eletroforese capilar (marina tavares)

5/16/2018 Eletroforese Capilar (Marina Tavares)

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REVISAOMECANISMOS DE SEPARA


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Ldct t.;Ii = (Pe! + Po"",) Vonde J..lie J..li+1sao as mobiIidades aparentes de dois solutoseluindo em posicoes adjacentes, J..lmedia a mobilidade mediados solutos, J..lel' a mobilidade eletroforetica do soluto i, J. .lusma mobilidade do fluxo eletroosmotico, V e a diferenca de poten-cial aplicada, D e a media dos coeficientes de difusao dos doissolutos, Lint e 0 comprimento do capilar e Ldet e a distancia doponto de inje~ao a posicao do detector,As equacoes (I) a (3) indicam que 0 uso de voltagens eleva-das e vantajoso, pois implica em urn ganho de resolucao e efici-encia, assim como na diminuicao do tempo de analise, Outraobservacao pertinente e que, em separacoes diffceis, a resolucaode pares de solutos eluindo muito proximos pode ser melhoradapelo ajuste da magnitude do fluxo eletroosm6tico. Quando amobilidade eletroosm6tica for aproximadamente igual, mas desinal oposto a mobilidade dos solutos, urn ganho de resolucao ealcancado (equacao I). As penaJidades para este tipo de estrate-gia, no entanto, sao: perda de eficiencia (equacao 2) e aumentoconsideravel do tempo da analise (equacao 3).Soluciies Tampiio

Quando a separacao envolve solutos com carater acido-base,a mobilidade eletroforetica do soluto depende do pH do eletro-lito. Neste caso, 0 termo mobilidade efetiva, 0 qual incorpora 0produto das mobilidades eletroforeticas das especies em equilf-brio e a distribuicao das concentracoes relativas de cada especieno pH considerado, e ernpregado". Assim sendo, 0 controle dopH e aconselhavel e a escolha de uma solucao tampao adequadatern implicacoes diretas na otimizacao da separacao, Adicional-mente, a suscetibilidade do fluxo eletroosm6tico a variacoes depH requer que 0 tarnpao apresente constancia no valor de pH(alta capacidade). Outras propriedades desejaveis para urn siste-ma tampao incluem: baixo valor de absorbancia no cornprimen-to de onda selecionado para a analise, e baixa mobilidade, paraminimizar a geracao de calor por efeito Joule. Alern disso, aescolha do tampao esta vinculada a consideracoes sobre a formada banda: via de regra, tampoes contendo fons com mobilidadesemelhante a do soluto previnem distorcoes no perfil da bandae minimizam 0 seu alargamento.

(3)De forma geral, os sistemas tampao sao eficientes em urn

intervalo de pH correspondente ao pKa, mais ou menos umaunidade. Na tabela I foram selecionados os tampoes maiscornu mente usados em eletroforese capilar e seus respectivospKa. Especialmente titeis para eletroforese capilar sao os tam-poes biologicos, conhecidos como tampoes de Good (Tris/borato,histidina, Caps, etc). Estes sistemas, em geral, possuem fonsgrandes, de baixa mobilidade e podem ser usados em altas con-centracoes, sem a desvantagem de gerar calor excessivo. Entre-tanto, os tampoes de Good apresentam a inconveniencia de ab-sorver fortemente na regiao do UV.

Em capilares de sflica fundida, 0 intervalo de pH adequa-do para trabalho varia entre 2 e II, mas em geral este inter-vatu e limitado pel a estabilidade do soluto. A concentracaodas solucoes tampoes usadas em eletroforese capilar variatipicamente entre 5 e 200 mmol L1. Na escolha da concentra-~ao sao considerados varies efeitos. Altas concentracoes po-dem comprometer a separacao, pelo excesso de calor decor-rente do efeito Joule. Baixas concentracoes podem aumentara tendencia de adsorcao de certos solutos na parede do capi-lar e, portanto, ocasionar alargamento e distorcao das bandas.Adicionalmente, em baixas concentracoes, 0 fluxo eletroos-m6tico pode se tornar errarico, 0 que dificulta areprodutibilidade dos tempos de migracao e consequentemen-te prejudica a identificacao inequfvoca dos solutos.A FSCE e aplicavel a uma grande variedade de solutos,incluindo Ions inorganicos, compostos organicos de baixa mas-sa molecular e biomoleculas com alguns mil hares de daltons.A figura I apresenta uma serie de aplicacoes da eletroforesecapilar em solucao livre, em sistemas tampon ados comuns. Urnexemplo magistral do poder de resolucao de FSCE e 0 apre-sentado na figura IB. Nesta aplicacao, a separacao dos diaste-roisomeros de peptfdeos sinteticos, con tendo 36 aminoacidos,e demonstrada. Estes peptfdeos foram sintetizados de tal formaque, dos 36 aminoacidos, 35 apresentam conformacao L, eapenas urn apresenta conforrnacao D, a qual e inativa biologi-camente. A FSCE e capaz de distinguir tais isomeros, ondeuma pequena alteracao estrutural ocasiona a variacao da distri-bui~ao espacial de carga da molecula, e desta forma causa di-ferencas de mobilidade. Outro exemplo, que demonstra a esco-Iha adequada do sistema tarnpao, e 0 apresentado na separacaode acucares da figura IE. Alem das caracterfsticas tamponantes,

Tabela 1. Sistemas tampao cornu mente usados em eletroforese capilar.!"Sistema Tampao pKa Sistema Tampao pKa Sistema TampaoFosfato 2,12 Imidazol 7,00Citrato 3,06 MOPS 7,20Formiato 3,75 Fosfato 7,21Succinato 4,19 TES 7,50Citrato 4,74 HEPES 7,55Acetato 4,75Citrato 5,40Succi nato 5,57MES 6,15ADA 6,60BIS-TRIS propano 6,80PIPES 6,80ACES 6,90MOPSO 6,90

HEPPSOTRICINA

8,008,158,208,258,308,358,499,249,509,6010,4012,32

Hidrocloreto de amido-glicinaGlicilglicina

TRISBICINAMorfolinaBoratoCHES

CHAPSOCAPSFosfato

ACES: acido 2-[(2-amino-2-oxoetil)aminoj etanossulfOnico; ADA: acido N-[2-acetamidoj-2-iminodiacetico; BICINA: N,N-bis[2-hidroxietil)aminoj etanossulfOnico; BIS-TRIS: 1,3,-bis[tris(hidroximetilj-metilaminoj propano; CAPS: acido 3-[ciclohexilaminoj-l-propanossulfonico: CHAPSO: sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonioj-2-hidroxi-I-propano; CHES: acido 2-[N-ciclohexilarnino] etanossulfOnico; HEPES: acido N-2-hidroxietilpiperazina-N' -2-etanossulfOnico; HEPPSO: acido N-[2-hidroxietillpiperazina-N' -[2-hidroxij propanossulfonico; MES: acido 2-[N-morfolinoj etanossulfonico; MOPS: acido 3-[N-morfolinojpropanossulfOnico; MOPSO: acido 3-[N-morfolinoj-2-hidroxi propanossulfOnico; PIPES: piperazina-N ,N' -bis-jacidoetanossulfonico]: TES: acido N-tris[hidroximetiljmetil-2-amino etanossulfonico: TRICINA: N-[2-hidroximetil)etilj-glicina; TRIS:Tris(hidroximetil)amino metano.

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Figura 1. Aplicacites representativas de eletroforese cupilur em soluciio livre, (A) Eletroferograma de sulfo-ftulocianinas de zinco em tampilo decitrato 20 mmol L'I. pH 2.5; 630 nm (ref. 15); (8) Eletroferogramu de peptideos diasteroisiimeros em tampiio de trietanolaminu-fosfato (TEAP) 10mmol t:', pH 2.5; 200 nm (ref. 16. adaptado); (C) Eletroferogruma de nucleotideos em tampiio defosfato 2.4 mmol t:' e NaCl5 mmol L'I. pH 10;260 nm (ref 17. adaptado); (D) Eletroferograma de adocantes sinteticos e conservantes em tampilo de boruto 20 mmol L'I. pH 9.4; 192 nm (ref18. adaptado): (E) Eletroferogruma de oligo-sacarideos em tampilo de borato 175 mmol t:', pH 10.5 (ref. 18. adaptado),

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o eletr6lito escolhido, borato, possui propriedades complexantes eno caso, foi empregado para alterar a seletividade da separacao,Aditivos

