utilizaÇÃo de eletroforese microfluÍdica na …

UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA FACULDADE DE FARMÁCIA

MESTRADO PROFISSIONAL EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS

GISELE NOGUEIRA FOGAÇA

UTILIZAÇÃO DE ELETROFORESE MICROFLUÍDICA NA DETECÇÃO DA ADIÇÃO DE SORO DE QUEIJO EM LEITE

CRU, PASTEURIZADO, UHT E EM PÓ

Juiz de Fora 2017




Dissertação apresentada ao curso de

Pós-Graduação Mestrado Profissional em

Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados

como requisito parcial para obtenção do

grau de mestre.

Orientadora: Profa. Dra. Marta Fonseca Martins

Co-orientadora: Drª Alessa Siqueira de Oliveira dos Santos

Juiz de Fora 2017




Dissertação apresentada ao curso de

Pós-Graduação Mestrado Profissional em

Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados

como requisito parcial para obtenção do

grau de mestre.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Edna Froeder Arcuri

________________________________________

Alessa Siqueira de Oliveira dos Santos

________________________________________ Marco Antônio Moreira Furtado

________________________________________

Marta Fonseca Martins

FICHA CATALOGRÁFICA

Dedico aos meus pais, que sempre

estiveram comigo nessa caminhada. Sem

eles, eu não teria concluído essa fase tão

importante na minha vida.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por tudo!

A Universidade Federal de Juiz de Fora pela oportunidade concedida para que eu

pudesse dar continuidade aos estudos e enfim me tornar mestre.

Ao Convênio Embrapa - Monsanto, financiador do projeto, que possibilitou a

realização deste trabalho.

A minha orientadora, Marta Martins, mais uma vez, por ter acreditado no meu

potencial e por todos os conselhos dados, principalmente, nas ocasiões mais

estressantes e confusas.

A minha co-orientadora, Alessa Siqueira, que mais que isso, se tornou uma pessoa

exemplar na minha vida, pelo profissionalismo e pelo caráter.

Aos outros integrantes do Laboratório de Genética Molecular da Embrapa Gado de

Leite que contribuíram, de alguma forma, para a conclusão do mestrado.

Aos colegas e companheiros de aula, que juntos, fazíamos tudo parecer mais fácil.

Aos meus pais por todo apoio oferecido durante a minha caminhada acadêmica e

mais que isso, na minha formação como pessoa.

À Keli, minha chefe no trabalho, pela compreensão que proporcionou a minha

liberação da função nos períodos de aula. E por todos os ensinamentos.

Às minhas colegas de trabalho Rosimar e Carol, que de alguma forma também me

ajudaram.

As minhas amigas Daiana Machado e Tatiane Tagliatti, que me ajudaram, me

escutaram e tornaram meus dias muito mais divertidos.

Ao Fernando David, pela amizade e pelo companheirismo, que sempre me

incentivou para a conclusão do mestrado, mesmo com tantos percalços.

RESUMO

Fraudes em lácteos é um problema do ponto de vista econômico, já que traz

prejuízos ao consumidor, e em alguns casos, são caracterizadas como um problema

de saúde pública, visto que essas podem reduzir os componentes nutritivos originais

do alimento ou mesmo provocar contaminação microbiológica, química ou física. Por

este motivo, metodologias que visam a comprovação da autenticidade dos produtos

lácteos têm sido desenvolvidas. Desse modo, este trabalho teve como objetivo

avaliar o método lab-on-a-chip para a detecção de fraude em leite de vaca pela

adição de soro de queijo. Sendo assim, amostras de leite cru, pasteurizado, UHT e

em pó foram adicionadas com soro de queijo, simulando este tipo de fraude, em

níveis crescentes 0; 1; 2,5; 5; 10; 20; 30; 50% (v/v). Todas as amostras foram

submetidas a eletroforese lab-on-a-chip e SDS-PAGE com o objetivo de detectar

fraude. Os resultados obtidos utilizando as duas metodologias foram satisfatórias

quanto a separação e quantificação das proteínas do leite. Somente foi possível

detectar a fraude a partir de 1% de adição de soro de queijo para os quatro tipos de

leite testados pela técnica lab-on-a-chip. Com base nestes resultados, conclui-se

que esse método pode ser aplicado como um mecanismo de triagem para a

detecção de fraude em leite nas rotinas em laboratórios da indústria. Entretanto

ressalta-se que a técnica lab-on-a-chip deve ser submetida a um processo de

validação de metodologia para que possa ser utilizada na rotina em laboratórios de

qualidade do leite.

Palavras-chave: fraude em leite, eletroforese, lab-on-a-chip, qualidade do leite.

ABSTRACT

Dairy fraud is a problem from the economic point of view, since it causes harm to the

consumer and in some cases is characterized as a public health problem, since

these frauds can reduce the original nutritional components of the food or even

cause microbiological contamination, chemical or physical. For this reason,

methodologies aimed at proving the authenticity of dairy products have been

developed. Therefore, this work aimed to evaluate the lab-on-a-chip method for the

detection of fraud in cow's milk by the addition of cheese whey. Therefore, samples

of raw, pasteurized, UHT and powdered milk were added with cheese whey,

simulating this type of fraud, at increasing levels 0; 1; 2.5; 5; 10; 20; 30; 50% (v/v). All

samples were submitted to lab-on-a-chip electrophoresis and SDS-PAGE with the

aim of detecting fraud. The results obtained using the two methodologies were

satisfactory regarding the separation and quantification of milk proteins. It was only

possible to detect fraud from 1% addition of cheese whey to the four milk types

tested by the lab-on-a-chip technique. Based on these results, it was conclude that

this method can be applied as a screening mechanism for the detection of milk fraud

in routines in industry laboratories. However, it is emphasized that the lab-on-a-chip

technique must be submitted to a methodology validation process so that it can be

used routine in milk quality laboratories.

Keywords: milk fraud, electrophoresis, lab-on-a-chip, milk quality.

LISTA DE SIGLAS

α - CN Alfa Caseína α - LA Alfa Lactoalbumina β - CN Beta Caseína β - LG Beta Lactoglobulina BSA Albumina Sérica Bovina

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CMP Caseinomacropeptídeo DBO Demanda Bioquímica de

Oxigênio

DIPOA Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal

DTT Ditiotreitol GMP Glicomacropeptídeo

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Ig’s Imunoglobulinas κ - CN Kappa Caseína kDa Quilodalton Kg Quilograma L Litro

LANAGRO Laboratórios Nacionais Agropecuários

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Met Metionina μL Microlitro mA Miliampere NANA Ninhidrina Ácida ou Ácido

Siálico Nm Nanômetro

RIISPOA Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal

SDS Dodecilsulfato de Sódio TCA Ácido Tricloroacético

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 12

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 14

2.1. COMPOSIÇÃO DO LEITE ............................................................................................ 14

2.2. COMPOSIÇÃO DO SORO DE QUEIJO ....................................................................... 16

2.3. FRAUDES EM LEITE.................................................................................................... 19

2.4. METODOLOGIAS PARA A DETECÇÃO DE FRAUDES EM LEITE .............................. 21

2.4.1. Eletroforese convencional.................................................................................... 22

2.4.2. Eletroforese lab-on-a-chip ou eletroforese microfluídica ...................................... 24

2.4.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ................................................. 25

3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 27

3.1. OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 27

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 27

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 27

4.1. AMOSTRAS DE LEITE E SORO DE QUEIJO .............................................................. 27

4.2. PROTEÍNAS-PADRÃO ................................................................................................. 28

4.3. PREPARO DAS SIMULAÇÕES DE FRAUDE NAS AMOSTRAS DE LEITE ................. 28

4.4. QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS PELO MÉTODO

DE BRADFORD ................................................................................................................... 29

4.5. PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE LEITE FRAUDADAS ......................................... 29

4.6. ELETROFORESE CONVENCIONAL EM SDS-PAGE .................................................. 29

4.6.1. Preparo das amostras ......................................................................................... 29

4.6.2. Corrida eletroforética ........................................................................................... 30

4.6.3. Coloração dos géis .............................................................................................. 30

4.7. ELETROFORESE LAB-ON-A-CHIP.............................................................................. 31

4.8. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................. 32

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 33

5.1. COMPARAÇÃO ENTRE O COMPORTAMENTO DAS PROTEÍNAS DOS LEITES CRU,

PASTEURIZADO, UHT E EM PÓ FRAUDADAS COM SORO, PELO MÉTODO

ELETROFORÉTICO LAB-ON-A-CHIP ................................................................................. 33

5.1.1. Análise quantitativa das amostras de leite cru fraudadas com soro de queijo ...... 34

5.1.2. Análise quantitativa das amostras de leite pasteurizado fraudadas com soro de

queijo ............................................................................................................................ 36

5.1.3. Análise quantitativa das amostras de leite UHT fraudadas com soro de queijo ... 39

5.1.4. Análise quantitativa das amostras de leite em pó fraudadas com soro de queijo . 41

5.2. QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS PROTEÍNAS DOS LEITES CRU,

PASTEURIZADO, UHT E EM PÓ FRAUDADOS COM SORO DE QUEIJO, PELO MÉTODO

ELETROFORÉTICO SDS-PAGE ......................................................................................... 43

5.2.1. Análise quantitativa obtida pela técnica SDS-PAGE para as proteínas do leite cru

fraudado com soro de queijo ......................................................................................... 45

5.2.2. Análise quantitativa obtida pela técnica SDS-PAGE para as proteínas do leite

pasteurizado fraudado com soro de queijo .................................................................... 48

5.2.3. Análise quantitativa obtida pela técnica SDS-PAGE para as proteínas do leite UHT

fraudado com soro de queijo ......................................................................................... 50

5.2.4. Análise quantitativa obtida pela técnica SDS-PAGE para as proteínas do leite em

pó fraudado com soro de queijo .................................................................................... 54

6. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 59

7. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 65

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 65

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 66

12

1. INTRODUÇÃO

O leite é o primeiro alimento dos mamíferos nos estágios iniciais da vida e as

propriedades contidas nele fornecem energia e nutrientes necessários para o

crescimento de grande parte dos animais (PRATA & PRATA, 2012). O consumo de

produtos lácteos é elevado por todo mundo e esse fato o torna objeto de ações

ilícitas que caracterizam fraude e que consequentemente, influencia em um controle

de qualidade mais exigente (CARVALHO et al., 2007).

O leite antes de chegar ao consumidor passa por vários processos que vão

desde a recepção da matéria-prima (leite cru), processamento e transporte até a

comercialização nas prateleiras dos mercados. Existe ainda, a produção de leite,

normalmente em pequenas propriedades, que é vendido livremente sem nenhum

padrão de qualidade. Durante esses passos podem ocorrer eventos que interferem

na qualidade e segurança do leite e derivados, na maioria das vezes de forma

intencional como a adição de substâncias estranhas para ganhos econômicos, por

exemplo (WANDERLEY et al. 2013).

As fraudes de natureza econômica mais comumente praticadas no leite são

adição de água, adição de substâncias neutralizantes da acidez, reconstituintes da

densidade e adição de soro de queijo (FILHO et al., 2009). Deste modo, o interesse

a respeito da autenticidade de produtos lácteos tem aumentado a cada ano, uma

vez que o leite fraudado além de perder as suas propriedades físico-químicas, pode

também ter a sua microbiota natural comprometida (AQUINO, 2013).

Fraudes com soro de queijo são bastante comuns devido a sua composição

ser semelhante a do leite. Além de seu baixo custo é produzido em grande

quantidade muitas vezes sem local apropriado para descarte. Deste modo, a

incorporação de soro de queijo ao leite é facilitada, mas, no entanto sua detecção é

dificultada pelos métodos comuns estabelecidos em legislação (CARVALHO et al.,

2007; TULLIO, 2007).

Perante a legislação brasileira, adição de soro de queijo ao leite é

considerada fraude (BRASIL, 2017) já que o leite tem suas características originais

alteradas e também devido ao fato de que o consumidor não tem acesso a este tipo

de informação. Em contrapartida, a instrução normativa nº16, de 23 de agosto de

2005 do MAPA, permite que o soro de queijo seja utilizado como ingrediente para as

bebidas lácteas. Contudo, o produto final deve ter em seu em rótulo a informação da

13

quantidade de soro adicionada, considerando que pelo menos 51% do produto final

seja composto de base láctea (BRASIL, 2005).

Na tentativa de inibir essas irregularidades, como a adição de soro de queijo

de forma inapropriada no leite, é necessária inspeção de forma eficaz por parte dos

órgãos fiscalizadores, com a finalidade de garantir a qualidade e segurança do leite,

assegurando também a autenticidade dos produtos perante aos consumidores bem

como sua saúde (WANDERLEY et al., 2013).

Para isso, muitas metodologias foram desenvolvidas para a detecção de

fraudes em leite pela adição de soro de queijo tais como a determinação do ácido

siálico também denominado como NANA (WARREN, 1959) e que mais tarde os

autores Wolfschoon-Pombo e Pinto (1985) adaptaram tal reagente, que passou a ser

chamado de reagente de Erlich; cromatografia líquida de alto desempenho por

filtração gélica (CLAE-FG) descrita por Hooydonk e Olieman (1982); eletroforese

convencional em gel de poliacrilamida (PAGE) (VILELA, 1987); CLAE em coluna de

fase reversa (CLAE-FR) (OLIEMAN; RIEL, 1989); eletroforese convencional com

dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), métodos imunológicos e moleculares, entre

outros tipos de cromatografias (GALINDO-AMAYA; VALBUENA-COLMENARES;

ROJAS-VILLAROEL, 2006; TULLIO, 2007; ROJAS et al., 2009; MARQUES et al.,

2011).

