eletroforese 2011 pdf

5/11/2018 Eletroforese 2011 PDF - slidepdf.com

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ELETROFORESE

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1. Características básicas;2. O fluxo determinante;3. Fatores envolvidos;4. O ponto isoelétrico;5. Tipos de eletroforese:

Eletroforese livre,

Eletroforese em suporte semi-sólido,Eletroforese em suporte sólido,Eletroforese capilar,Focalização isoelétrica,Eletroforese com SDS,Eletroforese bidimensional,

Eletroforese de alta voltagem,Immunobloting,Iontoforese.

6. Revelação;7. Analise qualitativa e quantitativa;8. Aplicações e procedimentos experimentais

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OBJETIVOS:ELETROFORESE



DEFINIÇÃO:Processo de separação e/ou caracterização dos componentes deum sistema, baseado na carga elétrica livre das partículas, ondeocorre a migração diferencial das mesmas quando submetidas aum campo elétrico.

PRINCÍPIO:Para que uma partícula se mova no campo elétrico é necessárioque possua carga, isto é, excesso ou deficiência de elétrons,resultando em carga elétrica livre.

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ELETROFORESE



A eletroforese é especialmente útil como método analítico. Suavantagem é que as proteínas podem ser separadas e visualizadas,permitindo determinar rapidamente o número de proteínas presentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação particular deproteínas.

A eletroforese permite também a determinação de propriedadescruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e sua massarelativa podem ser estimados.

Técnicas especializadas de eletroforese como Western blotting ,

eletroforese bi-dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadaspara detectar produtos gênicos extremamente escassos, encontrarsimilaridades entre eles e detectar e separar isoenzimas.

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ELETROFORESE



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Fracionamento e caracterizaçãoAminoácidosPeptídeosProteínas (lipo e glico)NucleotídeosÁcidos carboxílicosAdoçantesVitaminasCorticoides

PesticidasOutras partículas que apresentem cargasem função do pH do meio.

ELETROFORESE



Componentes que possuem carga elétrica livre migram para pólo decarga oposta a sua. Portanto, partículas carregadas positivamentemigram para o pólo negativo (cátodo) e partículas carregadasnegativamente migram para o pólo positivo (ânodo).

Na eletroforese a força elétrica, F el , que move a macromolécula (osácidos nucléicos, e as proteínas também podem ser separados deste modo) éo potencial elétrico, , vezes a carga líquida da molécula, q .

A força que pára a migração da macromolécula é a fricção, F f , que éproporcional a velocidade da partícula, V , vezes o coeficiente de fricção, f fr :

No caso do campo elétrico constante, as duas forças se balanceiam e amolécula migra com a velocidade constante.

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ELETROFORESE



Eletroforese é o fluxo de partículas carregadas = o fluxo migracional.

A forca que atua sobre as moléculas com cargas elétricas é proporcional

ao valor da carga e o gradiente do potencial elétrico .O fluxo, J , é proporcional a:

a carga (q) ,

a Concentração das moléculas (C) ,

a Área que o fluxo atravessa (A) ,

a Mobilidade das moléculas (u)

o Gradiente do potencial elétrico

x

qCAu J

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ELETROFORESE



A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétricodepende de vários fatores: densidade de carga elétrica livre: principal fator, diretamente proporcional.

potencial elétrico aplicado: diretamente proporcional. A voltagem aplicada deve ser adequada paraseparar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe oscomponentes. Voltagem muito alta, porém, aquece o sistema e prejudicaa separação

raio da partícula: inversamente proporcional viscosidade do meio: inversamente proporcional

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃOELETROFORÉTICA:

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ELETROFORESE



Outros fatores também influenciam na velocidade de migração:

pH do meio (tampão);

força iônica do tampão;

interação com a fase fixa; tipo de suporte;

grau de embebição (absorção) do suporte;

temperatura;

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃOELETROFORÉTICA:

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ELETROFORESE



PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é o valor do pH no qualas cargas positivas e negativas (da proteína) se equivalem. Não

tendo carga elétrica efetiva, e portando, não migrando na presença

do campo elétrico.

Existem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuemoutros grupos dissociáveis:

Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cisteína (grupo sulfidrila, pK=8,3),Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil,pK=12,5).As proteínas são poliaminoácidos e, portanto, possuem o comportamentomúltiplo dos aminoácidos componentes.

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ELETROFORESE



Proteínas pI

Pepsina Ovalbumina

Soroalbumina Urease -Lactoglobulina Hemoglobina Mioglobina Quimotripsinogênio Citocromo C

Lisozima

-1.0 4.6

4.9 5.0 5.2 6.8 7.0 9.5 10.7

11.0

PONTO ISOELÉTRICO

Quase todas as proteínas possuíram o ponto isoelétrico exato,por exemplo:

O ponto isoelétrico da pepsina que está apresentado na tabela é -1.Há alguma coisa errada?

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ELETROFORESE



As imunoglobulinas não possuem ponto isoelétrico fixo.Faça uma pesquisa e descubra o porquê.

ESQUEMA DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEINAS SÉRICAS PELOSPONTOS ISOELETRICOS

pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3

Albumina

Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulina

Alfa 2- globulina Beta - lipoproteína

Alfa – lipoproteína

Memorize os pontos isoelétricos das proteínas séricas.Para qual pólo elétrico elas vão migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6?

O ponto isoelétrico da Gama-globulina está na faixa de 6.3-8.3.Há alguma coisa errada?As imunoglobulinas todas não possuem o ponto isoelétrico fixo.

Fazer pesquisa e descobrir porque. 12

ELETROFORESE



MÉTODOS ELETROFORÉTICOS:

ELETROFORESE SEM SUPORTE: denominada eletroforese livre.