Em FSCE e bastante comum 0 uso de eletr6litos aditivados.o uso de aditivos e indicado em quatro situacoes: para alterar amobilidade do soluto, modificar 0 f1uxo eletroosm6tico,solubilizar solutos ou compostos na matriz da amostra e reduzira interacao de certos solutos com a parede do capilar (minimizaradsorcao), Uma Iista de varies aditivos e seus respectivos efei-tos e apresentada na tabela 2.Urn dos exemplos mais interessantes da FSCE em eletr6litosaditivados e a separacao de cations inorgfinicos. A separacao decations e em geral uma pratica diffcil, em razao das semelhancasde raio ionico efetivo, que se refletem na similaridade dacondutancia equivalente e mobilidade. A figura 2 i1ustra este pro-blema, onde a condutancia ionica equivalente de varies grupos decations e apresentada em ordem ascendente. Pela observacao dosvalores, conclui-se que a separacao dos metais alcalinos e alcali-nos terrosos e viavel, enquanto que a separacao de varies metaisde transicao e praticamente impossfvel. Neste caso, e entao aeon-selhavel a incorporacao de agentes complex antes ao eletr6lito decorrida (Figura 3A), visando uma alteracao seletiva da mobilida-de dos cations e, conseqiientemente, urn ganho de resolucao, Outrorecurso empregado na analise de cations e 0 uso de urncomplexante auxiliar , como urn composto de insercao, cuja cavi-dade discrimina solutos de diferentes tamanhos (Figura 3B). Emambos os casos, como todas as especies complexas e metal livreestao em equilfbrio dinamico, 0 eletroferograma de urn cationmetalico complexado apresenta uma banda iinica. 0 tempo demigracao desta banda pode ser alterado, se 0 equilfbrio e deslo-cado, em razao da alteracao da distribuicao total de carga. Napratica, isto e feito pela modificacao da concentracao docomplex ante no eletrolito ".

A analise de cations e em geral realizada sob deteccaoespectrofotometrica indireta, uma vez que a maioria dos cationsmetalicos apresenta baixa absortividade na regiao espectral detrabalho (200 a 900 nm). Assim sendo, a absorbiincia de urncromoforo cationico (em geral urn cIoridrato de amina) emonitorada no decorrer da analise. Quando a banda do solutocatifmico chega ao detector, 0 cation do crom6foro e deslocado,e 0 sinal de absorbancia decai, retornando a sua posicao origi-nal, assim que 0 soluto deixa 0 detector. A figura 4 apresentadois exemplos classicos de separacao de cations por FSCE em

~ 80-r------------c------R-b-------------------------,~ _ / s~ K

Yb_T/DY-::-HO--Gd--E/U-J~-Nd-pr-La-Ce

..: S ca/o /- F __ Co';:: Mg Zn--Mn-Cu- e-Cd~ 50- N/ Na8 - /

40-

ORDEMRESCENTEFigura 2. Conduuincia iiinicu equivulcntc dos ntetuis do grup I. /I etransiciio (ref. 20. adaptado).

~NJECAo

--00000000,A Vosm 0( I. (,J ligante(,J ~ ~U@~88metal complexo~+

Bb~ eter coroaV 0( VI

complex~ ~Vosm--00000000~

.C~@0Figura 3. Reprcsentuciio esquenuitica da lIligra('(io de cations por ele-troforese capilur na presence de age lites complexantes (A) e compostosde inclusiio (B). Detulhe mostrando IIsuperficie internu do capilar,carregada negativamente, e a orgalliwrao da soluciio nas imediaciiesda superficie. A composiciio vetorial das velocidades eletroosmotica(v""m) e eletroforeticu (v,j) resultu na velocidade apurente (Vi) de migra-rao do soluto.

Aditivo Puncao e/ou EfeitoTabela 2. Aditivos de eletr6lito cornu mente empregados em eletroforese capilar.

Agentes de pareamento ionico e modificadores da carga superficial.Bloqueiam sftios ativos na superffcie do capilar. Reduzem adsorcao e assimetria de pico.Reduzem a interacao soluto-capilar, melhoram a resolucao e simetria de pico.Usados nas separacoes quirais e como complex antes auxiliares na separacaode compostos neutros.Usados nas separacoes quirais e como complexantes auxiliares na separacao de metais.Reduzem a adsorcao soluto-capilar, auxiliam na solubilidade de solutos organicose reduzem 0 fluxo eletroosm6tico.Modificam a mobilidade de certos solutos, afetam a resolucao,Agentes modificadores do tluxo eletroosm6tico.Reduzem 0 fluxo eletroosm6tico, alteram a conformacao de protefnas e previnema adsorcao soluto-capilar.Aumentam a solubilidade de solutos organicos. Reduzem interacao soluto-capilar.Agentes modificadores do t1uxo eletroosm6tico.Revertem 0 f1uxo eletroosm6tico.Aumenta a solubilidade das protefnas,

Acidos sulfonicosAminasAnf6litosCiclodextrinasEter coroaGlic6isMetais de transicaoPolimeros de celuloseSais inorgiinicosSolventes orgfinicosTensoativos cationicosUreia

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I ,B 2 ,0 2,2 2,4 2,6 minFigura 4. Scpurucit t ie cations por eletroforesc cupilur COlli aditivos.(AJ Eletrolito: -t-mettlbemitumina fi mmol C'. dcido ldtico /5 mmol C, e metanol 5 %. pi! 4.25 (ref. 22. aduptado); (B) Eletrolito: imidazol5 mmol C'. dcido hidroxi-isobutirico 6.5 mmol C' e lfi-crowlI-6 ether1 mmol L'. pH 4.5; 2/4 11 m (ref. 23. aduptudo).

eletr6litos aditivados. 0 sinal do detector foi invertido, para queo eletroferograma apresente 0 seu registro convencional, compicos voltados para cima. Na figura 4A, alern do cromotoro e docomplexante, foi empregado 0 solvente metanol a 5%, cujo efeitoprovavel e 0 de alterar 0 raio ionico efetivo de alguns cations,melhorando a seletividade da separacao, Na figura 4B, a conhe-cida co-eluicao de potassic e amonio pode ser resolvida na pre-senca de urn eter coroa, com 6 atomos de oxigenio,Agentes Modificadores da Superficie Capitar

Os capilares utilizados em eletroforese capilar sao fabrica-dos com silica fundida, uma forma pura de di6xido de silfcioamorfo. Este material confere aos capilares muitas proprieda-des importantes, como dimensfies precisas, alta con stante die-letrica, baixa condutividade eletrica, alta condutividade termi-ca, resistencia mecanica e particularmente, alta transrnissao6ptica para urn intervalo apreciavel do espectro (190 a 900nm). Quimicamente, os capilares de silica sao caracterizadospela presenca de varies grupos silanol (SiOH), os quais sao

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fracamente acidos em carater, Em contato com 0 meio aquoso,alguns destes grupos dissociam, tornando a superffcie negati-vamente carregada. Os grupos silanol sao diretamente relacio-nados com 0 fenomeno da eletroosmose 1. 11 Alern disto, estesof ere c ern sftios abundantes para interacao coulornbica comcertos solutos, e portanto por vezes tern urn efeito adverso naqualidade da separacao e deteccao final.

Varies procedimentos tern sido introduzidos para 0 controleda densidade de carga na parede do capilar, visando tanto 0controle do tluxo eletroosm6tico quanta a eliminacao da inte-racao soluto-capilar. 0 uso de capilares revestidos internamen-te e uma pratica comum. Nestes capilares, os grupos silanolsao bloqueados quimicamente pel a reacao com ligantes polaresdo tipo organosilanos (trimetilclorosilano, y-metacriloxipropil-trimetoxisilano), entre outros. Este tipo de revestimento tern semostrado efetivo por urn perfodo de tempo Iimitado, devido 11hidr6lise reversfvel do oxigenio silil, particularmente em valo-res altos de pH.

Talvez a maneira mais elegante de manipulaciio da cargasuperficial do capilar e a desativacao dinamica que decorre daadsorcao ffsica de agentes tensoativos cationicos, tais como osalquil derivados dos sais quaternaries de amonio. A escolhaadequada do tamanho da cadeia do tensoativo como sua con-centracao permite 0 controle direto da magnitude do tluxo ele-troosm6tico e mesmo a sua inversao".

A figura 5 ilustra as vantagens do controle de fluxo e pola-ridade da fonte de alta tensao, dentro do contexte da migracaode anions. Considere a introducao hidrodinfimica' de uma amos-tra contendo solutos anionicos, A figura 5A exemplifica a sepa-ra~ao sob tluxo eletroosm6tico (eof) normal, fluxo direcionadoao catodo", e polaridade positiva na extremidade do capilar ondee feita a injecao de amostra. Este tipo de analise somente epossfvel no caso de anions lentos (arornaticos, por exemplo),cuja mobilidade e menor que a mobilidade eletroosmotica. Se

Aeofnormal

~+polaridadenormal

Beofnormal

~-polaridadeinvertida

Ceof invertido


Deof suprimido


Figura 5. Representaciio esquenuuica till lIIigrarlio tie /tnions pOI' ele-troforese capilar.

