LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de Genética

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Análise da Diversidade Molecular em Bactérias Fitopatogênicas

Aluna: Carla de Freitas MunhozOrientadora: Profa. Dra. Maria Lucia Carneiro Vieira

Sumário

Origem da diversidade molecular em bactérias

fitopatogênicas;

Finalidades dos estudos sobre essa diversidade;

Técnicas moleculares mais utilizadas;

Aplicações.

Origem da diversidade molecular em bactérias

fitopatogênicas.

Variação genética:

pré requisito para a evolução biológica.

As bactérias surgiram no nosso planeta há 3,8 bilhões de anos:

• Grande diversidade de formas de vida;

• Capacidade de viverem sob diferentes condições ambientais:

- Ambientes extremos com diferentes composições químicas, pH, temperatura.

Procariontes: maior grau de adaptação e maior plasticidade fenotípica.

Capacidade de adaptação:

• Devido a existência de diversas rotas

metabólicas.

Bactérias fitopatogênicas são capazes de se

adaptarem a:

• Diferentes condições climáticas;

• Diversos estádios fenológicos do hospedeiro;

• Defensivos usados em seu controle.

Em bactérias, três

estratégias contribuem

para a geração de

variantes genéticos:

Em bactérias, três

estratégias contribuem

para a geração de

variantes genéticos:

*Mutações: importantes na geração da diversidade de populações bacterianas.

1 – Pequenas mudanças pontuais na seqüência de nucleotídeos do genoma

Mutações espontâneas: uma em cada 108 eventos.

Genes/patogenicidade: resposta da planta resistente/susceptível.

Substituição de nucleotídeos;

Deleções e inserções de 1 ou poucos nucleotídeos.

2 - Rearranjamento em regiões do genoma

Duplicações;

Inversões;

Transposições ou inserções.

Transformação;

Transdução;

Conjugação.

3 – Aquisição de seqüências de DNA

Finalidades do estudo da diversidade molecular de bactérias fitopatogênicas.

Distinguir e classificar isolados.

Relacionar distribuição geográfica com

heterogeneidade do patógeno.

Gerar de informações que auxiliem em estudos

fitopatológicos.

Proceder estudos taxonômicos.

Auxiliar no controle de doenças.

-Mensurar a quantidade de diversidade

genética dentro de uma população;

-Estabelecer relações filogenéticas dentro

e entre subpopulações;

-Proceder a subdivisão da variação.

Entender a história evolutiva da espécie.

-Conduzir à seleção e posicionamento de genes de

resistência da planta.

Estudar a estrutura de populações de patógenos.

Métodos de avaliação

Antes da década de 80:

� Marcadores morfológicos;

� Estudos patológicos;

� Estudos bioquímicos;

� Aloenzimas.

Nas últimas décadas:

� Permitiram maior precisão na avaliação da diversidade genética.

� Disponibilidade de várias técnicas de marcadores moleculares.

Métodos de avaliação

Técnicas moleculares mais utilizadas para estudo

de diversidade de bactérias fitopatogênicas.

Elementos repetitivos do genoma bacteriano.

Identificados primeiro em enterobactérias (E. coli e S. typhimurium).

Motivos geneticamente estáveis;

Diferem quanto ao número de cópias e localização no cromossomo.

Rep-PCR

Arranjo único devido a sua história evolutiva.

Geram fingerprints genômicos.

Distinguem diferentes patovares de uma espécie.

3 “famílias” / construção de primers:

REP – Repetitive Extragenic Palindromic (35-40pb)

ERIC – Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (124-129pb)

BOX Elemento (154pb)

Louws et al, 1994

Rep Box Eric

PCR / Eletroforese em gel de agarose 1,4%.

Técnica simples / Fácil execução / Discriminativa.

RFLP

(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Baseada em:

restrição enzimática e hibridização de sonda de DNA.

Detecta polimorfismo intra-patovar.

Distingue patovares;

Busca fragmentos específicos de DNA em amostras

de composição complexa.

Altamente reprodutível.

1 – Extração de DNA e quantificação;

2 – Digestão enzimática do DNA com uma ou mais enzimas;

3 – Separação de fragmentos por eletroforese em gel de agarose;

5 –Hibridização com sonda marcada;

6 -Lavagens;

7 – Auto-radiografia.

4 – Montagem do Blot, transferência do DNA para membrana e fixação do DNA;

Sondas:

-Região intergênica 16S-23S;

-Gene de patogenicidade;

-Fragmentos de DNA conhecidos;

-Fragmentos de RAPD.