Nesse sistema as substâncias são separadas em meio totalmente líquido, em tubo emforma de “U”. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde amaioria das proteínas tenha a mesma carga, porém com densidade de carga emobilidade diversa. O índice de refração nessa fronteira muda pela passagem dasproteínas. Os movimentos de convecção provocados pela dissipação do calor exigemaparelhos e instalações especiais. É um método em desuso.

Diagrama esquemático da célula de Tiseliuspara medir a mobilidade eletroforética pelométodo do movimento de fronteiras. No exemplo é mostrada duas diferentes espéciesde proteínas carregadas negativamente, comdiferentes mobilidades eletroforéticas, dissolvidasem solução tampão. Neste caso todas as

proteínas migram para o ânodo. As mais rápidasassumem as fronteiras (1) tanto ascendentequanto descendente, ultrapassando, as maislentas (2). Como resultado forma-se duasfronteiras em movimento ascendente e duasfronteiras em movimento descendente.

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO

ELETROFORESE EM SUPORTE:

A solução aquosa de proteínas é imobilizada em uma matriz solida ou semi-sólida (material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica) eliminandoa convecção e os distúrbios de vibração. Diminui a difusão das substâncias, oque facilita a sua completa separação. Metodologia mais simples, de maiorresolução e que necessita de menores quantidades de amostra em relação aeletroforese livre.

ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO: Os suportes sólidos mais usados são papel de filtro (EPF) e acetato decelulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que não interagemcom as proteínas migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato decelulose tem a vantagem sobre o papel de filtro proporcionando melhorfracionamento, inclusive na separação de beta-globulina e beta-lipoproteína, oque não é possível em papel, e maior rapidez na separação. O processo deeletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados emzonas nítidas. A posição e quantidade das proteínas, pode ser avaliada por umdensitômetro.

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO

(a). Diagrama esquemático do instrumental utilizado. A amostra é aplicadano centro do papel previamente umedecida pela própria solução tampão. Asextremidades do papel são mergulhadas na solução tampão, na qual oseletrodos estão imersos e aonde será aplicado o campo elétrico.

(b) Representação esquemática do eletroforetograma completo. Veja queos íons positivos (cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativosem direção ao ânodo. Moléculas com carga resultante nula, permanecem noponto de aplicação da amostra.

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Os suportes semi-sólidos mais usados são os géis de agar, agarose e poliacrilamida. Épossível maior resolução eletroforética quando o suporte ou material da matriz poderetardar ou excluir moléculas protéicas em função dos seus tamanhos moleculares.

ELETROFORESE EM GEL ÁGAR OU AGAROSE (EA): o processo é semelhante aodescrito para eletroforese em acetato de celulose. Uma variação dessa técnica, bastanteutilizada é a IMUNOELETROFORESE. Nessa técnica após a separação eletroforética da

amostra, faz-se uma reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparação pararetirar as proteínas solúveis, restando os complexos Ag-Ac insolúveis (precipitados nogel), que são visualizados através de coloração específica. A analise imunoeletroforéticapermite definir ou caracterizar uma substância através de suas propriedadeseletroforéticas (mobilidade), diferenças na velocidade de difusão (coeficiente de difusão)e pelas propriedades imunológicas (especificidade).

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA). A eletroforese é realizadaem géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida éum suporte que funciona com uma peneira molecular, promovendo a filtração da amostrapela rede do gel, reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporçãoaproximada à massa de cada uma delas. Nesse caso há associação da separação porcarga e por massa relativa. Nesse sistema, proteínas com mesmas cargas são

separadas por suas massas relativas. s16

ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Aparelhos e peças para eletroforese vertical

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOFORMAÇÃO DO GEL DE POLIACRILAMIDA – polimerização

Gel de poliacrilamida

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOProcedimento esquemático

As amostras (misturas dasproteínas a ser analisadasestão colocadas com ajudadas micropipetas, nospoços do gel (1-3). Ocampo elétrico estáaplicado (4) e as proteínasmigram com velocidades

diferente (5, 6) dependendodas cargas elétricas livres etamanhos.

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOEM GEL ÁGAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA

Slab-eletroforese – eletroforese em camada fina do gel

Há dois tipos de géis: no topo o gel é comporos grandes e serve para concentrar asamostras; no baixo o gel é com porosmenores e serve para separação as proteínasou outros componentes do analise.

Esquema do gel em camada fina entre duasplacas de vidro. Aplicaçãodas amostras e resolução dasproteínas após revelação.

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ELETROFORESE



ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDORevelação

A) corante Coomassie blue; B) coloração por prata

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ELETROFORESE



A) brometo de etídio; B) nitrato de prata; C) marcação radioativa;

D) quimiluminescência; E) Coomasie Blue; F) fast blue BB salt.

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação




Com Luz UV Com corantes fluorescentes

Visualização dos ácidos nucléicos

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ELETROFORESE




Em Laboratorio

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ELETROFORESE




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ELETROFORESE



Eletroforese ácidos nucléicos

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ELETROFORESE



Eletroforese na presença do SDS

Um método eletroforético comumente utilizado para a determinação da pureza e do pesomolecular de proteínas faz uso de detergente dodecilsulfato de sódio (SDS). O SDS liga-seà maioria das proteínas, provavelmente por interações hidrofóbicas em quantidadesgrosseiramente proporcionais ao peso molecular de cada proteína e, em geral, naproporção de uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos. O SDS ligadoadiciona uma grande carga negativa à molécula de proteína, tornando insignificantes ascargas intrínsecas da mesma.

