eletroforese 2013 parte1

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04/03/2013 1 ELETROFORESE Eletroforese Parte1 04/03/2013 2 1. Caractersticas bsicas; 2. O fluxo determinante; 3. Fatores envolvidos; 4. O ponto isoeltrico; 5. Tipos de eletroforese: Eletroforese livre, Eletroforese em suporte semi-slido, Eletroforese em suporte slido, Eletroforese capilar, Focalizao isoeltrica, Eletroforese com SDS, Eletroforese bidimensional, Eletroforese de alta voltagem, Immunobloting, Iontoforese. 6. Revelao; 7. Analise qualitativa e quantitativa; 8. Aplicaes e procedimentos experimentais 3 OBJETIVOS: ELETROFORESE DEFINIO: Processo de separao e/ou caracterizao dos componentes de um sistema, baseado na carga eltrica livre das partculas, onde ocorre a migrao diferencial das mesmas quando submetidas a um campo eltrico. PRINCPIO: Para que uma partcula se mova no campo eltrico necessrio que possua carga, isto , excesso ou deficincia de eltrons, resultando em carga eltrica livre. 4 ELETROFORESE 04/03/2013 3 A eletroforese especialmente til como mtodo analtico. Sua vantagem que as molculas podem ser separadas e visualizadas, permitindo determinar os componentes presentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparao particular de protenas. A eletroforese permite tambm a determinao de propriedades cruciais de uma protena, tais como o seu ponto isoeltrico e sua massa relativa. Tcnicas especializadas de eletroforese como Western blotting, eletroforese bi-dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadas para detectar produtos gnicos extremamente escassos, encontrar similaridades entre eles e detectar e separar isoenzimas. 5 ELETROFORESE 6 Fracionamento e caracterizao Aminocidos Peptdeos Protenas (lipo e glico) Nucleotdeos cidos carboxlicos Adoantes Vitaminas Corticoides Pesticidas Outras partculas que apresentem cargas em funo do pH do meio. ELETROFORESE 04/03/2013 4 Componentes que possuem carga eltrica livre migram para plo de carga oposta a sua. Portanto, partculas carregadas negativamente migram para o plo positivo (anodo) e partculas carregadas positivamente migram para o plo negativo (catodo). Na eletroforese a fora eltrica, Fe que move a macromolcula o potencial eltrico (A) , vezes a carga lquida da molcula (q). A fora que pra a migrao da macromolcula a frico, Ff, que proporcional a velocidade da partcula, V, vezes o coeficiente de frico, ffr: No caso do campo eltrico constante, as duas foras se balanceiam e a molcula migra com a velocidade constante. 7 ELETROFORESE Eletroforese o fluxo de partculas carregadas = o fluxo migracional. A forca que atua sobre as molculas com cargas eltricas proporcional ao valor da carga e o potencial eltrico. O fluxo, J, proporcional a: a carga pontual (q), a concentrao da molcula (C), a rea que o fluxo atravessa (A), a mobilidade da molcula (u) o potencial eltrico |.|

\|AA =xqCAu J 8 ELETROFORESE 04/03/2013 5 A velocidade com que uma partcula se movimenta no campo eltrico depende de vrios fatores: - densidade de carga eltrica livre: principal fator, diretamente proporcional ao fluxo. - potencial eltrico aplicado: diretamente proporcional ao fluxo. A voltagem aplicada deve ser adequada para separar o mais rapidamente possvel, antes que a difuso espalhe os componentes. Voltagem muito alta aquece o sistema e prejudica a separao; - raio da partcula: inversamente proporcional; - viscosidade do meio: inversamente proporcional. FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAO ELETROFORTICA: 9 ELETROFORESE Outros fatores tambm influenciam na velocidade de migrao: - pH do meio (tampo); - fora inica do tampo; - interao com a fase fixa; - tipo de suporte; - grau de embebio (adsoro) do suporte; - temperatura; FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAO ELETROFORTICA: 10 ELETROFORESE A adsoro a caracterstica que certos suportes, principalmente o papel, agar e alguns tipos de agarose apresentam interagindo fisico-quimicamente com os anfolitos, como por exemplo, protenas carregadas positivamente. Para eliminar este problema, devemos trabalhar com solues-tampo cujo pH seja superior ao pI dos anflitos, de modo que a carga dos anfolitos seja negativa e repulse a carga negativa presente nestes meios. 04/03/2013 6 PONTO ISOELTRICO de uma protena o valor do pH no qual as cargas positivas e negativas (da protena) se equivalem. No tendo carga eltrica efetiva, e portando, no migrando na presena do campo eltrico. Existem aminocidos que alm da carboxila e do grupo amina possuem outros grupos dissociveis: Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cistena (grupo sulfidrila, pK=8,3), Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil, pK=12,5). As protenas so poliaminocidos e, portanto, possuem o comportamento mltiplo dos aminocidos componentes. 