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os anions sao rapidos ou moderadamente lentos (inorganicos ecarboxflicos alifaticos de cadeia curta), eles deixam a colunaassim que 0 campo eletrico e estabelecido e nunc a atingem 0detector, cuja posicao e fixa em urn ponto no final da coluna. Ainversao da polaridade, figura 5B, torna viavel a analise deanions rapidos, no entanto, como estes migram em contra-fluxo,o tempo de analise pode ser consideravelmente longo. A situa-~iio ideal para a analise de qualquer anion, seja lento ou rapido,e a demonstrada pela figura 5C. A adsorcao de tensoativoscationicos, seguida pela interacao por dispersao entre as caudas(forcas de London), permite 0 estabelecimento de uma estruturabidimensional (semi-micelas) na superffcie, onde as cabecaspositivas do tensoativo estao voltadas para a solucao, Destaforma, uma dupla camada eletrica constitufda de anions e entaoorganizada na interface superficie-solucao. Sob a~ao de urn cam-po eletrico, uma parte dos anions presentes na camada difusasofre rnigracao em direcao do anodo. Esta migracao e estendidaa outras camadas da solucao, e a solucao como urn todo migrana direcao do anodo, processo conhecido na Iiteratura de anionscomo fluxo eletroosmotico invertido'". Uma ultima possibilida-de de analise, que tambern se aplica a anions de qualquer natu-reza e a representada pela figura 5D. Nesta situacao, a separa-~ao e conduzida sob f1uxo suprimido, em capilares especiais,com revestimento interno. Entretanto, comparativamente a ana-lise sob fluxo invertido, 0 tempo de eluicao e bastante longo.A analise por FSCE de anions inorganicos ou organicos debaixa massa molecular, assim como a de cations, e tambern re-alizada sob deteccao indireta. Neste caso, urn cromoforoanionico, cuja absorbfincia e monitorada continuamente, e esco-Ihido como eletrolito de corrida. A escolha do eletr6lito eotimizacao das condicoes de analise e funcao do tipo de aniona separar, se rapido ou lent025 A figura 6 ilustra varias possibi-lidades para a separacao de anions: a figura 6A demonstra aseparacao de anions lentos, em eletrolitos nao aditivados e sobfluxo normal (capilares comuns), enquanto que a Figura 6Bdemonstra a separacao de anions rapidos, moderadamente lentose lentos, sob eletrolito aditivado com tensoativo cationico e flu-xo invertido. A figura 6B ilustra muitas das propriedadesmarcantes da eletroforese capilar: alta eficiencia e poder de re-solucao, analises rapidas e grande capacidade de picos (36solutos em 3 minutos). A figura 6C apresenta uma separacao deanions realizada com eletr6litos nao aditivados e em colunasespeciais, onde os grupos silanol da superffcie foram bloquea-dos e, portanto, 0 tluxo eletroosm6tico esta inibido. Neste caso,a separacao ocorre exclusivamente devido a diferencas intrfnse-cas de mobilidade eletroforetica dos anions.

Urn aspecto interessante da separacao de anions, observavelnos eletroferogramas da figura 6C, e 0 efeito do tipo do eletrolitosobre a simetria final da banda. Sempre que a mobilidade doanion do eletr6lito aproxima-se da mobilidade do anion do soluto,a banda e simetrica, Discrepancias de mobilidade geram band asdistorcidas, que apresentam cauda (tailing) ou cauda frontal(fronting), caso a mobilidade do anion do eletr6lito seja muitomaior ou muito menor que a mobilidade do anion do soluto, res-pectivamente. A figura 7 ilustra as situacoes de simetria (IlA =IlB) e assimetria (IlA "# IlB) de pico, onde IlA e a mobilidade dosoluto anionico e IlB e a mobilidade do anion do eletr6lito. Adistribuicao espacial das moleculas e assimetrica quando a pre-senca da banda gera distorcoes locais do campo eletrico, E. Nocaso IlA < IlB: as moleculas do soluto que estao posicionadas nainterface BA, ao difundirem para a regiao B, sofrem uma dimi-nui~ao de velocidade (EB < EA), e com 0 tempo tendem a afastar-se do centro da banda. Se as moleculas pertencem a interface AB,a difusao para a regiao B tambern causa retardamento, mas como tempo, 0 centro da banda as alcanca. No caso IlA > IlB, a situ-a~iio e invertida: rnoleculas na interface BA ao penetrarem a re-giao B sao aceleradas (EB > EA) e retornam ao centro da banda,enquanto que moleculas na interface AB ao serem aceleradas naregiao B, afastam-se do centro da banda.

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c270nm

',0,2VANADATO 75 mM25' nm

', '

~oI OD El O 1 .5 mM226nm

7,0

'. 0 5,2 minFigura 6. Separacao de unions por eletroforese capilar. (A) Fluxoeletroosmtit ico normal: tampiio de borato 20 mmol t:', pH 9.55; 200nm(ref. 26. adaptado); (B) Fluxo eletroosmotico invertido: cromato 5 mmolt:' e OFM anion-BT 0.4 mmol L-I (Waters. tensoativo cuti imico), pH8 (ref 27. adaptado); (C) Com supressiio defluxo. Cotuna DBI (Perkin-Elmer; f i lme de 0.05 11mde espessura, fuse CI) (ref. 28. adaptado).

1.2. Eletrocromatografia MicelarA limitacao prirnaria dos metod os eletroforeticos em solu-

~ao livre e a impossibilidade de separar compostos neutros, amenos que existam diferencas significativas de massa molecu-lar. Em geral, compostos neutros migram no capilar por a~iio

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ACapi lar o O ~ 1 ~ B 1 W oCampo _____J""l__El4ttrico ----,____,---Local EA>EB EA=EB EA


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Tabela 3. Concentra~ao micelar crftica (CMC) e numero de agrega~ao (N) para tensoativos de uso comum em eletrocromatogratia micelar.3'Agente Tensoativo Estrutura/Formula CMC N(abreviacao) (mmol L-')

M C O O - N a +H O _ ( : ( )

Anionico:Dodecil sulfato de sodio (SDS)Octil sulfato de sodio (SOS)Cationico:Cloreto de hexadecil- tr imetil-amonio (CT AC)Brometo de dodecil-trirnetil-arnonio (DTAB)Anfoterico:N-dodecil sultafna (SB-12)Niio-ionico:Polioxietileno-t-octilfenol (Triton X-I 00)

Bile:Deoxicolato de sodio (NADC)

C'2H2,OS03-Na+CXHI7 0S03-Na+8,1136

6220

CIt;H33W(CH3h CI-C'2H2,W(CH3h Br- 1,315 78501,2

(CH3)3CCH2C(CH3hCr,H4(OCH2CH2)~50H

0,2 143

6,4 14

A extensao com que a associacao soluto/micela ocorre deter-mina a ordem de elui~ao dos solutos.Vantagens e Limitaciies

A MECC oferece varias vantagens em relacao a outras tee-nicas alternativas de separacao, A instrumentaeao basica e iden-tica a empregada em eletroforese de zona em solucao livre', noentanto a MECC e mais versatil, Em MECC, diferencas demobilidade eletroforetica podem ser exploradas para separarsolutos ionicos. ao mesmo tempo que, diferencas de distribuicaoentre a fase micelar e 0 eletrolito podem ser usadas para separarsolutos neutros. A MECC apresenta uma eficiencia muito mai-or, quando comparada as tecnicas cromatograficas similares(pareamento ionico, por exemplo), em decorrencia das caracte-rfsticas inerentes ao fluxo eletroosmotico, particularmente docarater linear do perfil radial da velocidade'. Alern disso, auniformidade das micelas, em termos de distribuicao de tama-nho, minimiza os problemas associ ados com a resistencia a trans-ferencia de massa (vide proxima secao).

Apesar de ser uma tecnica eletroforetica com extensa vari-edade de aplicacoes, a MECC apresenta algumas limitacoes deordem pratica e teorica, Em eletrocromatografia micelar, a ra-zao entre 0 volume das fases (Vm i cc ,a lV sn 'u ~ i in ) e relativamentegrande: uma solucao 0,5 mol L-' de dodecilsulfato de sodio,por exemplo, apresenta uma razao de fases maior que 0,01.Este fator, considerando que micelas sao instaveis em solucoesaquosas contendo altos teores de solventes organicos, em ge-ral, impossibilita 0 uso de MECC para solutos com forte cara-ter apolar. Nestas condicoes, tais solutos sao completamenteretidos pela micela, e portanto, nao sao diferenciados quandoatingem 0 detector. Alem disso, em razao da velocidade e dovolume efetivo das micelas dependerem criticamente das con-dicoes da separacao, a reprodutibilidade do tempo de eluicaoexige urn controle cuidadoso das condicoes experimentais.Comparativamente a outras tecnicas eletroforeticas, a MECCpossui uma baixa capacidade de picos, 0 que limita seu uso amisturas nao muito complex as. Esta caracterfstica esta direta-mente relacionada ao fato de que em MECC, a fase secundaria(micelas) esra em movimento e, conseqiientemente, todos ossolutos, mesmo os total mente retidos pela micela, sao elufdos,Isto limita 0 tempo em que a separacao deve ocorrer a urnintervalo caracterfstico, De acordo com a figura 9, os solutos500

so podem eluir entre os tempos to (soluto nao-retido pelamicela, ou simplesmente urn soluto neutro, que migra apenaspor a~ao do fluxo eletroosmotico), e tM (tempo de migracao damicela). Assim, 0 fator to/tM expressa convenientemente 0 in-tervalo iitil de separacao em MECC.