Uma nova técnica tem sido utilizada em alguns estudos para a separação e

quantificação de proteínas, a chamada eletroforese capilar microfluídica ou lab-on-a-

chip.Esse método tem sido recomendado por fornecer bons resultados, otimização

do tempo de análise e preparo de amostras, pequeno consumo de reagentes e um

limite de detecção na ordem de nanogramas de proteínas em microlitros (µL) de

amostras. Muitas pesquisas têm demonstrado resultados satisfatórios ao avaliar

perfil protéico do leite com o uso dessa metodologia (ANEMA, 2009; BUFFONI et al.,

2011; COSTA, 2014; MEURER; 2014).

Deste modo, o método lab-on-a-chip pode ser adotado como uma técnica

alternativa a técnica convencional SDS-PAGE como uma forma de triagem para a

identificação de fraude em leite pela adição de soro de queijo. Sendo assim, o

objetivo deste trabalho foi avaliar o método lab-on-a-chip para detectar fraude em

leite de vaca pela adição de soro de queijo.

14

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. COMPOSIÇÃO DO LEITE

Grande parte do leite é constituída por água e, conforme a espécie de

mamífero, ocorrem variações nas quantidades de lipídios, proteínas e carboidratos,

os quais são produzidos nas glândulas mamárias. Demais componentes como

minerais e outros compostos solúveis, são produzidos diretamente do plasma

sanguíneo (PELLEGRINI et al., 2012).

O leite de vaca é constituído por aproximadamente 87% de água e 13% de

compostos sólidos, sendo 3,9% representados pelos lipídios; 3,4% proteínas; 4,8%

lactose e vitaminas e somente 0,8% correspondente aos minerais. Esses

componentes conferem ao leite elevado valor nutricional e são determinantes nas

características de cor e sabor, além de exercerem influência na fabricação de

queijos, manteigas, iogurtes e demais derivados (REIS et al., 2012).

A Instrução Normativa (IN) nº 62, de 29 de dezembro de 2011, do Ministério

da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) define leite como:

Entende-se por leite, sem outra especificação, o produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. O leite de outros animais deve denominar-se segundo a espécie de que procede. (BRASIL, 2011).

Dentre esses componentes, as proteínas são consideradas como elementos

principais que caracterizam o leite de vaca. Basicamente, existem duas classes:

proteínas do soro, correspondendo a 20% do total de proteínas; e as caseínas,

sendo seis tipos conhecidos αs1 – alfa s1, αs2 – alfa s2, β – beta, γ – gama, κ –

kappa e λ – lambda correspondentes a 80% do total (GALINDO-AMAYA;

VALBUENA-COLMENARES; ROJAS-VILLARROEL, 2006).

Aproximadamente 50% das caseínas do leite compõem o grupo das alfa-

caseínas (α-CN), 30% o de beta-caseína (β-CN) e 15% de κappa-caseína (κ-CN). Já

a fração proteica do soro contém aproximadamente 50% de beta-lactoglobulina (β-

LG), 25% de alfa-lactoalbumina (α-LA) e os outros 25% de outras proteínas como

albumina do soro bovino (BSA), lactoferrinas, imunoglobulinas (Ig’s) (OLIVEIRA;

BRAVO; TONIAL, 2012), caseínomacropeptídeo (CMP), que é formado a partir da

15

hidrólise da κ-CN. (MARQUES et al., 2011) e é um indicador de fraude em leite pela

adição de soro de queijo (BRASIL, 2006) entre outras.

As duas classes de proteínas são diferentes química e fisicamente. As

soroproteínas são proteínas menores quando comparadas às caseínas, sua

estrutura é globular, compactas, solúveis em várias faixas de pH, termolábeis e não

coaguláveis pela renina (BOSCHI, 2006). Já as caseínas são fosfoproteínas que

conseguem manter a sua estabilidade quando ligadas a moléculas de cálcio

(MARQUES et al., 2011). Em sua forma nativa, essas proteínas se agregam em

estruturas termodinamicamente estáveis que são chamadas de micelas. Nestas

micelas, na porção hidrofóbica ficam as caseínas sensíveis ao cálcio e àquelas

insensíveis a esse mineral permanecem na parte hidrofílica; esse fato é responsável

pela estabilidade físico-química das micelas (RASMUSSEN et al., 1999).

O papel das micelas de caseínas é sequestrar partículas de fosfato de cálcio

no leite, e por este motivo, a principal fonte desse mineral na alimentação de recém-

nascidos é o leite. O deslocamento do fosfato de cálcio entre as micelas está

envolvido nos processos de mineralização dos ossos quanto no controle da

concentração de cálcio e fosfato no leite, o que evita a calcificação das glândulas

mamárias (HOLT et al., 2013).

Do ponto de vista econômico, as caseínas são as mais relevantes devido ao

seu alto valor nutritivo e suas características físico-químicas que influenciam

diretamente na fabricação diversos derivados do leite (HUPPERTZ et al., 2006;

REIS et al., 2012). Acredita-se que o processamento do leite em altas temperaturas

só é possível graças a essas proteínas, especificamente, visto que elas

permanecem estáveis quando submetidas ao calor (FOX e McSWEENEY, 1998).

De um modo geral, o papel nutricional de proteínas nos alimentos

frequentemente é estudado. Pesquisas sobre o uso de proteínas como ingredientes

funcionais é bastante difundido, como pode ser visto em produtos lácteos comerciais

entre outros alimentos que destacam o apelo funcional, que se fundamenta na

utilização de peptídeos bioativos oriundos das proteínas do leite. Ao empregar as

proteínas como propulsoras funcionais, torna-se viável para as indústrias o

desenvolvimento de novos produtos com atributos específicos, agregando valor a

subprodutos, como por exemplo, o soro de queijo, o qual muitas vezes representa

um problema para o setor industrial (OLIVEIRA; BRAVO e TONIAL, 2012).

16

Além disso, proteínas são muito utilizadas como indicadoras da legitimidade

do leite e derivados por meio de métodos de análise que visam a separação e

quantificação de proteínas como a eletroforese e outras como cromatografia,

espectrofotometria e ensaios imunológicos (MAGENIS, 2015). A adição de soro de

queijo ao leite, por exemplo, pode ser detectada pela presença de suas proteínas

específicas de forma evidenciada em um gel de eletroforese, pela identificação do

CMP por cromatografia ou ainda por características físico-químicas típicas do soro e

até mesmo por alterações de cor, odor e sabor.

2.2. COMPOSIÇÃO DO SORO DE QUEIJO

O soro de queijo é um subproduto aquoso verde-amarelado proveniente da

fabricação de queijos sendo produzido a partir da coagulação enzimática ou ácida

do leite. Conforme o tipo de coagulação podem ser gerados o soro doce que é

oriundo da coagulação enzimática e o soro ácido, o qual se dá a partir da

coagulação ácida do leite (TULLIO, 2007).

A composição e o tipo de soro varia de acordo com o queijo que é fabricado,

além de depender da técnica utilizada para o processamento, o que acarreta em

diversas mudanças nos teores de proteína, gordura e minerais (AQUINO, 2013). O

soro de queijo é composto por aproximadamente 93% de água e os 7% restantes

corresponde a matéria seca representada pela lactose, proteínas, gordura e sais

minerais.

O soro de queijo contém alto valor nutricional que é atribuído, principalmente,

as proteínas que possuem aminoácidos essenciais. Estas proteínas apresentam

importantes propriedades funcionais de solubilidade, formação e estabilidade de

espuma, emulsibilidade, geleificação, formação de filmes e cápsulas protetoras,

além de fazerem parte de um grupo proteico diversificado com características

estruturais bastante diversificadas (SGARBIERI, 2005). No quadro 1 estão listadas

as principais proteínas do soro.

17

Quadro 1 – Distribuição das principais proteínas presentes no soro de queijo oriundo da fabricação de queijos a partir de leite bovino

Proteínas do soro Concentração (g/L)

β-Lactoglobulina (β-LG) 3,2

α-Lactoalbumina (α-LA) 1,2

Albumina sérica bovina (BSA) 0,4

Imunoglobulinas (Ig’s) 0,7

Lactoferrina 0,1

Lisozima Desprezível

Proteínas totais 5,6 Fonte: Sgarbieri (2005). Adaptado.

No leite de vaca as proteínas α-LA e β-LG são as principais sendo, esta

última, a mais abundante. A β-LG tem 162 aminoácidos, sua função é definida pela

estrutura primária e tem peso molecular que varia entre 18 kDa e 36 kDa. É sensível

em pH ácido e altas temperaturas e é absorvida no intestino delgado por apresentar

resistência a acidez e enzimas estomacais. Os peptídeos derivados desta proteína

estão envolvidos nas ações do organismo anti-hipertensiva, antioxidante,

antimicrobiana, imunoestimulante e hipocolesterolêmico (ALMEIDA et al., 2013). No

entanto, a β-LG, pode provocar alergias naqueles indivíduos considerados mais

sensíveis, como por exemplo, crianças (SGARBIERI, 2005).

A α-LA com 123 aminoácidos tem peso molecular de 14 kDa e é rica em

aminoácidos essenciais como o triptofano, precursor de uma importante vitamina

para o metabolismo celular. Seus peptídeos derivados desempenham funções

biológicas anticancerígenas, antimicrobianas contra bactérias como Escherichia coli,

Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae (ALMEIDA et al., 2013).

A BSA, um polipeptídeo com cerca de 582 aminoácidos e aproximadamente

66 kDa, pode-se ligar quimicamente a moléculas de ácidos graxos livres e outros

lipídeos facilitando seu transporte na corrente sanguínea atuando ativamente nas

funções fisiológicas e funcionais (ALMEIDA et al., 2013).

As Ig’s têm alto peso molecular variando entre 150 a 1000 kDa e estão

envolvidas com funções do sistema imune protegendo contra infecções. Quatro das

cinco classes das Ig’s se encontram no leite bovino: IgG, IgA, IgM e IgE, sendo que

a IgG representa 80% do total. As Ig’s têm bom desempenho praticamente em todos

os sistemas do organismo e atuam em atividades da imunidade passiva e têm poder

antioxidante. Estão relacionadas também com o estímulo da apoptose de células

tumorais (SGARBIERI, 2004; ALMEIDA et al., 2013).

18

A lactoferrina de peso molecular 78-80 kDa é formada por 689 aminoácidos.

Esta proteína pode inibir a proliferação e o crescimento de bactérias gram-positivas

e gram-negativas e também de leveduras, fungos e protozoários, pois ela é capaz

de obter o ferro livre do ambiente. (SGARBIERI, 2004; ALMEIDA et al., 2013).

No caso do soro doce, originado da coagulação enzimática do leite, além

destas proteínas existe ainda um macropeptídeo chamado de

caseinomacropeptídeo (CMP), o qual é produzido pela hidrólise uma caseína, a κ-

CN. Devido a esse motivo, não é considerada como uma proteína do soro

especificamente, já que o CMP tem origem a partir da quebra de uma proteína do

leite (HARAGUCHI; ABREU; DE PAULA, 2006).

O CMP, porém, não é formado exclusivamente pela coagulação enzimática,

pois pode ser originado a partir de microrganismos psicrotróficos, que produzem

uma enzima que é capaz de hidrolisar a κ-CN. Isso é um ponto negativo para a

detecção de fraudes pela adição de soro de queijo, pois os resultados das análises

podem ter influência da ação desses microrganismos e não necessariamente,

significa que o leite foi fraudado com soro de queijo (OLIVEIRA et al., 2009).

O soro de queijo é produzido em grande quantidade. Por exemplo, para a

produção de 1 Kg de queijo são necessários em média 10 L de leite, claro que

levando em consideração uma série de outros fatores como a qualidade do leite

recebido bem como o tipo de queijo que será fabricado. Essa grande quantidade de

soro gerada e devido sua composição ser muito semelhante a do leite, podem

implicar em práticas ilícitas como a sua adição de forma inadequada no leite,

visando o aumento de volume o que caracteriza fraude econômica, uma vez que

lesa o consumidor por este adquirir um produto com as características originais

alteradas (CARVALHO, 2007). Ou ainda, em muitos laticínios, o soro é descartado

junto com os outros efluentes gerados na fabricação de produtos lácteos, o que

agrava o potencial poluidor dessa substância (SILVA, 2011).

Como cerca de 90 a 95% do volume de leite que é destinado para a produção

de queijos resulta em soro, isto representa um fator relevante para que medidas

alternativas para o uso do soro sejam viabilizadas. Uma das formas para o descarte

é o tratamento do efluente antes do seu retorno para o meio ambiente, o qual é feito

em estações de tratamento (ETEs) instaladas na área das próprias indústrias

laticinistas; ou ainda, ser armazenado separadamente em tanques a fim de

aproveitá-lo na fabricação de outros produtos lácteos, fornecê-lo para outras

19

empresas que o utilizam como matéria-prima na fabricação de diversos alimentos

entre outras aplicações (OLIVEIRA; BRAVO; TONIAL, 2012).

2.3. FRAUDES EM LEITE

A legislação brasileira por meio do RIISPOA em seu artigo nº 504, considera

fraudados as matérias-primas ou os produtos de origem animal que apresentem

adulterações ou falsificações, sendo que as definições para esses dois conceitos

são diferentes (BRASIL, 2017)

As adulterações são definidas como: matérias-primas ou produtos que

tenham perdido suas características originais devido a substituição por componentes

estranhos que não estão dispostos em legislação específica; adição de ingredientes

ou qualquer outra substância visando mascarar outras alterações, má qualidade da

matéria-prima, deficiência na fabricação ou aumentar o volume ou o peso do produto

com o objetivo de benefício próprio; produtos que na manipulação ou na fabricação

tenham sido empregados matérias-primas ou ingredientes impróprios ou que não

cumpram ao disposto nas legislações específicas de determinado produto; os

produtos em que tenham sido adicionados ingredientes, aditivos ou coadjuvantes de

tecnologia diferentes daqueles expressos na formulação original ou sem autorização

do Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal (DIPOA); ou os

produtos que com alterações na data de fabricação e no prazo de validade (BRASIL,

2017).

