmou que a única alteração da sequência se encontra no codão 117 com uma alteração K117N, AAA>AAT. Este clone é em seguida misturado com ADN do KRAS Control Wild-Type para criar uma mistura de heterozigotos.

O “KRAS Positive Control Exon 4B” foi criado pela síntese do KRAS Exon 4 utilizando a sequência de referência acima mas contendo a mutação A146T. A sequenciação de ADN confirmou que a única alteração da sequência se encontra no codão 146 com uma alteração A146T, GCA>ACA. Este clone é em seguida misturado com ADN do KRAS Control Wild-Type Exon para criar uma mistura de heterozigotos.

5 Componentes O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD é composto por (1) uma Caixa de componentes de digestão SURVEYOR com 10 tubos de reagente sem orifícios vazios e (2) um Suporte de tubos de controlos e componentes PCR externo com 13 tubos de reagente e 7 orifícios vazios.

Número de

catálogo Componente

Cor da tampa do

tubo

Volume fornecido no Kit de

100 reacções

Caixa de componentes de digestão SURVEYOR

710160 SURVEYOR Nuclease W Roxo 2 x 105 µL

710161 SURVEYOR Enhancer W2 Preto 105 µL

708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 µL

708027 0.15 M MgCl2 Solution Castanho 105 µL

708030 SURVEYOR Stop Solution Vermelho 250 µL

710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µM) Laranja 2 x 125 µL 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µM) Laranja 2 x 125 µL

Caixa de controlos e componentes PCR

703310 DNA Polymerase Vermelho 100 µL 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Transparente 1 mL 703065 dNTPs (10 mM) Transparente 500 µL

710157F KRAS Primer Exon 3 Forward (10 µM) Azul 90 µL

710157R KRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µM) Azul 90 µL

710154F KRAS Primer Exon 4A Forward (10 µM) Azul 90 µL

710154R KRAS Primer Exon 4A Reverse (10 µM) Azul 90 µL

710156F KRAS Primer Exon 4B Forward (10 µM) Azul 90 µL

710156R KRAS Primer Exon 4B Reverse (10 µM) Azul 90 µL

710131 KRAS Control Wild-Type Amarelo 120 µL

710136 KRAS Positive Control Exon 3 Verde 40 µL

710137 KRAS Positive Control Exon 4A Verde 40 µL

710138 KRAS Positive Control Exon 4B Verde 40 µL

482407 Instruções de Utilização Transferir a partir do site*



5 Componentes


5.1 Número de Amostras que podem ser testadas com um Kit

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD foi concebido para permitir testar 100 reacções. O número total de amostras que podem ser testadas com o kit depende do tamanho médio do lote de amostras testadas em cada momento, uma vez que em cada placa de reacção deve ser incluído um conjunto de reacções de controlo (Controlos Wild-Type, Positive Controls e Controlos sem modelo). A tabela que se segue apresenta o número de amostras que podem ser analisadas com o Kit KRAS em função do tamanho médio do lote de amostras. Isso tem em consideração (a) os 9 controlos (3x Wild-Type, 3x Positive Controls, 3x Controlos sem modelo) que são necessários para cada execução de análise de amostras e (b) o limite de 100 reacções por kit.

Nota: Se forem processadas várias placas, deve ser processado em cada placa um conjunto dos 9 controlos listados acima. Por conseguinte, duas placas precisam de, no total, 18 reacções de controlo, 3 placas precisam de 27 reacções de controlo, etc.

Quando se aumenta o tamanho do lote de amostras, aumenta o número de amostras que podem ser testadas com um kit, reduzindo o custo médio de reagentes por amostra. A tabela abaixo serve de orientação para determinar o número de amostras que podem ser testadas com um único kit.

Tamanho

do lote de

amostras

N.º de reacções de

controlo + N.º de

amplificações de

amostras

N.º de reacções

por

processamento

N.º total de

processamentos

de lote de

amostras por kit

Total de

amostras

testadas

por kit

1 9 + 3 12 8 8

2 9 + 6 15 6 12

3 9 + 9 18 5 15

4 9 + 12 21 4 16

5 9 + 15 24 4 20

5.2 Sequenciação de DNA

São fornecidos Universal Sequencing Primers (PNs 710153F e 710153R) para utilização na sequenciação de ADN de todas as amostras testadas. As amplificações obtidas por PCR, criadas antes da digestão com a SURVEYOR Nuclease, devem ser utilizadas na sequenciação.

6 Reagentes e Equipamentos Adicionais Necessários


6 Reagentes e Equipamentos Adicionais Necessários

Os componentes e equipamentos adicionais necessários para utilizar o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD para DHPLC incluem os seguintes:

Sistema DHPLC, coluna, tampões, ADN tamanho padrão - consulte o Apêndice A.3.1 Especificações do Sistema DHPLC para aplicações SURVEYOR Scan quanto às características de um sistema DHPLC adequado para utilização com este kit

Água para biologia molecular

Tubos PCR de 0,2 mL, tiras ou placa de 96 poços

Micropipetas

Pontas de pipeta

Banho de gelo

Agitador de vórtice

Microcentrífuga

Termociclador

Géis de agarose e equipamento de electroforese em gel de agarose

Solução de lixívia a 10% ou agente de limpeza semelhante

7 Preparação dos Reagentes

Todos os reagentes fornecidos com este kit estão prontos a utilizar. Alguns componentes precisam de ser descongelados, agitados ou centrifugados numa microcentrífuga antes da sua utilização. Verifique os detalhes na secção Procedimento de Teste abaixo apresentada. É necessário combinar reagentes para produzir Misturas Principais e misturas de reacção. Os detalhes completos são fornecidos na secção Procedimento de Teste abaixo.

8 Armazenamento e Tempo de Permanência na Prateleira

O kit deve ser armazenado a uma temperatura entre -18 ºC e -25 °C num frigorífico de temperatura constante até ser utilizado. Tenha em atenção o Prazo de Validade de cada kit recebido. Não utilize um kit cujo prazo de validade já tenha expirado.

A mistura da SURVEYOR Nuclease preparada no Passo 7 com a Digestão de SURVEYOR Nuclease deve ser imediatamente usada, uma vez que a SURVEYOR Nuclease W é desactivada ao longo do tempo na presença de outros componentes da mistura de reacção da SURVEYOR Nuclease.

9 Advertências e Precauções

Nenhum dos reagentes deste kit representa um perigo para a saúde nas quantidades fornecidas. A Ficha de Dados de Segurança, documento n.º MSD-710106, da Transgenomic pode ser transferida a partir de


Este kit não contém substâncias de origem animal ou humana que representem um risco de infecção.

Este kit deve ser utilizado apenas pelas pessoas que receberam formação sobre as técnicas laboratoriais adequadas. Ao trabalhar com os componentes deste kit, use sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e protecção ocular. Após a utilização, os componentes do kit devem ser eliminados como resíduos clínicos e em conformidade com as normas e regulamentos locais.

As alíquotas de reagentes pipetadas a partir dos tubos deste kit destinam-se a ser utilizadas apenas uma vez. Os componentes deste kit demonstraram manter-se estáveis ao longo de 25 ciclos de congelamento/descongelamento. Não utilize este kit se este número de ciclos de congelamento/descongelamento for excedido.


10 Recolha, Manuseamento e Armazenamento da Amostra Primária


10 Recolha, Manuseamento e Armazenamento da Amostra Primária

O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD foi validado para utilização com ADN extraído a partir de amostras de tumores de cancro colo-rectal fixadas em formol e embebidas em parafina (FFPE). Para uma extracção optimizada do DNA, os tecidos devem ser fixados em formol durante 14–24 horas antes de serem embebidos em parafina.

As biópsias tumorais são uma mistura heterogénea de células tumorais e células não tumorais. Para além disso, o próprio tumor é uma mistura heterogénea de células tumorais com mutações e células tumorais sem mutações. Uma vez que estas mutações somáticas podem não estar uniformemente distribuídas pelo tumor, as análises mutacionais de diferentes secções do mesmo tumor podem ser diferentes. Para aumentar a probabilidade de detectar uma mutação, o ADN da região tumoral do tecido deve ser isolado, raspando apenas a área do tumor da lâmina de vidro utilizando um bisturi novo e esterilizado para cada nova lâmina.