[CH 3 -(CH 2 ) n -CH 2 -O-SO 3 - ] Na +

Dodecilsulfato de sódio (SDS)

A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioriaadquire, então, uma mesma forma geométrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e,por esta razão, passam a ter uma mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, aeletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base nasua massa, com os polipeptídios menores migrando mais rapidamente. Proteínas tratadascom SDS, perdem a carga intrínseca e adquirem carga negativa constante em relação amassa relativa. Sendo negativas, são atraídas para o ânodo e a separação ocorre segundoa massa relativa. As proteínas menores migram na frente, o inverso da cromatografica por

gel-filtração. 27

ELETROFORESE

ELETROFORESE



ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDANA PRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS).

Exemplo do gráfico padrão para

determinação da massa relativa

Eletroforetograma

Etapas:1. medida das distancias percorridas (todas as proteínas e corante Lider);2. Calculo de Rf (migração relativa = Dp/DL);3. construção do gráfico Padrão, onde eixo Y – migração relativa e eixo X – Logaritmo damassa relativa das proteínas padrão;4. Utilizando valor do Rf da proteína desconhecida, determine o Logaritmo da massamolecular .

Descubra a massa relativa daproteína desconhecida, noEletroforetograma ao lado.

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L o g d a M a s s a R e l a t i v a

Migração Relativa

ELETROFORESE



FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO

A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o pontoisoelétrico (pI) de uma proteína. Talvez seja o método mais eficiente de

eletroforese.Nesse método, inicialmente, os anfólitos (uma mistura de ácidos e basesorgânicos, de pequena massa) são aplicados no suporte (um gel), apósaplicarmos um campo elétrico num tempo curto (pré-corrida) para distribuir osanfólitos ao longo do gel e estabelecer um gradiente linear de pH no gel de

poliacrilamida ou agarose.

Uma mistura de moléculas compontos isoelétricos diferentes é

aplicada (1). As moléculasmigram (2) até cada uma delaschegar ao local com o valor dopH igual ao seu pI (3).

1

2

3

3

Separação das moléculas em acordo com pontos isoelétricos

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ELETROFORESE



FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃOResultado

Quando uma mistura protéica é colocada nogel de poliacrilamida ou agarose cadaproteína migra para o cátodo ou anodo atéatingir o pH, que é igual ao seu pI (pHisoelétrico), formado uma área estacionária.Assim, proteínas com diferentes pontosisoelétricos distribuem-se de forma diferenteao longo do gel, formado uma áreaestacionária.O processo da revelação é similar ao

processo utilizado na nossa aula pratica compapel da celulose como suporte sólido:corante revelador e solução descorante.

A separação das moléculasde acordo com seus

pontos isoelétricos. 30

ELETROFORESE



Combinando dois métodoseletroforéticos :

a focalização isoelétrica (IEF ) e

a eletroforese na presença de SDS)

em géis bidimensionais consegue-sea resolução de misturas maiscomplexas de proteínas. Este métodocomposto é mais sensível do que afocalização isoelétrica ou a eletroforeseem SDS sozinhos. A eletroforese

bidimensional separa as proteínas depeso molecular idêntico, que diferemem ponto isoelétrico, ou proteínas compI similar, porém massas relativasdiferentes.

Eletroforese bidimensional. O principio

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ELETROFORESE



Combinando os dois métodos: 1. focalização isoelétrica (IEF ) e

2. eletroforese na presença de SDS

A eletroforese bidimensional separa as

proteínas de mesma massa relativa quediferem em pontos isoelétricos, ouproteínas com pI similares, porém massasdiferentes.

Revelado com o corante Coomassie.

Eletroforese bidimensional

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ELETROFORESE



Coloração por prata Corantes fluorescentes

Eletroforese bidimensional - Revelação

Cada pontinho representa um proteína diferente. A intensidade dacoloração indica a quantidade da proteína.

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ELETROFORESE



ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM

Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema paraseparação de pequenas moléculas com rapidez, antes que elas

possam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenospolipeptídios.

Fonte externo para eletroforese34

ELETROFORESE



“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método de diagnostico.

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ELETROFORESE



“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico.

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ELETROFORESE



Analise dos eletroforetogramas. Densitometros são fotocolorímetros específicos.

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ELETROFORESE



Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.Densitogramas = curvas de absorbância

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ELETROFORESE



Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.Densitogramas = curvas de absorbância

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Determinação as quantidades relativas de cada proteína nas analiseseletroforeticos

Como podemos calcular as quantidades relativas de cada proteína na amostra analisada, baseados

apenas nos densitogramas ? Isto pode ser resolvido de duas formas.

Baseado na área do gráfico. Primeiro tem que traçar uma linha na base do gráfico ligando os pontosiniciais e finais. Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivação de funções, mas podemosutilizar um artifício geométrico para resolver nosso problema: basta traçarmos retas paralelas aos eixos xe y, cobrindo todo o gráfico (formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como seusássemos um papel milimetrado (quanto mais próximas essas linhas umas das outras, mais exata será

a medida obtida). Para descobrir as áreas aproximadas das curvas do gráfico, devemos então contar onúmero de quadrados contidos no gráfico. Quando o quadrado estiver apenas parcialmente contido nográfico, a ele será atribuído valor 0,5. Quando o quadrado estiver totalmente contido no gráfico, a eleserá atribuído valor 1. Após a contagem, soma-se os valores, obtendo as áreas relativas das curvas.Outra possibilidade é aproxima o cada curva (pico) com uma ou mais figuras geométricas e calcula asáreas delas. Área somatória assumida como 100%. Área de cada pico – X%.

Com uma balança analítica. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico e com uma tesoura,

podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. Em seguida pesa-se esse recorte e anota-se a o peso obtido (PG =peso total), referente a todo gráfico. Depois, recorta-secada Gaussiana (picos) do gráfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa dasproteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total, PG.