Sonda: plasmídeorecombinante P2

contendo fragmentos de DNA repetitivos.

Sonda: fragmento de RAPD.

Khoodoo e Jaufeerally-Fakim, 2004.

Barak e Gilbertson, 2002.

PFGE (Pulsed-field gel eletrophoresis)

Baseada em restrição do DNA

com enzimas de corte raro e

eletroforese em gel de campo

pulsado.

Caracterização de patovares.

Gera fingerprints: poucos fragmentos / grande comprimento.

Permite a separação de grandes

moléculas de DNA por eletroforese.

Campo pulsado:

A direção do campo elétrico muda periodicamente

forçando a reorientação das moléculas.

Eletroforese em gel de agarose (1%):

•10 a 15°C / sem interrupção da energia.

Limitações:

-exige experiência na sua

aplicação;

-é dispendiosa e demorada;

-exige equipamentos

específicos.

Staphylococcus aureus digerido com a enzima SmaI. www.medscape.com/viewarticle/414413_3

Staphylococcus aureus (linhagem R6)

digerido com a enzima SmaI.Borer at al, 2002.

ITS (Internal transcribed spacer)

Região bastante variável entre diferentes isolados.

Distinção de patovares.

Cubero e Graham, 2002

Seqüenciamento da região intergência 16S-23S.

PCR com primers que amplificam a região intergênica.

O produto da PCR é seqüenciado.

Alinhamento das seqüências.

Comparação base de dados do GenBank.

Fingerprints patovar específicos.

AFLP

(Amplified Fragment Length Polymorphism)

Combina restrição enzimática e PCR;

Géis de alta resolução;

Eletroforese em gel de poliacrilamida;

Ampla cobertura do genoma;

Munhoz e Weiss (dados não publicados)

(A) Dupla digestão com enzimas de restrição EcoRI e MseI

DNA genômico total

< 0,04%

~10,0%

~90,0%

Fragmentos de restrição

(B) Ligação dos adaptadores específicos dos sítios de restrição

A A T T GC

Adaptador EcoRI

AATTCG

TT A A

Adaptador MseI

GTC A

(C) Amplificação para seleção de fragmentos

(com nucleotídeo seletivo em cada iniciador)

G T A A G

Fragmento amplificado

G A A T T GT AATTC CTC A T

CC A T T

A A T T GGA

A A T T GGA

CC A T T

G T A ATC A T

N G A A T T GAATTC CN

Iniciador EcoRI+A

Iniciador MseI+C1

Fragmentos não amplificados

TC A TG T A A

CC A T T

A

TC A TG T A A

CC A T T

T

TC A TG T A A

CC A T T

C

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

*Utiliza-se altas concentrações de Mg++ para diminuir a estringênciado anelamento;

PCR com primer randômico de 10 nucleotídeos;

Gera fingerprint patovar específico.

Eletroforese em gel de agarose;

Munhoz et al., 2006.

Cada técnica molecular apresenta um tipo de polimorfismo, dependendo da região do

genoma a qual ela revela.

Assessment of genetic diversity of Xanthomonas campestris pv. campestris isolates from Israel by

various DNA fingerprinting techniques

A.Valverdeab, T. Huberta, A. Stolova, A. Dagara, J. Kopelowitzc and S. Burdmana*

aDepartment of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Quality Sciences, Hebrew University of Jerusalem, PO Box 12, Rehovot 76100, Israel; bDepartment of Vegetal Production, IRNASA-CSIC, Salamanca 37008, Spain; and c Savyon Diagnostics Ltd, 3 Habosem St, Ashdod 77610, Israel.

Plant Pathology (2007) 56, 17–25.

Analisar a diversidade genética entre 22 isolados de X. campestris

pv. campestris:

-Israel e outras localizações;

-6 raças conhecidas;

Comparar a capacidade de detecção de 3 técnicas moleculares:

-PFGE, AFLP e Rep-PCR;

-Calcular o coeficiente de similaridade entre os isolados;

-Gerar dendograma.

Objetivos

Estabelecer relação entre os perfis moleculares e patogenicidade.

Enzima SpeI apropriada para fingerprint do patógeno;

Boa reprodutibilidade;

Boa resolução:

Fragmentos de 40 a 340 Kb;-12 a 21 bandas;

11 grupos;

Padrão diferente para cada grupo.

