UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA E FARMACOLOGIADISCIPLINA DE BIOFÍSICA

ELETROFORESE

1. PROPRIEDADE ELÉTRICA DAS SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS As substancias orgânicas são em grande parte constituídas que apresentam propriedades elétricas e se comportam como eletrólitos quando presentes em uma solução. Estas propriedades serviram de base para o desenvolvimento de um método de separação de partículas em solução sob a ação da corrente elétrica. O deslocamento de partículas eletricamente carregadas pela ação de um campo elétrico ficou conhecido como “eletrocinese”. Se as partículas que se movimentam são íons, o fenômeno é chamado “ionoforese” e, se são micelas, “eletroforese”. Podendo neste caso ocorrer “anaforese” e “cataforese”, quando as micelas se dirigem para o ânodo ou para o cátodo, respectivamente.

2. CONCEITO DE ELETROFOSESE Podemos conceituar ELETROFORESE como sendo a migração de partículas ou moléculas possuidoras de carga elétricas e presentes em um meio líquido, quando submetidas à ação de um campo elétrico. Assim, é possível analisar os componentes de uma solução conforme a manifestação se suas propriedades elétricas, como, por exemplo, as proteínas do soro sanguíneo e outros líquidos biológicos que em dado pH podem apresentar cargas elétricas.

3. ELETROFORESE/MODELO SIMPLIFICADO

Sabemos que em uma solução estão presentes muitos componentes que são constituídos por partículas ou moléculas com cargas elétricas. No entanto, para facilitar a compreensão dos princípios físicos envolvidos no processo de eletroforese, utilizaremos a ilustração de um modelo simplificado constituído por uma única partícula de forma esférica possuidora de uma carga Q (negativa), num meio líquido, sob a ação de um campo elétrico de intensidade E (figura 1).

E

R f -Q

( - ) ( + )

Figura 1. Representação de forças que atuam sobre uma partícula eletricamente carregada (-Q) submetida a um campo elétrico. Nestas condições, a partícula ficará sujeita a ação de uma força ( f ) de origem elétrica, cuja intensidade é dada por :

f = E Q (1)

Opondo-se ao movimento da partícula existe a força de atrito viscoso ( R ) que, segundo STOKES, equivale a :

R = 6 r n v (2) Em que n é o coeficiente de viscosidade do meio líquido, r e v são, respectivamente, o raio da partícula e a velocidade com que ela se desloca.

O valor máximo que R pode assumir é igual ao de f, que quando atingido, a partícula entrará em equilíbrio dinâmico, isto é, sua velocidade será constante. Nestas condições, tem-se:

6 r n v = E.Q Sendo o valor de v determinado por:

v = E . Q (3) 6 r n v

A fórmula (3) mostra que a velocidade de deslocamento da partícula é diretamente proporcional a E e Q e inversamente proporcional a r e n.

4. O QUE PODEMOS DETERMINAR PELA ELETROFORESE

Usualmente com uma corrida eletroforética é possível à obtenção das seguintes informações:

a) Determinação do número de componentes numa amostra;b) Determinação da quantidade de cada componente na amostra;c) Determinação da mobilidade de cada componente da amostra;d) Obtenção de informações da camada elétrica envoltória da partícula;c) Determinação do ponto isoelétrico das moléculas.

5. TIPOS DE ELETROFORESE

a. ELETROFORESE DE FRONTEIRA MÓVEL

As primeiras pesquisas no sentido de separar os componentes de uma solução foram realizadas pela chamada eletroforese de fronteira móvel ou eletroforese livre. Neste tipo de eletroforese as partículas migram no interior da massa liquida (solução tampão), sob a ação da corrente elétrica existente entre os dois eletrodos. TISELIUS, em 1937, desenvolveu uma cuba que incorporava melhoria com relação às anteriormente utilizadas, pois permitia a aplicação desde 2 ml até 150 ml de solução da amostra que se desejava separar por eletroforese. Esta cuba se constituía de um tubo em U, de secção cilíndrica, dividido em 3 segmentos cujas extremidades se ajustam entre si pelas suas faces polidas e lubrificadas, permitindo o deslizamento lateral da parte central, conforme figura 2, abaixo:

elet. elet

secção superior

secção média

********** secção inferior (a) (b) (c)

FIGURA 2 . Representação esquemática da cuba de Tiselius :a. Colocação da amostra.b. Deslocamento da secção inferior para colocação do tampãoc. Conexão dos eletrodos em meio tamponado.