Usar esse noção para analisar a fração relativa das proteínas séricas a partir dos densitogramasde eletroforese apresentados na pagina anterior.

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ELETROFORESE



Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



A eletroforese das proteínas do soro, dentro de certos limites, tem importantepapel na investigação clínica. A análise do diagrama eletroforético poderá serfeita por uma simples inspeção visual da fita, após coloração, ou através dosdados quantitativos obtidos por eluição da fita e leitura em fotocolorímetro ou

pela leitura da fita no densitômetro.

A eletroforese do soro do adulto normal, usando tampão pH 8,6 de forçaiônica 0,05, resulta na separação de 5 componentes protéicos:

fração albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama globulina.

A fração albumina é a que mais se distancia do ponto de aplicação no sentidodo pólo positivo. As frações globulinas são designadas pela ordem demobilidade decrescente. Uma vez que a densidade da coloração dasdiferentes frações é proporcional as suas concentrações, a fração albumina éque se mostra mais densa.

Eletroforese das proteínas séricas:

correlações clínico-patológicas

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:

Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%

Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%

Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%



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ELETROFORESE

ELETROFORESE



GLOBULINA ALFA-1 AUMENTADA: Enfermidades agudas, crônicas dequalquer natureza (por exemplo, resfriados, furunculose); síndromenefrótica; processos inflamatórios agudos. Neoplasias e outros;síndrome com destruição tissular; efermidade de Hodgkin; úlcera

péptica; gastroenterites agudas; colites ulcerosas e carcinoma gástrico.GLOBULINA ALFA-1 DIMINUÍDA: Cirrose hepática, periarteritescrônicas, hepatites por vírus, má absorção e má nutrição.

CLOBULINA ALFA-2 AUMENTADA: Síndrome nefrótica, icterícia

obstrutiva, tuberculose pulmonar e extrapulmonar, mieloma múltiplo,enfermidade de Hodgkin, nefrose e glomerilonefrite, enfermidades docolágeno, diabete melitus, úlcera péptica, gastroenterites agudas,colites ulcerosas e carcinoma gástrico



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ELETROFORESE

ELETROFORESE



GLOBULINA ALFA-2 DIMINUÍDA: Hepatites por vírus, cirrose hepática,síndrome de má absorção e má nutrição. BETA CLOBULINA AUMENTADA: Especialmente em todos os processos emque há hiperlipemia como: síndrome nefrótica, mixedema, icterícia obstrutiva emieloma múltiplo.

BETA GLOBULINA DIMINUÍDA: Leucemias mielogênicas e momocíticas,colites ulcerosas, nefrose e glomerulonefrites. GAMA CLOBULINA AUMENTADA: Inflamações crônicas (entre elasendocardites bacterianas e hepatites crônicas), necroses hepáticas,enfermidades do colágeno com excessão da perioarterite nodosa, calazar(leishmaniose), linfogranuloma venéreo, cirrose crônica (ê característica a

quase ausência de demarcação entre os picos beta e gama), sarcoidoses,artrite reumatóide, plasmocitoma e macroglobulinemia.GAMA GLOBULINA DIMINUÍDA: Baixa resistência por infecções, leucemiaslinfáticas, úlceras gástricas, colites ulcerosas, enterites agudas, câncer doestômago, nefroses, glomerulonefrites e enfermidades de má absorção enutrição.

Eletroforese das proteínas séricas:correlações clínico-patológicas

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ELETROFORESE

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Eletroforese em capilar: apresentação esquemática

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Eletroforese em capilar

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Tipos de eletroforese em capilar:

Eletroforese zonal em capilar (EZC): é a forma mais simples de eletroforese em

capilar e também é conhecida como em eletroforese em solução. A separação sebaseia na diferença da razão massa/carga das substâncias. O fundamental na EZC é ahomogeneidade da solução tampão e a uniformidade na intensidade do campo elétricoao longo do capilar. O controle do pH do meio é muito importante uma vez que eleinterfere na dissociação dos grupamentos acídicos e protonação dos grupamentosbásicos do soluto.

Eletroforese em gel no capilar (EGC): é uma adaptação da eletroforese em geltradicional só que ocorrendo no interior do capilar, que é preenchido com uma soluçãode polímeros criando uma peneira molecular. Deste modo é possível separar pelotamanho substâncias que apresentam a razão massa/carga similar. Está técnica écomumente empregada na determinação do peso molecular de proteínas e na análisede seqüenciamento de DNA.

Focalização isoelétrica em capilar (FIC): possibilita que moléculas anfóteras comoproteínas sejam separadas em um gradiente de pH estabelecido entre o cátodo e oanodo. As moléculas irão migrar até onde sua carga resultante seja zero. No pontoisoelétrico as moléculas estacionam em uma zona focada, que pode ser localizadautilizando um detetor de pressão ou por meios químicos. A FIC é muito utilizada paracaracterização de proteínas.

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Estudo clínico do plasma e outros líquido do organismo demamíferos (EAC ou EPF);

Resolução de misturas complexas de proteína, ácidos nucléicos

e aminoácidos (EGPA, EGPA-SDS, FI);

Determinação da pureza e homogeneidade molecular (EGPA,EGPA-SDS, FI);

Determinação do pI das proteínas (FI);

Determinação da massa relativa (EGPA-SDS).

APLICAÇÕES:

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Determinação de alterações em amostras submetidas a ação de

agentes químicos (drogas) ou físicos (radiações) - (EGPA, EGPA-SDS,FI);

Genética molecular (EGPA** ou EGPA-SDS)- testes de paternidadeentre outros;

Testes mais refinados para diagnóstico (“immunoblotting” - testepara HIV) - (EGPA ou EGOA-SDS);

Veterinária (EGPA, EGPA-SDS, FI) - usado para avaliar alteraçõespatológicas em animais;

Taxonomia** (EGPA, EGPA-SDS, FI) - Classificação de espécies.