Já as definições para falsificação são: qualquer produto que tenha sido

utilizado nomes diferentes dos previstos no RIISPOA, em normas complementares

ou no registro de produtos junto ao DIPOA; produtos que tenham sido elaborados,

fracionados ou reembalados, expostos ou não ao consumo, com a aparência e as

características gerais de um outro produto registrado junto ao DIPOA e que tenha o

nome deste, mesmo não o sendo; quando o rótulo do produto contenha informações

que gere confusão ao entendimento do consumidor ou ainda que lhe seja atribuído

informações de cunho terapêutico; produtos que tenham sido elaborados a partir de

espécie diferente daquela informada no rótulo ou diferente da especificada no

registro do produto; ou ainda produtos que não tenham sido processados conforme

20

descrito no seu registro, expostos ou não ao consumo, mas que estejam indicados

como um produto processado (BRASIL, 2017).

De todo modo, em ambos os casos seja ela adulteração ou falsificação dos

produtos de origem animal, estão previstas penalidades uma vez que essas práticas

lesam o consumidor (BRASIL, 2017).

Na indústria do leite, a prática de fraudar ocorre em qualquer etapa da cadeia

da produção leiteira, que vai desde a ordenha até o beneficiamento, já na indústria,

podendo ser feita por meio da adição de substâncias que se misturam ao conteúdo

principal e são difíceis de detectar, normalmente realizadas pelos produtores de

leite, transportadores ou mesmo funcionários de laticínios (MAGALHÃES, 2008).

A fraude de leite fluido de natureza econômica é a mais comum, sendo feita

através da incorporação de água ou outras substâncias, como neutralizantes de

acidez, reconstituintes de densidade e adição de soro de queijo (FILHO et al., 2009).

A ação fraudulenta por meio da adição de água ocorre para aumentar o

volume do leite. Inconsistências entre o ponto de congelamento e a densidade do

leite são indícios desse método. Quando a fraude é realizada na indústria, ela é bem

mais precisa e as alterações são difíceis de serem percebidas. A fraude por adição

de água também prejudica a qualidade microbiológica do leite, visto que a maioria

dos fraudadores utiliza água não tratada, além de reduzir de forma significativa o

valor nutricional do produto (ABRANTES et al., 2014).

Outras substâncias também são comumente adicionadas para aumentar o

volume do leite, como por exemplo, soro de queijo. Devido ao baixo custo dos soros

e por ser um meio de aproveitar tal resíduo proveniente da indústria queijeira, esse

tipo de fraude tornou-se viável visto que é economicamente atrativa para muitas

empresas. Esta ação ocasiona uma concorrência mercadológica desleal, lesando as

empresas que atuam corretamente, bem como o consumidor. Tal prática ainda é

difícil de ser controlada pelos órgãos responsáveis, muitas vezes em função da

ausência de métodos de análise capazes de detectar a fraude em tempo hábil

(CARVALHO et al, 2007; MAGALHÃES, 2008).

A adição de soro de queijo ao leite tem sido o foco de muitos pesquisadores

desde há pelo menos 20 anos. Com isso, diversas metodologias já foram

desenvolvidas para a detecção desse tipo de ação fraudulenta, como determinação

do ácido siálico, método de determinação de ninhidrina ácida, determinação do

índice de índice caseinomacropeptídeo (CMP) por CLAE entre outras. No Brasil, a

21

Instrução Normativa nº 7/2010, determina como método oficial para a rede de

Laboratórios do MAPA (LANAGROS), a pesquisa de CMP utilizando eletroforese

capilar e HPLC seguidos de espectrometria de massas (BRASIL, 2010). E a

Instrução Normativa nº 68/2006 também oficializa a técnica CLAE para a detecção

de fraude por adição de soro de queijo com base no índice de CMP. Contudo, são

metodologias é que exigem alto investimento financeiro, analistas capacitados e

tempo para a realização das análises, tornando difícil o alcance aos resultados.

Todavia, as formas para adulteração do leite ainda são problemas muito

frequentes. Isto se deve a capacitação dos fraudadores que conseguem desenvolver

formas modernas de adulteração que estão fora dos limites de detecção

empregados com as metodologias existentes (AQUINO, 2013).

2.4. METODOLOGIAS PARA A DETECÇÃO DE FRAUDES EM LEITE

Diversas metodologias para detecção de fraudes em leite tem fundamento na

separação e quantificação de proteínas e são importantes para o controle da

qualidade e segurança do leite e seus derivados. O método oficial estabelecido pelo

ministério da agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA), a cromatografia líquida

de alta eficiência (CLAE) é baseada na quantificação do CMP (BRASIL, 2006).

Contudo, os resultados podem ser falso positivos, visto que o CMP também

pode ser proveniente da ação de microrganismos psicrotróficos, os quais são

capazes de produzir uma enzima que hidrolisa a κ-CN, reação esta que ocorre

naturalmente nessa proteína na produção de queijos (OLIVEIRA et al., 2009).

Ainda assim a separação e quantificação das proteínas do leite de vaca

representam um fator de extrema importância para pesquisas que envolvem leite e

derivados. Em muitos estudos, o reconhecimento e a nomenclatura dessas

proteínas, na prática laboratorial, são baseadas principalmente na sua separação

por técnicas eletroforéticas. Eletroforese em gel de poliacrilamida em determinadas

condições, como na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS) é uma técnica eficaz

para a separação, detecção e quantificação das frações de proteínas existentes no

leite (ANEMA, 2009).

Nos últimos anos, uma inovação que tem fundamento na técnica de

eletroforese similar ao SDS-PAGE, a chamada eletroforese microfluídica em chip ou

22

lab-on-a-chip, tem sido útil para a separação e quantificação de proteínas, sendo

utilizada para avaliar o perfil proteico do leite (ANEMA, 2009; MEURER, 2014).

Outras metodologias como eletroforese capilar, método espectrofotométrico,

ensaios imunológicos e reação em cadeia da polimerase, do termo em inglês

polymerase chain reaction (PCR) são bastante utilizadas para a detecção de fraudes

em leite, até mesmo aquelas originadas pela adição de leite de outras espécies.

Bons resultados têm sido observados além de uma boa correlação entre essas

metodologias, quando comparadas. Todavia, cada método tem as suas

particularidades que oferecem vantagens e desvantagens e nenhum deles, se

aplicado sozinho, é capaz de permitir informações completas sobre as proteínas do

leite (ANEMA, 2009; PATEL et al., 2007).

Anema (2009) em seu estudo com a metodologia lab-on-a-chip onde avaliou o

perfil proteico do leite, apontou diversas vantagens da técnica: tempo de análise,

quantidade de amostra e reagente, tempo de preparação das amostras e índice de

toxicidade de reagente quase que inexistente. Essas vantagens oferecem ao método

uma possibilidade de ser utilizado como alternativo e/ou complementar a

metodologia oficial do MAPA na detecção de fraude em leite.

2.4.1. Eletroforese convencional

O uso da eletroforese é muito comum para o fracionamento e caracterização

de aminoácidos, peptídeos, proteínas (incluindo lipoproteína e glicoproteína) e

outras substâncias com importância biológica que apresentam cargas em função ao

pH do meio (SILVA JÚNIOR, 2001). Para proteínas, esta técnica é empregada como

um método analítico eficaz, pois em uma mistura qualquer, por exemplo, é possível

separar proteínas pelo seu peso molecular, determinar o ponto isoelétrico e ainda,

fazer uma análise qualitativa a partir da imagem do gel reproduzida em um

computador (NELSON; COX, 2004).

As primeiras eletroforeses em gel de poliacrilamida eram com o uso de um

tipo de gel somente, o chamado gel fracionador ou de separação ou ainda gel de

poro pequeno. Mais tarde, introduziu-se o gel de concentração ou também chamado

de gel de poro largo ou ainda gel de empilhamento que antecedia o gel fracionador.

A partir daí, surgiu o sistema descontínuo nas eletroforeses em gel de poliacrilamida

23

para proteínas, onde se inseriu descontinuidades na porosidade dos géis, na

composição química e no pH das soluções-tampão constituintes de cada gel, no pH

da solução-tampão existente no catodo e anodo bem como na sua composição.

Esse processo é feito através da base orgânica Tris (Trihidroximetil-aminometano)

que se apresenta sob a forma de Tris-HCl nas soluções-tampão dos géis e na forma

de Tris-Glicina nos compartimentos dos eletrodos (SILVA JÚNIOR, 2001).

Todo esse sistema de eletroforese baseada na diferença de potencial entre os

eletrodos pode ainda ser usado em técnicas nativas (sem desnaturantes) as quais

separam por peso, carga e forma das macromoléculas; e desnaturantes, com uso de

SDS, utilizando agentes redutores ou não, onde a separação ocorre essencialmente

pelo peso molecular (SILVA JÚNIOR, 2001). A eletroforese em gel de poliacrilamida

associada ao SDS é uma técnica muito usada para análise de proteínas. O gel é

uma matriz composta de um polímero de acrilamida de ligações cruzadas de N, N-

metil-bis-acrilamida, a qual permite escolher o tamanho dos poros de acordo com a

concentração de acrilamida. Isto é, quanto mais concentrada a acrilamida no meio,

menores serão os poros da malha formada (ROCHA et al., 2005).

Anteriormente à corrida eletroforética desnaturante em SDS-PAGE é

necessário que a forma e a carga nativa das proteínas sejam eliminadas. Isso

acontece para que a separação durante a corrida aconteça preferencialmente em

função da massa molecular e para tal, as proteínas são tratadas com SDS. A função

principal do SDS é normalizar a carga e o formato das proteínas, ou seja, ocorre a

desnaturação onde a estrutura das proteínas – normalmente globular – passa a ser

uma estrutura linear que possui densidade de carga uniforme. Além desse

tratamento com SDS, as proteínas podem ser associadas a agentes redutores,

como ditiotreitol (DTT) e 2-Mercaptoetanol, que quebram as ligações por pontes

dissulfeto auxiliando na eliminação da estrutura tridimensional das proteínas (SILVA

JÚNIOR, 2001; ROCHA et al., 2005).

Posteriormente ao tratamento das proteínas, elas são aplicadas nos poços

delimitados do gel e então são submetidas a corrente elétrica. As proteínas se

deslocam pela malha do gel do polo negativo para o positivo. Levando em

consideração o tamanho das proteínas, as menores migram mais rápido do que as

maiores. Há necessidade de utilizar padrões proteicos de pesos moleculares já

conhecidos para obter o valor do peso molecular das proteínas de interesse (SILVA

JÚNIOR, 2001; ROCHA et al., 2005).

24

2.4.2. Eletroforese lab-on-a chip ou eletroforese microfluídica

O método de eletroforese microfluídica ou ainda chamada de técnica

microfluídica lab-on-a-chip é uma eletroforese em SDS-PAGE, mas que, no entanto

é feita em chips próprios e realizada em equipamentos específicos. Neste trabalho

foi utilizado o equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies,

Waldbronn, Alemanha). O mecanismo de funcionamento para as proteínas se

baseia na sua detecção conforme o seu peso molecular por fluorescência induzida

por um laser, do inglês, laser-induced fluorescence (LIF) que acontece durante a

corrida eletroforética. A intensidade de fluorescência nas proteínas são medidas em

função do tempo de suas migrações (NITSCHE, 2011).

É uma técnica recente para a separação e quantificação de proteínas bem

como DNA e RNA. Estudos demonstraram o uso desse método na análise das

proteínas do leite e derivados, inclusive com o intuito de identificar fraude no leite

oriunda da adição de leite de outras espécies (WU, QIN e LIN, 2008; NITSCHE,

2011).

Esta metodologia traça perfis proteicos com auxílio de kits próprios,

fornecidos pelo mesmo fabricante, Agilent. No caso de proteínas, há dois kits

existentes: Agilent Protein 80 kit, que é capaz de detectar proteínas com massa

molecular de 5-80 kDa; e Agilent Protein 230 kit, que determina proteínas com peso

molecular de 14-230 kDa. Para o perfil proteico do leite, utiliza-se o Agilent Protein

80 kit, já que as massas moleculares das principais proteínas do leite estão dentro

deste intervalo (GARCÍA-OTERO et al., 2013).

O Agilent Protein 80 kit tem os seguintes componentes: chips de proteínas

com microcanais que funcionam como peneiras (seleção) para detectar proteínas

dentro da faixa 5-80 kDa; Protein 80 Gel-Matrix e Protein 80 Dye Concentrate,

utilizados no preenchimento dos chips antes da inserção das amostras; tampão de

amostra, que é usado para o preparo da solução de desnaturação e Protein 80

Ladder que é o padrão de peso molecular de proteínas nas faixas 6,5; 15; 28; 46 e

63 kDa. As referentes massas moleculares das proteínas, concentrações, área total

da proteína, tempo de migração dentre outros índices são detectados

automaticamente pelo programa Agilent 2100 Expert por meio de cálculos

matemáticos e algoritmos, que acontecem à medida que as amostras vão sendo

detectadas e lidas pelo sistema. Para determinação das massas moleculares, o

25

tempo de retenção (Rf) das proteínas é comparado com os tempos de retenção do

Ladder (NITSCHE, 2011; GARCÍA-OTERO et al., 2013).

