eletroforese de gfp

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Eletroforese da proteína GFP em gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE).

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  • Licenciatura em Biotecnologia 2 ano

    Engenharia Gentica

    Prof. Kiril Bahcevanfziev

    Electroforese da protena GFP

    Elaborado por:

    20110351 Ana Martins

    20110213 Ndia Correia

    20120217 Tiago Lima

    20110239 Tiago Pinho

  • 2

    ndice

    Introduo .......................................................................................................... 3

    Procedimento ..................................................................................................... 5

    Protocolo 1 ...................................................................................................... 5

    Protocolo 2 ...................................................................................................... 7

    Resultados e discusso.................................................................................... 13

    Protocolo 1 .................................................................................................... 13

    Protocolo 2 .................................................................................................... 14

    Concluso ........................................................................................................ 16

    Bibliografia ........................................................................................................ 17

  • 3

    ntrodu o

    GFP uma protena presente em alforrecas fluorescentes. Esta protena

    foi originalmente purificada bioquimicamente da alforreca como parte do

    complexo proteico, mas a sua versatilidade e utilidade para escolas e para a

    indstria biotecnolgica foi determinada na clonagem e na expresso desta

    protena recombinada em E. coli, como j foi feito em experincias anteriores.

    Na vertente da electroforese, colnias de bactrias em placas de

    controlo (no induzidas) e em placas com colnias induzidas so isoladas e

    examinada para determinar a presena ou ausncia da protena GFP.

    A protenas, ao contrrio do DNA que quantificado em termos de

    tamanho ou pares de base, so quantificadas em termos do seu peso

    molecular relativo a um tomo de hidrognio, em daltons.

    Para as quantificar, a tcnica de electroforese em gel de poliacrilamida

    contendo dodecilsulfato de sdio (SDS-PAGE) das mais utilizadas. Na SDS-

    PAGE, as protenas em soluo so sujeitas aco da corrente elctrica,

    migrando numa direco a uma velocidade que reflecte a sua massa molecular

    e carga global.

    As protenas so previamente desnaturadas pelo calor na presena de

    reagentes desnaturantes, os quais destroem as ligaes dissulfeto das

    protenas, e pelo detergente SDS. O SDS, carregado negativamente, rodeia as

    cadeias proteicas, desnaturando-as e cobrindo as protenas com cargas

    negativas. Assim, as protenas carregadas negativamente so separadas,

    migrando em direco ao elctrodo positivo.

    Gel

    Protenas

    Electroforese

    Direco da

    electroforese

    Ilustrao 1 Mecanismo da electroforese de protenas em gel de poliacrilamida. (A) Electroforese. (B) Migrao das protenas atravs do gel.

  • 4

    Dependendo do seu tamanho, cada protena migra de forma

    diferenciada ao longo do gel: protenas de menor tamanho molecular migraro

    mais rapidamente, enquanto as de maior tamanho tero mais dificuldade em se

    movimentar pelos poros do gel e, assim, movem-se mais lentamente.

  • 5

    Procedimento

    Protocolo 1 Purificao da Protena Verde Fluorescente (GFP)

    Preparao de Meio LB Lquido

    1. Reidratar a ampicilina e a arabinose, adicionando 3 mL de tampo TE a cada um dos frascos.

    2. Adicionar 55 mL de gua destilada a um Erlenmeyer e deixar ferver no micro-ondas. 3. Adicionar a cpsula de LB ao Erlenmeyer e deixar a embeber durante aproximadamente 20 minutos. 4. Ferver novamente a soluo no micro-ondas e agitar. Repetir este passo at

    estar completamente dissolvido. 5. Deixar arrefecer o meio at aproximadamente 50C.

    6. Pipetar 0.5 mL de arabinose e 0.5 mL de ampicilina no meio e agitar.

    7. Em 2 tubos de cultura aliquotar em cada, 2 mL do meio LB/Amp/Ara lquido. Os tubos podero ser guardados a 4C.

    Inoculao e Crescimento das Culturas Celulares

    1. Diferenciar os dois tubos de cultura com meio LB/Amp/Ara liquido com + e -.

    2. Inocular as bactrias transformadas com o plasmdeo pGLO cultivadas em meio LB/Amp (bactrias sem fluorescncia/produo da protena GFP) no tubo - e as bactrias transformadas com o plasmdeo Pglo em meio LB/Amp/Ara (bactrias com fluorescncia/produo da protena GFP) no tubo +.

    6 3. Fechar os tubos, agitar vigorosamente as culturas bacterianas durante 30 segundos e incubar horizontalmente na estufa a 32C durante 48 horas.

  • 6

    Fase de Purificao Concentrao Bacteriana e Lise

    1. Retirar as culturas da estufa e com uma luz UV verificar se existem diferenas entre elas. 2. Etiquetar um eppendorf com + e pipetar para o mesmo 2 mL da cultura que incubou no tubo +. Centrifugar o eppendorf durante 5 minutos velocidade mxima e descartar o sobrenadante.