Para a utilização bem-sucedida deste kit, o ADN extraído deve cumprir os critérios listados na secção Considerações sobre o Modelo.

NOTA: As amostras de ADN extraído não destinadas a análise imediata com este kit devem ser armazenadas congeladas a uma temperatura entre -20 ºC e -80 ºC.

11 Procedimento de Teste


11 Procedimento de Teste

11.1 Detecção de Mutações Somáticas com os Kits de Análise SURVEYOR Scan - Uma Visão Geral

A detecção e confirmação de mutações com a SURVEYOR Nuclease envolve três passos:

Passo 1 - Preparar amplificações por PCR a partir de ADN mutante (teste) e normal (referência), continuando a partir do ciclo final de amplificação por PCR para fundir todas as cadeias duplas e depois arrefecer lentamente para uma formação óptima de hetero- e homodúplices (os heterodúplices ocorrem quando uma cadeia de uma sequência Wild-Type se hibrida com uma cadeia de uma sequência mutante).

Passo 2 - Tratar uma porção da mistura híbrida de heterodúplices/homodúplices com a SURVEYOR Nuclease. A SURVEYOR Nuclease irá cortar ambas as cadeias de ADN com heterodúplices, dando origem a fragmentos de ADN. O ADN Control Wild-Type, tratado da mesma forma, serve de controlo de fundo.

Passo 3 - Analisar os fragmentos de ADN com o sistema DHPLC. A formação de novos produtos de clivagem, devido à presença de uma ou mais desigualdades (mismatches), é indicada pela presença de picos cromatográficos adicionais. Os tempos de migração dos produtos de clivagem indicam o tamanho dos fragmentos e, por conseguinte, a localização aproximada da desigualdade ou desigualdades.

12 Instruções Passo-a-Passo



12.1 Configuração/Calibração inicial do Sistema DHPLC

Aquando da preparação da placa SURVEYOR Nuclease para análise com o sistema DHPLC, consulte o Apêndice A.3 Requisitos de desnaturação do sistema HPLC (DHPLC).

12.2 Considerações antes da Análise de Amostras KRAS

Antes de processar amostras num sistema DHPLC, deve ser processado um ADN de tamanho padrão apropriado para assegurar que o sistema está a funcionar correctamente. Através do instrumento, o pessoal do laboratório deverá verificar a qualidade da resolução do ADN de tamanho padrão antes de prosseguir com a análise.

12.3 Considerações sobre o Modelo

1. Para o DNA modelo isolado FFPE, use os procedimentos normais de laboratório para avaliar a qualidade e quantidade do ADN extraído, de forma a assegurar que existe quantidade suficiente de modelo para a PCR.

2. O rácio de absorção 260/280 deve ser superior a 1,80.

3. Para agilizar a preparação da PCR, ajuste a concentração do modelo de trabalho para cerca de 12,5 ng/µL. Se necessário, dilua o ADN modelo em água para biologia molecular.



12.4 Considerações sobre o Fluxo de Trabalho

O kit foi concebido para permitir a análise de 100 reacções. Podem ser analisados lotes de amostras mais pequenos, mas os controlos do kit e um “controlo sem modelo” têm de ser incluídos em cada lote de amostras. O kit contém materiais de controlo suficientes para 100 reacções de todas as combinações de tamanhos de lotes de amostras a serem utilizados.

No geral, o processamento de amostras deve ser executado desde o início ao fim, conforme descrito nestas Instruções de Utilização. Se o processamento de uma amostra tiver de ser interrompido antes da conclusão de todos os passos, o ADN deve ser armazenado a uma temperatura de -20 °C nos pontos indicados. Contudo, deve-se evitar a exposição de qualquer amostra congelada a ciclos repetidos de congelamento/descongelamento e o armazenamento congelado (-18 a -25 °C) de ADN amplificado por PCR ou de produtos de digestão da SURVEYOR Nuclease por períodos alargados (>1 semana) deve ser evitado.

A análise de amostras deve seguir o fluxo de trabalho abaixo ilustrado:

Isolamento

de ADN e

PCR

Electroforese em gel

Análise de SURVEYOR

Nuclease e DHPLC

SURVEYOR Scan

Positivo

SURVEYOR Scan

Negativo

Classificar PCR como Robusta/Fraca

NVD

Raspagem

de tecido

Qualidade da

sequência aprovada

Qualidade da

sequência

reprovada

Falha do

SURVEYOR

Scan

Confirmação

da sequência

Mutações nos codões

A59, Q61,

K117 ou A146

5

4

7 6

3

21

9

8

NVD

Figura 3 Fluxo de Trabalho da análise com o Kit SURVEYOR Scan KRAS



Notas da Figura 3

1. Isole o DNA a partir de FFPE utilizando os procedimentos normais de laboratório.

2. Execute a PCR e verifique a qualidade do DNA através da electroforese em gel.

3. Registe se a banda de PCR é Robusta (≥20 ng/µL) ou Fraca (<20 ng/µL).

Se existirem múltiplas bandas de PCR, prepare ADN genómico fresco a partir de FFPE.

4. Com amostras que são classificadas como PCR Robusta ou PCR Fraca após a amplificação por PCR, avance para o tratamento da SURVEYOR Nuclease e análise do sistema DHPLC.

Note que com uma chamada de PCR Fraca, poderão não haver ADN suficiente para a geração de resultados significativos no sistema DHPLC, mas poderá haver ADN suficiente para a sequenciação.

5. Consulte o Apêndice B – Guia de resolução de problemas para exemplos de resultados SURVEYOR Scan com falha. Todas as amostras com resultado falhado do SURVEYOR Scan devem ser reprocessados de uma das seguintes formas:

a. repetindo a PCR se ainda restar ADN genómico suficiente

b. voltando a extrair ADN a partir de FFPE. Esta deverá ser a escolha secundária, uma vez que normalmente não é desejável cortar outro bloco FFPE.

c. se for utilizada outra secção ou bloco, o teste deve ser repetido na íntegra, uma vez que as discrepâncias na digestão podem dever-se à heterogeneidade tumoral.

6. Se não existirem picos de clivagem visíveis, registe um resultado negativo do SURVEYOR Scan, ou seja, NVD = Nenhuma Variante Detectada.

7. Se uma amostra apresentar produtos de clivagem da SURVEYOR Nuclease (não corresponder ao Wild-Type Control relevante), estes devem ser enviados para confirmação da sequenciação.

8. Se a análise de confirmação de sequências for inaceitável, deve proceder de uma das seguintes formas:

a. repetir a PCR se ainda restar ADN genómico suficiente

b. voltar a extrair ADN a partir de FFPE. Esta deverá ser a escolha secundária, uma vez que normalmente não é desejável cortar outro bloco FFPE.

9. Se a análise de confirmação de sequências for aceitável, os resultados devem indicar:

a. Sequência Wild-Type, ou seja, Nenhuma Variante Detectada (NVD); ou

b. Variante Detectada. Se a confirmação de sequências indicar qualquer alteração de base resultando numa alteração em aminoácido no:

i. codão 59

ii. codão 61

iii. codão 117; ou

iv. codão 146

classifique como uma mutação positiva do KRAS.

Nota: é possível ter uma chamada de SURVEYOR Scan Positivo que também resulta em "Nenhuma Variante Detectada" a partir de um teste de confirmação de sequências. O nível de detecção (LOD) da SURVEYOR Nuclease num sistema DHPLC é tão baixo como 2% de mutante em 98% de ADN Wild-Type para algumas mutações, enquanto que o LOD de sequenciação é de cerca de 10-25% de mutante em 90-75% de ADN Wild-Type.

Nota: se uma amostra for 100% de ADN mutante, não podem ser formados quaisquer heterodúplices e a amostra aparentará ser “Wild-Type”. No entanto, as amostras de biopsia tumoral conterão células Wild-Type devido à heterogeneidade do tumor e/ou à contaminação do



tecido normal; 5% de amostras de Wild-Type podem ser detectados por este kit com traços idênticos a 5% de ADN mutante.