Este equipamento de eletroforese apresenta diversos inconvenientes referentes às presenças de correntes hídricas e de um complicado sistema fotográfico dos componentes separados. A temperatura desse sistema era controlada por um banho a temperatura

constante e igual à temperatura de máxima densidade do tampão (próxima de 4o C), evitando assim, as correntes de convecção que originavam correntes hídricas que deformam as linhas limites de separação das frações na corrida eletroforética. Outra inovação da cuba de TISELIUS foi à utilização do sistema óptico SCHLIERREN, que permite a observação ou registro fotográfico das linhas limites. No entanto, se tratava de um complicado sistema de visualização dos resultados, bem diferente das técnicas que são atualmente usadas. A utilização dessa técnica no estudo das proteínas presentes no soro sanguíneo proporcionou ao químico Arne Tiselius o premio Nobel de 1948. A instabilidade do equipamento comprometia de forma significante a eficiência do método na separação dos compostos. Esta deficiência foi minimizada com a utilização de meio suporte ( papel ou gel), onde ocorria a mobilização das partículas pela ação da corrente elétrica. O que ficou conhecido como eletroforese de zona ou de meio estabilizado.

b. ELETROFORESE DE ZONA OU DE MEIO ESTABILIZADO

Este tipo de eletroforese atualmente em uso, utiliza um dispositivo conhecido como cuba eletroforética que é composta de dois compartimentos, um com eletrodo positivo e outro com o eletrodo negativo. Acima do nível da solução tampão é colocado um suporte entre os dois compartimentos da cuba, no suporte se distende uma tira de papel de filtro ou fita de acetato de celulose, cujas extremidades a solução tampão. Ao contrário da eletroforese livre a de meio estabilizado exige um meio suporte poroso e estabilizado sob a forma de fibras, malhas ou gel, no qual as partículas devem migrar. Como instrumento analítico, sua grande vantagem está no fato de que apenas alguns microlitros da amostra é o suficiente para uma completa separação eletroforética, permitindo fazer avaliação tanto qualitativa como quantitativa dos componentes.

b1. MEIOS DE SUPORTE SÓLIDOS PAPEL DE FILTRO O papel de filtro foi o meio de suporte poroso inicialmente utilizado, principalmente na separação de proteínas séricas (como por exemplo, na análise de rotina em laboratórios clínicos). É de baixo custo, de fácil aplicação da amostra e localização das frações por colocação e posterior quantificação pela densitometria. Ao lado destas vantagens existe o inconveniente devido à falta de uniformidade nos diâmetros dos poros do papel de filtro, o que faz a distribuição do tampão não uniforme em toda extensão do papel. O tamanho da tira de papel de filtro usada é de aproximadamente 3 x 30 cm, onde são suficientes alguns microlitros da amostra para uma completa separação dos componentes. A cuba de eletroforese pode ser horizontal ou vertical de acordo com a disposição do papel, conforme pode ser visto nos esquemas abaixo (figuras). Tanto na horizontal como na vertical, existe uma parede divisória central separando a cuba em dois compartimentos, que devem permanecer cheios com a solução tampão (figura 3). Em cada compartimento há um eletrodo de platina, entre os quais é aplicada a diferença

de potencial. As soluções nos compartimentos devem estar sempre no mesmo nível, de modo a evitar o aparecimento de uma corrente líquida de um compartimento para o outro, através do papel que está mergulha no compartimento. Representações esquemáticas das cubas de eletroforese horizontal e vertical.

horizontal vertical

8

4

1 2 3 5 6 7

1 e 3- eletrodos; 2- parede divisória 5 e 7- eletrodos; 6- parede divisória4- meio de suporte 8- meio de suporte

A diferença de potencial que é aplicada geralmente entre 180 a 200 volts para evitar um elevado aquecimento do sistema que prejudica a separação entre os componentes da amostra. Dentro da cuba onde está à solução tampão, encontram-se os eletrodos constituídos geralmente por um fio de platina. O dispositivo é fechado por uma tampa de modo a impedir a evaporação do tampão e a corrida para proteínas plasmáticas tem duração de 2 horas.

ACETATO DE CELULOSE

O uso das fitas de acetato de celulose apresenta muitas vantagens sobre o papel, principalmente no que diz respeito à pureza e transparência. Os poros são de tamanhos regulares variando de 0,5 a 3, o que possibilita uma melhor uniformidade da distribuição do tampão. As proteínas séricas são melhores separadas em acetato de celulose que em papel de filtro. Consegue-se boa separação, em baixa voltagem, com 0,1 microlitros de soro. Pode-se até mesmo separar as proteínas séricas em tiras bem mais estreitas como é o caso da microeletroforese.