    3. Ressuspender o pellet em 250 L de soluo TE. 4. Adicionar 1 gota de lisozima soluo bacteriana para iniciar a digesto

    enzimtica da parede celular das bactrias. Misturar o contedo invertendo o eppendorf. 5. Guardar o eppendorf a -20C durante a noite, o que ir causar a ruptura total das bactrias.

    Fase de Purificao LiseBacteriana

    1. Retirar o eppendorf do congelador e deixar descongelar. 2. Centrifugar 10 minutos velocidade mxima, reservar o sobrenadante e

    descartar o pellet (constitudo por detritos celulares insolveis).

    3. Aquando da centrifugao, preparar a coluna de cromatografia removendo a tampa, retirar a parte inferior e deixar o tampo drenar.

    7 4. Adicionar 2 mL, no total, de Equilibration Buffer desde o topo da coluna de cromatografia, aliquotando 1 mL de cada vez. Drenar o tampo at 1 mL de volume. Fechar a coluna de cromatografia pelo topo e pela parte inferior e guardar temperatura ambiente. 5. Finda a centrifugao, transferir 250 L do sobrenadante para um novo eppendorf tambm etiquetado como +. 6. Adicionar 250 L de tampo de ligao ao sobrenadante + e guardar a soluo a 4C.

  • 7

    Fase de Purificao Cromatografia de Protenas

    1. Etiquetar 3 tubos colectores de 1 a 3 e coloc-los no suporte de esponja. 2. Remover a tampa e a parte inferior da coluna de cromatografia e inseri-la no

    tubo colector 1, deixar o Equilibration Bufffer escorrer at superfcie da matriz HIC. 3. Pipetar cuidadosamente 250 L do sobrenadante + para a coluna de cromatografia, encostando a ponta parede do tubo, acima da matriz HIC. 4. Aps a drenagem transferir a coluna de cromatografia para o tubo colector 2. Adicionar 250 L de Wash Buffer e deixar escorrer atravs da coluna de cromatografia.

    5. Transferir a coluna de cromatografia para o tubo colector 3. Adicionar 750 L de tampo TE e deixar o volume escoar atravs da coluna. 6. Examinar os 3 tubos colectores e anotar as diferenas. Selar os tubos com parafilme e guard-los a 4C.

    Protocolo 2 Electroforese das GFP

    1. Laemmli sample buffer: adcionar 0.3 g de DTT a 30 ml de tampo Laemmli. Ressuspender. A concentrao final do DTT ser de 50 mM. A soluo restante dever ser armazenada a -20C. Antes de cada utilizao, aquecer a soluo temperatura ambiente para dissolver o precipitado de SDS que se forma aquando da congelao.

    2. Precision Plus Protein Kaleidoscope standards: Antes de cada utilizao, aquecer a soluo temperatura ambiente para dissolver o precipitado de SDS que se forma aquando da congelao. 3. TGS Running Buffer: Misturar 100 ml de 10x Tris-glycine-SDS running buffer

    com 900 ml de gua destilada. 1x TGS pode ser armazenado por 6 meses.

    Preparao

    1. Marcar 4 eppendorffs

    Branco, (-) calor Verde, (-) calor Branco, (+) calor Verde, (+) calor

  • 8

    2. Adicionar 300 l de Laemmli sample buffer aos dois tubos (-) calor.

    3. Usando uma ansa de inoculao, recolher colnias saudveis (20100) de uma placa LB/amp (colnias brancas) e transferir para o tubo Branco, (-) calor. Misture bem, invertendo o tubo entre o polegar e o indicador. Certifique-se de que no h nenhum aglomerado de colnias visvel no tubo. Se necessrio, os aglomerados podem ser dispersos com a ajuda de uma micropipeta de 100 l. 4. Repetir o processo isolando e misturando bem colnias saudveis (20100) de uma placa LB/amp/ara (colnias verdes) e transferir para o tubo verde, (-) calor.

    5 5. Transferir 150 l da mistura do tubo branco (-) calor para o tubo branco (+) calor. Transferir 150 l da mistura do tubo verde (-) calor para o tubo verde (+) calor.

    6. Aquecer os tubos marcados (+) calor, a 95C por 5 min, num banho-maria. Arrefecer at temperatura ambiente.

    Electroforese

    1. Preparar o gel (420%).

    2. Carregar o gel de acordo com a ordem da tabela 1 para que metade do gel seja posteriormente corada com Coomassie (para se ver a complexidade das

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    protenas da E. coli e a expresso da GFP) e a outra metade no (para se ver a fluorescncia verde).

    Nota: as amostras no aquecidas so muito mais viscosas do que as sujeitas a aquecimento pelo que pode ser mais moroso conseguir deposit-las nos poos do gel. Uma vez que as amostras no atingem a ebulio, o ADN genmico no desnatura a amostra fica com um aspecto mais espesso. As amostras devem ser carregadas lentamente e a ponta da micropipeta puxada rapidamente para cima e para fora do poo; as amostras devem ficar no fundo do poo.

    3. Deixar correr por 30 min a 200 V em tampo 1X TGS. Usando a lmpada de UV, examinar o gel d