Nota: os resultados positivos do SURVEYOR Scan podem ser devidos a alterações de bases que não as que são activadoras do KRAS. Embora estas mutações sejam raras, a confirmação através de outros métodos, tais como a sequenciação de ADN, será necessária para determinar se um resultado positivo do SURVEYOR Scan é ou não uma mutação activadora do KRAS.

Nota: o processo de fixação em formol utilizado na preparação de amostras FFPE de biópsia tumoral podem resultar na desaminação de citosinas. Esta desaminação converte a citosina em uracilo. A polimerase irá “interpretar” este uracilo como uma timina e incorporar uma adenina nas cadeias copiadas. Isto irá então parecer uma mutação onde o G normal é agora substituído por um A gerando uma mutação de G/C para A/T que é uma mutação artificial resultante do processo de fixação e não uma verdadeira mutação somática. Estes são acontecimentos raros, mas se forem copiados no ciclo de PCR, estes irão “parecer” mutações. Estes não se repetem com a reanálise.

Um exemplo de uma potencial mutação de desaminação da citosina que seria considerada para a determinação do tratamento do paciente é o KRAS A146T.

- Codão 146: GCA>ACA (A146T)

Por isso, é recomendado que qualquer mutação dessas seja confirmada por uma análise de duplicados do mesmo ADN genómico ou que todas as amostras sejam sujeitas à análise de duplicados desde o início da análise.

12.5 Protocolo de Amplificação

1. A solução pré-misturada dNTP da Transgenomic (PN 703065) é fornecida com uma concentração de trabalho total de 10 mM de desoxinucleótidos (2,5 mM de cada um dos quatro desoxinucleótidos).

2. Os primers de PCR KRAS Exon 3, Exon 4A e Exon 4B Forward e Reverse (PNs 710157F/R, 710154F/R e 710156F/R) são fornecidos na concentração de 10 µM.

3. Retire os primers de 10 µM, a solução de 10 mM dNTPs e o DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) do frigorífico e descongele em gelo.

4. Uma vez descongelados, agite em vórtice todos os componentes do kit (~10 segundos) para misturar bem, centrifugue brevemente (~10 segundos) para assegurar que não resta nenhum líquido nas tampas dos tubos e coloque em gelo.

5. Prepare as Misturas Principais em gelo.

6. Use a tabela que se segue como um guia para preparar a Mistura Principal para as reacções do KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A e KRAS Exon 4B:

Número de Reacções: 10

Cálculo do Volume:

Volume de Água (µL) 330**

DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL) 50

dNTPs (µL) 40

KRAS Primer Exon 3, 4A ou 4B Forward (µL) 25

KRAS Primer Exon 3, 4A ou 4B Reverse (µL) 25

DNA Polymerase (µL) 10

Volume Total da Mistura Principal 48,0

**Nota: O utilizador deve ter como objectivo um mínimo de 25 ng de ADN por reacção de 50 µL. Quando as concentrações de ADN extraído são inferiores a 12,5 ng/µL, aumente proporcionalmente o volume de ADN extraído para assegurar 25 ng por reacção. Diminua também nessa mesma quantidade o volume de água nas Misturas Principais para resultar em 50 µL por reacção. Todas as amostras preparadas com estas Misturas Principais irão necessitar de diluir o ADN extraído para



aproximadamente o mesmo nível de concentração mínimo. A utilização de concentrações de ADN extraído inferiores a 5 ng/µL não é recomendada.

7. Calcule os volumes necessários para qualquer Mistura Principal de acordo com o gráfico acima; note que:

(a) Para a Mistura Principal 1, KRAS Exon 3, serão necessárias três reacções adicionais para o KRAS Control Wild-Type, para o KRAS Positive Control Exon 3 e para o KRAS Exon 3 Controlo sem modelo (NTC1).

(b) Para a Mistura Principal 2, KRAS Exon 4A, serão necessárias três reacções adicionais para o KRAS Control Wild-Type, para o KRAS Positive Control Exon 4A e para o KRAS Exon 4A Controlo sem modelo (NTC2).

(c) Para a Mistura Principal 3, KRAS Exon 4B , serão necessárias três reacções adicionais para o KRAS Control Wild-Type, para o KRAS Positive Control Exon 4B e para o KRAS Exon 4B Controlo sem modelo (NTC3).

Nota: tenha em atenção que será necessário um volume de Mistura Principal ligeiramente superior a este cálculo para compensar as perdas durante a pipetagem.

8. Rotule os tubos de PCR de 0,2 mL ou os poços de uma placa de 96 poços, com as informações adequadas da amostra.

9. Rotule tubos centrífugos de 2,0 mL para a preparação da Mistura Principal.

10. Adicione o volume necessário de água para biologia molecular aos tubos centrífugos de 2,0 mL rotulados “Mistura Principal”.

11. Adicione o volume necessário de DNA Polymerase 10X PCR Buffer aos tubos da Mistura Principal.

12. Adicione o volume necessário de 10 mM dNTPs aos tubos da Mistura Principal.

13. Adicione o volume necessário de KRAS Forward Primers aos respectivos tubos da Mistura Principal.

14. Adicione o volume necessário de KRAS Reverse Primers aos respectivos tubos da Mistura Principal.

15. Retire a DNA Polymerase (PN 703310) do frigorífico.

16. Centrifugue a DNA Polymerase durante ~10 segundos.

17. Misture a DNA Polymerase durante ~10 segundos.

18. Adicione o volume necessário de DNA Polymerase aos tubos da Mistura Principal.

19. Coloque a tampa nos tubos da Mistura Principal.

20. Antes de utilizar, agite em vórtice os tubos da Mistura Principal durante ~30 segundos e depois centrifugue brevemente durante ~10 segundos.

21. Armazene em gelo até ser utilizado.

22. Pipete 48,0 µL (ver nota acima no passo 6) da Mistura Principal nos poços adequados, mudando entretanto as pontas de pipeta se estiver a utilizar um pipetador de canal único. Se estiver a utilizar um pipetador de repetição, assegure que não existem derrames ou salpicos de poço para poço. Mantenha a placa em gelo.

23. Nos poços adequados, adicione 2,0 µL (ver nota acima no passo 6) de cada ADN modelo de amostra ou de água (controlo sem modelo, NTC). Use pontas de pipeta separadas para cada amostra e evite a contaminação cruzada entre amostras por salpicos. Coloque a tampa nos poços que contêm as amostras de ADN e o NTC com as tiras de 8 tampas (se estiver a utilizar uma placa de 96 poços) ou coloque a tampa nos tubos de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que as tampas estão bem seladas.

24. Só então deve abrir os tubos de ADN modelo de controlo do kit (PNs 710131, 710136, 710137, 710138) um de cada vez. Pipete 2,0 µL de cada um dos modelos destes controlos em último lugar, de forma a reduzir a probabilidade de contaminação de qualquer amostra de ADN. Mais uma vez, coloque a tampa em cada poço com as tiras de



8 tampas (se estiver a utilizar uma placa de 96 poços) ou coloque a tampa nos tubos de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que as tampas estão bem seladas.

NOTA: A boa prática é colocar os controlos sem modelo (NTC) em poços não adjacentes aos Positive Controls ou amostras.

NOTA: Para uma sugestão sobre como configurar placas de 96 poços para análise de todos os KRAS e NRAS exons 2-4 consulte o Apêndice A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR Scan.

25. Agite em vórtice (velocidade ~1/2) durante 10 segundos.

26. Centrifugue durante 1-2 minutos para assegurar que todas as soluções são recolhidas no fundo dos poços ou tubos. Verifique se as soluções estão no fundo de cada poço ou tubo. Senão, repita a centrifugação.

12.6 Programa do Termociclador para Protocolo de Amplificação

1. Use o seguinte protocolo do termociclador para Amplificação por PCR e formação de heterodúplices:

Desnaturação inicial

95 C 5 minutos

Amplificação de assentamento

15 ciclos

95 C 30 segundos

62 C, -0,5 ºC/ciclo 30 segundos

72 C 25 segundos

Amplificação

30 ciclos

95 C 30 segundos

55 C 30 segundos

72 C 25 segundos

Extensão final

1 ciclo 72 C 2 minutos

Formação de heterodúplices

95 ºC 2 minutos

≤12 C Manter

12.7 Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR

1. Recomenda-se que a qualidade e quantidade das amplificações seja verificada através da electroforese em gel (ou meio equivalente) antes de avançar para a digestão com a SURVEYOR Nuclease.