INTERVALO (JTIL

Solutonao-retido


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esta finalidade. 1 < 1 para a medida de tM, se faz necessario deter-minar 0 tempo de migracao de urn soluto permanentemente re-tido no interior da micela: Sudan III, urn corante sohivel emagua, tern sido bastante utilizado como soluto de prova.o intervalo limitado dos tempos de eluicao em MECC tam-bern altera a expressao para a resolucao:

onde N eo mimero de pratos, k'i e k'2 sao os fatores de capa-cidade para dois solutos eluindo adjacentemente e a e 0 fator deseletividade, definido pela razao:

k'a =_2k'iNovamente, quando 0 valor de tM tende ao infinito, 0 ultimo

termo da expressao (6) se aproxima da unidade, e a expressaoda resolucao e simplificada para aquela convencionalmente de-finida em separacoes cromatograficas.

Em cromatografia, a resolucao aumenta com 0 aumento dofator de capacidade. Em MECC entretanto, a relacao entre Rs e k'nao e intuitiva, devido ao ultimo termo da equacao (6), que defato, diminui com 0 aumento de k'. A resolucao passa por urnmaximo, para valores de k' entre I e 5. 0 valor otimo depende dointervalo de eluicao. Quando a velocidade de rnigracao da micelae a velocidade eletroosmotica tern magnitudes aproximadas, masdirecoes opostas, 0 intervalo de eluicao pode ser estendido e 0valor otimo de k' aumentado. No entanto, sob estas condicoes, areprodutibilidade dos tempos de eluicao pode ser comprometida.

Em geral, a reducao dos valores de k' dos iiltirnos componen-tes da mistura e necessaria para melhorar a resolucao. Urn au-mento de tM relativo a tR e suficiente para diminuir k'. 0 tempode eluicao da fase micelar e determinado pela velocidade aparen-te da micela, VM,que por sua vez, e a soma vetorial das veloci-dade eletroosmotica, V"'I11'e eletroforetica da micela, Vc.M:VM = Vusm + Vc,M

V,.M = 20('" j(Ka) E311 (10)

onde /;,e 0 potencial zeta' da superffcie capilar, / ; , m e 0 poten-cial zeta da superffcie micelar, f (xa) e uma funcao do tama-nho e forma da micela, Eo e a permitividade do vacuo, 1 0 e 11sao, respectivamente, a constante dieletrica e viscosidade domeio, e E e 0 campo eletrico. Em condicoes de rotina (micelaanionica, pH > 5), V"'111 maior que Vc.M.Desta forma, umadirninuicao do potencial zeta do capilar ira reduzir tanto V"'111quanto VM. Isto produz 0 efeito desejado de aumento de tMrelativo a tR. Alem disto, desde que 0 fator to/tM diminui, 0valor de resolucao otima aumenta, deslocando-se para valoresmaiores de k', Estrategias para a dirninuicao do potencial zetado capilar, e conseqUentemente do fluxo eletroosmotico, jaforam discutidas previamente, quais sejam, revestimento docapilar (silunizacao, etc), assim como alteracao das proprieda-de ffsico-qufmicas da solucao (pH, forca ionica, viscosidade econstante dieletrica),o fator de capacidade de urn soluto e 0 produto do coefici-ente de parricao, K, e a razao entre as fases, P (razao entre osvolumes da fase estaciondria e fase movel):k' = 1 3 K (II)QUiMICA NOVA. 20(5) (1997)

(6)

Em cromatografia lfquida de fase reversa, a incorporacao desolventes na fase movel afeta os valores de k', pois altera 0coeficiente de particao. Em MECC, a situacao e complicada pelofato de que os solventes organicos afetarn nao so K, mas tam-bern 1 3 . Solventes organicos alterarn a concentracao crftica damicela (CMC) e, portanto, 0 volume micelar, Alern disso, aadicao de solventes organicos altera a viscosidade e a constantedieletrica da fase movel e, consequentemente, 0 potencial zetado capilar, resultando na variacao da velocidade eletroosmotica.Metanol, isopropanol e acetonitrila sao alguns dos solventestestados para a extensao do intervalo de tempos de eluicao. Emgeral, a reducao do fator capacidade dos solutos que eluem porultimo e conseguida as custas de longos tempos de analise.

Em MECC, a capacidade de picos (n) e dada pela seguin-te expressao:

(7) N I/2 II+ --In...!L4 II (12)onde tn e 0 tempo de retencao do n-esimo componente, no casor, = tM, e tl e 0 tempo de retencao do primeiro componente aeluir do capilar, tl = t"'I11'

Em geral, se nenhum procedimento e usado para estender 0intervalo de eluicao, 0 fator to/tM varia entre 0,2 e 0,5 (valorestfpicos obtidos em solucoes de SDS tamponadas com fosfato eborato). Assumindo urn fator tOItM= 0,3 e N = 10',0 mimeromaximo de solutos que podem ser separados em urna iinicacorrida e de aproximadamente 100. Considerando neste exem-plo, que a eficiencia da separacao e bastante elevada (10' pra-tos), 100 solutos e urn rnimero muito menor do que poderia serseparado em outras tecnicas correlatas, que nao exibem esta li-mitacao do intervalo de eluicao.Causas de Alargamento de Bandas

(8)

Alern das causas convencionais discutidas anteriormente paraeletroforese de zonal existem algumas particularidades emMECC, como tambem processos distintos, que contribuem paraa dispersao das zonas. Por exemplo, foi demonstrado que avariancia da zona resultante de difusao longitudinal e proporci-onal ao coeficiente de difusao do soluto e ao tempo de migra-~ao. Em MECC, est a contribuicao depende nao somente da di-fusao do soluto na fase movel, como tam bern de sua difusiio nafase micelar. Adicionalmente, os solutos que apresentam altosvalores de k' despendem muito tempo no interior da micela, quepor sua vez migra lentamente. Assim sen do, tais solutos reque-rem mais tempo para eluir do capilar e as bandas sao mais vul-neraveis ao alargamento gerado por difusao.

Micelas sao estruturas dinfimicas e, por conseguinte, estaosujeitas a polidispersao: variacao de tamanho com 0 tempo, emdecorrencia do equilfbrio de troca entre 0mon6mero e 0N-mero.A polidispersao micelar gera uma distribuicao relativa de mass asmoleculares ou tamanhos e, portanto, e urn fator importante aconsiderar na escolha de uma fase pseudo-estacionaria paraMECC. A mobilidade eletroforetica da micela e determinada porfatores como tamanho e forma (termo f (xa) da equacao (10), osquais, por sua vez, dependem do mimero de agregacao, N. Agen-tes tensoativos, que inerentemente geram micelas em urn amplointervalo de tamanhos e formas, podem nao ser adequados paraMECC. Solutos interagindo com micelas de diferentes tamanhosexibem urn amplo intervalo de velocidades de rnigracao e podemproduzir bandas largas. Urn aumento da concentracao dotensoativo, assim como urn aumento de temperatura, podem con-tribuir para acelerar 0 processo de troca entre micela e mon6mero,melhorando a eficiencia da separacao.

Efeitos adversos relacionados com a resistencia a trans fe-rencia de massa entre as fases pseudo-estacionaria e moveltambem podem ocorrer em MECC. Em geral, baixas voltagens

(9)

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e altos coeficientes de difusao do soluto minimizam estes efei-tos. A contribuicao da resistencia it transferencia de massa nafase pseudo-estacionaria e em geral de pequena magnitude parasolutos nao-polares, em decorrencia do tamanho das micelas(= 40 Angstrons para SDS) e da cinetica rapida da interacaosoluto/micela. No entanto, devido it natureza das torcas envol-vidas, 0 processo de particao entre solutos pol a res ou ionicose a micela pode apresentar uma cinetica lenta, e causar 0 alar-gamento das bandas.

