extracao eletroforese curso verao

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Fundamentos de Extrao de DNA e RNA

MSc. Ana Liedke

ImportnciaUso de DNA para estudos de natureza variada: diagnstico (sensvel e especfico); medicina (estudo do cncer; identificao doenas); processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais); genoma investigaes de percia, paternidade... Uso de RNA para estudos de natureza variada: Transcrio Reversa do RNA (cDNA); Anlises de expresso gnica Northern, RT-PCR, construo de bibliotecas de cDNA

Organismosbactrias, fungos, vrus, tecidos vegetais e tecidos animais

Organismosbactrias, fungos, vrus, tecidos vegetais e tecidos animais

A extrao e a purificao de cidos nuclicos uma etapa fundamental para se obter alta eficincia de amplificao nos protocolos que usam a reao em cadeia da polimerase (PCR).

Tipos de DNAEucariontes (ncleo individualizado) DNA nuclear; DNA mitocondrial; DNA cloroplasto;

Tipos de DNAEucariontes (ncleo individualizado) DNA nuclear; DNA mitocondrial; DNA cloroplasto;

Tipos de DNAProcariontes (sem ncleo) DNA circular; DNA plasmidial;

Fator adicional: parede celular

Extrao de DNA/RNA

Extrao de DNA/RNAPassos principais: lise das membranas plasmticas e nucleares; degradao protenas; purificao do DNA/RNA.

Para cada tipo de amostra, vrios protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.

Extrao de DNA/RNAPassos principais: lise das membranas plasmticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associaes hidrofbicas e destruam a bicamada lipdica.

detergentes

Extrao de DNA/RNAPassos principais: lise das membranas plasmticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associaes hidrofbicas e destruam a bicamada lipdica.

detergentes

micelas

Extrao de DNA/RNAPassos principais: lise + degradao protenas;

detergentes

Proteinase k

Extrao de DNA/RNAPassos principais: lise + degradao protenas; A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album; capaz de digerir a queratina (Keratin), da o nome Proteinase K. detergentes Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA

Proteinase k

Extrao de DNA/RNAPassos principais: lise + degradao protenas;

Digesto em banho-maria com temperatura prxima a 50C

detergentes

Proteinase k

O tempo de incubao pode variar. Importante que a amostra se apresente totalmente digerida

Extrao de DNA/RNA

Fenol: desnaturao das protenas de maneira eficiente, remove as partes orgnicasAviso: O fenol um produto altamente txico, irritante para a pele e mucosas

Fenol:Clorofrmio:lcool isoamlico (25:24:1): eficiente para desproteinizar e sua ao se fundamenta na propriedade hidrfoba das protenas que apresentam afinidade por solventes orgnicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgnica mais densa. Clorofrmio: retira resduos de fenol

Extrao de DNA/RNAPassos principais: purificao do DNA/RNA (eliminao de resduos orgnicos)

Uso de lcool para a precipitao

formao do Pellet

A molcula de DNA no solvel em lcool e, desta maneira, tende a formar um aglomerado de molculas quando em meio alcolico.

Notas - Extrao de RNA A principal preocupao na extrao de RNA consiste na sua degradao por ribonucleases (RNAses), que so enzimas extremamente resistentes a vrios tratamentos, inclusive trmicos (fervura, autoclavagem etc.); DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminao com RNAses das solues, equipamentos, vidrarias e reagentes; Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas... Extrao usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de clulas e tecidos; DNAse; O RNA total livre de contaminaes por DNA ou protenas.

Quantificao DNA/RNAEspectrofotmetro Qualidade da extrao Determinao da quantidade de DNA/RNA extrado nucleotdeos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm 280 nm para estimar a contaminao com protenas

260 e 280 nm

razo 260/280 = 1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequadaUm valor inferior indica contaminao com protenas e um valor superior indica contaminao com RNA.

Conservao da amostra Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em lcool absoluto imediatamente aps a coleta, e trocado aps 24h. Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com slica. Para todas amostras congeladas em estoque, prefervel o fracionamento em pequenas alquotas para que o material no sofra descongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidao do tecido e para a degradao do DNA. O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos cidos nuclicos no sejam degradados

Material Necessrio

Para executar os protocolos de extrao de DNA, necessrio que o laboratrio tenha os equipamentos bsicos, o material plstico e todas as solues utilizadas nos procedimentos. O material mnimo necessrio o seguinte: a) Centrfuga com rotor para vrios tipos de tubos b) Capelas de exausto. c) Banho-maria com termostato ou com termmetro para aferio da temperatura. d) Microtubos de polipropileno. e) Micropipetas automticas para volumes diversos (com ponteiras).