Resultados

PFGE

Boa reprodutibilidade;

Gerou de 25 a 33 fragmentos variando entre 100 e 500pb;

Padrão único para todos os isolados;

12 grupos;

Concordância com dos dados de PFGE.(SM75/Israel)

AFLP

Rep-PCR

Padrão de fingerprint complexo: 29 a 41 bandas / 200 e 3000pb;

Pequena variação na reprodutibilidade;

Formação de 13 grupos (B100);

Distribuição dos isolados de acordo com AFLP e PFGE.

Teste de patogenicidade

Inicialmente: todos os isolados mostraram-se patogênicos.

Diferença de patogenicidade entre isolados com mesmo perfil

molecular.

Diversidade dentro do patovar maior que a previamente estimada.

Alta correlação entre Rep-PCR e AFLP.

Formação de vários grupos:

-diferentes locais de coleta / alta diversidade entre os israelenses.

Conclusões

Isolados B100 (Itália) e HR11279A (UK) foram agrupados com isolados de Israel: devido a disseminação ou adaptabilidade.

Vários isolados com fingerprint único: adaptação.

Afiliação de raças não pode ser inferida por fingerprint de DNA.

PFGE e AFLP: reprodutibilidade;

Rep-PCR: rápido, barato, discriminativo.

Genetic Diversity of Pierce’s Disease Strains and

Other Pathotypes of Xylella fastidiosa

Mavis Hendson,1† Alexander H. Purcell,1* Deqiao Chen,1 Chris

Smart,2‡ Magalie Guilhabert,2 and Bruce Kirkpatrick2

Division of Insect Biology, University of California, Berkeley, California 94720-3112,1 and

Department of Plant Pathology, University of California, Davis, California 956162

Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2001, p. 895–903. Vol. 67, No. 2

Comparação com isolados de X. fastidiosa do Sudeste dos Estados Unidos, causadores de doença em videira, pessegueiro, ameixeira e carvalho.

Objetivos

Análise da relação genética entre isolados de X. fastidiosada Califórnia coletados em videira, amendoeira e oleander.

Utilização das técnicas RAPD, Rep-PCR, PFGE e ITS.

Análise da região intergênica 16S-23S (ITS)

Seqüenciamento de fragmentos com 500 bases contendo a ITS;

A análise das seqüências resultou em 4 grupos;

Isolados oriundos do mesmo hospedeiro apresentaram seqüências idênticas.

Rep-PCR

Todos os isolados da Califórnia apresentaram mesmo perfil.

Resultados

Perfil de Eric-PCR: 1-Uva/Georgia, 2-Uva/Flórida, 3-Uva/California, 4-Maple/Califórnia, 5-

Uva/Califórnia, 6, 7 e 8-Amêndoa, 9-Ladder 1Kb, 10-Carvalho/Flórida, 11-Carvalho/Georgia, 12 e

13-Oleander, 14 ctr. -

A-Amêndoa

G-Uva

M-Maple

O-Carvalho

Ol-Oleander

P-Pêssego

Pl-Ameixa

RAPD

Testados 20

oligonucleotídeos;

10 primers geraram

fingerprints complexos;

-Distinção de isolados

de diferentes

hospedeiros.

PFGE

Enzimas NotI e SpeI

produziram fragmentos

adequados para

comparação entre

isolados;

*Agrupamentos

obtidos pelas três

técnicas foram

concordantes.

A-Amêndoa

G-Uva

M-Maple

O-Carvalho

Ol-Oleander

P-Pêssego

Pl-Ameixa

Variação revelada por RAPD sugere que:

-Isolados “PD” evoluíram nos últimos 130 anos ou

-Isolados geneticamente diferentes foram introduzidos ou

-Alguns isolados são nativos da América do Norte;

Todas as análises genéticas produziram mesmo agrupamento

de associação a hospedeiros de X. fastidiosa;

Isolados mais costeiros são mais parecidas entre si do que com os

do sul ou centro da Califórnia (maiores estudos).

RAPD e PFGE revelaram maior grau de diversidade genética;

Conclusões

Estudos de hibridização DNA-DNA podem confirmar se os grupos representam espécies distintas;

Resultados sugerem diferenciação taxonômica (patovar):-Vários isolados tem habilidade de infectar hospedeiros diferentes e causar doenças.

Estudos com isolados de outros hospedeiros – CVC – podem esclarecer as diferenças encontradas;

Baixa variabilidade na região intergênica mostra que os isolados são filogeneticamente proximamente relacionados;

A avaliação preliminar da diversidade genética

de bactérias fitopatogênicas pode auxiliar nos estudos

taxonômicos, epidemiológicos e de detecção, bem

como ajudar na criação de programas de pesquisa

visando obter variedades resistentes.

Considerações finais