Resistencia it transferencia de massa na fase m6vel envolvedois processos distintos: difusao intermicelar e intracoluna. Qefeito intermicelar ocorre porque a difusao do soluto entre asmieelas e urn processo lento. Este processo e analogo ao queocorre em colunas empacotadas usadas em cromatografia it If-quido, onde a difusao rapida do soluto entre as partfculas dorecheio e de extrema importancia, Mesmo em concentracoes mo-deradas de tensoativo, a distancia entre as micelas e extrema-mente pequena, dificultando a passagem do soluto. No entanto,verifica-se em MECC, uma menor resistencia it transferencia demassa na fase m6vel quando comparada it cromatografia it lfqui-do em colunas empacotadas. As micelas constituem uma fasesecundaria mais uniforme e homogeneamente dispersa (devidoit repulsao coulombica entre as micelas) e tern dimens5es meno-res que as partfculas usadas nas colunas empacotadas. Devido itquase perfeita distribuicao de micelas e sua natureza t1ufdica,diferencas de percurso na migracao dos solutos sao praticamen-te eliminadas, explicando-se assim a maior eficiencia obtida nasseparacoes por MECC.Em cromatografia, a resistencia it transferencia de massaintracoluna e consequencia do perfil de velocidade parab6licoda fase m6vel. Moleculas do soluto localizadas no centro dacol una movem-se mais rapidamente que as moleculas pr6ximasit parede. Urn efeito semelhante ocorre em colunas empacota-das, no qual as moleculas localizadas entre as partfculas do re-cheio experimentam urn f1uxo parab6lico local. Em MECC, alent a transferencia de massa intracoluna ira contribuir para 0alargamento das bandas somente se existir urn gradiente de ve-locidade radial no capilar. Tais gradientes podem ser originadospor efeitos terrnicos apenas, ja que a natureza do f1uxoeletroosm6tico, constancia do perfil radial da velocidade,minimiza esta fonte de dispersao.Aplicaciies

A figura J O apresenta uma serie de aplicacoes representati-vas de MECC, exemplificando a separacao de drogas de usofarrnaceutico e compostos de interesse ambiental. Variosaditivos que encontram aplicacao pratica em eletrocromatogra-fia micelar estao compilados na tabela 4. Q surfactante maiscornu mente empregado em separacoes micelares e sem diivida,o dodecil sulfato de s6dio (Figura lOA, C e D). Misturas detensoativos podem ser empregadas para gerar micelas mistas.Surfactantes nao-ionicos, como Brij-35 ou Triton X- I00, po-dem ser usados para diminuir a carga efetiva do SDS. Comoresultado, e possfvel modular 0 tempo de analise pela escolhada concentracao do surfactante nao-idnico, sem recorrer a urnaumento de campo eletrico, Qutros surfactantes sao escolhidos

tendo em vista determinados efeitos. Urn exemplo relevante e 0uso dos sais de bile. A estrutura molecular destes agregadosdifere grandemente da proporcionada pelos surfactantes de ca-deia alifatica longa. Alern de apresentarem uma cavidade menoshidrof6bica que as de SDS, 0 que e particularmente interessantepara a separacao de solutos fortemente apolares, as micelas desais de bile sao iiteis nas separacoes quirais. A separacao decorticoester6ides em micelas de sais de bile e apresentada nafigura lOB. Urn exemplo importante do poder de resolucao ob-tido pelo uso de ciclodextrinas e ilustrado pela figura 10D, quemostra a separacao MECC-CD de hidrocarbonetos arornaticospolinucleares (PAH), compostos de grande impacto ambiental.1.3. Eletroforese Capilar em Gel

A eletroforese capilar em gel (capillary gel electrophoresis,CGE) tern sido extensivamente utilizada na separacao de com-postos de carater ionico e alta massa molecular':". Neste tipo deeletroforese, os solutos migram atraves de uma estruturapolirnerica, sendo mais ou menos impedidos em seu percurso,de acordo com 0 seu tamanho, processo este conhecido comopeneiramento (Figura I I). Macrornoleculas, tais como oligonu-c1eotfdeos, fragmentos de DNA e protefnas de alta massamolecular, nao podem, de fato, ser separadas sem este tipo dematriz. Nestas rnoleculas, a razao entre a massa e a carga (m/z)nao varia com 0 aumento da massa molecular. Sendo assim, amobilidade permanece a mesma, nao havendo discriminacaotemporal e/ou espacial dos oligomeros em urn sistema de eletro-forese em solucao livre. A restricao seletiva na passagem demoleculas de diferentes tamanhos pela matriz polimerica e 'por-tanto condicao necessaria para a separacao ocorrer.Geis sao estruturas porosas, em que urn componente t1uido eimobilizado numa rede polirnerica. As cadeias de urn polfrneropod em ser interligadas por process os ffsico-qufmicos (ligacoescovalentes, interacoes de Van de Waals) definindo os geis quf-mieos, e/ou emaranhadas mecanicamente (geis ffsicos oupolfmeros enovelados). Numa classificacao mais rigorosa, osgeis qufmicos sao compostos apenas de partfculas coloidaisliofflicas, e.g. poliacrilamida, enquanto que os col6ides liof6bi-cos sao melhor designados como s6is, e.g. agarose. A distanciamedia entre as ligacoes, distribuicao dos pontos de ligacao econteiido Ifquido govern am 0 tamanho e a distribuicao dos po-ros no gel. Uma vez formados, os geis sao estruturas delicadas,sujeitas a mudancas de morfologia pela a~ao da temperatura,pH, forca ionica e concentracao do meio. Portanto, as condlcoesem que urn gel e preparado e manipulado devem ser rigorosa-mente controladas, pois afetam nao s6 a diferenciacao de mole-culas com diferentes massas moleculares, como tambern a con-sistencia dos resultados analfticos,

Tradicionalmente, os geis empregados em eletroforese deplaca (slab gel) eram produzidos ill situ pela polimerizacao depoliacrilamida com urn agente apropriado, ou pela gelatinizacaode uma solucao aquecida de agarose, em meio tamponado. Estesgeis eram entao moldados em blocos de aproximadamente 0,2 a5 mm de espessura ou colocados em tubos com 0,5 a 10 mm dedifimetro. Durante a eletroforese, os solutos eram separados embandas, sendo que moleculas pequenas percorriam distancias

Aditivo Funcao e/ou EfeitoTabela 4. Aditivos de eletr6lito comumente empregados em eletrocrornatografia micelar.

CiclodextrinasSais de BileSolventes OrganicosSurfactantes nao-ionicosUreia

Fase complexante auxiliar. Empregadas nas separacoes quirais.Cavidade micelar moderadamente hidrof6bica. Empregados nas separacoes quirais.Ajuste do coeficiente de particao do soluto. Alteracao da seletividade.Formacao de micelas mistas. Promo vern separacoes mais rapidas,Solubilizacao de protefnas, DNA, hidrocarbonetos e aminoacidos, Propicia 0 aumentodo intervalo de eluicao,

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B6

A

Bl

o 10 15

B .cc:ocj.o.

u12 16 20 mt n

cc,

c,

6 10 14 m in

D

. . ~:i20 m in 600

Figura 10. Aplicllr'le.~ reprcscntativas da eletrocromatografia micelar. (A) Eletroferogramu de vitaminas em tampiio de borato 50 mmol L'I, NaCI20 mmol t:' e SDS 50 mmol t:', pH 9,1; 200 11m; r el32, aduptado; (B) Eletroferogramu de corticoesteroides em tampiio de borato lOa mmol L'1 em presenya de um sal de bile (colato) lOa mmol L' ,pH fI,45; 254 nm; ref . 33, adaptado); (C) Eletroferograma de pesticidas em tampiio defosfato12 mmol L' , borato fI mmol L'I e SDS 100 mmol t:', pH fI,9; ref. 34, aduptado; (D) Eletroferogramu de hidrocarbonetos aromdticos policicl icosem tampiio de borato lOa mmol L'I, ureia 20 mmol L:', y-ciciodextrina 20 mmol t:' e SDS 100 mmol t:', pH 9; ref. 35, aduptado.

~o

( y . .\( I I,\. t - +

Figura 11. Reprcsentacdo esquenuitica da mignufio de solutos de mobilidudesemelhante em uma matriz porosa till ausencia defluxo eletroosmotico.

majores. Apes a separacao, as band as eram visualizadas atra-yes de tecnicas de tingimento.

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No formate capilar, a eletroforese em gel faz uso de polfmerosIineares (poliacrilamida, metilcelulose, derivados de celulosehidroxilada, polivinilalcool, dextran), polfmeros com ligacoes cru-zadas, do tipo covalente (poliacrilamida. bis-acrilamida) ou pon-tes de hidrogenio (agarose) e polfrneros enovelados (oxide depolietileno). Apesar do uso indiscriminado de geis depoliacrilamida, e importante observar que na pratica, tais gelsexibem como inconveniente, a instabilidade hidrolftica. Por estarazao, 0 usa destes geis e Iimitado a intervalos restritos de pH,e mesmo em pH relativamente moderados, a hidrolise ocorre,Iimitando a vida iitil do capilar.

A implernentacao da tecnologia para fabricacao de capilarespreenchidos com gel confrontou-se com varies problemas, Pri-meiramente, ocorria 0 fenomeno de encolhimento do polfmerodurante 0 processo de fabricacao no interior do capilar, 0 quegerava rupturas na estrutura final do gel. Estas rupturas estrutu-rais formavam bolhas de ar, que eventual mente causavam inter-rupcao da corrente eletrica durante a eletroforese. Outro aspectorelacionava-se com 0 usa de altas voltagens, Nestas condicfies,

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o tluxo eletroosmotico era suficientemente forte para arrastar 0gel para fora do capilar. Por este motivo, 0 uso de agarose nafabricacao de capilares foi logo descartado, porque alem dobaixo ponto de fusao, agarose con tern grupos ionizaveis, capa-zes de gerar fluxo eletroosmotico.