A eletroforese microfluídica oferece vantagens sobre a técnica de eletroforese

convencional. A corrida eletroforética, com um total de 10 amostras por chip, ocorre

em não mais que 40 minutos, tempo muito inferior quando comparado ao tempo

necessário à eletroforese convencional que demora de 2 a 3 horas. Faz uso de

pequeno volume de amostras e de reagentes; além disso, os níveis de toxicidade

dos reagentes são baixos em relação àqueles utilizados na técnica tradicional

(ANEMA, 2009; NITSCHE, 2011; GARCÍA-OTERO et al., 2013).

A técnica lab-on-a-chip, em amostras de leite, foi utilizada para obtenção do

perfil proteico e já foram determinados os pesos das principais proteínas, porém os

trabalhos realizados não são muito detalhados (ANEMA, 2009). Meurer (2014) em

seu estudo onde avaliou amostras de leite com simulações de fraude pela adição de

leite de vaca ao leite de cabra, o método lab-on-a-chip foi capaz de detectar a fraude

a partir de 20% de adição de leite de vaca, demonstrado pelo comportamento da α-

CN s1 bovina.

Como não há relatos na literatura sobre o uso desta técnica para identificar

fraude no leite pela adição de soro de queijo, neste trabalho esta metodologia foi

utilizada com esta finalidade.

2.4.3. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A CLAE é uma técnica analítica de grande impacto devido a sua sensibilidade

e uma ampla gama de aplicações, sendo possível utilizá-la no controle de qualidade

de rotinas industriais e até mesmo pesquisas mais detalhadas (CHUST, 1990).

É baseada na separação de componentes químicos presentes em um meio,

ou seja, em uma amostra também chamada de soluto. Tal separação se dá por um

processo de interação seletiva entre as moléculas do soluto e duas fases da

metodologia denominadas estacionária e move (CHUST, 1990).

A fase estacionária trata-se da coluna cromatográfica que nada mais é que

um cilindro rígido feito de aço ou vidro. Já a fase móvel ou solvente que flui através

do sistema, conduzindo a amostra injetada pela coluna e pelo detector. A

composição química de uma amostra dispõe de diferentes graus de afinidade com

26

as fases móvel e estacionária influenciando assim nas velocidades de migração, o

que resulta na separação cromatográfica (CHUST, 1990).

Ainda de acordo com Chust (1990) existem vários tipos de CLAEs que são

definidas basicamente pelo mecanismo de separação, que por sua vez, depende do

tipo de amostra que será analisada além do objetivo da mesma. Os principais

mecanismos e suas respectivas aplicações estão descritas a seguir:

a) Cromatografia de adsorção: separação de vitaminas lipossolúveis (A, D e E),

ftalatos, fenóis, aflatoxinas, anilinas entre outras;

b) Cromatografia de fase reversa (partilha): vitaminas incluindo as lipossolúveis,

aminoácidos, proteínas, drogas terapêuticas, fenois, alcaloides, ácidos graxos livres,

carboidratos, compostos aromáticos, nucleotídeos etc;

c) Cromatografia de permeação em gel: proteínas, polímeros e resinas;

d) Cromatografia de interação hidrofóbica: quase que exclusivamente utilizada para

separação de proteínas;

e) Cromatografia de interação iônica: cátions e ânions inorgânicos incluindo os

metais de transição.

Para a indústria de leite e derivados a cromatografia é considerada uma

grande ferramenta para averiguar a autenticidade desses produtos, sendo a análise

cromatográfica baseada na separação de proteínas que inclui os tipos de fase

reversa, troca de íons, interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão (MOORE,

et al., 2010).

Embora a CLAE seja eficiente para separar e quantificar as proteínas de

alimentos em geral, auxiliando na verificação da autenticidade dos produtos

alimentícios, a técnica oferece muitas limitações principalmente quando o objetivo de

seu uso é a aplicação na rotina industrial. Além do tempo de análise ser demorado,

o método requer diversos tipos de solventes tóxicos que são indispensáveis para a

fase móvel e também ao preparo da matriz alimentar onde é preciso realizar o

isolamento das proteínas de interesse. Associado a isso, o custo do equipamento é

bastante elevado não sendo acessível a maioria das indústrias do setor de alimentos

(MOORE, et al., 2010).

Outras metodologias vêm sendo empregadas para a detecção de fraude em

leite, como o uso de PCR, no entanto esta técnica é eficaz para identificação de

27

fraudes a partir de misturas de leite de espécies de animais diferentes. Esta

metodologia é rápida e com bom limite de detecção, porém é preciso investimento

alto e a necessidade de regulamentação pelos órgãos oficiais (MALORNY et al.,

2003).

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar o método lab-on-a-chip para a detecção de fraude em leite de vaca

pela adição de soro de queijo.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o comportamento das principais proteínas do leite α, β e κ caseínas

bem como das proteínas do soro β-LG e α-LA com a aplicação da metodologia lab-

on-a-chip, utilizando amostras de leite cru, pasteurizado, UHT e leite em pó;

Detectar fraude a partir da avaliação das proteínas dos leites cru,

pasteurizado, UHT e em pó nas condições empregadas;

Utilizar a técnica lab-on-a-chip como método de triagem para auxiliar a

identificação de fraude em leite pela adição de queijo em leite;

Comparar a técnica lab-on-a-chip com a eletroforese SDS-PAGE na

separação e quantificação das proteínas do leite.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. AMOSTRAS DE LEITE E DE SORO DE QUEIJO

Foram utilizadas amostras de leite cru, pasteurizado, UHT e em pó e soro de

queijo. As amostras de leite cru foram coletadas no Campo Experimental José

28

Henrique Bruschi (CEJHB) da Embrapa Gado de Leite em Coronel Pacheco, Minas

Gerais. Já as amostras comerciais (leite pasteurizado, UHT e em pó) foram

adquiridas em estabelecimento comercial de Juiz de Fora-MG, sendo que para as

amostras de leite UHT e em pó são da marca A e o leite pasteurizado da marca B. O

leite em pó foi reconstituído da seguinte maneira: 130 g de leite em pó integral em

900 mL de água ultrapura levemente aquecida; essa solução foi homogeneizada em

chapa aquecedora. O soro de queijo foi obtido da produção de queijo a partir do leite

cru no Laboratório de Análises de Alimentos da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF).

4.2. PROTEÍNAS-PADRÃO

As proteínas-padrão utilizadas alfa-caseína (α-CN), beta-caseína (β-CN),

kappa-caseína (κ-CN), beta-lactoglobulina (β-LG) e alfa-lactoalbumina (α-LA) foram

adquiridas da Sigma-Aldrich® (Saint Louis, MO, EUA). Essas proteínas

individualmente foram diluídas em água ultrapura ficando com concentração final de

10 mg/mL. Posteriormente foi preparada um mix de proteínas-padrão contendo

todas as proteínas a uma concentração final de 1 mg/mL cada, para serem utilizadas

como padrão nas corridas eletroforéticas.

4.3. PREPARO DAS SIMULAÇÕES DE FRAUDE NAS AMOSTRAS DE LEITE

As amostras com simulação de fraude (v/v) dos diferentes tipos de leite cru,

pasteurizado, UHT e em pó foram preparadas com adição de soro de queijo em

níveis crescentes (0; 1; 2,5; 5;10; 20; 30; 50%), sendo que 100% é o soro puro. Logo

em seguida, essas amostras foram armazenadas e mantidas em temperatura -80 C°

até o uso para as análises posteriores.

29

4.4. QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS PELO

MÉTODO DE BRADFORD

A concentração de proteínas totais das amostras de leite com simulações de

adulteração foi determinada pelo Método do Reagente de Bradford (Bio-

RadLaboratories, Lisboa, Portugal) conforme recomendações do fornecedor e

quantificado utilizando o modo “Bradford Protein” no software do espectrofotômetro

NanodropTM1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA).

A curva padrão foi elaborada com a proteína soro albumina bovina (BSA)

(Sigma®Aldrich, MO, EUA) que foi diluída em água ultrapura entre os intervalos 0;

0,2; 0,4; 0,6; 1,5 e 2,0 mg/mL.

4.5. PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE LEITE FRAUDADAS

Cada amostra adulterada dos diferentes tipos de leite foi purificada em

acetona. Foram diluídos 200 μL de amostra em 600 μL de acetona gelada e em

seguida, essas diluições foram armazenadas a -20°C por 2 h. Após esse período de

tempo, foi centrifugada a 20.000 x g por 30 min. O sobrenadante foi descartado e o

pelete foi completamente seco em temperatura ambiente. O pelete foi ressuspendido

em 200 μL de solução tampão Bis-Tris Propano Ureia 7M, homogeneizado por

vórtex e mantido a 4°C por no mínimo 15 h. Em seguida, essas amostras foram

novamente homogeneizadas no vórtex e mantidas a -20°C até o uso (Manual GE

Healthcare, 2D Electrophoresis, 2004).

4.6. ELETROFORESE CONVENCIONAL EM SDS-PAGE

4.6.1. Preparo das amostras

As amostras purificadas em acetona foram descongeladas e homogeneizadas

por vórtex por 15 s. Foi feita a diluição na proporção 1:9 em água ultrapura em cada

amostra. Para a separação das proteínas, essas diluições foram preparadas na

proporção 1:1 em tampão SDS 2X (Tris-HCl pH 6,8 0,5 M; SDS 10%; glicerol 99,9%,

30

azul de bromofenol 0,5% e 310 mg de ditiotreitol–DTT 1 M), homogeneizadas e

aquecidas a 95°C por 5 min. e mantidas no gelo até a aplicação no gel.

O tampão de corrida Amersham ECL Gel 10X (GE Healthcare Life Sciences,

Bjorkgatan, Uppsala, Suécia) foi diluído na proporção 1:10 em água destilada, de

acordo com as instruções do fabricante.

Como padrão de peso molecular foi utilizado o NovexProtein com intervalo

entre 3.5 - 260 kDa (Novex® Sharp Pre-stained Protein Standard, Life Technologies

– Carlsbad, CA) e um mix das proteínas-padrão (α-LA, β-LG, α-CN, β-CN e -CN) de

modo que a concentração de cada proteína foi de 1mg/mL.

4.6.2. Corrida eletroforética

O sistema de eletroforese utilizado foi o tipo horizontal no suporte Amersham

ECL Box (GE Healthcare Life Sciences, Bjorkgatan, Uppsala, Suécia). Os géis com

concentração de SDS 12% são do mesmo fornecedor e já são prontos para o uso

não tendo a necessidade de prepará-los. Inicialmente, foi realizada uma pré-corrida

em gel de 15 poços durante 12 min. a 160 volts. Após esse tempo, as amostras

preparadas foram aplicadas no gel seguindo as instruções do fabricante. A corrida

eletroforética foi feita a 140 volts por 90 minutos.

4.6.3. Coloração dos géis

Os géis foram corados com Comassie Brilliant Blue R-250. A solução corante

a base de Coomassie Brilliant Blue R-250 (Rockford, IL) foi preparada na diluição de

0,2% (m/v) em etanol absoluto. Após a completa diluição do corante, foram

adicionados a mistura, 4 g de ácido tricloroacético (TCA) em 100 mL.

Posteriormente, depois de total dissolução de TCA, completou-se a solução com

água destilada para um volume final de 200 mL.

Os géis ficaram imersos na solução corante por pelo menos 15 h. Em

seguida, fez-se a lavagem em água destilada para retirada do excesso de corante e

então foram colocados em solução descorante contendo 80 mL de ácido acético PA,

250 mL de etanol absoluto inferindo em um volume final de 1 L, completado com

31

água destilada. Os géis permaneceram nessa solução por tempo suficiente até que

fossem totalmente descorados. Os géis foram secos (colocados em papel celofane

transparente), escaneados e analisados pelo software ImageQuanTL (GE

Healthcare Life Sciences, Bjorkgatan, Uppsala, Suécia).

4.7. ELETROFORESE LAB-ON-A-CHIP

Todas as amostras com simulação de fraude foram submetidas à eletroforese

microfluídica no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer com uso do kit Protein 80

(Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha). Este kit é composto por uma solução

gel matriz, padrão de peso molecular (ladder) com intervalo entre 5 a 80 kDa,

solução desnaturante, solução de descoloração, microtubos próprios com coluna e

filtro, e chip específico para proteína. O procedimento seguiu o recomendado pelo

fabricante.

As amostras de leite com simulações de fraude foram preparadas em

condição redutora com uso de DTT 1 M conforme o protocolo do fabricante da

seguinte maneira: em microtubos de 0,5 mL foram diluídos 2 μL da solução

desnaturante em 4 µL (0,018 mg/mL) de amostra seguido de homogeneização e

centrifugação em minicentrífuga (Modelo Minitube, Maxlabor, Presidente Prudente,

São Paulo), por 15 s. Para a desnaturação das proteínas, as amostras e o mix de

proteínas padrão foram aquecidos a 95ºC por 5 min., e após esse período, foram

imediatamente armazenadas em gelo por 15 s seguido de homogeneização por

vórtex. Posteriormente, foram adicionados 84 µL de água ultrapura em cada

microtubo. Em seguida, realizou-se homogeneização das amostras e então foram

mantidas em temperatura ambiente até a aplicação no chip.

No chip foram aplicados 4 µL de amostra e 6 µL do ladder e a corrida

eletroforética aconteceu por 30 minutos no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer

assim como orienta o protocolo do fabricante.