Fundamentos de Eletroforese Agarose (AGE) e Poliacrilamida (PAGE)

MSc. Ana Liedke

Eletroforese um mtodo simples e muito eficiente para separar, para identificar e para purificar fragmentos de DNA, RNA e de protenas. Ela consiste na separao de molculas ionizadas de acordo com sua carga eltrica e seu peso molecular. Molculas com carga negativa migram para o plo positivo (nodo) e molculas com carga positiva migram para o plo negativo (ctodo).A migrao das cargas quando so submetidas a uma diferena de potencial chamada de eletroforese.

EletroforeseExistem dois modelos bsicos de eletroforese: Gel de agarose

AGE

+

EletroforeseExistem dois modelos bsicos de eletroforese: Gel de agarose Gel de poliacrilamida

-

+

AGE

+

PAGE

EletroforeseExistem dois modelos bsicos de eletroforese: Gel de agarose Gel de poliacrilamida

-

+

AGE

+

PAGE

Fonte

Eletroforese

Plo -

Plo +

Equipamento - Agarose gar-gar (gar ou agarose) um hidrocolide componente da parede celular, extrado de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta; insolvel em gua fria dissolve em gua quente (absorve uma quantidade de gua de cerca de vinte vezes o seu prprio peso) formando um gel noabsorvvel, no-fermentvel e com importante caracterstica de ser atxico. Concentraes de 0,5 2,5% Diludos no tampo TBE ou TAE. (Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)

Fatores que afetam a migrao de fragmentos de DNA em gis de agaroseTamanho do DNA Diferentes tamanhos de molculas, diferentes taxas de migrao no gel de agarose Concentrao da agarose Conformao do DNA

Fatores que afetam a migrao de fragmentos de DNA em gis de agaroseTamanho do DNA

Concentrao da agarose Conformao do DNA

Fatores que afetam a migrao de fragmentos de DNA em gis de agaroseTamanho do DNA

Concentrao da agarose Conformao do DNA em formas ou conformao do DNA,

a migrao velocidadesDNA superenrolado DNA linear mais lento mais rpida

Equipamento - AgaroseDespeja na forma com o pente Agarose tampo aquece

Cuba com Tampo TBE ou TAE

EquipamentoDNA

+

marcador migraoaumentar a densidade da amostra (faz afundar no poo) adicionar cor s amostras Permite acompanhar a corrida

(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)

(+)

marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra High...)DNA com fragmentos de tamanho conhecido

EquipamentoDNA

+

marcador migrao (Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poo) adicionar cor s amostras Permite acompanhar a corrida

(+)

marcador de tamanho molecular (Low mass, High e Ultra High...)

Depois de migrar o suficiente.....

Colorao com brometo de Etdio (EtBr) (0,0001%).Transiluminador (caixa de luz UV)

Brometo de EtdioAVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritao pele, olhos e trato respiratrio.

Intercala entre as fitas de cidos nuclicos Fluorescente na luz ultravioleta

Equipamento - PoliacrilamidaUtilizado tanto para Protenas quanto para DNA/RNA Composto por Acrilamida e Bis-AcrilamidaAVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou absorvido pela pele. Causa irritao da pele, olhos e trato respiratrio. Pode afetar o sistema nervoso central.

Concentraes diferentes quanto mais acrilamida, menores os poros

Protenas: a carga e a forma devem ser excludas, com adio de SDS (dodecilssulfato de sdio) que possui carga negativa converte protenas em estrutura linear

Equipamento - PoliacrilamidaColorao com:

Brometo de Etdio (EtBr), prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e anlise de amostra diluda) SYBR Green (menos mutagnico)

Coomassie Blue se liga inespecificamente a praticamente todas as protenas. menos sensvel que corar com a prata mas efetivo tambm, alm de ser fcil de corar

FotodocumentaoTransluminador Caixa acoplada mquina fotogrfica Computador

AGEFcil preparo, no-txico.

X

PAGE

mais difcil de ser preparado e muito txico quando em p ou em soluo. tem maior capacidade de resoluo e mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp pares de base). podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferena. tambm usados para separao de protenas

menor capacidade de resoluo, porm apresenta maior extenso de separao. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)