Em 1987, B. L. Karger e A. S. Cohen31i.37apresentaram so-lucoes para ambos os problemas, descrevendo, em duas paten-tes, a fabricacao detalhada de capilares preenchidos com gel. 0metoda de Karger e Cohen consiste num pre-tratamento do ca-pilar com 0 reagente 3-metacriloxi-propil-trimetoxi-silano. Estereagente tern dupla finalidade: elimina 0 tluxo eletroosmoticoatraves de uma ligar;:ao covalente com os grupos silanol da su-perffcie capilar e evita a extrusao do gel durante operacao dosistema, atraves da ligar;:ao co valente com 0 gel a ser formadona etapa seguinte. 0 capilar e entao preenchido com uma solu-r;:ao tamponada do monornero (acrilamida e N,N-metilenobisa-crilamida), catalisador (persulfato de arnonio) e N,N,N' ,N'-tetrametiletilenodiamina. As extremidades do capilar sao imersasem solucao tampao e a polimerizacao do gel ocorre in situ,apos algumas horas. Outras variacoes deste procedimento depolimerizacao e revestimento do capilar foram desenvolvidasposteriormente. E interessante mencionar urn procedimento queenvolve a aplicacao de pressao para comprimir a solucaopolimerizante dentro do capilar e evitar a formacao de bolhas efraturas na estrutura polimerica final ".De forma geral, os capilares empregados em eletroforese comgel estao limitados a diametros de 50 a 100 urn e comprimentosde 15 a 40 cm. A introducao de amostra e feita exclusivamentepelo metodo eletrocinetico" e 0 uso de urn padrao interno e re-comendavel durante analise. A restricao de diametro e devida aaspectos praticos da fabricacao dos capilares con t endo gel. 0comprimento do capilar e escolhido em funcao da concentracaodo poifmero. Urn aumento da concentracao do polfrnero permiteo uso de capilares mais curtos. No entanto, esta pratica diminuio intervalo efetivo para a separacao ocorrer. Numa placa de gel,os solutos percorrem uma distancia caracterfstica, inversamenteproporcional 11rnassa molecular, em urn tempo pre-estabelecido.Contrariamente, em urn capilar, todos os solutos devem percor-rer uma distancia fixa, para efeito de deteccao, e espera-se queisto ocorra em tempos distintos. Desta forma, se a velocidadedos solutos e diminufda pelo aumento da resistencia do gel, 0tempo de analise pode se tornar inconvenientemente longo. Poroutro lado, se 0 comprimento do capilar e diminufdo considera-velmente, os solutos podem atingir 0 detector sem que a separa-~ao tenha ocorrido.

Con forme discutido anteriormente, uma das principais van-tagens de realizar separacoes eletroforeticas em urn capilar eque 0 seu formato possibilita a dissipacao eficiente do calorgerado pelo efeito Joule. Em CGE, esta vantagem e duplamen-te verificada, em razao da geometria do capilar e das proprie-dades anti-convectivas do gel. 0 limite pratico do uso de altasvoltagens e a propria integridade ffsico-qufmica do gel. A ope-ra~ao prolongada sob altas tensoes pode levar a rupturas darede polimerica, ocasionando a formacao de bolhas de ar e,eventual mente, a interrupcao da corrente eletrica. A vida utildos capilares preenchidos com gel esta em torno de 20 h a 300Y ern . Para muitas aplicacoes isto equivale a 50 injecoes deamostra. Para melhores resultados, a extremidade do capilarpreenchido com gel deve ser cortada uniformemente e tamberndeve-se evitar a desidratacao do gel, quando 0 capilar nao es-tiver em uso.

Outra dificuldade associada com os capilares preenchidoscom gel e a diferenca de coeficientes de expansao termica entreo gel e a sflica fundida, material cornu mente usado na fabrica-r;ao de capilares. Com 0 aumento da temperatura interna nocapilar, durante a operacao do sistema, ocorre uma expansaode volume do gel. Nestas condicoes, urn grande stress podeocorrer, com possfvel destruicao da integridade do gel, inclusi-ve provocando 0 deslizamento do material, criando lacunas no

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interior do capilar. Este fato limita a temperatura de operacaode capilares preenchidos com gel a valo res inferiores a 40"C.A figura 12 apresenta uma serie de aplicacoes representati-

vas da eletroforese capilar em gel. Urn exemplo interessantedeste tipo de eletroforese e a possibilidade de determinacao damassa molecular. Na separacao apresentada pela figura l2A,protefnas, independentemente de sua forma inicial, sao previa-mente denaturadas com dodecilsulfato de sodio (SDS) e se trans-formam em bastoes alongados. Uma vez que uma quanti dadeconstante de SDS e introduzida por unidade de massa molecular,a razao mlz de cada protefna e identica. Assim sendo, a discri-minacao das protefnas durante a migracao eletroforetica e base-ada apenas em diferencas de tamanho. E possfvel construir umacurva de calibracao com pad roes de protefnas de massamolecular conhecida, onde 0 logaritmo da massa molecular va-ria com 0 tempo de migracao. A massa molecular de uma pro-tefna pode entao ser obtida, pela medida do seu tempo de mi-gracao no mesmo eletrolito e nas condicoes de operacao em queas protefnas padrao foram determinadas, e posterior interpolacaona curva de calibracao.II. FOCALIZA


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2 4 6 8 10 min 12 10 min 20'"M'" c D

N~,,00~ . . . . , ~co r1 ~~M0N coN; : : :


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A

pH

concentracao do anf61ito

concenfracao do anf61ito

DISTANCIAFigura 14. Evoludio do gradiente de pH e perfil da concentraciio dosanfolitos, ao longo do capilar, antes (A) e depots (8)da etapa dejllcalil.ar;iio.

como tal, enquanto 0 campo eletrico existir. Se uma moleculado soluto (representada pelo sfmbolo na Figura 15), pertencen-te a uma banda ja focalizada, difunde em direcao a solucaocircunvizinha ela imediatamente adquire carga, perdendo ouganhando pr6tons. Adquirindo carga, a molecula novamentemigra, por eletroforese, em direcao ao eletrodo de carga oposta,retornando portanto a banda original. Este efeito de auto-focalizacao gera band as extremamente finas, conferindo afocalizacao isoeletrica altfssima eficiencia e urn grande poderde resolucao.Uma vez que os solutos s6 podem ser monitorados durantesua passagem pelo detector, e a posicao do detector e fixa, epreciso mobilizar as bandas estacionarias ate 0 detector, semque haja perda da resolucao obtida durante a etapa previa defocalizacao. A mobilizaciio pode ser conseguida atraves da apli-cacao de pressiio (rnobilizacao hidrodinamica) ou de voitagem(rnobilizacao eletroforetica), Neste ultimo caso, a adi~iio de urnsal ao reservat6rio con tendo 0 an6lito ou cat6lito se faz neces-saria. A mobilizacao eletroforetica e em geral preferida porqueperda de resolucao das band as pre-focalizadas e comparativa-mente menor.

A figura 16 ilustra a etapa de mobilizacao eletroforetica nasdirecoes cat6dica e an6dica. A mobilizacao cat6dica e usual-mente selecionada, a menos que na amostra existam compostosmuito acidos, 0 processo de rnobilizacao ocorre por imposicaoda eletroneutralidade. No estado estacionario, a seguinte condi-~iio e satisfeita:

(13)onde CH+, Cow, CSH+ e CA- representam as concentracoes

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DISTANCIApH alto pH baixo- - - , ) ~ . 1 . ....0('----- ~+

Figura 15. Focaliml',io de 11/11 soluto anfoterico em um gradiente de pH.

catodo anodoe E 8.. .NaOH mobiliza~o cat6dicaNaCI H3Pq.OH- H+

catodo anodo

e ~ E 8NaOH mobiliza~o an6di';;; H3P04OH- + NaCI~H

._ Na+Figura 16. Mobi/izar;i io eletroforetica cauidica e anodica por adir;iio deum sal inerte (NaCI).

molares de todas as especies ionicas presentes na mistura deanf6litos. Se urn sal do tipo X m Yn e adicionado ao cat6lito, aequacao de balance de massa e alterada para:

(14)onde CYm _ e a concentracao molar do anion e m' representa suacarga. 0 anion adicionado compete com OH- em sua eletromi-gracao para 0 interior do capilar. Em decorrencia desta compe-ti~iio, uma quantidade menor de hidroxilas entra no capilar, eportanto 0 pH decai, Solutos que ja estavam focalizados no pHigual ao pI tornam-se cationicos com a diminuicao local de pH,e comecam a migrar na direcao do catodo. Para mobilizacaoan6dica, a seguinte expressiio e valida:

(15)onde CXn+ e a concentracao molar do cation adicionado e n"represent a sua carga. Aqui, 0 cation X'" compete com H+ du-rante eletromigracao para 0 interior do capilar, e, conseqiiente-mente, 0 pH aumenta. Solutos previamente focalizados tornam-se anionicos e migram na direcao do anodo. 0 contra-ion do salusado na mobilizacao eletroforetica, 0 cation s6dio no exemplo

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da mobilizacao cat6dica e 0 anion cloreto no exemplo damobilizacao an6dica, niio influencia 0 processo de mobilizacao,porque ele permanece no reservat6rio do cat6lito e an6lito, res-pectivamente, sob a a~iio do campo eletrico, Aumentando-se aconcentracao do sal, 0 processo de mobilizacao e acelerado, como prejufzo de que as bandas podem ser deformadas em raziio docalor gerado pelo efeito Joule.Urn aspecto operacional interessante da focalizacao isoeletri-ca decorre da maneira pel a qual os solutos sao introduzidos nocapilar. Uma vez que os solutos sao dissolvidos na solucao deanf6litos, e possfvel introduzir grandes volumes de amostra,comparativamente a outras tecnicas eletroforeticas. 0 tlnico fa-tor limitante e a solubilidade do soluto nestas solucoes, Esteprocedimento permite a analise de amostras bern dilufdas, 0 quefaz da focalizacao isoeletrica urn me todo especial mente atrativopara a analise de quantidades minutas. Em geral, na pratica deClEF, capilares revestidos sao empregados, com duas finalida-des principais: supressao do fluxo eletroosm6tico, que perturba-ria a etapa de focalizacao e, para minimizar a adsorcao de pro-teinas, solutos alvo deste tipo de separacao.

A figura 17 apresenta duas aplicacoes representativas daeletroforese capilar por focalizacao isoeletrica: a separacao devariantes da hemoglobina em dois gradientes de pH. A hemo-globina total de uma pessoa adulta e geralmente composta de98% hemoglobina tipo A, 2-3% tipo A2 e 1% tipo F. Uma seriede patologias tern sido relacionadas com mutacoes genetic as quegeram diferentes tipos de hemoglobinas (S e C) e/ou alteram asporcentagens normalmente encontradas para os tipos A e F. Aeletroforese capilar por focalizacao isoeletrica e uma tecnica po-derosa, que pode fornecer informacao tanto sobre a pureza dahemoglobina, como auxiliar na sua tipagem atraves da indica-~iio do ponto isoeletrico. 0 ponto isoeletrico de uma protefnapode ser determinado pela comparacao de seu tempo demobilizacao com os tempos de mobilizacao de protefnas de piconhecidos. No exemplo da figura 17A os pi sao: hemoglobinatipo A2 = 7,37, tipo S = 7,12, tipo A = 6,94, e na figura 178,hemoglobina tipo A = 6,99, tipo F = 7,05, tipo S = 7,17 e tipoC =7,40.III. ISOTACOFORESE CAPILAR

A instrumentacao necessaria para a realizacao de isotacofo-rese capilar (capillary isotachophoresis, CITP) e comercializada

'" A. . . ." " .,; N~'" " "~ ~ ~"- -s "-z ~ ~" ~'" "- " -o.~o "-> ~s: v "-c ~. g'U -o" " C > '": c.0 _ g C s: l ~ u '"0 .0 C U

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desde os meados dos anos 70. A literatura na area e vasta, con-tando com varies livros, imimeros artigos de revisao e diversascornpilacoes de simp6sios44-47. Apesar de todo este suporte teo-rico e instrumental, a isotacoforese niio tern sido elegida, noslaborat6rios mundiais, como uma tecnica de rotina, especial-mente nos Estados Unidos, onde e muito pouco difundida. Emcertas partes da Europa, como na Republica Tcheca, e em menorextensiio na Holanda, a isotacoforese e uma ferramenta analfticaimportante, tendo sido empregada na separacao e preparo de dro-gas, na avaliacao de alimentos e amostras ambientais, alern demuitas outras aplicacoes significativas. No Japiio, a utilizacao maiscomum da isotacoforese e de carater academico, como na deter-minacao de mobilidades eletroforeticas e constantes de equilfbrio,fornecendo extensas compilacoes de dados'", bastante uteis emestudos de otimizacao de condicoes analfticas.

Ao contrario da eletroforese de zona, em isotacoforese, 0sistema de eletr61ito e heterogeneo. A amostra e inserida entreduas solucoes, cuja mobilidade ionica e criteriosamente selecio-nada, 0 eletr6lito lider e 0 eletr6lito terminador. Tanto solutoscationicos como anionicos podem ser analisados por est a tecni-ca, desde que em misturas distintas, definindo assim, a chamadaCITP cationica e a CITP anionica, respectivamente. Para ossolutos basicos, com pKa elevados, 0 modo cationico e 0 maisindicado, enquanto que 0 modo anionico e recomendado parasolutos acidos.

A escolha dos eletr61itos e de importancia critica para 0 suces-so das separacoes isotacoforeticas, Na analise de cations, comoesquematizado na figura 18, 0 eletr6lito Ifder deve conter urncation cuja mobilidade seja superior a mobilidade de qualquercation presente na amostra. Ja 0 eletr6lito terminador deve contero cation de menor mobilidade. Na analise de anions, 0 mesmocriterio deve ser praticado, sendo que, neste caso, e a mobilidadedo anion, 0 fator a ser considerado na escolha dos eletr6litos Ifdere terminador. Solutos com mobilidade superior a do Ifder niio saoseparados por CITP; estes migram mais rapidamente que 0 Ifdere seguem portanto, 0mecanismo de separacao por eletroforese dezona. Por outro lado, a escolha de urn terminador moderadamenterapido remove, do isotacoferograma, os componentes da amostracom mobilidade inferior, sendo assim, uma maneira elegante dediscriminar, na amostra, os solutos indesejaveis. A tabela 5 apre-senta a composicao de alguns sistemas de eletr6litos comumenteempregados em CITP. Alguns aditivos como hidroxi-isopropilmetilcelulose (HPMC), polietileno glicol (PEG), polivinil

. . .A:r B

UA:r

3 8 13Figura 17 . Andlise dos variuntes du Ilelllo!j!o/Jillil humuna tipo A2 A e S em urn gradiente de pH 3-10 (A) e tipo A , F, See em 1 1 1 1 1 gradiente depH 5-11(B). Mistura de anftilitos: Profocus 'M ; ref 43, adaptado.

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alcool, Triton X-I 00 e Brij 35 sao em geral escolhidos para au-xiliar a solubilizacao de certos solutos, ou como m odi fi cadoresdo tluxo eletroosmotico.

A isotacoforese possui duas caracteristicas marcantes: a exis-tencia de urn estado estacionario, em que todas as bandas mi-gram com a rnesrna velocidade, e 0 fato de que cada banda eessencialmente focalizada. Quando 0 campo elet rico e aplicado,diferentes gradientes de potencial evolvem em cada banda (Fig.18, tracado inferior), de tal forma que todos os solutos eventu-almente migram com velocidades identicas, i.e., com a veloci-dade isotacoforetica, Vi tp ' Em regioes onde cations de menormobilidade estao presentes, 0 campo eletrico e mais intenso.Estes solutos, entretanto, movem-se com a mesma velocidadeque os solutos de maior mobilidade, submetidos a campos ele-tricos mais fracos, Portanto, as velocidades das bandas indivi-duais sao auto-normalizadas:Vi tp = !!L EL = !!SI ESI = !!S2 ES2 = !!S3 ES3 = = !!TET (16)onde os Indices L, SeT denotam os Ions do lfder, solutos eteminador, respectivamente. A capacidade de picos das separacoes

CampoEh~tricoLocal

Figura 18. Rcprescntucdo esquenuitica da migracdo de solutos cati/ ini-CIIS. SII ' pllr isotacoforese capilur na aussncia de fluxo eletroosmtitico.o eletrolito lider if L. II terminador if Tea velocidade isotucoforeticaeVilI"

isotacoforeticas e apreciavelmente grande, uma consequenciada maneira pela qual as bandas migram, adjacentes uma asoutras, mantendo a continuidade eletrica.