32

4.8. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

As análises das amostras fraudadas foram feitas de acordo com o

delineamento em blocos completos casualizados. Neste delineamento todos os

tratamentos (níveis crescentes de adição de soro) das amostras de leite foram

aplicados dentro do chip (blocos), totalizando nove chips para cada tipo de leite, ou

seja, nove repetições de tal modo que todos os tratamentos estivessem contidos

num mesmo chip. Ainda seguindo o conceito deste tipo de delineamento, as

amostras adulteradas, foram aplicadas de modo aleatório no chip. A Figura 1

apresenta um esquema simplificado deste tipo de delineamento.

Figura 1- Esquema de blocos completos casualizados. Cada um dos chips representa um bloco com todos os tratamentos (adição de soro) distribuídos aleatoriamente. Esta estratégia foi empregada para os quatro tipos de leite: cru, pasteurizado, UHT e em pó adulterados com soro de queijo.

33

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. COMPARAÇÃO ENTRE O COMPORTAMENTO DAS PROTEÍNAS DOS

LEITES CRU, PASTEURIZADO, UHT E EM PÓ FRAUDADOS COM SORO, PELO

MÉTODO ELETROFORÉTICO LAB-ON-A-CHIP

Dados quantitativos tais como peso molecular, área do pico das proteínas,

porcentagem proteica total e altura do pico proteico das proteínas do leite, α-CN, β-

CN, κ-CN e das proteínas do soro β-LG e α-LA, foram estimados automaticamente

pelo software Agilent 2100 Expert. A partir da análise comparativa dessas

informações foi evidente que a variável área da caseína do leite da classe α,

apresentou comportamento semelhante para todas as amostras testadas no estudo.

Por este motivo, este dado foi utilizado como indicador quantitativo de fraude em

leite pela adição de soro de queijo.

A análise de variância (ANOVA) foi realizada com base nos dados tabulados

para cada proteína e para cada tipo de leite: cru, pasteurizado, UHT e em pó. A

ANOVA, neste caso, é um teste de hipóteses que visa verificar se alguma das

variáveis explicativas (X1 e X2) pode ser retirada do modelo. A hipótese nula é o

coeficiente da variável X2, representado por a2, e é igual a zero (H0: a2 = 0). Em outras

palavras, significa que o nível de adição de soro não influencia no comportamento

das proteínas do leite. A hipótese alternativa (H1: a2 ≠ 0) é que esse coeficiente não é

nulo, ou seja, o tratamento com soro tem influência nas proteínas do leite.

No estudo em questão, os resultados obtidos com a ANOVA foram suficientes

para comprovar que houve diferença, isto é, foram significativos para mostrar que o

comportamento das proteínas do leite foi influenciado pela adição de soro. Com isso

conclui-se que a hipótese nula foi rejeitada, influindo no erro tipo I sendo necessário

prosseguir com um teste de comparações múltiplas. Sendo assim, o teste de Dunnet

foi aplicado com o objetivo de comparar se as amostras consideradas como controle

(0% = leite puro de cada tipo de leite) teriam diferença em relação as amostras as

quais os tratamentos (adições de soro nos níveis 1; 2,5; 5; 10; 20; 30; 50 e 100%)

foram empregados. Os resultados estão apresentados nos tópicos que seguem.

34

5.1.1. Análise quantitativa das amostras de leite cru fraudadas com soro de

queijo

As médias das áreas dos picos das proteínas do leite cru fraudado com níveis

crescentes de soro apresentaram valores uniformes. As médias das áreas das

caseínas e das proteínas do soro, estimadas a partir das nove repetições realizadas

com a técnica lab-on-a-chip estão contidas na Tabela 1 a seguir.

Tabela 1 – Valor médio da área dos picos das principais frações proteicas das amostras de leite cru com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtido com a técnica lab-on-a-chip.

Níveis de adição de soro

Áreas*

Principais proteínas do leite

α-CN β-CN κ-CN α-LA β-LG

0% 652,62 645,74 34,49 61,37 48,59

1% 604,74 609,57 33,38 55,30 47,44

2,5% 561,02 574,31 28,01 53,91 42,65

5,0% 519,50 548,10 27,24 49,85 38,77

10,0% 492,72 517,82 23,99 48,22 31,48

20,0% 353,45 383,99 14,86 41,22 30,99

30,0% 333,46 356,57 17,82 44,19 29,46

50,0% 238,59 249,36 13,16 44,41 30,89

100,0% - - - 37,51 20,64

*Média calculada a partir das nove repetições realizadas com a técnica de eletroforese lab-on-a-chip.

De acordo com os valores das áreas apresentados na tabela acima, se

percebe uma redução gradativa à medida que se eleva a adição de soro de queijo

no leite cru, com destaque para as proteínas α-CN e β-CN, as quais apresentaram

tendência de diminuir até o nível de 50% de adição de soro. Este comportamento

não foi demonstrado pela proteína κ-CN que com 30% de soro de queijo, teve seu

valor da área aumentado em 2,9 quando comparado ao nível anterior. Ao comparar

a média da área obtida para os picos das proteínas α-CN e β-CN em 0% (652,62 e

645,74, respectivamente) com os valores médios da área dos picos para as mesmas

proteínas com 50% de adição de soro (238,59 para α-CN e 249,36 para β-CN), fica

evidente que tais valores das áreas dos picos proteicos foram reduzidos de forma

regular.

Esses dados analisados pelo teste de Dunnet, resultaram em diferença

significativa para as caseínas (p < 0,05), como apresentado na Tabela 2.

35

Tabela 2 – Comparação dos níveis de significância das caseínas do leite α, β e κ-CN entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite cru, obtidos pelo teste de Dunnet

Proteína α-CN Proteína β-CN Proteína κ-CN Tratamento Valor de p Tratamento Valor de p Tratamento Valor de p

T1 T1 T1 T2 0,0425 T2 0,0316 T2 0,8685 T3 < 0,0001 T3 0,0002 T3 0,0670 T4 < 0,0001 T4 0,0013 T4 < 0,0001 T5 < 0,0001 T5 < 0,0001 T5 < 0,0001 T6 < 0,0001 T6 < 0,0001 T6 < 0,0001 T7 < 0,0001 T7 < 0,0001 T7 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 < 0,0001

Legenda: T1: Tratamento 1 – 0% de adição de soro; T2: Tratamento 2 – 1% de adição de soro; T3: Tratamento 3 – 2,5% de adição de soro; T4: Tratamento 4 – 5% de adição de soro; T5: Tratamento 5 – 10% de adição de soro; T6: Tratamento 6 – 20% de adição de soro; T7: Tratamento 7: 30% de adição de soro; T8: Tratamento 8 – 50% de adição de soro.

Com base no exposto na tabela 2 acima, concluí-se que para as caseínas α e

β os resultados foram significativos estatisticamente a um nível de significância de

5% (p < 0,05) a partir de 1% de adição de soro de queijo, padrão este que se

manteve até o nível de 50% de adição. Para a proteína κ-CN, com 5% de adição de

soro de queijo em diante, foi possível constatar a adulteração no leite em um nível

de significância de 5% (p < 0,05). Isto quer dizer que houve diferença entre as

médias das áreas dos picos das proteínas, ou seja, as médias não são iguais

quando comparados os tratamentos: T1 (0%) e T2; T1 (0%) e T3 (2,5%); T1 (0%) e

T4 (5%); T1 (0%) e T5 (10%); T1 (0%) e T6 (20%); T1 (0%) e T7 (30%) e T1 (0%) e

T8 (50%) para as proteínas α e β; e entre as comparações T1 (0%) e T4 (5%); T1

(0%) e T5 (10%); T1 (0%) e T6 (20%); T1 (0%) e T7 (30%) e T1 (0%) e T8 (50%)

para a κ-CN.

Estes resultados sugerem que a técnica lab-on-a-chip foi capaz de detectar a

fraude em leite cru por adição de soro de queijo a partir do menor nível de adição

(1%) para as principais proteínas do leite, o que pode tornar o método um aliado nas

análises de rotina laboratorial que visa o controle da qualidade e a garantia da

genuinidade do leite.

Ao contrário disso, os resultados da análise estatística de dados das

proteínas do soro β-LG e α-LA apresentaram uma reação diferente daquela

esperada, já que essas proteínas tiveram seus valores de área também diminuídos

conforme o aumento da proporção de soro. Além disso, os valores de área para

essas proteínas não teve diminuição contínua, como a ocorrida com as caseínas do

36

leite. A Tabela 3 traz os valores de área do pico das proteínas do soro pela técnica

lab-on-a-chip e seus respectivos níveis de significância, quando analisados pelo

teste de Dunnet, os quais estão maiores que 5%, o que significa dizer que para os

valores de médias no teste de comparação das mesmas, o resultado não foi

representativo. Baseado no exposto, as proteínas do soro não são determinantes

para a detecção da fraude em leite com soro de queijo pela técnica lab-on-a-chip.

Tabela 3 – Comparação dos níveis de significância das proteínas do soro β-LG e α-LA, entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite cru, obtidos pelo teste de Dunnet

Proteína β-LG Proteína α-LA Tratamento Valor de p Tratamento Valor de p

T1 T1 T2 0,8583 T2 0,9998

T3 0,8374 T3 1,0000 T4 0,9767 T4 1,0000 T5 0,9576 T5 1,0000 T6 0,9997 T6 0,9999 T7 1,0000 T7 0,7207 T8 1,0000 T8 < 0,0001


5.1.2. Análise quantitativa das amostras de leite pasteurizado fraudadas com

soro de queijo

Os valores médios das áreas dos picos das proteínas do leite pasteurizado

com simulação de adulteração com soro de queijo, calculados a partir das 9

repetições realizadas com a técnica lab-on-a-chip, estão expressos na Tabela 4.

Tabela 4 - Valor médio da área dos picos das principais frações proteicas das amostras de leite pasteurizado com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtido com a técnica lab-on-a-chip.


Áreas*



0% 691,41 688,59 37,40 53,17 59,81

1% 660,79 670,97 37,30 49,86 50,09

2,5% 544,61 569,97 32,40 41,31 43,78

37


Áreas*



5,0% 494,58 526,11 25,70 41,94 45,94

10,0% 456,50 494,21 23,20 38,30 40,59

20,0% 361,90 397,40 16,10 36,29 34,18

30,0% 293,31 324,04 10,10 36,72 30,69

50,0% 202,72 223,71 7,80 38,88 30,30

100,0% - - - 47,83 24,54

*Média calculada a partir das 9 repetições realizadas com a técnica de eletroforese lab-on-a-chip.

Os dados tabulados apresentados na Tabela 4 destacam as proteínas α-CN,

β-CN e κ-CN para a redução do valor da área do pico de tais proteínas. Isso também

aconteceu com as amostras de leite cru sob as mesmas condições. Porém, no

entanto, os resultados foram estatisticamente significativos ao nível de 5% de

significância (p < 0,05) somente para a α-CN. As proteínas β-CN e κ-CN por sua

vez, embora tenham tido seus valores de média reduzidos à medida que a

proporção de soro aumentou, não mostraram resultados significativos

estatisticamente quando comparados àqueles da α-CN, ao realizar o teste de

comparação entre as médias (Tabela 5). Neste caso, os resultados para a caseína α

corrobora com o comportamento exibido por essa mesma proteína para as amostras

de leite cru fraudadas com soro, onde a partir de 1% de adição de soro de queijo, a

fraude foi detectada.

Tabela 5 – Comparação dos níveis de significância das caseínas do leite α, β e κ-CN entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite pasteurizado, obtidos pelo teste de Dunnet


T1 T1 T1 T2 0,0410 T2 0,2098 T2 0,1316 T3 < 0,0001 T3 0,3140 T3 0,0081 T4 < 0,0001 T4 0,2250 T4 0,0108 T5 < 0,0001 T5 0,0130 T5 0,0095 T6 < 0,0001 T6 0,0525 T6 0,0026 T7 < 0,0001 T7 0,0177 T7 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 0,5055 T8 < 0,0001


38

Ao analisar a tabela 5 acima, é visível que a caseína α teve seus resultados

significativos estatisticamente a um nível de significância de 5% (p < 0,05) a partir de

1% de adição de soro de queijo, cujo padrão se manteve até o nível de 50% de

adição. Ou seja, as médias não são iguais quando são comparados os tratamentos:

T1 (0%) e T3 (2,5%); T1 (0%) e T4 (5%); T1 (0%) e T5 (10%); T1 (0%) e T6 (20%);

T1 (0%) e T7 (30%) e T1 (0%) e T8 (50%).

Já para as caseínas β-CN e κ-CN, os resultados foram opostos àqueles

obtidos com as amostras de leite cru, não representando nenhuma conformidade

entre os valores, o que implica em dizer que não têm significância estatística dentro

das condições empregadas. Sendo assim, a proteína α-CN, foi determinante para a

detecção da fraude em leite pela adição de soro de queijo com o método lab-on-a-

chip.

Os resultados da análise de dados das proteínas do soro também não foram

positivos. As áreas dos picos não aumentaram como se esperava e os resultados

não foram estatisticamente significativos, como pode ser observado na Tabela 6.

Deste modo, pode-se dizer que a reação dessas proteínas frente a técnica lab-on-a-

chip sob as condições impostas pelo estudo demonstrou instabilidade nos valores

das áreas quantificados. Sendo assim, com as áreas apresentadas para essas

proteínas, significa dizer, que elas não contribuíram para a detecção de fraude em

leite pela adição de soro de queijo, resultado este que coincide com o encontrado

também para as amostras de leite cru.