APLICAÇÕES:

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Obstáculos para penetração da pele: A resistência do estrato córneo (camada maisextrema da pele) impede a entrada de medicamentos: moléculas grandes têm muitadificuldade em atravessar a epiderme para os vasos sangüíneos da derme.Soluções: Os equipamentos utilizados nesse caso denominam-se os aparelhospara iontoforese e estão apresentados na figura seguinte. O aparelho utiliza pulsosde eletricidade praticamente indolores que tornam a pele permeável.

IontoforeseA eletroforese pode ser utilizada para “injeção” de

medicamentos através da pele.

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



https://reader003.{domain}/reader003/html5/0212/5a8088a4bb474/5a8088c

Estrutura da pele

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Estrutura da pele

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Iontoforese

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Iontoforese é um processo de facilitação da penetração dos tecidosbiológicos para substâncias ionizadas (com cargas elétricas livres)quando submetidas a aplicação do potencial elétrico adequado.

As substâncias são geralmente os fármacos (antiinflamatórios,

esteróides e anestésicos locais). Iontoforese é usada paratransportar quantidades clinicamente significativas dos fármacospara região cutânea e subcutânea do tecido.

A análise experimental e clínica demonstram a importância deste

método na clínica, fisioterapia, dermatologia, otorrinolaringologia,oftalmologia, odontologia, e neurologia.

Iontoforese

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ELETROFORESE

ELETROFORESE



Mecanismos: Ionização e Eletroosmose

As drogas colocadas em meio aquoso são compostos iônicos que sedissociam em partículas carregadas positivamente e negativamente,portanto serão atraídos por eletrodos de sinal contrário.

Ionização -> ex. (fosfato de dexametasona sódica)(-) íon fosfato de dexametasona e (+) íon sódio.

Iontoforese

A identificação da droga prediz a polaridade do eletrodo que será usados

para mover ou entregar a droga ao tecido.Drogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogasnegativas, sob o cátodo (eletrodo negativo)

O eletrodo ativo contém a droga e o eletrodo oposto é chamado deeletrodo dispersivo.

56

ELETROFORESE

Eletroosmose



1. Eletroforese;2. Electroosmose com cargas

elétricas fixas negativas. Osporos seletivamente

preenchidas com cátions quefaz acontece o fluxo da água(junto com os cátions) nadireção do pólo negativo =catodo.

3. Eletroosmose com cargaselétricas fixas positivas. Os

poros seletivamentepreenchidas com anions quefaz acontece o fluxo da água(junto com os anions nadireção do pólo positivo =anodo.

Esse fluxo leva as moléculasneutras e, também influi na

migração das moléculas comcargas elétricas livres:freando aquelas que semovimenta contra fluxo daágua e acelerando amigração outras que semovimenta na mesma

direção do que a água.

Eletroosmose

1.

2.

3.

57

ELETROFORESE



Então na eletroosmose o fluxo do solvente acontece enquanto o campoelétrico é aplicado sobre um meio poroso (membrana, pele....) com cargas

elétricas fixas nas paredes dos poros.Por isso razão os suportes (solido ou semi-solido) para o eletroforesesempre estão feitos dos materiais sem as cargas elétricas fixas nos poros.

Eletroosmose

Em pH fisiológico (~7), a pele apresenta excesso de cargas negativas quefacilita migração dos cátions e o fluxo do solvente/água (junto com as

substâncias dissolvidas) para o catodo.Fluxo: de anodo para catodo.

A pele é isoelétrica (número das cargas positivas igual ao número das cargasnegativas) em pH entre 3 e 4 (Costello, et al 1995).

Por isso o fluxo da água se reverte em pH <3, porque nessas condições apele apresenta excesso de cargas positivas que facilita migração dosanions e o solvente (junto com as substâncias dissolvidas) para o anodo.Fluxo: de catodo para anodo. Fonte da energia elétrica

58

ELETROFORESE

Iontoforese: ELETROFORESE



Iontoforese:Eletroforese + Eletroosmose

59

ELETROFORESE

ELETROFORESE



Princípios da Iontoforese

A taxa de penetração da droga aumenta com:

Aumento da carga da drogaAumento da corrente iônicaDecréscimo da massa molecular do íon

(íons pequenos e leves apresentam maior

mobilidade)

www.dexrx.com

60

ELETROFORESE

ELETROFORESE

http://www.dexrx.com/

http://www.dexrx.com/



Curdy, C., Kalia, Y.N., & Guy, R.H

A resistência oferecida pela pele reside na camadasuperficial da epiderme, ou seja, estrato córneo, quelimita a perda de água do corpo.

O estrato córneo é o maior obstáculo para a entrega

de drogas transdérmica.


61

ELETROFORESE



• Banga, 1998 A espessura da pele é de aproximadamente 2 a 3 mm e o

estrato córneo tem 10-15 μm.

Os espaços intercelulares estão completamente cheios delamelas que são compostas por lipideos, ceramidas,colesterol e ácidos graxos em quantidades praticamenteiguais.

A morfologia dos lipídeos é importante para a função debarreira do estrato córneo.


62

ELETROFORESE



• Robinson, A.J & Snyder-Mackler, L., 1995

Muitos compostos são carregados positivamente ounegativamente. Quando estes compostos são colocados emsoluções apropriadas, dissociam-se em componentes que secomportam como íons. Estes íons podem ser influenciados pelocampo elétrico aplicado a solução, onde eles podem ser atraídospelos pólos de sinais contrários. A força elétrica de repulsãodestas cargas é a força motriz para a iontoforese.