A focalizacao das bandas em isotacoforcse e tambern resul-tante da normalizacao da velocidade. Se urna molecula do solutoatinge, por difusao, uma banda subsequente, onde prevalece umcampo eletrico menor, sua velocidade e decrescida e a molecularetorna a banda original. Da mesma forma, se uma moleculadifunde para a banda precedente, onde existe urn campo eletricomais intenso, sua velocidade de migracfio e momentaneamenteaumentada e a molecula alcanca a banda de origem. Na figura18, a auto-focalizacao da banda S2 e representada por duas fle-chas diametralmente opostas.Em CITP e comum a elirninacao do fluxo eletroosmotico,embora nao necessaria. Os capilares tipicamente usados sao desilica fundida ou teflon, com diametros apreciavelrnente maio-res que os empregados em eletroforese de zona (c.a. 500-800urn), dado 0 aspecto focalizante da tecnica. A injecfio de amos-tra pode ser realizada tanto pelo metoda hidrodinamico quantaeletrocinetico '. A analise isotacoforetica e em geral realizadasob corrente constante. Nestas condicoes, quando os solutos demenor mobilidade sao introduzidos no capilar, a voltagern au-menta proporcionalmente, permitindo assim a na lis e s ra pid as ,sem os problemas relacionados com 0 aquecimento pelo efeitoJoule. Alternativamente, a separacao pode ser conduzida sobvoltagem con stante, no entanto, com 0 prejufzo de um tempo deanalise prolongado.

A figura 19 apresenta esquemas de separacao para cations eanions por isotacoforese capilar, Na CITP cationica, a ordemde migracao dos solutos e identica, seja na presenca (Fig. 19A)ou ausencia de tluxo (Fig. 19B). 0 capilar e inicialmente pre-enchido com 0 eletrolito lfder e, apos injecao da amostra, aseparacao e efetuada com 0 eletrolito terminador. A polaridadeda fonte de alta tensao e positiva na extremidade do capilaronde e feita a injecao de amostra. Nestas condicoes, a veloci-dade isotacoforetica e velocidade eletroosmotica, se existir, saodirecionadas ao catodo (aterrado). Na separacao de anions empresenca de tluxo (Fig. 19C), a situacao e diferente: 0 tluxoeletroosmotico continua direcionado ao catodo, mas a veloci-dade isotacoforetica e dirigida ao polo oposto. Neste caso, 0capilar deve ser preenchido inicialrnente com 0 eletrclitoterminador, sendo a corrida feita com 0 lfder, A polaridade per-manece positiva na extremidade de injecao, Uma vez que a ve-locidade eletroosmotica ultrapassa a velocidade isotacoforetica,

CITP Cati6nicaTabela 5. Cornposicao de alguns sistemas tampao comumente empregados em isotacoforese capilar.?"

fon do liderContra-Ion do lfderpH do lider

HCI 10 mmol L-I2,0

KOAc 10 mmol L-IHOAc4,5

fon do terminadorContra-Ion do terminadorpH do terminador

TRIS 10 mmol L-IHCI8,5

HOAc 10 mmol L-I

CITP Ani6nicafon do lfderContra-Ion do IfderAditivopH do lfder

HCI 10 mmol L-Ip-alanina

0,2% HPMC3,3

HCI 10 mrno l L-IL-histidina0,2% HPMC6,0

HCI 10 mmol L-IAmmediol

0,2% HPMC8,8fon do terminador A c . Caproico10 mmol L-I MES10 mmol L-I p-alanina10 m m ol L-I

Ba(OHhontra-Ion do terminador TrispH do terminador 6,0 9,0Ammediol: 2-amino-2-metil-I,3-propanodiol; HPMC: hidroxipropil-metil-celulose; MES: addu 2-[N-morfolino] etanossulfonico; TRIS:Tris(hidroximetil)amino metano

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A

B

c INJECAOT

TT

D

Figura 19. Mi!ll'll{'tio isotacojorctica catodica (A. B) e anodicu (C, D) em capilares tie silicafundida (A. C) e teflon (B. VJ.

os solutos, embora ani6nicos, migram em direcao ao catodo, atin-gindo 0 detector, em ordem decrescente de mobilidade. Na CITPani6nica sob tluxo suprimido (Fig. 190), a amostra e injetada nacoluna ja preenchida com 0 eletr6lito Ifder. Apenas a polaridadeda fonte deve ser invertida, isto e, negativa na extremidade de.injecao, para que os solutos sejam conduzidos ao detector.

Muito embora existam instrumentos especiais para isotaco-forese, esta pode ser praticada em equipamentos convencionaisde eletroforese capilar, que na maioria utilizam detectores6pticos baseados na medida de absorbancia na regiao do UV-Vis. Cabe salientar aqui, que recentemente foi introduzido nomercado, urn equipamento para eletroforese capilar comdeteccao em Iinha por condutividade eletrica'", que portanto,tam bern pode ser utilizado para isotacoforese.

Eletroferogramas gerados por isotacoforese capilar diferemdos tracados tipicamente obtidos por outros metodos eletrofore-ticos. Quando a deteccao por condutividade e empregada (Figu-ra 20), 0 registro do sinal decresce por degraus, onde cadaplateau representa uma das bandas. Assim, no infcio da corrida,a condutividade e alta devido a presenca do eletr6lito lfder, quecontern os fons de maior mobilidade, decresce com a passagemdos solutos, e final mente estabiliza em urn valor mfnimo, cor-respondente a condutividade do eletr6lito terminador, que nofinal da corrida preenche total mente 0 capilar. A informacaoanalitica provern da largura da banda, que e proporcional a con-centracao original do soluto na amostra, e nao da altura ou areados picos como nos demais metodos de separacao analogos. Urnaspecto interessante da isotacoforese sob corrente constante eque, cada banda, ao atingir 0 estado estacionario, apresenta aconcentracao do eletr6lito lfder. Assim, solutos inicialmentemen os concentrados na amostra apresentam, no capilar, band ascontrafdas, enquanto que os mais concentrados apresentam ban-das expandidas. Uma vantagem proeminente da isotacoforesecapilar e a pre-concentracao de arnostras dilufdas, capacitando atecnica para a analise de traces.o tracado nao usual dos isotacoferogramas pode gerar equf-vocos na identificacao dos solutos. Aqui, 0 tempo de migracaonao e inforrnativo da identidade provavel do soluto, outra dife-renca marcante em relacao aos outros metodos eletroforeticos.Desta forma, a ordem de passagem dos solutos pelo detector naose relaciona com a cornposicao qualitativa da amostra. Por exem-plo, quando componentes que nao estao presentes no padrao,aparecem na amostra, a ordem relativa das band as e alterada.Este fato contribui para que 0 desenvolvimento de metodologiaem isotacoforese seja considerado mais complexo, quando com-parado a eletroforese de zona em solucao livre, onde 0 conheci-mento da composicao da amostra nao e tao crftico.A figura 21 apresenta urn isotacoferograma tfpico de urnamistura de amino-acidos, mostrando dois tracados, 0 de condu-tividade e 0 de absorbancia. E interessante observar que apenas


wos~t--::JoZoohder

soluto concentrado/'~ soluto dlluido

terminador

TEMPOFigura 20. lsotacoferograma COlli registro temporal till condutividade.

dois dos solutos da mistura sao visualizados no registro de absor-bancia: Nsbenzoil-alanina e acido benz6ico. Assim sendo, os de-mais solutos podem ser usados como espacadores, Espacadoressao compostos que nao apresentarn absorbancia no comprimentode onda selecionado para a analise, e possuem uma mobilidadeintermediaria ados solutos que se deseja separar, Alem de auxi-liar a resolucao de compostos de mobilidade semelhante, urnespacador pode facilitar a deteccao dos solutos de interesse eviabilizar a coleta de fracoes. Cabe ressaltar que, durante a coletade fracoes, os solutos estao isentos do eletr6lito, aspecto bastantevantajoso no preparo de drogas, por exemplo.CONCLUSAO

As analises por eletroforese capilar estao fundamentadas emmecanismos diversos de separacao, A implicacao direta destaversatilidade define 0 aspecto mais impressionante da tecnica: apossibilidade de analisar, desde fons tao pequenos como Iftio ouf1uoreto, ate estruturas de dimensoes macromoleculares, comoprotefnas e fragmentos de DNA, em uma iinica col una capilar,desde que 0 eletr6lito seja criteriosamente escolhido.AGRADECIMENTOS

Ao CNPq (bolsa de recern-doutor) e FAPESP (processos 94/4440-2 e 9512396-9) pelos auxilios concedidos. Urn agradeci-mento especial a Sra Eliana Viana Prado, desenhista do lQ-USP, pelo trabalho impecavel no tracado dos eletroferogramas.

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alaninaac, benz6ico

.9 8ttl 'Ec: ttI0 S- e c; ,BB

0 2 3 4 min

A - -- -- -- -- . carbonato (C02do ar)

Figura 21. Analise de amino-dcidos pOI" isotacoforese capilar com detecciio pOI" condutividade (trucado A) e ubsorb/inciau 254 tim (tracado B).Capilar: PTFE 30 em x 550 pm; eletrolito lider: 10 mmol t:' HC/litu/ado com ammediolapH 9.1; eletrolito terminudor: 10 mmol t:' /3-a/aninaajustudu a pll /0 com hidrtixido de btirio saturado; injeciio: 10 JlL; corrente: 210 J l A . reduzida para 60 JlA durante detecciio; ref 51. adaptado.REFERENCIAS

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eletroforese capilar (marina tavares)

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