Tabela 6 – Comparação dos níveis de significância das proteínas do soro β-LG e α-LA, entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite pasteurizado, obtidos pelo teste de Dunnet


T1 T1 T2 0,9995 T2 0,1316 T3 0,8950 T3 0,0081 T4 0,9996 T4 0,0108 T5 1,0000 T5 0,0095 T6 1,0000 T6 0,0026 T7 1,0000 T7 < 0,0001 T8 1,0000 T8 < 0,0001


39

5.1.3. Análise quantitativa das amostras de leite UHT fraudadas com soro de

queijo

As médias dos valores de área das proteínas do leite UHT com adição de

soro de queijo foram determinadas pelo cálculo dos dados referentes a área de cada

proteína, os quais foram estimados automaticamente nas nove repetições com a

realização da eletroforese lab-on-a-chip. A Tabela 7 a seguir, contém os valores

médios das áreas das frações proteicas do leite UHT com simulação de adulteração.

Tabela 7- Valor médio da área dos picos das principais frações proteicas das amostras de leite UHT com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtido com a técnica lab-on-a-chip


Áreas*



0% 686,60 772,07 47,38 40,87 23,56

1% 642,80 733,09 42,81 43,59 23,70

2,5% 536,90 614,70 25,17 35,08 23,52

5,0% 481,80 571,32 25,93 32,71 24,37

10,0% 431,90 514,28 19,68 32,01 24,43

20,0% 358,20 432,49 10,50 30,59 26,06

30,0% 305,70 369,76 2,64 30,37 23,84

50,0% 239,30 284,93 2,31 40,49 31,56

100,0% - - - 52,31 38,71 *Média calculada a partir das 9 repetições realizadas com a técnica de eletroforese lab-on-a-chip.

Avaliando as informações da Tabela 7, verifica-se que as caseínas do leite

das classes α, β e κ-CN tiveram seus valores de área reduzidos à medida que o

nível de adição de soro aumentou. Estes resultados foram significativos

estatisticamente (p < 0,05) a partir de 1% de adição de soro de queijo para as

proteínas α e β caseínas; e a partir de 2,5% de soro para a κ-CN, conforme pode ser

observado na Tabela 8.

40

Tabela 8 – Comparação dos níveis de significância das caseínas do leite α, β e κ-CN entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite UHT, obtidos pelo teste de Dunnet


T1 T1 T1 T2 0,0239 T2 0,0347 T2 0,1871 T3 < 0,0001 T3 < 0,0001 T3 < 0,0001 T4 < 0,0001 T4 < 0,0001 T4 < 0,0001 T5 < 0,0001 T5 < 0,0001 T5 < 0,0001 T6 < 0,0001 T6 < 0,0001 T6 < 0,0001 T7 < 0,0001 T7 < 0,0001 T7 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 < 0,0001


Considerando os valores expressos na Tabela 8, constata-se que a fraude

pela adição de soro de queijo foi detectada pelas caseínas do leite UHT: a partir de

1% de adição de soro de queijo para a α e β-CN e 2,5% de adição para a κ-CN, a

um nível de significância de 5%. Com base neste resultado pode-se concluir que

houve diferença entre as médias das áreas dos picos proteicos quando comparados

os tratamentos: T1 (0%) e T2 (1%); T1 (0%) e T3 (2,5%); T1 (0%) e T4 (5%); T1

(0%) e T5 (10%); T1 (0%) e T6 (20%); T1 (0%) e T7 (30%) e T1 (0%) e T8 (50%)

para as caseínas α e β; e T1 (0%) e T3 (2,5%); T1 (0%) e T4 (5%); T1 (0%) e T5

(10%); T1 (0%) e T6 (20%); T1 (0%) e T7 (30%) e T1 (0%) e T8 (50%) para a κ-CN.

Ao contrário disso, os dados das análises das áreas dos picos das proteínas

do soro não foram representativos e se mostraram opostos ao objetivo esperado,

pois as áreas dos picos reduziram. Em consequência, os resultados estatísticos

também não foram significativos, de acordo com a Tabela 9.

Tabela 9 – Comparação dos níveis de significância das proteínas do soro β-LG e α-LA, entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite pasteurizado, obtidos pelo teste de Dunnet


T1 T1 T2 0,9943 T2 0,9009 T3 0,0691 T3 0,8860 T4 0,0067 T4 0,9441 T5 0,0030 T5 0,9474 T6 0,0005 T6 0,9907

41


T7 0,0004 T7 0,9119 T8 0,8503 T8 1,0000


5.1.4. Análise quantitativa das amostras de leite em pó fraudadas com soro de

queijo

A distribuição dos valores médios das áreas das proteínas do leite em pó com

adição crescente de soro de queijo, estimados a partir das nove repetições

realizadas com o método lab-on-a-chip, está disposta na Tabela 10.

Tabela 10 - Valor médio da área dos picos das principais frações proteicas das amostras de leite em pó com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtido com a técnica lab-on-a-chip


Áreas*



0% 773,90 1141,46 22,78 12,59 16,08

1% 727,87 1075,37 17,38 16,89 11,88

2,5% 651,78 989,76 14,27 12,66 12,50

5,0% 592,64 901,33 14,54 16,99 11,68

10,0% 536,19 847,49 14,42 18,98 9,86

20,0% 421,97 673,11 13,24 19,37 9,68

30,0% 355,21 580,01 10,27 18,18 8,55

50,0% 260,64 424,82 7,68 28,22 13,01

100,0% - - - 61,88 25,83 *Média calculada a partir das 9 repetições realizadas com a técnica de eletroforese lab-on-a-chip.

Baseado nos resultados apresentados na Tabela 10 observa-se a

regularidade com que as médias dos picos das proteínas α-CN e β-CN reduziram à

medida que adição de soro de queijo foi acrescida na amostra do leite em pó. Assim

como para as amostras de leite cru, pasteurizado e UHT, houve redução

representativa quando se compara os valores entre as médias obtidas em 0 e 50%

dessas proteínas em questão. A proteína k-CN, embora seus valores de área dos

picos proteicos entre os níveis de adulteração tenham apresentado certa

42

uniformidade, na proporção de 5%, houve um leve aumento, da mesma maneira

como verificado para as amostras de leite UHT com adição de soro.

Na análise estatística dos dados, as caseínas do leite mais uma vez foram

determinantes na detecção da fraude pela adição de soro de queijo, ao nível de

significância de 5% (p < 0,05). Estes resultados estão apresentados na Tabela 11 a

seguir.

Tabela 11 – Comparação dos níveis de significância das caseínas do leite α, β e κ-CN entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite em pó, obtidos pelo teste de Dunnet


T1 T1 T1 T2 0,0310 T2 0,0210 T2 0,0254 T3 < 0,0001 T3 < 0,0001 T3 < 0,0001 T4 < 0,0001 T4 < 0,0001 T4 < 0,0001 T5 < 0,0001 T5 < 0,0001 T5 < 0,0001 T6 < 0,0001 T6 < 0,0001 T6 < 0,0001 T7 < 0,0001 T7 < 0,0001 T7 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 < 0,0001 T8 < 0,0001


De acordo com os dados apresentados na Tabela 11, conclui-se que a fraude

pela adição de soro de queijo foi detectada pelas caseínas do leite em pó a partir de

1% de adição de soro de queijo ao nível de significância de 5%. Com base neste

resultado pode-se concluir que houve diferença entre as médias das áreas dos picos

proteicos quando comparados os tratamentos: T1 (0%) e T2 (1%); T1 (0%) e T3

(2,5%); T1 (0%) e T4 (5%); T1 (0%) e T5 (10%); T1 (0%) e T6 (20%); T1 (0%) e T7

(30%) e T1 (0%) e T8 (50%).

Já para as proteínas do soro os valores das áreas não demonstraram

regularidade, pois não houve padrão de redução ou aumento de seus valores. Além

disso, pela análise estatística não foi obtido resultados significativos ao nível de

significância de 5%, conforme apresentado na Tabela 12.

43

Tabela 12 – Comparação dos níveis de significância das proteínas do soro β-LG e α-LA, entre os tratamentos aplicados nas amostras de leite em pó, obtidos pelo teste de Dunnet


T1 T1 T2 0,9995 T2 0,9798 T3 0,8950 T3 0,8678 T4 0,9996 T4 0,9752 T5 1,0000 T5 0,9973 T6 1,0000 T6 0,9998 T7 1,0000 T7 1,000 T8 1,0000 T8 1,000


5.2. QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS PROTEÍNAS DOS LEITES CRU,

PASTEURIZADO, UHT E EM PÓ FRAUDADOS COM SORO DE QUEIJO, PELO

MÉTODO ELETROFORÉTICO SDS-PAGE

A análise quantitativa das proteínas do leite, realizada pelo software

ImageQuant TL, estima automaticamente valores de massa molecular (perfil

proteico), área, porcentagem total para cada proteína e tempo de migração que está

intimamente ligado aos valores de massa molecular. O perfil proteico do leite é

amplamente descrito em muitos trabalhos e já é bastante conhecido no setor leiteiro

com a técnica SDS-PAGE (VELOSO et al., 2002).

O método em SDS-PAGE foi eficiente com relação, principalmente, a

separação das proteínas e das estimativas de suas respectivas massas

moleculares. Farrel Jr. e colaboradores (2004), Anema (2009), Marques e

colaboradores (2011) e Meurer (2014) encontraram valores de massa molecular

para as principais proteínas do leite semelhantes aos obtidos neste estudo. Na

Tabela 13 está apresentada a comparação dos valores de massa molecular obtidos

para amostras de leite cru, pasteurizado, UHT e em pó adulteradas com soro de

queijo com os valores de massa já descritos em alguns estudos.

44

Tabela 13–Valores estimados da massa molecular das caseínas do leite e das proteínas do soro para as amostras dos leites cru, pasteurizado, UHT e em pó, comparados com os valores de massa molecular descritos na literatura através da utilização da técnica SDS-PAGE Proteínas do leite

MW (kDa)

Leite bovino L.C. L.P. L. UHT L.Pó

α-CN 30 ± 3[1] 23,6[2] 29,94[3] 30,66 32,09 31,58 32,41 β-CN 27 ± 4[1] 25,2[2] 28,03[3] 25,90 26,33 26,64 26,29 κ-CN 24 ± 4[1] 19,0[2] 25,72[3] 23,02 23,06 23,45 23,24 β -LG 19 ± 2[1] 18,3[2] 16,63[3] 13,47 13,35 13,59 13,57 α-LA 13 ± 3[1] 14,1[2] 12,56[3] 11,03 10,85 11,04 10,99

[1] – Massas moleculares estimadas por Anema (2009). [2] – Massas moleculares estimadas por Farrel Jr. et al. (2004). [3] – Massas moleculares estimadas por Meurer (2014). L.C. – Leite cru. L. P. – Leite pasteurizado. L. UHT. – Leite UHT. L. Pó. – Leite em pó.

Com base nos valores expostos na Tabela 13 pode ser observado que houve

pouca variação nas massas moleculares estimadas para as caseínas do leite nas

amostras de leite cru, pasteurizado, UHT e em pó em comparação com àquelas

descritas na literatura apresentada. Farrel Jr (2004) e colaboradores relataram que

as principais faixas caseínicas estão em torno de 19 a 25 kDa, no entanto, neste

estudo, as caseínas do leite migraram a uma faixa próxima a 30 kDa e até um pouco

maior que este valor, assim como apresentado por Marques e colaboradores (2011)

ao analisarem amostras de leite em pó pela técnica SDS-PAGE. Isto pode ter

acontecido devido a ligação em formas variadas das proteínas ao SDS ou ainda pela

interação das frações de caseínas separadas (MARQUES et al., 2011).

Embora o perfil proteico dos leites analisados tenha tido poucas variações

com relação aos valores de massa molecular das principais proteínas do leite, estes

ainda estão bastante próximos daqueles obtidos na literatura para a técnica SDS-

PAGE, o que implica dizer que tal método foi eficaz na separação e quantificação

das proteínas do leite.

Entretanto, para identificação de fraude em leite pela adição de soro de

queijo, as massas moleculares estimadas parecem não sofrer alterações

significativas não sendo possível a detecção da fraude por esta variável. Em

contrapartida, as outras variáveis fornecidas pelo software específico não exibiram

um comportamento uniforme com relação a diminuição de caseínas como

demonstrado pela técnica lab-on-a-chip, nem tampouco para as proteínas do soro. O

motivo pelo qual isto pode ter acontecido pode ter relação com a sensibilidade do

método SDS-PAGE que não foi capaz de detectar fraude no leite pela adição de

soro de queijo.

45

5.2.1. Análise quantitativa obtida pela técnica SDS-PAGE para as proteínas do

leite cru fraudado com soro de queijo

Os dados fornecidos pelo software ImageQuant TL, especificamente valor de

área das bandas das proteínas do leite cru α-CN, β-CN, κ-CN, β-LG e α-LA com

adição de soro de queijo estão distribuídos na Tabela 14.

Tabela 14 – Distribuição dos valores da variável área das frações proteicas do leite cru com soro de queijo estimados pela análise dos geis SDS-PAGE no software ImageQuant TL Proteínas do leite


Variáveis Área* Área* Área* Área* Área*

0% 1328,00 738,67 486,67 576,67 630,00

1% 1312,00 722,67 576,00 576,00 668,67

2,5% 1276,67 701,33 669,33 504,00 648,00

5,0% 1239,33 665,33 575,33 469,33 665,33

10,0% 1256,00 666,68 574,00 413,33 629,33

20,0% 1274,67 666,67 430,67 502,67 573,33

30,0% 1110,00 703,33 540,67 556,00 631,33

50,0% 917,33 615,33 595,33 522,67 505,33

100,0% - - - 540,67 626,67

*Valores médios calculados a partir das repetições realizadas com a técnica SDS-PAGE.