11 ELETROFORESE Protenas pI Pepsina Ovalbumina Soroalbumina Urease |-Lactoglobulina Hemoglobina Mioglobina Quimotripsinognio Citocromo C Lisozima -1.0 4.6 4.9 5.0 5.2 6.8 7.0 9.5 10.7 11.0 PONTO ISOELTRICO Quase todas as protenas possuem o ponto isoeltrico exato, por exemplo: Observe o ponto isoeltrico da pepsina que est apresentado na tabela. H alguma coisa errada? 12 ELETROFORESE 04/03/2013 7 As imunoglobulinas possuem pontos isoeltricos diferentes. Faa uma pesquisa e descubra o porqu. DISTRIBUIO DAS PROTEINAS SRICAS PELOS PONTOS ISOELETRICOS pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3 Albumina Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulina Alfa 2- globulina Beta - lipoprotena Alfa lipoprotena Observe os pontos isoeltricos das protenas sricas. Para quais polos eltricos elas vo migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6? O ponto isoeltrico da Gama-globulina est na faixa de 6.3-8.3. H alguma coisa errada? 13 ELETROFORESE TIPOS DE SUPORTES ELETROFORTICOS: ELETROFORESE LIVRE: Nesse sistema as substncias so separadas em meio totalmente lquido, em tubo em forma de U. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde a maioria das protenas tenha a mesma carga, porm com densidade de carga e mobilidade diversas. O ndice de refrao nessa fronteira muda pela passagem das protenas. Os movimentos de conveco provocados pela dissipao do calor exigem aparelhos e instalaes especiais. um mtodo em desuso. Diagrama esquemtico da clula de Tiselius para medir a mobilidade eletrofortica pelo mtodo do movimento de fronteiras. No exemplo mostrada duas diferentes espcies de protenas carregadas negativamente, com diferentes mobilidades eletroforticas, dissolvidas em soluo tampo. Neste caso todas as protenas migram para o nodo. As mais rpidas assumem as fronteiras (1) tanto ascendente quanto descendente, ultrapassando, as mais lentas (2). Como resultado formam-se duas fronteiras em movimento ascendente e duas fronteiras em movimento descendente. 14 ELETROFORESE 04/03/2013 8 ELETROFORESE EM SUPORTE SLIDO ELETROFORESE EM SUPORTE: A soluo aquosa de protenas imobilizada em uma matriz solida ou semi-slida (material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecnica) eliminando a conveco e os distrbios de vibrao. Diminui a difuso das substncias, o que facilita a sua completa separao. Metodologia mais simples, de maior resoluo e que necessita de menores quantidades de amostra em relao a eletroforese livre. ELETROFORESE EM SUPORTE SLIDO: Os suportes slidos mais usados so papel de filtro (EPF) e acetato de celulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que no interagem com as protenas migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato de celulose tem a vantagem sobre o papel de filtro proporcionando melhor fracionamento, inclusive na separao de beta-globulina e beta-lipoprotena, o que no possvel em papel, e maior rapidez na separao. O processo de eletroforese mantido at que os componentes tenham sido separados em zonas ntidas. A posio e quantidade das protenas podem ser avaliadas por um densitmetro. 15 ELETROFORESE ELETROFORESE EM SUPORTE SLIDO (a) Diagrama do instrumental utilizado. A amostra aplicada no centro do papel previamente umedecida pela prpria soluo tampo. As extremidades do papel so mergulhadas na soluo tampo, na qual os eletrodos esto imersos e aonde ser aplicado o campo eltrico. (b) Representao esquemtica do eletroforetograma completo. Veja que os ons positivos (cations) migram em direo ao ctodo e os ons negativos em direo ao nodo. Molculas com carga resultante nula, permanecem no ponto de aplicao da amostra. 16 ELETROFORESE 04/03/2013 9 ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SLIDO Os suportes semi-slidos mais usados so os gis de agarose e poliacrilamida. possvel maior resoluo eletrofortica quando o suporte ou material da matriz pode retardar ou excluir molculas proticas em funo dos seus tamanhos moleculares. ELETROFORESE EM GEL GAR OU AGAROSE (EA): o processo semelhante ao descrito para eletroforese em acetato de celulose. Uma variao dessa tcnica, bastante utilizada a IMUNOELETROFORESE. IMUNOELETROFORESE: aps a separao eletrofortica da amostra, faz-se uma reao antgeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparao para retirar as protenas solveis, restando os complexos Ag-Ac insolveis (precipitados no gel), que so visualizados atravs de colorao especfica. A analise imunoeletrofortica permite definir ou caracterizar uma substncia atravs de suas propriedades eletroforticas (mobilidade), diferenas na velocidade de difuso (coeficiente de difuso) e pelas propriedades imunolgicas (especificidade). s17 ELETROFORESE ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SLIDO ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA): A eletroforese realizada em gis feitos d