Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose

Danielson Ramos

Introdução

Antes, os estudos da engenharia de DNA eram monitorados pela velocidade de sedimentação em gradiente de sacarose;

Hoje, se utiliza a técnica de eletroforese em géis de agarose e poliacrilamida, pois são mais simples, rápidas e poder de resolução superior.

Princípio da eletroforese: Consiste na migração e separação de partículas em uma matriz, submetidas a uma diferença de potencial elétrico.

• A migração das partículas depende do tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas.

• Esquema 1: Eletroforese Sistema Horizotal

• Esquema 2: Eletroforese Sistema vertical

Parâmetros que afetam a migração do DNA de fita dupla em gel de agarose

• Tamanho da molécula de DNA, concentração de agarose e marcadores moleculares;

• Conformação do DNA e agentes intercalantes;

• Voltagem aplicada;

• Tampão de corrida

Protocolo Experimental

• Preparo do gel

• Eletroforese

• Anomalias de migração mais frequentes

- Efeito de extremidades;

- Efeito de sobrecarga da amostra;

- Contaminação do DNA por sais e proteínas.

Cuidados Importantes

• Brometo de etídeo: Usar luvas na manipulação e antes de serem descartados, devem ser descontaminados;

• Luz UV: Usar óculos e outros Eps;

• Agarose: Não agitar o erlenmeyer logo após a fusão (preparo);

• Reciclagem do Gel: Descontaminar, estocar em H2O destilada com trocas(15 dias), fundir em microondas, medir o volume e acrescentar o tampão decorrida, estocar a temperatura ambiente;

• Diferentes concentrações de géis na reciclagem, considerar 1%.

Finish