Avaliando os dados apresentados na Tabela 14 é possível observar um que

os valores não assumiram um padrão homogêneo de redução ou aumento da área

das bandas das proteínas do leite cru à medida que os níveis de soro aumentaram.

De acordo com a variável analisada, esperava-se que houvesse redução desses

valores para as caseínas e um aumento dessa mesma variável para as proteínas do

soro. No entanto, este comportamento não foi exibido para as amostras de leite cru

com adição de soro de queijo.

Com base nas Figuras 6 e 7, nas quais estes resultados estão demonstrados

graficamente, observa-se melhor a desordem da variável área das bandas das

proteínas do leite cru.

46

Figura 06 – Representação gráfica do comportamento da variável área das caseínas do leite cru com adição de soro de queijo obtidas com a técnica SDS-PAGE. A: Demonstração da caseína alfa (α). B: Apresentação da caseína beta (β). C: Representação da caseína kappa (κ). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda. No eixo horizontal, estão distribuídos os níveis de adição de soro de queijo.

47

Figura 07 - Representação gráfica dos valores de área das proteínas do soro das amostras de leite cru com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtidos pela técnica SDS-PAGE. Em A está demonstrada a proteína do soro β-LG (beta lactoglobulina). Em B está apresentada a proteína do soro α-LA (alfa lactoalbumina). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda. No eixo horizontal, estão distribuídos os níveis de adição de soro de queijo.

48


leite pasteurizado fraudado com soro de queijo

A distribuição dos valores médios da variável analisada no software

específico, área, obtidos como resposta do efeito da adição de soro de queijo nas

amostras de leite pasteurizado, por meio da utilização do método SDS-PAGE, está

expressa na Tabela 15.

Tabela 15 – Distribuição dos valores da variável área das frações proteicas do leite pasteurizado com adição de soro de queijo estimados pela análise dos géis SDS-PAGE no software ImageQuant TL

Proteínas do leite



0% 1086,00 748,00 514,67 515,33 552,00

1% 1050,00 730,00 533,33 515,33 551,33

2,5% 1067,33 675,33 481,33 498,00 658,00

5,0% 1048,67 711,33 392,00 480,00 658,67

10,0% 1048,67 675,33 516,00 444,00 675,33

20,0% 1028,67 782,00 445,33 463,33 533,33

30,0% 1013,33 712,00 462,67 463,33 640,00

50,0% 977,33 604,67 498,00 444,67 623,33

100,0% - - - 586,67 587,33


A partir dos resultados demonstrados na Tabela 15 nota-se que para a

variável analisada, as proteínas do leite pasteurizado não exibiram comportamento

uniforme da mesma forma como ocorreu com as amostras de leite cru sob as

mesmas condições. Nas Figuras 8 e 9 as caseínas e as proteínas do soro das

amostras de leite pasteurizado fraudadas com soro de queijo, estão representadas

graficamente. De acordo com os gráficos, é possível visualizar melhor a resposta de

tais proteínas, quanto ao valor de área, obtida pela técnica SDS-PAGE.

49

Figura 8 - Representação gráfica do comportamento da variável área das caseínas do leite pasteurizado com adição de soro de queijo obtidas com a técnica SDS-PAGE. A: Demonstração da caseína alfa (α). B: Apresentação da caseína beta (β). C: Representação da caseína kappa (κ). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda.

50

Figura 9 - Representação gráfica dos valores de área das proteínas do soro das amostras de leite pasteurizado com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtidos pela técnica SDS-PAGE. Em A está demonstrada a proteína do soro β-LG (beta lactoglobulina). Em B está apresentada a proteína do soro α-LA (alfa lactoalbumina). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda.


leite UHT fraudado com soro de queijo

Os resultados a partir da análise dos géis pelo software específico das

amostras de leite UHT com adição de soro de queijo em níveis crescentes estão

apresentados, a seguir, na Tabela 16.

51

Tabela 16 - Distribuição dos valores da variável área das frações proteicas do leite UHT adulterado com soro de queijo estimados pela análise dos géis SDS-PAGE no software ImageQuant TL

Proteínas do leite

α-CN β-CN κ-CN α-LA

β-LG


0% 1065,33 695,33 558,67 541,33 614,67

1% 1080,67 589,33 460,67 576,00 589,33

2,5% 1096,00 589,33 518,00 572,00 556,67

5,0% 1111,33 583,33 535,33 595,33 602,67

10,0% 1044,00 624,00 502,67 580,00 633,33

20,0% 1130,67 645,33 450,67 545,33 587,33

30,0% 1167,33 730,00 489,33 526,00 576,00

50,0% 902,67 626,00 437,33 541,33 556,67

100,0% - - - 487,33 604,67


Igualmente aos resultados para as amostras de leite cru e pasteurizado

fraudadas com soro de queijo, as amostras de leite UHT nesta mesma condição,

reproduziram o mesmo padrão de distribuição dos valores de área para as proteínas

do leite pelo método SDS-PAGE. Isto é, esta variável não contribuiu para a detecção

da fraude, pois através dela não foi possível observar nenhuma diferença que

indique variações das proteínas do leite UHT, assim como ocorreu com os leites cru

e pasteurizado.

Os gráficos com os dados obtidos para as caseínas e proteínas do soro do

leite UHT adulteradas, estão exibidos nas Figuras 10 e 11, respectivamente.

52

Figura 10 - Representação gráfica do comportamento da variável área das caseínas do leite UHT com adição de soro de queijo obtidas com a técnica SDS-PAGE. A: Demonstração da caseína alfa (α). B: Apresentação da caseína beta (β). C: Representação da caseína kappa (κ). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda. No eixo horizontal, estão distribuídos os níveis de adição de soro de queijo.

53

Figura 11 - Representação gráfica dos valores de área das proteínas do soro das amostras de leite UHT com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtidos pela técnica SDS-PAGE. Em A está demonstrada a proteína do soro β-LG (beta lactoglobulina). Em B está apresentada a proteína do soro α-LA (alfa lactoalbumina). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda. No eixo horizontal, estão distribuídos os níveis de adição de soro de queijo.

54


leite em pó fraudado com soro de queijo

Os valores de área das proteínas do leite em pó com adição de soro de

queijo, obtidos com a análise dos géis pelo software específico, estão distribuídos na

Tabela 17.

Tabela 17 - Distribuição dos valores da variável área das frações proteicas do leite em pó adulterado com soro de queijo estimados pela análise dos géis SDS-PAGE no software ImageQuant TL

Proteínas do leite



0% 1146,00 710,00 606,00 570,67 729,33

1% 1106,00 714,67 517,33 517,33 782,67

2,5% 1231,33 782,00 482,00 572,67 695,33

5,0% 1230,67 639,33 482,00 532,00 743,33

10,0% 1196,00 744,67 481,33 498,67 708,67

20,0% 1138,67 618,67 463,33 570,00 748,00

30,0% 1228,67 620,00 516,00 514,00 606,00

50,0% 1102,00 639,33 516,67 518,67 731,33

100,0% - - - 532,00 694,67


Ao observar os valores expressos na tabela 17, observa-se que as proteínas

do leite, novamente, não seguiram um padrão de distribuição para as variáveis

analisadas nem quanto a redução para as caseínas e nem com relação ao aumento

das proteínas do soro. Estes dados estão exibidos em gráficos nas Figuras 12 e 13.

55

Figura 12 - Representação gráfica do comportamento da variável área das caseínas do leite em pó com adição de soro de queijo obtidas com a técnica SDS-PAGE. A: Demonstração da caseína alfa (α). B: Apresentação da caseína beta (β). C: Representação da caseína kappa (κ). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda. No eixo horizontal, estão distribuídos os níveis de adição de soro de queijo.

56

Figura 13 - Representação gráfica dos valores de área das proteínas do soro das amostras de leite em pó com adição de soro de queijo em níveis crescentes obtidos pela técnica SDS-PAGE. Em A está demonstrada a proteína do soro β-LG (beta lactoglobulina). Em B está apresentada a proteína do soro α-LA (alfa lactoalbumina). A barra vertical indica o valor de área, a qual está expressa pelos números do eixo vertical, à esquerda. No eixo horizontal, estão distribuídos os níveis de adição de soro de queijo.

Considerando que os resultados encontrados com a análise dos géis pelo

software ImageQuant TL foram semelhantes para os quatro tipos de leite com

adição de soro de queijo testados neste estudo, conclui-se que através das variável

analisada não foi possível a identificação da fraude pela adição de soro de queijo

com a técnica SDS-PAGE, já que não houve relação entre a quantidade de soro

acrescentada. No entanto, as proteínas do leite ficaram muito bem dispostas nos

géis SDS-PAGE, como pode ser visualizado na Figura 14, confirmando a eficácia da

técnica para esta função.

57

Figura 14 - Perfil eletroforético SDS-PAGE das proteínas do leite. A, B, C e D – amostras de leite cru, pasteurizado, UHT e em pó fraudadas com soro, respectivamente. 1 – marcador molecular NovexProtein; Os valores de 10 a 260 correspondem aos valores do marcador molecular em kDa. Adição de soro: 2 – 0%; 3 – 1%; 4 – 2,5%; 5 – 5%; 6 – 10%; 7 – 20%; 8 – 30%; 9 – 50%; 10 – 100%. As setas indicam as principais proteínas do leite.

Os resultados dessas análises permitiram a detecção da fraude por adição de

soro de queijo ao nível de significância de 5% (p < 0,05) a partir da análise

quantitativa dos valores de área do pico das proteínas, α-CN, obtidos pela técnica

lab-on-a-chip, comportamento este, diferente daquele demonstrado para as mesmas

amostras no método SDS-PAGE. Esta última técnica, por sua vez, foi eficiente na

separação e quantificação da massa molecular das proteínas, como pode ser

observado na figura 14.

Nas Tabelas 18 e 19 está representada a comparação entre os resultados

obtidos pelas técnicas lab-on-a-chip e SDS-PAGE, respectivamente.

58

Tabela 18– Comparação dos níveis de adição de soro de queijo entre os tipos de leite a partir da análise da variável área de cada proteína obtida com a técnica lab-on-a-chip Níveis de adição de soro de queijo

Tipo de leite Variável

analisada Caseínas Proteínas do soro

α-CN β-CN κ-CN β-LG α-LA

Cru

Área

1% 1% 10% - -

Pasteurizado 1% 1% 5% - -

UHT 1% 1% 2,5% - -

Em Pó 1% 1% 2,5% - - Legenda: - Não foi possível a identificação da adulteração em nenhum nível de adição de soro de queijo.

Tabela 19 – Comparação dos níveis de adição de soro de queijo entre os tipos de leite a partir da análise das variáveis área e porcentagem total de cada proteína obtida com a técnica SDS-PAGE Níveis de adição de soro de queijo

Tipo de leite Variáveis

analisadas Caseínas Proteínas do soro

α-CN β-CN κ-CN β-LG α-LA

Cru Área - - - - -

Pasteurizado Área - - - - -

UHT Área - - - - -

Em Pó Área - - - - - Legenda: - Não foi possível a identificação da adulteração em nenhum nível de adição de soro de queijo, a partir da análise da variável área das proteínas do leite.

Considerando as tabelas acima observa-se que a técnica SDS-PAGE não

apresentou reprodutibilidade nos resultados para as variáveis analisadas. O nível de

adição de soro de queijo no qual a técnica foi capaz de identificar adulteração foi de

20% demonstrada, somente, pela proteína κ-CN, o que implica dizer que a

sensibilidade da técnica foi baixa para as condições deste experimento. Este é um

valor considerado alto quando se compara com os resultados encontrados pelo uso

do método lab-on-a-chip, o qual foi capaz de detectar a fraude por meio da adição

de soro de queijo de forma semelhante para os quatro tipos de leite testados.

59

6. DISCUSSÃO

O método lab-on-a-chip foi capaz de detectar a fraude dentro das condições

empregadas no experimento, enquanto que a técnica SDS-PAGE foi eficiente

apenas para a separação e quantificação das proteínas do leite.

Marques e colaboradores (2011) também obtiveram sucesso utilizando SDS-

PAGE para separação das proteínas para amostras de leite e soro em pó, quando

avaliadas separadamente. Em contrapartida, ao analisar misturas dessas amostras

visando a detecção de fraude em leite por meio da adição de soro, os resultados não

foram satisfatórios, pois a técnica SDS-PAGE não foi capaz de estabelecer uma

correlação entre a quantidade de soro adicionada. Este resultado foi similar ao

obtido neste estudo, onde a fraude em leite pela adição de soro não foi identificada a

partir da eletroforese em SDS-PAGE.

Entretanto, resultados contrários foram obtidos por Aquino (2013) em seu

trabalho, o qual detectou a adulteração em amostras de leite cru adulteradas

experimentalmente com soro de queijo pelo método SDS-PAGE. A partir da análise

qualitativa, foi verificada alteração da intensidade das bandas proteicas α-s1CN, β-

CN e β-LG, além da análise dos valores de suas concentrações por software

específico.

Alterações quanto a intensidade da banda proteica no gel SDS não foram

representativas neste trabalho. Houve uma leve redução da intensidade da banda da

proteína κ-CN nas amostras de leite cru a partir de 5% de adição de soro. Nos

outros tipos de leite analisados pasteurizado, UHT e em pó, a intensidade da banda

começou a ser reduzida a partir de 20% de adição, como pode ser observado ainda

na Figura 14.