2. Analise uma alíquota do produto de PCR, juntamente com diferentes quantidades de um ladder de massa ADN de 100-bp.

3. Use o ladder para estimar a concentração do ADN amplificado.

4. Apenas deve ser observada uma única banda superior a 20 ng/µL correspondente ao produto de PCR principal.

5. Se estiverem presentes múltiplas bandas, certifique-se de que a qualidade do ADN modelo de partida era suficiente (consulte o Apêndice B – Guia de Resolução de Problemas).

6. Se não for observado nenhum produto, certifique-se de que a qualidade do ADN modelo de partida era suficiente (consulte Apêndice B – Guia de Resolução de Problemas). Se a qualidade satisfizer as especificações, aumente o volume de modelo para 4,0 µL por reacção de 50 µL (reduza a água por reacção para 31,0 µL).

7. Não deve ser visível nenhum produto de PCR na amostra de controlo sem modelo. Se estiverem visíveis produtos de ADN com este controlo, é provável a ocorrência de contaminação; consulte o Apêndice B - Guia de Resolução de Problemas.



8. Classifique a PCR como PCR Robusta ou PCR Fraca.

a. A PCR Robusta deve ter uma única banda igual ou superior a 20 ng/µL.

b. A PCR Fraca deve ter uma única banda inferior a 20 ng/µL.

c. Avance para a digestão com a SURVEYOR Nuclease com pontuações de PCR Robusta e Fraca.

CONSELHO: nessa etapa, os produtos de PCR podem ser armazenados a uma temperatura inferior ou igual a -20 ºC até uma semana.

12.8 Digestão da SURVEYOR Nuclease

1. Depois de a PCR da amostra ser considerada suficiente em termos qualitativos e quantitativos, execute a reacção de digestão com a SURVEYOR Nuclease, conforme descrito de seguida.

2. Descongele os tubos que contêm a 0.15 M MgCl2 Solution e o SURVEYOR Enhancer Cofactor em gelo.

3. Adicione 10,0 µL de cada amostra amplificada por PCR a partir de cima para um novo tubo de PCR de 0,2 mL ou poço de uma placa de 96 poços.

4. Prepare uma mistura fresca com 0.15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 e SURVEYOR Nuclease W (mistura da SURVEYOR Nuclease).

Use a tabela que se segue como um guia para preparar uma Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease para a análise de múltiplas amostras. O exemplo abaixo contém os volumes para uma Mistura Principal para 10 amostras.

Tenha em atenção que será necessário um volume de Mistura Principal ligeiramente superior a este cálculo para compensar as perdas durante a pipetagem.

Número de Reacções de Digestão com SURVEYOR Nuclease:

10

Cálculo do Volume:

0.15 M MgCl2 Solution (µL) 10,0

SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL) 10,0

SURVEYOR Enhancer W2 (µL) 10,0

SURVEYOR Nuclease W (µL) 20,0

Volume Total da Mistura Principal: 50,0

Adicionar 5 µL de Mistura Principal da SURVEYOR Nuclease a cada

amostra amplificada por PCR (µL) 10,0

Volume Total da Reacção de Digestão com SURVEYOR Nuclease:

15,0

a. Centrifugue cada reagente antes de o utilizar.

b. Agite suavemente em vórtice cada reagente antes de pipetar; centrifugue brevemente durante ~10 segundos após cada etapa de vórtice.

c. Para cada digestão, adicione os seguintes componentes a um tubo microcentrífugo de PCR de 0,2 mL (ou maior).

1,0 µL 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027) 1,0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1,0 µL SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2,0 µL SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)

Ou adicione 5 µL de Mistura Principal, preparada de acordo com a tabela acima.

5. Agite lentamente em vórtice a Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos numa velocidade reduzida.



6. Centrifugue a Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos numa velocidade reduzida.

7. Coloque a Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease em gelo até ser utilizada.

Nota: A Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease preparada no Passo 7 deve ser imediatamente usada, uma vez que a SURVEYOR Nuclease W é desactivada ao longo do tempo quando na presença de outros componentes da Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease.

8. Pipete uma alíquota de 5,0 µL-da Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease em cada tubo ou poço com uma alíquota de 10,0 µL de produto amplificado por PCR (ver o Passo 3 acima).

9. Quando a pipetagem estiver concluída, centrifugue os tubos de PCR de 0,2 mL ou placa de 96 poços durante 10 segundos.

10. Agite lentamente em vórtice os tubos de PCR de 0,2 mL da amostra ou placa de 96 poços, durante 10 segundos.

11. Centrifugue durante 10 segundos a uma velocidade reduzida (este passo é especialmente importante se a digestão for executada num instrumento sem uma tampa aquecida).

12. Deixe incubar a uma temperatura de 42 °C durante 30 minutos.

13. Adicione 1,0 µL de SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) a cada tubo ou poço e agite lentamente em vórtice (o volume total da reacção de digestão com a SURVEYOR Nuclease é de 16,0 µL).

CONSELHO: Os produtos de digestão SURVEYOR podem ser armazenados a uma temperatura ≤ -20 ºC até uma semana.

14. Carregue as amostras digeridas num sistema DHPLC.

Nota: Para definições de gradiente sugeridas do sistema DHPLC para a análise de digestões da SURVEYOR Nuclease, consulte http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.

13 Procedimentos de Controlo da Qualidade

13.1 Controlo de Qualidade do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD

Os ADNs Plasmídicos de Controlo estão incluídos no kit para permitir a execução de verificações de controlo da qualidade em passos específicos do procedimento de teste. Para o Protocolo de Amplificação, estes controlos fornecem uma forma para assegurar que as Misturas Principais estão correctamente preparadas e a amplificação está a funcionar adequadamente. Também são necessários controlos sem modelo (nos quais é adicionada água em vez de ADN modelo) para verificar a possível ocorrência de contaminação dos componentes do kit com algum modelo de ADN externo.

Na fase de digestão com a SURVEYOR Nuclease, as amplificações de ADNs plasmídicos de controlo fornecem uma verificação eficaz de que as condições da reacção de clivagem (condições de preparação e incubação da Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease) foram satisfatórias. Na fase de análise, os cromatogramas do sistema DHPLC das amplificações de controlo digeridas com a SURVEYOR Nuclease fornecem orientações sobre onde os picos de produtos de clivagem correspondentes às mutações do KRAS Exons 3 e 4, mesmo a baixos níveis, irão eluir (ver Figuras 4-6). Os picos de produtos de clivagem correspondentes a outras mutações no KRAS Exons 3 e 4 podem eluir em posições ligeiramente diferentes.

Se as amplificações obtidas por PCR não coincidirem com os resultados descritos na secção Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR, consulte o Apêndice B - Guia de Resolução de Problemas ou contacte o Apoio Técnico da Transgenomic antes de avançar para os passos seguintes da análise de amostras.

http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings


13 Procedimentos de Controlo da Qualidade


13.2 Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo

O kit é fornecido com quatro ADNs de controlo:

KRAS Control Wild-Type; PN 710131

KRAS Positive Control Exon 3; PN 710136

KRAS Positive Control Exon 4A; PN 710137

KRAS Positive Control Exon 4B; PN 710138

Estes ADNs de controlo são plasmídeos com inserções. Cada Positive Control contém dois plasmídeos: uma mistura do KRAS Control Wild-Type e um clone de mutação que difere do Wild-Type num único par de bases. Os controlos são fornecidos em frascos separados, cada um com uma concentração de 10

5 cópias/µL.

Os primers de PCR KRAS Exons 3 e 4 Forward e Reverse, necessários para a amplificação por PCR, são fornecidos em separado no kit. Para a utilização destes controlos, siga as instruções contidas na secção Protocolo de Amplificação, Digestão com a SURVEYOR Nuclease e Análise do KRAS Exons 3 e 4 utilizando a SURVEYOR Nuclease.

RECOMENDAMOS VIVAMENTE QUE OS UTILIZADORES PRINCIPIANTES REALIZEM EXPERIÊNCIAS APENAS COM OS CONTROLOS ANTES DE TESTAREM AMOSTRAS

GENÓMICAS.