63

ELETROFORESE



Teoria da Iontoforese

A densidade de corrente é medida pela correnteaplicada dividido pela área em centímetros quadrado doeletrodo.

A quantidade de drogas entregue depende da correntetotal aplicada multiplicada pelo tempo.

A corrente contínua unidirecional causa irritação na pele,sendo tolerada em no máximo 1 mA/cm quadrado.

64

ELETROFORESE



Iontoforese vs InjeçãoA iontoforese é um tratamento não invasivo é orisco para a pele é baixo.

A iontoforese permite um tratamento sem dor parapacientes que não suportam injeções.

A iontoforese minimiza os traumas que ocorrem

nas injeções.

65

ELETROFORESE



Iontoforese vs Via OralA iontoforese permite a aplicação de drogas sem queelas sejam absorvidas pelo trato gastrointestinal

A iontoforese é permite a aplicação de drogastranspondo o metabolismo hepático.

A iontoforese diminui os riscos de superdosagem.

66

ELETROFORESE



Área de Aplicação

Precauções e Contra-indicaçõesOs riscos para o paciente é baixo, mas, ela não pode ser empregadano tratamento nas seguintes condições:

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Marcapasso cardíacosEstimulação na área torácicaEstimuladores implantadosSobre as carótidas no pescoçoÁrea faríngeaSangramentos

Diminuição ou ausência desensação.

CâncerHiper ou hipotensão não

controladaDoenças vascularesperiféricasTromboflebitesGestaçãoOsteoporoseObesidade morbidaDesordens epiléticas

ELETROFORESE



Fatores de AbsorçãoFatores fisiológicos

As condições do leito vascular é importante, pois a

vasoconstricção leva a uma diminuição do fluxo, enquantoa vasodilatação, aumenta-o.

Existem pequenas diferenças no fluxo de drogas por

iontoforese em mulheres e homens.

A quantidade e o tipo de pêlos também afeta o fluxo dedrogas na iontoforese.

68

ELETROFORESE



Penetração e DistribuiçãoA penetração dos íons

A penetração dos íons depende do tipo de tecido.

A profundidade é de aproximadamente 1 centimetro.

Alguns íons penetram até nos capilares subcutâneos.

69

ELETROFORESE



Aplicações ClínicasInflamação com dor constante

Fosfato sódico de Dexametasona a 0.4% (polaridade negativa)entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

Diclofenaco a 5% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

Cetoprofeno a 10% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 5 semanas

Hidrocloreto de Lidocaína a 4% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 3 semanas

70

ELETROFORESE



Aplicações Clínicas

Artrite Reumatóide

Salicilato de Sódio a 2% (polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.

Metacolina a (polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.

Citrato de Potássio a 2% polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

71

ELETROFORESE




Espasmos Musculares

Sulfato de Magnésio a 2% (polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais

durante 4 semanas Baclofeno a 0.5% polaridade negativa) entregue via ânodo

em 3 aplicações semanais durante 8 semanas

Cloreto de cálcio a 2% ( polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

72

ELETROFORESE




Cicatrização

Iodeto de Potássio a 10% ( polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.

Cloreto de Sódio 3% (polaridade negativa) entregue via cátodo

em aplicações por 4 semanas

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ELETROFORESE




Depósitos de Cálcio

Ácido Acético a 4% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais em 4 a 8 semanas

Neuropatias

Gabapentina a 6% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais em 2 a 8 semanas

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ELETROFORESE




Verrugas

Salicilato de sódio a 2% (polaridade negativa) entreguevia cátodo a cada 6 a 9 dias em 3 seções de

tratamento.Gôta

Citrato de lítio a 3% (polaridade positiva) entregue via

ânodo em 3 a 5 aplicações por uma semana

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ELETROFORESE



Concentração da DrogapH da solução da droga Preservativos

Fonte de corrente elétrica e intensidade de correnteIntensidade de corrente

IMPORTANTE RELEMBRAR QUE NAIONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TERÍONS COMPETIDORES.

Variáveis da Iontoforese

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ELETROFORESE




Concentração da droga

O movimento de íons aumenta com a concentração do soluto

no eletrodo doador.

pH da Droga

O pH é essencial para entrega da droga e comforto dopaciente. A soluções ótimas que predominam na formaionizada.

77

ELETROFORESE




Preservativos

Os Preservativos na formulação podem ser transferidos paraa pele durante a iontoforese. Isto pode causar eritemaslocalizados.

Os Preservativos criam competição iônica que resulta na

redução de entrega da droga.

78

ELETROFORESE



Variáveis da IontoforeseTipo de fonte de corrente elétrica

Sistemas de corrente constante são mais confiáveis que os

de voltagem constante.

Intensidade de corrente

A intensidade de corrente aumenta o fluxo de íons.

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ELETROFORESE



Efeitos colaterais do IontoforeseReação Alcalina

Queimaduras químicas podem ser induzidas sob os

eletrodos. Este tipo de queimadura pode ser causada porreações ácidas ou básicas.

Reações Alcalinas são mais comuns e resulta da

acumulação de hidróxido de sódio sob o cátodo.

80

ELETROFORESE



Efeitos colaterais da IontoforeseQueimaduras na pele

A corrente elétrica através da pele cria o movimento deíons. Este movimento de íons conduz a alteração do pH dapele.

As queimaduras podem ser causadas pela corrente e não

pela medicação.

81

R d i d i d iELETROFORESE



Reduzindo os riscos de queimar a

pelePara reduzir a incidência de irritação a pele:

1) Limpeza com sabão, água ou álcool antes da aplicação.