Este mesmo nível de detecção foi encontrado por Siqueira e colaboradores

(2000) em seu estudo com misturas de leite cru e soro em pó, no qual a análise

qualitativa do gel de SDS foi percebido aumento da intensidade da banda de

proteína correspondente a α-LA. Contudo, não foi notada diferença representativa na

mesma banda proteica à medida que a proporção de soro foi aumentada.

Entretanto, com base em análise densitométrica, os autores concluíram que houve

correlação entre as caseínas e as proteínas do soro, e que assim a técnica SDS-

PAGE foi eficaz para identificação e quantificação da adulteração em produtos

lácteos a partir da adição de soro de queijo.

60

Em outro trabalho visando a detecção de adulteração em leite, porém a partir

da mistura de leite de vaca e leite de cabra, foi identificada a fraude com 2,5% de

adição de leite de vaca utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida na presença

de ureia (UREIA-PAGE). Ao usar o SDS-PAGE, os autores concluíram que o método

não foi capaz de detectar a fraude em leite de cabra. Contudo com o resultado,

sugeriram que poderia ser eficiente na identificação de fraude em leite de égua

ocasionada pela incorporação de leite de cabra ou de vaca, devido a diferença de

migração das caseínas β e κ (EGITO et al., 2006).

Fraudes ocasionadas pela mistura de leite de diferentes espécies animais são

comuns, principalmente pelos altos valores atribuídos aos leites de cabra, búfala,

ovelha, camela, égua entre outros animais devido as características nutricionais do

leite e também porque esses animais são criados em menor escala quando

comparados as vacas. Em outro estudo, por exemplo, no qual foram avaliadas

misturas de leite de espécies diferentes, os resultados encontrados ao utilizar

UREIA-PAGE, indicaram adulteração em leite de cabra a partir de 2% de adição de

leite de vaca, sendo a α-CN bovina, a proteína determinante para a identificação da

fraude devido sua migração na corrida eletroforética ter sido mais rápida e com boa

resolução na separação das bandas proteicas; já a técnica SDS-PAGE, os

resultados foram satisfatórios apenas para a separação e quantificação das

proteínas do leite (MEURER, 2014). Estes dados apontados para a técnica SDS-

PAGE coincidem com os resultados observados neste presente trabalho, onde a

fraude promovida pela adição de soro não foi detectável para a mesma metodologia

empregada para todas as amostras testadas, sendo eficiente apenas, para a

separação das bandas proteicas.

Por sua vez, Galindo-Amaya; Valbuena-Colmenares e Rojas-Villarroel (2006)

obtiveram uma resposta razoável ao empregar a eletroforese em SDS-PAGE

visando a identificação do componente indicador de fraude em leite a partir da

adição de soro, o CMP. Ao analisarem amostras de leite cru, soro doce e soro ácido,

eles detectaram uma banda de proteína com massa molecular de aproximadamente

20,9 kDa que distinguia de qualquer outra proteína conhecida, além de ter ocorrido

somente nas amostras de soro doce. E ainda, ao avaliarem as misturas de soro com

leite cru, a mesma banda proteica foi evidenciada no gel com 1% de soro

adicionado, sendo intensificada com o aumento da proporção de soro para 5, 10 e

50%. Com base nesses resultados, eles concluíram então, que se tratava do CMP, e

61

que consequentemente, a técnica SDS-PAGE poderia ser aplicada em casos de

fraude em leite a partir de sua mistura com soro de queijo.

Resultados equivalentes foram observados no trabalho de Gasparetto (2007),

no qual avaliou amostras de leite pasteurizado fraudado com soro de queijo. Neste

experimento, foi identificada uma banda de proteína com aproximadamente 20, 9

kDa para a amostra com 5% de adição de soro com análise eletroforética em SDS-

PAGE. Esta banda proteica teve sua intensidade acentuada de acordo com o

aumento da proporção de soro adicionada, o que se concluiu que essa banda,

possivelmente, seria um indicativo de adulteração provocada pela adição de soro.

Fraude em leite a partir da adição de soro de queijo com o uso da técnica

SDS-PAGE foi relatada também por Vilela (1987). Em seu estudo, foram analisadas

amostras de leite pasteurizado com 0,5; 1 e 1,5% de soro previamente tratadas para

que o CMP fosse detectável. Como resultado, a banda proteica possivelmente

correspondente ao CMP, foi identificada nas amostras com o menor limite de

detecção, ou seja, 0,5% de adição de soro de queijo, concluindo que o método

utilizado foi capaz de identificar a fraude dentro das condições da pesquisa.

Em outro estudo onde foram avaliadas amostras comerciais de leite em pó

integral e desnatado na cidade do México, a fraude foi detectada em 14,81% das

amostras avaliadas a partir da identificação do CMP pela técnica SDS-PAGE. Isto

representa que houve ação fraudulenta em 16 de um total de 108 amostras

utilizadas no experimento, além de ser considerado um resultado alarmante, por se

tratar de marcas comerciais que não foram previamente tratadas com a simulação

de fraude (BETANCOURT et.al., 2000).

Resultados a partir da identificação do CMP são frequentes para estudos

onde se objetiva a detecção de fraude por meio da adição de soro de queijo, visto

que esse componente está presente somente no soro. No entanto, SDS-PAGE não

é a técnica mais recomendada para este tipo de análise, mesmo embora tenha sido

capaz de separar a banda de proteína em muitas pesquisas. Não se tem uma banda

proteica clara, e por isso, os resultados podem gerar dúvidas. Técnicas mais

sensíveis são sugeridas, como HPLC, cuja inclusive é a técnica oficial do MAPA no

Brasil (BRASIL, 2006). Outra questão que pode influenciar nos resultados está

relacionada a origem do CMP, que pode ser formado a partir da ação de

microrganismos psicrotróficos e não necessariamente pela coagulação ocasionada

pela renina/quimosina.

62

Entretanto, para análise de fraudes em leite, é sempre viável a busca por

metodologias mais simples e mais baratas, como é o caso do SDS-PAGE

comparado a técnica de HPLC. Além disso, eletroforese em SDS é um método

bastante utilizado devido sua eficiência na separação e quantificação das proteínas

do leite e tem sido empregada com sucesso em avaliações de fraude em leite a

partir da mistura de leite de diferentes espécies animais (VELOSO, 2002).

Por esses motivos, metodologias alternativas são pesquisadas e estudadas

continuamente e a técnica lab-on-a-chip retrata o avanço da tecnologia frente às

exigências do mercado, onde métodos viáveis financeiramente e que ofereçam

maior facilidade de execução são predominantes. O método eletroforético lab-on-a-

chip tem sido utilizado para separação e quantificação de proteínas até mesmo de

DNA e RNA (ANEMA, 2009; WU, QIN e LIN, 2008; HEY, 2007; JEONG et al., 2005;

GOETZ et al., 2004).

No caso da análise de proteínas, a técnica lab-on-a-chip tem sido aplicada

devido a sua equivalência ao método de eletroforese em SDS-PAGE, porém trata-se

de uma eletroforese na sua forma automatizada, proporcionando a análise de um

número de amostras em um período de tempo bastante inferior, 30 minutos, além de

utilizar pouca quantidade de amostras e reagentes menos tóxicos, quando

comparado a técnica SDS-PAGE (ANEMA, 2009).

Perante as vantagens que a eletroforese lab-on-a-chip oferece, Anema (2009)

em seu estudo com amostras de leite desnatado fresco e proteínas padrão do leite

individuais, avaliou os perfis eletroforéticos obtidos nessa técnica com a finalidade

de determinar se esta, demonstra potencial para a separação das proteínas do leite.

Para efeito de comparação com um método já estabelecido para as amostras

empregadas, o autor ainda submeteu as mesmas amostras à eletroforese em SDS-

PAGE. Nesse experimento em questão, o resultado indicou uma adequada

separação das proteínas do leite, principalmente para as proteínas do soro, as quais

tiveram seus tempos de migração assemelhados com aqueles das proteínas padrão,

o que sugere que a técnica lab-on-a-chip foi bem sucedida na separação dessas

proteínas.

Ainda de acordo com Anema (2009), quando comparadas as metodologias de

eletroforese lab-on-a-chip e SDS-PAGE, as proteínas do soro β-LG e α-LA e as

proteínas do leite α e β-CN apresentaram valores de massa muito próximos,

reforçando a ideia de que a eletroforese em chip pode ser facilmente utilizada como

63

técnica alternativa ao SDS-PAGE. No entanto, caseína κ foi a única proteína em que

apresentou valor de massa molecular muito distante, praticamente o dobro para a

metodologia lab-on-a-chip, quando comparados os dois métodos aplicados. Este

efeito sobre a κ-CN parece ter relação com mecanismos próprios da eletroforese em

chip, ou ainda, pode estar relacionado com a glicosilação, padrão de fosforilação e

característica de hidrobificidade da κ-CN, que altera sua estrutura e

consequentemente age na interação com o gel matriz durante separação (NITSCHE,

2011).

O uso da técnica lab-on-a-chip foi empregada com êxito na identificação,

separação e caracterização das proteínas do soro de leite de búfala, onde o

resultado obtido foi uma separação rápida das proteínas β-LG e α-LA, com massas

moleculares próximas as relatadas na literatura com o método SDS-PAGE, o que

consequentemente, chegaram a conclusão que essa técnica é apropriada para

avaliações que demandam rapidez como por exemplo, em atividades rotineiras

(BUFFONI, 2011), como um laboratório de controle de qualidade de uma indústria.

Em outro trabalho, cujo objetivo foi avaliar a influência da lactação em leite de

burra doméstica, a eletroforese lab-on-a-chip foi aplicada apenas para

caracterização e separação das proteínas do leite, onde os resultados para a massa

molecular foram equivalentes aos valores de massa obtidos na literatura existente,

demonstrando mais uma vez a especificidade da técnica para a separação e

quantificação das proteínas do leite (GUBIC et al., 2015).

Dentro desse contexto, é perceptível que o método de eletroforese lab-on-a-

chip proporciona resultados concretos quanto a separação e quantificação das

proteínas do leite, e que é bastante utilizado em muitos estudos com esta finalidade.

A partir disso, Furtado (2011), testou amostras de leite pasteurizado, soro de queijo

e suas misturas nas proporções 5, 10, 15 e 25% com o objetivo de identificar a

fraude em leite ocasionada pela adição de soro de queijo. Os resultados

preliminares foram inconclusivos, mesmo que embora tenha sido observada a

presença de um pico proteico característico, que sugere ser o CMP, para a amostra

com 5% de adição de soro de queijo.

No trabalho de Santos e demais coautores (2013) fraude em leite cru por

meio da adição de soro de queijo foi detectada nas amostras a partir de 1% de

adição, com base nas análises das concentrações das caseínas α e β obtidas pela

corrida eletroforética em lab-on-a-chip. Resultado este, similar ao encontrado neste

64

experimento para os 4 tipos de leite (cru, pasteurizado, UHT e em pó) testados com

simulações de fraude, onde a fraude foi encontrada também a partir do menor limite

de detecção, 1% de adição de soro de queijo.

Já Meurer (2014) em seu estudo com a técnica lab-on-a-chip que objetivou a

detecção de fraude em leite de cabra provocada pela adição de leite de vaca,

encontrou resultados insatisfatórios dentro das condições impostas no experimento,

pois a fraude no leite de cabra foi identificada com o limite mínimo de detecção de

20% de adição de leite vaca, constatada pela presença da αs1-CN. Resultado

idêntico foi encontrado por Jesus (2013) onde também avaliou amostras com

simulações de fraude a partir da adição de leite de vaca.

Como pode-se notar os resultados que visam a identificação de fraudes em

leite, sejam elas pela incorporação de soro ou leite de outras espécies de animais

são diversificados. Mas isso pode ter várias razões, como por exemplo, a

preparação das amostras de modo que as tornem identificáveis dentro do limite de

detecção do método que será empregado para tal detecção. Contudo, a partir

desses resultados e levando em consideração as vantagens que a técnica lab-on-a-

chip proporciona, é viável o aprimoramento de pesquisas envolvendo os produtos

lácteos com o uso desse método.

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7. CONCLUSÃO

Concluiu-se que as principais proteínas do leite α, β e κ caseínas bem como

das proteínas do soro β-LG e α-LA exibiram comportamento semelhante para os

quatro tipos de leite analisados com a técnica lab-on-a-chip: as caseínas tiveram

seus valores de área do pico proteico reduzidos à medida que o nível de soro

aumentou; e as proteínas do soro, não apresentaram valores de área uniformes nem

com relação ao seu aumento e nem redução;

Somente o método lab-on-a-chip evidenciou fraude a partir de 1% de adição

de soro de queijo, através do comportamento exibido pela α-CN, em todos os tipos

de leite testados. Este resultado pode tornar o método lab-on-a-chip como uma

técnica de triagem na rotina de laboratórios visando facilitar a identificação da fraude

em leite por adição de soro de queijo;

O método de eletroforese SDS-PAGE não foi capaz de identificar a fraude

provocada pela adição de soro de queijo nos leites cru, pasteurizado, UHT e em pó;

As duas técnicas empregadas, SDS-PAGE e lab-on-a-chip, foram capazes de

separar as bandas das proteínas do leite de forma eficaz. E esse padrão foi

semelhante para os quatro tipos de leite analisados: cru, pasteurizado, UHT e em

pó.

As massas moleculares das proteínas dos leites cru, pasteurizado, UHT e em

pó foram comparáveis entre as duas técnicas empregadas.

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Embora o resultado para o método lab-on-a-chip tenha sido satisfatório neste

estudo, a literatura encontrada oferece resultados muito variáveis, o que implica em

dizer, que a metodologia ainda precisa de aprimoramento para ser validada e assim,

tornar o seu uso prático na rotina de laboratórios de controle de qualidade.

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