14 Interpretação dos Resultados

14.1 Análise do KRAS Exons 3 e 4 utilizando a SURVEYOR Nuclease

Para fins de comparação e controlo, execute SEMPRE a digestão com SURVEYOR Nuclease em cada um dos controlos (Wild-Type e Positive Controls), um controlo sem modelo, assim como amostras de ADN, e execute a análise na mesma placa de amostras do sistema DHPLC.

Na fase de digestão com a SURVEYOR Nuclease, a amplificação destes ADNs plasmídicos de controlo fornecem uma verificação eficaz de que as condições da reacção de clivagem (condições de preparação e incubação da mistura SURVEYOR Nuclease) foram satisfatórias. Na fase de análise, os rastreios do sistema DHPLC destas amplificações de controlo digeridas com a SURVEYOR Nuclease fornecem orientações sobre onde irão eluir os fragmentos de ADN resultantes da clivagem nos sítios de mismatch (desigualdade) de mutações específicas, mesmo a baixos níveis (ver Figuras 4-6).

Se as amplificações obtidas por PCR ou os fragmentos de clivagem da SURVEYOR Nuclease derivados a partir dos ADNs de controlo não coincidirem com os resultados descritos, consulte o Apêndice B -Guia de Resolução de Problemas ou contacte o Apoio Técnico da Transgenomic antes de avançar para os passos seguintes da análise de amostras.

Os exemplos abaixo são apresentados apenas a título de exemplo e NÃO se destinam a ser utilizados para determinar a identidade de qualquer mutação. É necessária a confirmação da identidade de uma mutação de forma a determinar inequivocamente a presença de uma alteração de bases específica no Exon 3 ou 4 do gene KRAS.

A SURVEYOR Nuclease cliva todas as desigualdades (mismatches) resultantes da formação de heterodúplices entre ADNs Wild-Type e mutantes, não apenas mutações nos Exons 3 ou 4. A SURVEYOR Nuclease confirma que está presente uma desigualdade. A identidade da alteração de bases específica da mutação é necessária para a determinação do estado de activação de KRAS e deve ser confirmada por outros métodos, tais como a sequenciação.

14.2 Revisão de dados dos resultados do SURVEYOR Scan

Observe os cromatogramas e compare os cromatogramas de Wild-Type e Positive Controls com os da amostra. Determine se o cromatograma da amostra é similar a ou diferente do padrão Wild-Type. Se for diferente, a amostra deve ser considerada “SURVEYOR Scan Positivo” e enviada para análise da sequência de ADN. Consulte as Figuras 4-6 para exemplos e o Apêndice B – Resolução de Problemas, Problemas 7 e 8 para exemplos de tais amostras.



Qualquer amostra com um padrão de SURVEYOR Nuclease diferente do Wild-Type deve ser enviada para confirmação das sequências mesmo se não for idêntica ao Positive Control. Consulte o Apêndice B – Resolução de Problemas, Problema 7 para um exemplo de tal amostra.

Quando necessário, amplie a região de interesse e sobreponha o cromatograma da amostra com o Wild-Type Control para essa amplificação.

Identifique quaisquer diferenças entre o Wild-Type Control e a amostra analisada.

Importante! Após uma revisão minuciosa de cada amostra, o revisor de dados deve examinar se as amostras adjacentes na placa de análises têm os mesmos resultados positivos do SURVEYOR Scan. Se ocorrerem resultados positivos idênticos, estes podem resultar da contaminação cruzada de amostras ou controlos e a análise tem de ser repetida.



14.3 Exemplos de Resultados

Os exemplos de resultados obtidos utilizando o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD com o sistema DHPLC são apresentados nas Figuras 4-6 abaixo. Nestes exemplos, utilizando os WAVE

® 4500 Systems com detectores de UV e fluorescência, o processo descrito na secção

Instruções passo-a-passo foi seguido com precisão. Para uma orientação no que diz respeito às definições de gradiente sugeridas do sistema DHPLC para a análise de digestões da SURVEYOR Nuclease, consulte http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.

Figuras 4A e 4B: Análise WAVE DHPLC com detecção de UV (Figura 4A) e fluorescência (Figura 4B) de digestões da SURVEYOR Nuclease do KRAS Positive Control Exon 3 e do KRAS Control Wild-Type e ADN CRC isolado de secções FFPE. Ao rever visualmente os cromatogramas, as amostras digeridas devem ser comparadas ao Wild-Type Control (linha castanha). O KRAS Positive Control Exon 3 (linha verde) é uma mistura de Wild-Type e plasmídeos mutantes Q61H que resulta em picos de digestão de 65 e 135 bp; este controlo indica que o passo de digestão da SURVEYOR Nuclease está a funcionar e mostra a região do cromatograma que deve ser visualmente inspeccionada para determinar se uma amostra deve ser enviada para análise de sequências de ADN. Ao comparar padrões de digestão para as amostras 1-3 com o electroferograma de não digestão Wild-Type, é evidente que a Amostra 2 (linha preta) apresenta uma possível mutação e deve ser alvo de sequenciação para confirmar a presença ou ausência de uma mutação no codão relevante. As Amostras 1 e 3 (linhas azul e vermelha) possuem cromatogramas similares aos observados para o Wild-Type Control e não precisam de ser enviadas para análise de sequências de ADN. Tenha em atenção que o

Fluxo através de DHPLC

Lavagem

do DHPLC

Q61H gera fragmentos de 65 e

135-bp

Amplificação não clivada

200-bp

Q61H gera fragmentos de

65 e 135-bp

Figura 4B

Figura 4A


200-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 3 Amostra 1, KRAS Exon 3 Amostra 2, KRAS Exon 3 Amostra 3, KRAS Exon 3 Tamanho de ADN padrão


200-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 3 Amostra 1, KRAS Exon 3 Amostra 2, KRAS Exon 3 Amostra 3, KRAS Exon 3 Tamanho de ADN padrão


200-bp





resultado da sequência é o resultado definitivo, uma vez que podem existir outras mutações não relevantes que podem resultar em fragmentos do mesmo tamanho.

Figuras 5A e 5B: Análise WAVE DHPLC com detecção de UV (Figura 5A) e fluorescência (Figura 5B) de digestões da SURVEYOR Nuclease do KRAS Positive Control Exon 4A e do KRAS Control Wild-Type e ADN CRC isolado de secções FFPE. Ao rever visualmente os cromatogramas, as amostras digeridas devem ser comparadas ao Wild-Type Control (linha verde). O KRAS Positive Control Exon 4A (linha azul) é uma mistura de Wild-Type e plasmídeos mutantes K117N que resulta em picos de digestão de 80 e 88 bp; este controlo indica que o passo de digestão da SURVEYOR Nuclease está a funcionar e mostra a região do cromatograma que deve ser visualmente inspeccionada para determinar se uma amostra deve ser enviada para análise de sequências de ADN. Ao comparar padrões de digestão para as amostras 1 e 2 com o electroferograma de não digestão Wild-Type, é evidente que a Amostra 1 (linha vermelha) apresenta uma possível mutação e deve ser alvo de sequenciação para confirmar a presença ou ausência de uma mutação no codão relevante. A Amostra 2 (linha preta) possui um cromatograma similar ao observado para o Wild-Type Control e não precisa de ser enviada para análise de sequências de ADN. Tenha em atenção que o resultado da sequência é o resultado definitivo, uma vez que podem existir outras mutações não relevantes que podem resultar em fragmentos do mesmo tamanho.