b2. MEIOS DE SUPORTES SEMI-SÓLIDOS

GEL DE AGAR

Os géis são preparados com uma concentração de 1 a 2 % de agar, no mesmo tampão a ser utilizado na eletroforese. A solução é aquecida em banho-maria até a completa dissolução do agar, quando então, é colocada sobre uma placa de vidro de modo a fornecer a espessura desejada. A gelificação é alcançada pelo resfriamento. A placa de vidro contendo o gel é levada para uma cuba horizontal, na qual o contato entre o gel e a solução tampão pode ser feito por dois pedaços de papel de filtro. A amostra a ser aplicada é misturada em igual volume, com uma solução de agar (levemente aquecida para a liquefação) duas vezes mais concentrada do que a usada na placa. A mistura é então aplicada num orifício feito no leito do agar, próximo ao cátodo. O gradiente de tensão usado é de 5 a 6 V/cm. Consegue-se uma boa separação em menos de 50 minutos. São as seguintes as vantagens do agar como meio suporte :

1. Consegue separações num tempo menor que no papel;1. A adsorção das proteínas é menor;2. Apresenta a vantagem de poder ser combinada com a imunodifusão no mesmo

meio, obtendo-se desta forma a técnica conhecida como imunoeletroforese.

GEL DE POLIACRILAMIDA

O gel de poliacrilamida é um material sintético que é usado como meio suporte para a eletroforese desde 1959. O gel consiste de uma mistura de monômeros de acrilamida com n’-metileno-bisacrilamida em soluções de 3 a 10 % de concentração do monômero, em presença de um catalizador como persulfato de amônio. Este gel de acrilamida se polimeriza por interligações a intervalos regulares através de pontes de metileno.

- CH2 CH (CONH) CH2 CH (CONH)2 -

CH2

- CH2 CH (CONH) CH2 (CONH)2 -

A poliacrilamida oferece as seguintes vantagens sobre os outros suportes:

1.Ausência de eletrosmose; 2.A transparência dos géis permite medidas diretas das bandas, por fotometria; 3.Os géis são quimicamente inertes, o que facilita a coloração diferencial; 4.O manuseio dos géis, bem como a preparação da poliacrilamida não

Exige maiores cuidados que os demais meios suportes.

6. ESQUEMATIZAÇÃO DA MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA

A migração das cargas elétrica na eletroforese segue o estabelecido na Lei de Coulomb: Componentes de cargas negativas migram para o pólo positivo, enquanto, as de cargas positivas se deslocam para o pólo negativo. Este princípio aplicado a eletroforese está esquematizado abaixo:

7. MOBILIDADE ELETROFORÉTICA

A fórmula ( 3 ) que representa a mobilidade eletroforética ( página 2) pode ser escrita como V / E = Q / 6 r n (4 ), onde se verificar que o segundo membro mostra-se independente de E, razão pela qual é denominado mobilidade eletroforética da partícula, que é representada por .

= V / E = Q / 6 r n ( 5 )

Fisicamente a mobilidade é a relação entre a velocidade por unidade de campo elétrico. O modelo da figura 1(página 2) é uma concepção puramente hipotética, tendo

em vista que na prática as partículas se encontram numa solução eletrolítica, cujo pH tem valor constante dado pela solução tampão. Neste meio a partícula em questão atrai os íons com cargas de sinais contrários, sendo deste modo envolvida por uma “nuvem” iônica. No instante da aplicação do campo elétrico, as cargas envoltórias tendem a se deslocar em sentido oposto ao da partícula, afetando assim sua mobilidade, o que nos leva a concluir que o referido modelo mostrado na figura 1 serve apenas para facilitar a compreensão do fenômeno, uma vez que a fórmula 4 não deve ser aplicada com todo rigor.

8. FATORES DE AFETAM A MOBILIDADE ELETROFORÉTICA

1. FLUXO DE LÍQUIDO ATRAVÉS DO MEIO SUPORTE

a.Potencial eletrocinético :

Uma partícula carregada de eletricidade em solução eletrolítica (tampão) se envolve de íons de cargas opostas, formando uma camada fortemente aderente, o que provoca uma redução no potencial elétrico (potencial eletrocinético da partícula). Quando se aplica campo elétrico ocorre um movimento de todos os íons existentes, consequentemente se desfaz parte da camada iônica que envolve a partícula e o potencial desta se reduz a um valor denominado potencial zeta. Este potencial é reduzido por um aumento na concentração dos íons do tampão, e como conseqüência a diminui a mobilidade das partículas, assim como também diminuem os efeitos eletrocinéticos. A partícula fica envolvida por uma delgada camada líquida, provocando um escoamento da fase líquida em sentido oposto ao movimento da partícula - eletrosmose. No caso da eletroforese de proteínas em geral o pH do tampão é normalmente alcalino, a migração se dará em direção ao ânodo, enquanto o fluxo de líquido (eletrosmose) se da em sentido oposto ao da eletroforese, ou seja, do ânodo (polo positivo) para o cátodo (polo negativo). Além da movimentação hídrica da eletrosmose, também existe o movimento da solução tampão pelo fenômeno de endosmose. Uma discrição sumaria e ilustrativa desses fenômenos de movimentação hídricas no suporte é mostrada abaixo: ENDOSMOSE Consiste no deslocamento do tampão a partir das extremidades do suporte em direção ao centro.

