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ELETROFORESE

Universidade da Região da CampanhaCentro de Ciências da Saúde

Farmácia – Op.Unitárias

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CONCEITO

É uma técnica de separação baseada na migração das moléculas carregadas, numa solução, em função de aplicação de um campo elétrico.

Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromoléculas, podemos separá-las pela

carga ou pelo tamanho.

É uma técnica laboratorial de separação de frações

de proteínas, enzimas, DNA e RNA

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Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel: O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar e também para manter o pH mais ou menos constante.

Moléculas com carga negativa migram para o pólo posi

tivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para

o pólo negativo (cátodo).

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HISTÓRICO

A eletroforese de proteínas foi realizada

pela primeira vez em 1937 (Arne Tiselius).

– “Eletroforese livre”: soro sanguíneo em cinco frações protéicas principais;

– Prêmio Nobel: 1948

– Atualmente é utilizadas em vários setores: químicos, bioquímicos, industrias farmacêuticas, ciência forense, etc.

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Aplicações

Identificação de pessoas: em testes de paternidade,

comparando o DNA do suposto pai, da mãe e do filho;

na identificação de criminosos.

Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes

de diagnóstico);

Na Agropecuária (Animais e plantas

transgênicos).

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TÉCNICA DA ELETROFORESE Separação de material orgânico que apresenta cargas elétricas

definidas em pH específico

– Cuba eletroforética;

– Eletrodos (pólos positivos e negativos);

– Solução tampão: pH específico

– Pentes: para fazer poços aonde as amostras se

rão aplicadas

– Suporte para eletroforese;

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TÉCNICA DA ELETROFORESE

– Amostra a ser investigada.

– Brometo de Etídeo: corante fluorescente usado para

corar ácidos nucléicos.

Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico

– Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visua

lizar o DNA corado com EtBr.

Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV)

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SUPORTES UTILIZADOS EM ELETROFORESE

Acetato de celulose

Gel de agarose (concentração firme acima de 1%)

Vantagens: – Facilidade de manuseio – Conservação

Ideal – Baixo custo operacional

Gel de amido (Alto grau de definição analítica das frações separadas)Desvantagens: – Dificuldade na preparação do gel (tempo X material)– Tempo de migração excessiva (12 a 16 h) – Dificuldade na coloração das frações separadas

Gel de poliacrilamida

Eletroforese capilar

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ELETROFORESE NA VERTICAL

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ELETROFORESE NA HORIZONTAL

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VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE

O corante mais comum para géis de agarose é o

Brometo de etídio (EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quan

do intercalado nas bases deDNA (ou RNA)

Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhan

do sob UV podemos ver as bandas de DNA.

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Como é feito o exame de paternidade?

2. Extração do DNA 3. Amplificação do DNA 1. Coleta do sangue 3. Digestão do DNA

4. Eletroforese 5a. Southern Blotting 5b. Hibridização da membrana de nylon

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Como é feito o exame de paternidade?

6. Visualização

Figura Inclusão - Observe que um dos alelos (banda) do filho é proveniente da mãe e o outro alelo proveniente do suposto pai. Neste caso, a paternidade fica comprovada.

Figura Exclusão - Observe que um dos alelos (banda) do filho é proveniente da mãe. O outro alelo, no entanto, difere dos alelos do suposto pai. Neste caso, ocorreu uma exclusão de paternidade.

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Diagnóstico laboratorial da doença falciforme em neonatos e após osexto mês de vida

A doença falciforme é uma desordem Gené

tica da hemoglobina, com alta prevalência

no Brasil.

Doença hereditária que causa a malformação das

hemácias, que assumem forma semelhante a foices.

Apresenta elevada morbidade e mortalidade, necessi

tando de identificação e tratamento precoces.

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Portanto tornou-se o seu diagnóstico obrigatório pelostestes de triagem neonatal, em todo o país.

O diagnóstico laboratorial da doença no neonato baseia-se na detecção da hemoglobina S utilizando-se preferencialmente as técnicas de IEF e/ou HPLC (sensibilidadee especificidade).

A mortalidade na doença falciforme, principalmente porinfecção bacteriana ou por seqüestro esplênico, inicia-seapós os dois a três primeiros meses de vida, justificando

a importância do diagnóstico precoce.

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Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico das hemoglobinopatias é complexo e envolve uma análise que deve considerar:

dados clínicos e herança genética;

idade da criança por ocasião da coleta;

tempo de estocagem e condições de armazenamento da amostra.

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Diagnóstico laboratorial em neonatos

Baseia-se na detecção da hemoglobina S e deve seguir as normas estabelecidas no PNTN (Portaria do Ministério da Saúde nº 822/01)

Os métodos utilizados identificam, além da doença falciforme, outras hemoglobinopatias, bem como as criançasheterozigotas (portadoras de traço para hemoglobinopatias).

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Inicialmente, os programas de triagem utilizavam dois procedimentos eletroforéticos associados:

A eletroforese em acetato de celulose e pH alcalino seguida da eletroforese em ágar citrato em pH ácido.

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A primeira técnica diferenciaas hemoglobinas A da F e das variantes

mais freqüentes,como as hemoglobinas S e C, mas é

incapaz de distinguiras hemoglobinas A2 da C, O e E, bem

como as hemoglobinasS da D ou da G devendo, portanto, ser

confirmada pelaeletroforese em ágar citrato em pH ácido.

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A associação dessas técnicas não constitui o melhor

procedimento para triagem neonatal populacional, pois,

além de mais trabalhosa para realização em larga escala,

apresenta menor sensibilidade e especificidade para o

diagnóstico neonatal.

Atualmente, a maioria dos programas de triagem Neo

natal substituiu os métodos convencionais pela eletrofo

rese por focalização isoelétrica (IEF)

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Figura 2. Visão parcial de gel de IEF com várias corridaseletroforéticas. Legenda: NAFSC: controle na posição 16 do

gel de IEF Padrões: Hb FS, Hb FSC, Hb AS, Hb FAS; Transfusão: Hb AF emrecém-nascido

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e/ou pela cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).

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Diagnóstico laboratorial após o 6º mês de vida

os recém-nascidos diagnosticados à triagem neonatalcomo prováveis doentes falciformes devem ser reavaliados laboratorialmente após o 6º mês de vida.

Um teste simples como a pesquisa de drepanócitos,embora incapaz de diferenciar os vários genótipos, podeconfirmar a presença da Hb S.

A repetição da eletroforese confirma o perfil hemoglobínico num melhor momento, ocasião em que se aproxima do perfil do adulto.

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Para os pacientes que não foram submetidos à triagemneonatal e para diagnóstico diferencial entre as diferentesformas de doença falciforme, além dos sinais e sintomasclínicos, o seguintes exames podem ser utiliza dos:

Eletroforese em pH alcalino em acetato de celulose;

Eletroforese em pH ácido em ágar citrato ou gel de

agarose;

IEF; HPLC (kit beta tal); Pesquisa de drepanócitos e/ou teste de solubilidade;

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Dosagem da hemoglobina fetal pela técnica de desnaturação alcalina ou por HPLC (kit beta tal);

Dosagem de hemoglobina A2 por microcromatografiaem coluna ou por HPLC (kit beta tal);

Hemograma completo (hematoscopia, VCM) e reticulócitos;

Estudo do sangue dos pais (estudo familiar).

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DANIELLA QUADROS E CAMILA SIMÕES

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