168-bp

Fluxo através

de DHPLC

K117N gera fragmentos de

80 e 88-bp

K117N gera fragmentos de

80 e 88-bp


168-bp

Figura 5A

Figura 5B

Lavagem do

DHPLC


200-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 4A Amostra 1, KRAS Exon 4A Amostra 2, KRAS Exon 4A Tamanho de ADN padrão

Lavagem do

DHPLC


200-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 4A Amostra 1, KRAS Exon 4A Amostra 2, KRAS Exon 4A Tamanho de ADN padrão



Figuras 6A e 6B: Análise WAVE DHPLC com detecção de UV (Figura 6A) e fluorescência (Figura 6B) de digestões da SURVEYOR Nuclease do KRAS Positive Control Exon 4B e do KRAS Control Wild-Type e ADN CRC isolado de secções FFPE. Ao rever visualmente os cromatogramas, as amostras digeridas devem ser comparadas ao Wild-Type Control (linha castanha). O KRAS Positive Control Exon 4B (linha verde escuro) é uma mistura de Wild-Type e plasmídeos mutantes A146T que resulta em picos de digestão de 78 e 116 bp; este controlo indica que o passo de digestão da SURVEYOR Nuclease está a funcionar e mostra a região do cromatograma que deve ser visualmente inspeccionada para determinar se uma amostra deve ser enviada para análise de sequências de ADN. Ao comparar padrões de digestão para as amostras 1-3 com o electroferograma de não digestão Wild-Type, é evidente que a Amostra 3 (linha vermelha) apresenta uma possível mutação e deve ser alvo de sequenciação para confirmar a presença ou ausência de uma mutação no codão relevante. As Amostras 2 e 3 (linhas preta e verde claro) possuem cromatogramas similares aos observados para o Wild-Type Control e não precisam de ser enviadas para análise de sequências de ADN. Tenha em atenção que o resultado da sequência é o resultado definitivo, uma vez que podem existir outras mutações não relevantes que podem resultar em fragmentos do mesmo tamanho.


194-bp

Fluxo através

de DHPLC

Lavagem

do DHPLC

A146T gera fragmentos de

78 e 116-bp


194-bp

A146T gera fragmentos de

78 e 116-bp

Figura 6A

Figura 6B


200-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 4B Amostra 1, KRAS Exon 4B Amostra 2, KRAS Exon 4B Amostra 3, KRAS Exon 4B Tamanho de ADN padrão


200-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 4B Amostra 1, KRAS Exon 4B Amostra 2, KRAS Exon 4B Amostra 3, KRAS Exon 4B Tamanho de ADN padrão

15 Características de Desempenho



15.1 Nível de Detecção de Mutações utilizando os Kits SURVEYOR Scan

A validação dos Kits SURVEYOR Scan para plataformas DHPLC utilizando clones plasmídicos de todas as mutações indicadas tem mostrado que os picos da SURVEYOR Nuclease podem ser detectados numa mistura de 2-5% de mutante num fundo Wild-Type.

A chamada de sequenciação automática das cadeias forward e reverse muitas vezes não consegue detectar mutações a níveis abaixo de 10% em misturas com ADN Wild-Type. Juntamente com os resultados da SURVEYOR Nuclease, é possível interpretar com maior confiança os electroferogramas de sequenciação de 5-10% de mutante.

Se uma análise de amostras apresentar um resultado positivo do SURVEYOR Scan, mas não existir nenhuma mutação do KRAS ou do NRAS detectável através da sequenciação de ADN, recomendamos que seja registado um resultado de "Nenhuma Variante Detectada". Para mais detalhes, consulte a secção Considerações sobre o Fluxo de Trabalho”.

15.2 Confirmação de Sequências

Avance para a confirmação de sequências de todos os resultados positivos do SURVEYOR Scan para determinar a identidade da sequência das mutações do KRAS Exon 3 ou 4.

Não avance para a confirmação de sequências se o SURVEYOR Scan apresentar um resultado negativo. A amostra pode ser registada como Wild-Type ou nenhuma variante detectada.

Os Universal Sequencing Primers incluídos neste kit destinam-se a ser utilizados para a confirmação de sequências. O primer forward é o PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) e o primer reverse é o PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2).

15.3 Limitações do Procedimento de Teste

As substâncias contaminadas, transferidas através da extracção de amostras fixadas em formol e embebidas em parafina, podem interferir nos procedimentos de amplificação por PCR e de digestão com a SURVEYOR Nuclease. Os procedimentos de controlo da qualidade descritos na secção Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR irão assegurar que o ADN extraído é adequado para utilização neste kit.

Este kit foi validado para a análise de amostras de tumores de cancro colo-rectal fixadas em formol e embebidas em parafina. Não foi validado para diagnóstico de outros outro tipo de cancros ou para uso com amostras de biópsia frescas ou congeladas.

Para a resolução de problemas com resultados anormais ou para obter detalhes sobre factores que podem afectar este teste, consulte o Apêndice B - Guia de resolução de problemas abaixo.

Deve ter-se cuidado para evitar transferências ou contaminação cruzada com este kit. A extrema sensibilidade do método de teste requer que sejam tomadas precauções nos seguintes pontos:

Certifique-se de que todas as amostras são manuseadas de forma a que não possa ocorrer contaminação cruzada entre amostras.

Trabalhe numa estação de trabalho de PCR ou noutro espaço adequado onde a área de trabalho possa estar exposta aos raios UV antes de preparar as reacções de amplificação por PCR.

Use uma estação de trabalho ou sala de PCR separada para abrir as amostras após a amplificação por PCR para o Controlo de Qualidade através da electroforese em gel.

A preparação da digestão com a SURVEYOR Nuclease deve ser feita numa sala separada ou numa estação de trabalho de PCR diferente daquela onde a PCR inicial foi preparada.



Assegure que os controlos plasmídicos do kit são manuseados em separado das amostras de teste em todas as etapas do teste.

o Certifique-se de que todas as soluções, o controlo sem modelo e poços de amostras de ADN estão fechados com a respectiva tampa antes de abrir os tubos que contêm o DNA Plasmídico de Controlo.

o MANUSEIE OS CONTROLOS EM ÚLTIMO LUGAR. Adicione o DNA Plasmídico de Controlo aos tubos adequados apenas DEPOIS DE TODOS os poços de amostras e o controlo sem modelo estarem fechados com a respectiva tampa.

o Depois de tapar os tubos de ADN de controlo com a respectiva tampa, limpe TODOS os tubos e tampas com um agente de destruição de ADN (como por exemplo, solução de lixívia a 10%) antes de os transferir para outra área.

Ao pipetar as amostras nas placas de 96 poços, certifique-se de que não permite a contaminação das amostras de poços adjacentes devido a salpicos durante a mistura ou por não ter mudado pontas de pipetas.

Apêndice A


Apêndice A

A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR Scan

O plano de disposição de poços sugerido abaixo destina-se a ser utilizado na execução da análise SURVEYOR Scan simultânea dos sete KRAS e NRAS Exons em 10 amostras.

Chave: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutação; NTC = Controlo sem modelo.

A.2 Selos de ADN de controlo

As sequências com um "Selo" são apresentadas abaixo.

Chave: As regiões de mutação mais comuns estão assinaladas a Roxo. As sequências apresentadas em MAIÚSCULAS são bases codificadoras; as sequências apresentadas em minúsculas são bases não codificadoras.

Os controlos possuem um "selo" genético realçado a Amarelo; esta variação da sequência do KRAS Wild-Type, numa região onde não se espera ocorrerem mutações, pode ser utilizada para solucionar problemas de contaminação de amostras por Positive Controls. Consulte o Apêndice B - Guia de resolução de problemas, Problema 8, para um exemplo de um rastreio do SURVEYOR Scan de tal contaminação.

"Selo" do KRAS Exon 3

Tamanho da Amplificação: 200 bp. Para a criação do selo genético de plasmídeos de controlo

KRAS Exon 3, ACC é alterado para TGG. Os Codões 59 e 61 estão igualmente realçados

abaixo.

GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG

"Selo" do KRAS Exon 4A


KRAS Exon 4A, AGA é alterado para TCT. O Codão 117 está igualmente realçado abaixo.

AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC

"Selo" do KRAS Exon 4B


KRAS Exon 4B, agt é alterado para tca. O Codão 146 está igualmente realçado abaixo.

TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac

Apêndice A


A.3 Requisitos de desnaturação do sistema HPLC (DHPLC)

A.3.1 Especificações do sistema DHPLC para aplicações SURVEYOR SCAN

As especificações que se seguem constituem os requisitos mínimos das especificações do sistema DHPLC para a realização de testes com os Kits SURVEYOR Scan KRAS e NRAS.