ELETROSMOSE A dissociação do grupamento funcional COOH em COO- e H+, os radicais COO- se fixa a textura do suporte (papel de filtro ou acetato de celulose), enquanto os radicais H+ ficam livres no sistema se juntando a H2O e formando o íons hidrônio, que se desloca em direção ao pólo negativo quando ocorre a passagem da corrente. Observe na

ilustração abaixo que existe um ponto de equilíbrio entre as forças de eletrosmose e endosmose, é neste ponto que deve ser aplicada amostra a ser analisada.

b.Efeito Joule

A passagem da corrente elétrica através do meio suporte provoca o aquecimento do mesmo, devido à conversão da energia elétrica em calor pelo efeito joule. A potencia térmica dissipada P é medida em Watts e é dada por:

P = V. i Sendo, V a diferença de potencial aplicada e i a intensidade de corrente. O equilíbrio térmico do sistema será alcançado quando a quantidade de calor dissipada for igual à retirada do meio suporte pela evaporação da água, isto é: i = j m L, a massa de água é representada por: m = V. i / j L, sendo j a força iônica do tampão, L o calor de evaporação da água, e m a massa de água em gramas que se evapora por segundo no meio suporte.

* Endosmose * Endosmose

* Eletrosmose

Ponto de Equilíbrio: Endosmose e Eletrosmose

Para compensar esta perda por evaporação um fluxo de água se escoará através do meio suporte, partindo dos compartimentos do tampão. De um lado terá o mesmo sentido que o fluxo eletrosmótico e do outro, sentido contrário.

2. Adsorção Resíduos aniônicos ou catiônicos do meio suporte podem adsorver as partículas alterando a sua mobilidade. Isto é frequentemente observado em eletroforese de proteínas em papel de filtro e se manifesta pelo aparecimento de “caudas” nas regiões onde se encontram as proteínas, dificultando a separação entre as mesmas. Este fenômeno pode ser minimizado pelo tratamento prévio do papel com uma solução diluída de ácido clorídrico e posterior lavagem em água destilada.

3. Força Iônica A força iônica de uma solução tampão j, corresponde à concentração dos eletrólitos e depende da dissociação iônica das moléculas de seus sais, definida pela expressão: j = C. Z

2/ 2, em que Z é a valência do íon considerado e C, a concentração que deve se manter nos menores valores possíveis, que se situa entre 0,05 a 0,07 molar, para evitar a “compressão” da carga intrínseca da proteína e também redução da condutividade do meio. De forma que um acréscimo na concentração dos sais do tampão provoca uma diminuição no potencial eletrocinético alterando a mobilidade da proteína.

9. AS PROTEÍNAS COMO PARTÍCULAS CARAREGADAS ELETRICAMENTE Uma molécula de proteína, quando em solução pode apresentar carga elétrica positiva, negativa ou nula dependendo do pH da solução. O pH para o qual a carga é nula é conhecido como ponto isoelétrico (pI) da proteína. Neste pH, as cargas positivas e negativas existentes nas moléculas (NH3

+ e COO -) provem dos grupamentos funcionais existentes nos aminoácidos, que se encontra em equilíbrio exibindo carga total nula. Nesta circunstancia o pH da solução tampão é igual ao pI da proteína. Uma proteína exibe carga negativa quando estiver em uma solução tampão de pH menor que o seu ponto isoelétrico( pH < pI). Caso a proteína esteja em solução básica exibirá carga positiva (pH > Pi), pois está em uma solução tampão de pH > que o seu ponto isoelétrico. Esta esquematização mostrada é apenas simbólica uma vez que na molécula de proteína não encontraremos apenas os dois grupamentos NH3

+ e COO-, mas sim um número relativamente grande deles distribuídos principalmente pelas cadeias laterais da molécula.

NH3

+ NH3+ NH2

Pr Pr Pr

COOH COO - COO -

pH < pI pH = pI pH > pI

10. APLICAÇÕES BIOMÉDICAS DA ELETROFORESE Existe um vasto campo de aplicações, entre os quais mais comuns estão o estudo clínico do plasma e líquidos presentes no organismo, resoluções de misturas complexas de proteínas, ácidos nucléicos, aminoácido, identificação de componentes, determinação da pureza e homogeneidade molecular, determinação do e aplicações na genética molecular.

REGISTRO ELETROFORÉTICO NORMAL E DE ALGUMAS PATOLOGIAS