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Eletroforese de DNA
Gabriel M. Matos
Nicolas Conceição
Eletroforese
• Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA;
• Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA;
• Permite a recuperação dos fragmentos após a separação.
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose
Etapas da eletroforese
1) Preparo do Gel
Agarose ou Poliacrilamida
2) Migração
3) Visualização dos fragmentos
Tipos de géis
Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100 –
3.000 pb)
Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb
de diferença.
A escolha da matriz de separação usada depende
principalmente do tamanho dos fragmentos analisados.
Tipos de géis
Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose
unidos por ligações glicosídicas.
Tipos de géis
Algas rodophytas utilizadas na extração do ágar
A porcentagem utilizada é medida em peso/volume
Tipos de géis
A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e
resfriada para formação do gel (Gelificação)
32 - 45°C80 - 95°C
Tipos de géis
Concentração do
gel ( w/v %)
Faixa de separação
de DNA (kb)
0.3 5 – 60
0.6 1 – 20
0.7 0.8 – 10
0.9 0.5 – 7
1.2 0.4 – 6
1.5 0.2 – 3
2.0 0.1 – 2
Sambrook et al., “Molecular Cloning” 3 ed - 2000
1% 0,3%
Tipos de géis
Tipos de tampões
Solução Tampão:
• Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida
da molécula)
• Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)
Tipos de tampões
• Tris-Acetato e EDTA – TAE
• Tris-Borato e EDTA - TBE
• Tris-Fosfato e EDTA - TPE
Qual escolher??
Tipos de tampões
• Tris-Acetato e EDTA – TAE
Melhor resolução para fragmentos maiores.
• Tris-Borato e EDTA - TBE
• Tris-Fosfato e EDTA - TPE
Tipos de tampões
Diferença entre gel feito com Tampão e Água
Tipos de tampões
• Gel-Loading Buffer: usado para aumentar a densidade da
amostra e dar cor a amostra;
Azul de Bromofenol (migra mais rápido)
Xileno Cianol
Sacarose / Glicerol / Ficoll
Tipos de tampões
Corrida
Corrida
Os ácidos nucleicos apresentam
uma carga líquida negativa.
Com aplicação de uma corrente
elétrica eles migram em direção
ao polo positivo
Corrente elétrica
Corrida
Corrida
Migração
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
• Tamanho da molécula de DNA;
Migração
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
• Tamanho da molécula de DNA;
• A concentração de Agarose;
Poliacrilamida
Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de
acrilamida e bis-acrilamida.
Maior poder de resolução (até 1 pb)
Poliacrilamida
Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de
acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e
TEMED)
Poliacrilamida
Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de
acrilamida e bis-acrilamida.
Visualização dos fragmentos
PCR
Eletroforese
Visualização
Visualização dos fragmentos
PCR
Eletroforese
Visualização
• Colorimétrico
• Fluorescência
Visualização dos fragmentos
• CorantesNitrato de prata
Alta sensibilidade
Visualização dos fragmentos
• CorantesNitrato de prata
Alta sensibilidade
Prata
DNA
Redução da prata
Cor
Visualização dos fragmentos
• CorantesNitrato de prata
Alta sensibilidade
Prata
DNA
Redução da prata
Cor
Visualização dos fragmentos
Fluorescência
Visualização dos fragmentos
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
A T
C G
A T
Visualização dos fragmentos
A T
C G
A T
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
A T
C G
A T
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
• Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
Água age como uma molécula “quencher”
absorvendo a fluorescência.
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
• Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
• Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
• Como emitem fluorescência?
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
A T
C G
A T
Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos
• Absorvem luz em um comprimento deonda e emitem em um comprimentomenor (menos energia)
• Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese
Visualização dos fragmentos
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
• Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese
Visualização dos fragmentos
Brometo de Etídio
• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
Visualização dos fragmentos
• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
• Excitação em luz UV
• Emissão em luz laranja/vermelho
Brometo de Etídio
Visualização dos fragmentos
Visualização dos fragmentos
• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
• Pico de excitação em 285 nm (luz UV)
• Pico de emissão em 605 nm (luz laranja/vermelho)
• É considerado tóxico
Brometo de Etídio
Visualização dos fragmentos
• Blue Green• SYBR Green• GelRed• GelGreen
Intercalantes alternativos
Visualização dos fragmentos
Mas isso é do tamanho
esperado?
Visualização dos fragmentos
Mas isso é do tamanho
esperado?
Visualização dos fragmentos
Interpretação de Resultados
Presença ou ausência
Interpretação de Resultados
Presença de fragmentos de diferentes tamanhos
500 pb
300 pb
Interpretação de Resultados
Expressão diferencial de determinado gene
Interpretação de Resultados
Expressão diferencial de determinado gene