Sistema de administração de solvente com gradiente de elevado desempenho

Capacidade de gradiente binário; alta pressão ou baixa pressão

Controlo da taxa de fluxo, intervalo mínimo: 0,7 – 1,6 mL/min

Precisão da taxa de fluxo: ± 2% (H2O a 20 ºC)

Solvente desgaseificador

Sistema de auto-amostragem

Controlo de temperatura para placas frias, configurável: 4 a 14 ºC

Volume de injecção: 5–50 µL

Cartucho de separação

Concebido para a separação de tamanhos de fragmentos dsADN, fragmentos de tamanho entre 50 bp e 250 bp

Estufa de controlo de temperatura de alta precisão

Intervalo de temperatura: 40 a 70 ºC

Precisão de temperatura: ± 0,2 ºC

Reprodutibilidade da temperatura: ± 0,2 ºC

Linearidade sobre intervalo de temperatura completo: ± 2,0 ºC

Alternativa de detecção 1

Detector UV/VIS

Intervalo do comprimento de onda: 190 – 700 nm

Fonte UV: Lâmpada de deutério

Alternativa de detecção 2

Detector de fluorescência

Intervalo do comprimento de onda: excitação: 200 – 850 nm; emissão: 250 – 900 nm

Fonte de fluorescência: Lâmpada de Xénon de 150 W

Bomba de coloração de fluorescência

Taxa de fluxo fixa a 0,1 mL/min – 20%/+50%

Fluxo de baixa pulsação

A.3.2 Funcionamento do sistema

Para a instalação e utilização do sistema DHPLC, consulte e siga as recomendações do fabricante quanto à análise de fragmentos de dsADN dentro do intervalo de dimensões de 50 bp a 250 bp, direccionada para uma discriminação de tamanho igual ou superior a 10 bp. Este é o intervalo de dimensões para fragmentos no seguimento da digestão da SURVEYOR Nuclease com este kit.

Para uma orientação no que diz respeito às definições de gradiente sugeridas do sistema DHPLC para a análise de digestões da SURVEYOR Nuclease, consulte http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.

A.3.3 Manutenção dos cartuchos do sistema DHPLC

Para a manutenção dos cartuchos do sistema DHPLC, siga as recomendações do fabricante.

Nota: a análise de reacções da SURVEYOR Nuclease irá requerer protocolos de limpeza mais frequentes e rigorosos do que os utilizados na análise de amostras por PCR. Consulte as directrizes do seu sistema DHPLC para obter mais informações.



Apêndice A


A.4 Preparação do laboratório para testes PCR

Para produzir resultados de PCR fiáveis e sem contaminação, siga as boas práticas de laboratório aquando da concepção da disposição do laboratório de PCR.

Aquando do planeamento da disposição do laboratório, tenha em consideração a necessidade de separação espacial das actividades de preparação da amplificação por PCR e pós-amplificação. É importante separar as actividades de (i) isolamento do ADN; (ii) amplificação por PCR; e (iii) Pós-PCR como a abertura de tubos que contêm amostras amplificadas na preparação para a execução de géis e configuração de outros testes, tais como a digestão com SURVEYOR Nuclease e a sequenciação de ADN.

É igualmente importante ter materiais e equipamento de laboratório dedicados a cada área e para utilização apenas nessa área. A limpeza das superfícies com uma solução de lixívia a 10% (v/v), preparada semanalmente, auxiliará na eliminação de fragmentos de ADN ≤ 500 bp como modelos para PCR. Além disso, poderá ser útil para tratar plásticos e soluções com uma exposição de 7–10 minutos a luz UV de onda curta utilizando um crosslinker de UV.

Nota: as enzimas e ADN a amplificar não devem ser tratados com luz UV.

Usar vestuário de protecção adequado, mudar de luvas frequentemente e limpar as mãos com luvas com uma solução de lixívia a 10% (v/v) antes de entrar numa estação de trabalho ajudará em muito na redução da contaminação.

No mínimo, deverá existir uma configuração similar à disposição de duas salas apresentada no diagrama abaixo especificamente concebida para PCR e análise utilizando a SURVEYOR Nuclease.

Apêndice A


A.5 Referências Bibliográficas

1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix®

(panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728

2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12.

3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20.

4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65.

5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9.

6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21.

7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62.

8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702-707

9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6

10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9

11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706

Consulte também http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf para referências acerca da SURVEYOR Nuclease e respectivas aplicações.

http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728

http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf

Apêndice B


Apêndice B

Guia de Resolução de Problemas

A utilização eficaz dos Kits SURVEYOR Scan com o sistema DHPLC depende da conclusão bem-sucedida de um conjunto de passos. Um dos mais críticos é a amplificação por PCR, que tem de resultar na produção de ADNs específicos, uniformizados e em quantidade suficiente para serem detectados após hibridação e clivagem. Isso por sua vez depende da qualidade da amostra inicial. A realização do teste com DNA que não satisfaça os critérios de qualidade e quantidade não é recomendada.

Nota: Se estiver a utilizar pela primeira vez a SURVEYOR Nuclease, realize as experiências descritas na secção Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo depois de ler e compreender a secção Instruções Passo-a-Passo. Por favor, tenha junto de si os resultados dos ADNs Plasmídicos de Controlo antes de contactar o Apoio Técnico da Transgenomic.

Este Guia de resolução de problemas inclui uma lista dos problemas que pode encontrar ao utilizar os Kits SURVEYOR Scan com o sistema DHPLC e sugestões sobre como resolvê-los.

Consulte o manual do sistema DHPLC para informações detalhadas acerca do funcionamento e manutenção do instrumento. O manual inclui procedimentos específicos para verificar e manter o desempenho da coluna e inclui detalhes de resolução de problemas.

Problema 1 – Baixo rendimento da PCR ou nenhum produto de PCR quando analisado em gel de agarose

BAIXO RENDIMENTO DA PCR

CAUSA POSSÍVEL SOLUÇÃO

Fraca qualidade do ADN modelo

Repita a purificação do ADN; reveja o método de purificação utilizado. Se o ADN FFPE extraído estiver demasiado fragmentado, podem ser necessários blocos FFPE alternativos.

Demasiado ARN na amostra, o que levará à sobrestimação da concentração de ADN

Repita o tratamento com RNase da amostra de ADN e re-purifique o ADN.

Termociclador não calibrado.

Execute a calibração do termociclador.

Quantidade insuficiente de modelo.

Aumente a quantidade de modelo.

Nota: Deve ser utilizado ADN de alta qualidade a partir de FFPE. O ADN deve ter uma concentração de 25 ng/µL, tal como determinado pela absorção a 260 nm, deve ter um rácio de absorção a 260/280 nm superior a 1,8 e ser superior a 90% de ADN (ou seja, livre da maior parte da contaminação tARN e rARN, tal como julgado pelo aspecto num gel de agarose). Armazene as amostras de ADN a uma temperatura entre -20 °C e -80 °C.

A análise de ADN modelo extraído a partir de tecidos embebidos em parafina requer que se tomem diversas precauções. O ADN extraído pode ser tratado com uracil DNA glycosylase para prevenir a amplificação de fragmentos de ADN que contenham determinados resíduos de C. Muitas vezes, uma elevada percentagem de A260 que absorve material extraído a partir de tecidos embebidos em parafina não é bem amplificada durante a PCR. A utilização de uma maior quantidade de ADN de partida irá muitas vezes ajudar a produzir um produto de amplificação adequado. Outra consideração seria escolher secções de tumor FFPE com uma elevada percentagem de células tumorais. Poderá ser igualmente utilizada microdissecção, mas trata-se de uma opção que consome muito tempo e não recomendada para testes laboratoriais no geral.

Bom rendim

ento da

PCR

Baixo rendim

ento da

PCR

Banda de

ARN

Apêndice B


Problema 2 – Múltiplos produtos de PCR quando analisado em gel de agarose

MÚLTIPLOS PRODUTOS DE PCR


Temperatura de hibridação demasiado baixa.

Verifique a calibração do termociclador.

Nota: A PCR deverá gerar um rendimento suficientemente elevado (superior a 20 ng/µL) de uma ÚNICA espécie amplificada do tamanho correcto. A DNA Polymerase e o DNA Polymerase 10X PCR Buffer fornecidos com este kit devem ser utilizados para a PCR. As amplificações dos Controlos devem ser digeridas com a SURVEYOR Nuclease e analisadas em paralelo para excluir ruído de fundo artificial através da comparação visual de perfis de electroferograma (ver Exemplos de Resultados, Figuras 4-6). Examine cada produto de ADN amplificado antes da digestão através da electroforese em gel (ou através da Análise do DHPLC System) para se certificar de que é uma única espécie do tamanho esperado.