2) SATURAR OS ELETRODOS garantindo que não haja áreassecas. Preencha os eletrodos adequadamente.

3) Fazer as apliçações iontoforéticas somente em pele íntegra.

4) Reduzir a densidade de corrente por aumento no tamanho doeletrodo e decréscimo de corrente.

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I di õELETROFORESE



Indicações

• Inflamação• Dores• Depósitos do Cálcio

• Cicatriz e aderências

• Edemas• Ferimentos e infecções• Hiperidrose

Indicação Meios Elétrodo Tempo (minuto)

Corrente (miliampère)

HiperidroseEdemaVasodilataçãoÚlcera de Varicose

Bater a águaHialuronidaseHistaminaMetacolina

Ânodo (+)Ânodo (+)Ânodo (+)Ânodo (+)

15203-520

15-2020

2-105-30

http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm

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ELETROFORESE



(Robinson & Snyder-Mackler, 1995)• Pele danificada• Diminuição de sensação na pele• Sensibilidade a droga administrada• Sensibilidade a corrente direta• Marcapassos cardíacos e outros implantes

• Arritmias Cardíacas

Contra-indicações

84

ELETROFORESE



O aparelho para iontoforese

85

Fatores quais influenciaram na penetração



1 Concentração da substancia2 Densidade do corrente elétrico

3 Duração do processo

4 Impedância da pele

5 Lipofilicidade/hidrofilitidade e o peso molecular do fármaco6 Mobilidade do fármaco e a condutividade da solução

7 Valencia (numero maximo/densidade das cargas elétricas)

8 Valor de pH

9 Estado de ionização (depende do pK e pH)10 Efeito do Iontoforese na metabolização e degradação do

fármaco na pele

iontoforetica dos fármacos

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ELETROFORESE



Descreva o princípio da técnica de eletroforese e o procedimento detalhadode análise eletroforetica de uma amostra de proteínas.

Como determinar a quantidade relativa das proteínas num eletroforetograma?

Como a eletroforese pode ser utilizada em exames que auxiliam no processo

de diagnóstico?Qual é o significado de cada um dos parâmetros que compõem a equação de

fluxo migracional?

Qual é o fator mais relevante que determina a movimentação das proteínas

do soro na eletroforese da aula pratica?

Quais fatores influenciam na velocidade de migração da partícula durante aeletroforese?

Lista de exercícios

87

ELETROFORESE



1. Defina ponto isoelétrico. Como determiná-lo experimentalmente de maneirarápida e com maior precisão? Qual é o tipo de substância que torna istopossível?

2. Descreva resumidamente os tipos de eletroforese. Em que situações seaplicam?

3. Em que tipo de eletroforese a massa relativa das proteínas tem maior

importância? Explique como e que tipo de substância torna esse fator o maisrelevante?

4. Como revelar a localização das proteínas num eletroforetograma?5. Como determinar a quantidade relativa das proteínas reveladas numa

eletroforetograma?6. Que é e como funciona o densitômetro?7. Os corantes utilizados numa eletroforese (Lider e Revelador) possuem quais

propriedades?

Lista de exercícios

88

ELETROFORESE



Analise eletroforetica das proteinas do plasma de um paciente

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PROCEDIMENTO

ELETROFORESE



PROCEDIMENTO

MATERIAL NECESSÁRIO:

Cuba de acrílico para eletroforese, c/ponte de 11cm de largura,ajustável a 8,5 cm;Fonte de corrente continua (200-300 V);

Densitômetro (O densitômetro é um aparelho baseado na propriedade dasmoléculas de absorver a luz diretamente proporcional à concentração das

moléculas numa solução (espectrofotômetro específico));

Estufa, Fita de acetato de celulose 2,5x14 cm (Cellogel), Papéis defiltro, Pipeta automática, Tesoura, Pinça

Placas de Petri, Amostra (soro)

Corante líder (marcador da mobilidade máxima de qualquer partícula(molécula) numa eletroforese).

90

PROCEDIMENTOELETROFORESE



MATERIAL NECESSÁRIO:

Tampão de corrida: - veronal sódico: 5,15g +EDTA 2,6g por 1 litrode água - pH=8,6, força iônica= 0,075

Solução corante revelador: Amido negro 0,5g+metanol 45%+

ácido acético 10% em água.

Solução descorante: metanol 47,5% + ácido acético 5% em água

Solução desidratante: metanol

Solução transparentizante: Metanol 85%+ ácido acético 14%+glicerol 1%

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PROTOCOLO ELETROFORESE



1 – Observar o sinal do polo elétrico marcado na canaletas da cuba. Colocar tampão

de corrida nos dois lados da cuba, até a metade aproximadamente.

2 - Retirar com auxílio de pinça, a fita de acetato de celulose do pacote em que amesma é acondicionada, mergulhá-la no tampão de corrida e agitar (movimento devai-vem) durante 3-5 minutos.

3 – Retirar a fita da solução tampão com uma pinça (prendedo por umaextremidade), segurando-a na posição vertical em cima da cuba; remover o excessode tampão da fita, tocando-a levemente na outra extremidade com uma folha depapel de filtro. Escolher o lado permeável da fita.

Obs: somente uma das faces da fita é permeável - a opaca.

92

ELETROFORESE



PROTOCOLO

4 - Sempre com o auxílio de pinça, esticar muita bem a fita na ponte.Observar que ambas as extremidades estejam em contato com asolução tampão e que o lado permeável da fita estar situado paracima.

5 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 3-5 minutos, para equilibrarainda mais os poros da fita com a solução tampão.

6 - Desligar a fonte. Pipetar a amostra do soro com a pipetaautomática e com a mesma colocar numa placa de Petri, misturandocom o corante Líder. (O corante Líder é um corante que não temafinidade por proteínas, mas migra com maior velocidade do que as

proteínas. A distância percorrida pelo corante serve como uma distânciapadrão.) Aplicar uma pequena (5 microlitros) amostra, distante 1-2cm do pólo negativo (POR QUE? Explicar!). Marcar a posição daaplicação da amostra picotando com a tesoura os dois lados lateraisda fita (ponto de partida).

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7 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 30 minutos. Observar acorridapelo movimento do corante lider.

8 - Desligar a fonte, marcar a posição do corante líder picotandocom a tesoura de um lado lateral da fita (chegada). Segurar a fitacom a pinça no meio da fita e cortá-la em ambas as extremidades (~1cm acima do ponto de partida e ~1 cm abaixo do de chegada).Coloque a fita na placa de Petri e aplicar a solução corante revelador

(no nosso caso é Amido negro), por 2 minutos!

9 – Devolver o corante revelador para o recipiente e aplicar asolução descorante agitando. Fazer várias lavagens à temperaturaambiente e duas com solução descorante quente, com finalidade deremover o excesso do corante revelador. A fita deve ficar novamentebranca, exceto os locais onde tem proteína. OBS: O corante lídertambém é removido.

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PROTOCOLOELETROFORESE



PROTOCOLO

Analise do Eletroforetograma

Medidas necessarios para identificação das proteinas.Distancia percorrida e Migração Relativa,

Rf = DP/DL

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PROTOCOLO

ELETROFORESE



PROTOCOLO

10. Retirar a fita do descorante e estendê-la na parte de cima de umaplaca de Petri.

Medir a migração das proteínas com régua e calcula a migração relativa(Rf), definida como Rf= DP /DL , onde DP é distancia percorrida porproteína, mm, e DL é distancia percorrida por corante líder, mm. Compare seus dados com o padrão de migração relativa das proteínasnas nossas condições, as quais são: 1. Gama-globulina- ~0.320.07; 2. Beta- globulina~0.600.07;

3. Alfa2-globulina~ 0.730.06; 4. Alfa1-globulina~ 0.840.04;5. Albumina-~ 0.940.03

A partir da comparação indicar a localização das frações básicas àsproteínas do soro no seu eletroforetograma.

96

PROTOCOLO

ELETROFORESE



PROTOCOLO

11 – Na preparação da fita para leitura no densitômetro, antes devemos colocá-la por 30 segundos em metanol puro e logo em seguida, por 1 minuto na

solução transparentizante.

12 - Retirar a fita do solução transparentizante, estendê-la na parte de cima deuma placa de Petri e deixar na estufa

13 - Retirar da estufa, esperar esfriar, colocar na mesa de um densitômetro para realização da leitura e determinação da quantidade (relativa ou absoluta)de cada proteína.

até que a fita fique transparente (aproximadamente 1 minuto).

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O densitômetro é um aparelhobaseado na propriedade dasmoléculas de absorver a luz

diretamente proporcional àconcentração das moléculas numasolução (espectrofotômetroespecífico).

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O resultado da leitura da fita está apresentadocomo um gráfico (chamada “densitograma” quesoma de várias Gaussianas “picos”) onde asáreas sombreadas por cada Gaussiana (pico)representam a quantidade de proteína (ouqualquer outra substância que absorva a luz).

Soma todas as áreas = 100% das proteinasanalisadas;Área de qualque um - X

O densitômetro é construído para medidas da absorbância aolongo da fita com as proteínas coradas.

FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:

Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%

Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%

99




Agora que temos o gráfico obtido com a análisedensitométrica das corridas eletroforéticas, umpequeno problema se apresenta: Como podemos

calcular as quantidades relativas de cada proteína nasolução da corrida, baseados apenas no gráfico? Istopode ser resolvido de duas formas: 1. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico(azul) e separamos os picos (vermelho). Depois asáreas de cada pico podem ser obtidas através daaproximação por uma ou mais figuras geométricas.

Para saber a quantidade relativa das proteínas, bastaestabelecer relações matemáticas entre as áreas decada pico e a área total.2. Outra possibilidade é utilizar uma balança analíticae uma tesoura. Podemos simplesmente recortar ográfico e obter um pedaço de papel na fodo gráfaico.

Em seguida pesamos esse recorte e anotamos opeso obtido (PG=peso total), referente a todo gráfico.Depois recorta-se cada Gaussiana (picos) do gráfico(as linhas vermelhas) e pesa-se separadamente.Para saber a quantidade relativa das proteínas, bastaestabelecer relações matemáticas entre os pesosanotados e o peso total.

100

BibliografiaELETROFORESE



1. Laboratório para o clínico. Livraria Atheneu Editora, 19912. Diagnósticos clínicos e conduta terapêutica para examines laboratoriais. Todd,Sanford, Davidsohn, Editora Monole Ltda, 1982.

3. Eletroforese . Peulo Cesar Nahum4. Diagnóstico clínico e tratamento para métodos laboratoriais. J.B.Henry, Editora

Mamole Ltda, 1999.

5. Na Bancada. Manual de iniciação cientifica em laboratórios de pesquisasbiomédicas. Kathy Barker, Editora ArtMed, 20026. http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=21518847-2D72-475F-A5B9-

B236EC5B641E 7. http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp 8. http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis 9. http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm 10. http://chsfpc5.chem.ncsu.edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002.htm

Bibliografia

http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=21518847-2D72-475F-A5B9-B236EC5B641E


http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp

http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis


http://chsfpc5.chem.ncsu.edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002.htm



















http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis

http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp














eletroforese 2011 pdf

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