Problema 3 – Nenhum produto de clivagem observado ao executar a análise após o tratamento de heterodúplices com a SURVEYOR Nuclease

NENHUM PRODUTO DE CLIVAGEM CAUSA POSSÍVEL

SOLUÇÃO

Proporção de alvo de mismatch demasiado baixa

Verifique o teste utilizando os Controlos.

Formação insuficiente de hetero-dúplices

Siga o Procedimento correcto de PCR e Hibridação. Use ADN acabado de hibridizar nas digestões da SURVEYOR Nuclease.

Efectue uma nova amplificação por PCR utilizando (1) a mesma quantidade de ADN modelo; (2) uma maior quantidade de ADN de partida; ou (3) ADN isolado da mesma ou de uma outra secção FFPE.

SURVEYOR Nuclease Inactiva

Execute a reacção de Positive Control para verificar o desempenho da enzima. Use apenas Misturas Principais da SURVEYOR Nuclease que tenham sido acabadas de preparar.

Posição de heterodúplices

em falta

Bom rendim

ento da

PCR

Múltiplas bandas

rendimento

Pico não cortado

dos homodúplice

s

Apêndice B


Nota: A SURVEYOR Nuclease cliva sobretudo nas desigualdades em heterodúplices. A proporção de heterodúplices face a homodúplices na amostra hibridizada irá determinar o tamanho do sinal de digestão da SURVEYOR Nuclease. Se a mutação do KRAS estiver presente com uma concentração muito baixa na amostra de ADN genómico, o sinal pode ser demasiado baixo para gerar um resultado positivo.

É importante assegurar que o passo de hibridação está incluído no programa do termociclador (ver Protocolo de Amplificação), de forma a maximizar a eficiência da formação de heterodúplices. Os heterodúplices são formados de forma muito ineficiente durante as reacções padrão de PCR.

Nota: o rácio de sinal/ruído é normalmente elevado o suficiente para detectar mutações presentes a uma baixa percentagem do modelo de ADN total. É possível detectar um nível tão baixo como 2% de ADN mutante. As Figuras 4-6 mostram os produtos de digestão gerados com ADNs KRAS Positive Control de homodúplices e heterodúplices (incluídos neste kit) e amostras FFPE num WAVE DHPLC 4500 System. Os produtos de clivagem são claramente visíveis como dois novos picos que eluem com os tamanhos esperados que podem ser estimados em relação ao marcador de tamanho de ADN.

Atenção: os tampões de PCR disponíveis no mercado variam muito em termos de conteúdo e muitas vezes as formulações não são definidas pelos fornecedores. Há vários tampões que NÃO são compatíveis com a SURVEYOR Nuclease devido ao pH ou à presença de aditivos, agentes tensioactivos ou outros ingredientes patenteados. NÃO utilize qualquer polimerase ou tampões de polimerase 10X que não os fornecidos no kit.

Problema 4 – Fundo elevado após o tratamento com a SURVEYOR Nuclease

FUNDO ELEVADO CAUSA POSSÍVEL SOLUÇÃO

Passo de hibridação subóptimo.

Faça o seguinte:

1. Certifique-se de que a concentração de ADN está no intervalo >25 ng/µL.

2. Repita o passo de formação de heterodúplices, tendo cuidado para seguir o procedimento recomendado; ver 12.7.1.

Quantidade de ADN demasiado baixa

Verifique o rendimento e qualidade do ADN modelo

Produtos de PCR não específicos

Verifique o rendimento e qualidade do DNA modelo.

O SURVEYOR Enhancer W2 e/ou o SURVEYOR Enhancer Cofactor perderam actividade

Verifique o Prazo de Validade do kit.

Nota: A SURVEYOR Nuclease ocasionalmente corta ADN de cadeia dupla em sítios aleatórios correspondidos. Isto produz um fundo após a digestão. Esta actividade é suprimida pelo SURVEYOR Enhancer W2 e o seu Cofactor sem afectar negativamente a reacção de clivagem de desigualdades. O SURVEYOR Enhancer W2 e o SURVEYOR Enhancer Cofactor estão incluídos neste kit e devem sempre ser utilizados.

Fluxo através

do DHPLC

Lavagem do

DHPLC

Amostra com

linha de base

ruidosa

Apêndice B


Quando este corte ainda ocorre, geram-se pequenos picos no sistema DHPLC. A comparação das digestões dos controlos de homodúplices com as digestões da amostra permitirá que esses picos sejam reconhecidos.

Problema 5 – Picos de digestão da SURVEYOR Nuclease em controlos negativos

PICOS DE DIGESTÃO EM CONTROLOS NEGATIVOS


Contaminação dos conteúdos do kit com amplificações do KRAS ou controlos plasmídicos.

Elimine todos os componentes do kit e utilize um kit novo.

Contacte o Apoio Técnico da Transgenomic para discutir potenciais causas e fontes de contaminação.

Problema 6 – Falha nos resultados da SURVEYOR Nuclease

A DIGESTÃO DA SURVEYOR NUCLEASE DE CONTROLOS POSITIVOS FALHOU

CAUSA POSSÍVEL

SOLUÇÃO

A SURVEYOR Nuclease não foi adicionada

Efectue a digestão de uma nova amostra

A digestão da SURVEYOR Nuclease foi realizada à temperatura errada

Efectue a digestão de uma nova amostra

Fluxo através

do DHPLC

Lavagem do

DHPLC

Sinal fraco Picos de digestão no controlo Wild-

Type

Pico não cortado dos homodúplices

Nenhum pico de digestão

nítido


Apêndice B


Problema 7 – Picos inesperados no rastreio de digestão da SURVEYOR Nuclease

A DIGESTÃO DA SURVEYOR NUCLEASE DE CONTROLOS POSITIVOS FALHOU

CAUSA POSSÍVEL

SOLUÇÃO

Mutação presente num sítio pouco frequente

Efectuar a sequência da amostra para verificar a mutação

Pico de digestão

inesperado


Lavagem do

DHPLC

Fluxo através

do DHPLC

Picos de digestão

esperados

Apêndice B


Problema 8 – Contaminação de amostras com Positive Controls

Padrões de digestão consistentes com a presença de uma região com Positive Controls misturados e heterodúplices Wild-Type

CAUSA POSSÍVEL

SOLUÇÃO

Região de Codões 12 Região do selo de e 13 controlo

Técnica de pipetagem de fraca qualidade

Deverá ter cuidado ao pipetar amostras para evitar a contaminação cruzada.

Verifique as regiões de sequências de selo de controlo para contaminação de Positive Control.

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

Amostra 1 NVD nos Codões 12 e 13

Selo detectado

Amostra 2 c.34G>T

p.G12C, 30% Nenhum selo

detectado

Amostra 3 NVD nos Codões 12 e 13

Nenhum selo detectado

Detalhes para Encomendas


Detalhes para Encomendas

Número de produto

Nome do Produto Dimensão

710104 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 100 reacções

710106 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD 100 reacções

710400 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD 100 reacções

710077 CRC RAScan Combination Kit para KRAS e NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD

230 reacções

Detalhes de Contacto

Sede da Empresa Europa

Transgenomic, Inc. Transgenomic Limited

12325 Emmet Street 40 Watt Road

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*Apenas na América do Norte

www.Transgenomic.com

Tradução Disclaimer Transgenomic, Inc. tem feito todos os esforços para garantir a precisão desta tradução. Se você tem dúvidas sobre qualquer informação nesta versão traduzida do manual, consulte a versão em Inglês Instructions for Use for the SURVEYOR

® Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD for DHPLC Systems – 482407(EN)

http://world.Transgenomic.com/files/literature/482407-EN.pdf e / ou Transgenomic em contato support @transgenomic.com.



http://www.transgenomic.com/

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Documento N.º 482407(PT) rev-04

instruções de utilização do surveyor scan kit exons 3 & 4 ... · 3 princípios do teste de...

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