HEMOGLOBINAS –

ELETROFORESES E

OUTRAS METODOLOGIASPONTIFÍCIA UNIVERSIDADE

CATÓLICA DE GOIÁS

CBB-BIOMEDICINA

Prof.Luiz Murilo Martins de Araújo

PERFIL DAS HEMOGLOBINAS

MAIS COMUNS

% ADULTO % FETO

• Hb A - α2 β2 96 - 98 TRAÇOS

• Hb A2 - α2 Δ2 ATÉ 3.5-4.0 TRAÇOS

• Hb F - α2 TRAÇOS 99 2ץ

HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES

• Hb S - α2 β2(6: GLU VAL)

• Hb C - α2 β2(6: GLU LIS)

• Hb DLos Angeles-Punjab - α2 β2(121: GLU GLN)

• Hb MBOSTON - α2(58:HIS TIR) β2 (Metahemoglobina)

• Hb H - β4

• Hb BARTS - 4ץ

HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES

• Hb Lepore - Pareamento não homologo

entre os genes ץ e β (Híbrido ץ-β, sendo

a parte inicial, amino terminal semelhante

a gama e a terminal, carboxila,

semelhante a beta)

Hemoglobinas Instáveis:

Hb Torino - α2(43:PHE VAL) β2

Hb Koln - α2 β2(98:VAL MET)

OUTRAS HEMOGLOBINAS

ANORMAIS

• Hb E - α2 β2(26: GLU LYS)

• Hb J Baltimore - α2 β2(16: GLY ASP)

• Hb N Baltimore - α2 β2(95: LYS GLU)

• Hb O Arábica - α2 β2(121: GLU LYS)

• Hb Porto Alegre- α2 β2(9: SER CIS)

• Hb K Woolwich - α2 β2(132: LYS GLN)

OUTRAS HEMOGLOBINAS

INSTÁVEIS

• Hb Rio Claro - α2 β2(34: VAL MET)

• Hb Zurich - α2 β2(63: HIS ARG)

• Hb Santa Ana - α2 β2(88: LEU PRO)

• Hb Niteroi - α2 β2(42-44:PHE/GLU/SER 0)

• HB Koln - α2 β2(98: VAL MET)

• Hb Camperdown - α2 β2(104: ARG MET)

OUTRAS HEMOGLOBINAS

VARIANTES

• Hb G Philadelphia - α2 68: ASN LIS β2

• Hb I - α2 16: LYS GLU β2

• Hb J Oxford - α2 15: GLY ASP β2

• Hb J Rovigo - α2 53: ALA ASP β2

• Hb Constant Spring - α2 142: STOP GLN β2

OUTRAS HEMOGLOBINAS

INSTÁVEIS

• Hb Hasharon - α2 47: ASP HIS β2

• Hb Stanleyville II - α2 78: ASN LIS β2

• Hb G Pest - α2 74: ASP ASN β2

• Hb Kurosaki - α2 7 : LYS GLU β2

• Hb Westmead - α2 122: HIS GLN β2

• Hb Campinas - α2 26: ALA VAL β2

Prevalência de hemoglobinopatias em 238 amostras

coletadas para estudo eletroforético de hemoglobinas no

Laboratório lâmina-Rj, no ano de 2000.

• 61 FITAS(25,6%) APRESENTARAM HEMOGLOBINAS ANÔMALAS:

• Talassemia Alf a : 6/61 – 10%

• Talassemia Beta : 23/61 - 38 %

• Hemoglobinopatia AS: 22/61 – 36%

• Hemoglobinopatia AC: 3/61 – 5%

• Hemoglobinopatia AD: 1/61 – 1.5%

• Hemoglobinopatia SS: 1/61 - 1.5%

• Persistência Hereditária

de Hemoglobina Fetal: 5/61 - 8%

DOS TALASSÊMICOS:

• Talassemia Minor : 19/23 - 82%

• Talassemia Intermedia : 4/ 23 - 18%

Ricardo P. Ducatti

LEPAH-CBB-UCG

ELETROFORESE EM PH

ALCALINO

ELETROFORESE

• É definido como sendo a migração de

espécies carregadas eletricamente, que

ocorre quando as mesmas são dissolvidas

ou suspensas em um eletrólito, através do

qual uma corrente elétrica é aplicada.

• Esta técnica de separação foi

desenvolvida pelo químico Arne Tiselius

para o estudo de proteínas em soro e por

este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel

em 1948.

SEQUÊNCIA BÁSICA DA

ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS

EM pH alcalino

(-) (+)

• A2 G S K F A B H J I

C D

E DLos Angeles-Punjab

Lepore

A

R

T

s

O

R

L

E

Bu

ELETROFORESE DE Hb

BART’S E Hb H

A

F

S/D

A2/C/E

PERFÍS ELETROFORÉTICOS

• A - A : NORMAL

• A - S : Traço Falciforme (Banda A e S)

• S - S : Anemia Falciforme (Banda S)

• S - C : Falciforme/ Hb C (Banda S e C)

• S - βTal : Micro-Drepanocitose (Banda

S e aumento de A2 e F)

• S - αTal : Banda S e Hb H

• A - C : Hetereozigoto para Hemoglobina C

• C - C : Homozigoto para Hemoglobina C

SC AA

Hb A2 = 5,5%Traço talassêmico

A

F

S D

A2 C E

Persistência hereditária de Hb fetalHb F = 9%

A2 D

Doença da Hemoglobina H e BARTS

A2 D H

B

A

R

T

S

Hemoglobina Lepore (10 %)

A2 DLEPORE

ALTERAÇÕES NA ESTRUTURA QUÍMICA DA

MOLÉCULA POR TROCA DE AMINOÁCIDOS

Hb A- pI 6.8

HbS - pI 6.85

HbG - pI 6.90

HbC - pI 6.95

Hb S: Glu (-) Val (o): pI 6.85

Hb G: Asn (o) Lis (+): pI 6.90

Hb C: Glu (-) Lis (+): pI 6.95

P.C.NAOUM, 2001

ELETROFORESE EM pH

ALCALINO, COM

HEMOLISADO COM

SAPONINA

ELETROFORESE EM PH

ACIDO

ELETROFORESE ÁGAR-ÁCIDO

ELETROFORESE ÁGAR-

ÁCIDO

ELETROFORESE COM

ISOFOCALIZAÇÃO

ELETROFORESE CAPILAR

ELETROFORESE MICROCAPILAR

ELETROFORESE CAPILAR

• Técnica que foi introduzida em 1981, por

Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita

cada vez mais, como um importante

método analítico.

• Em sua forma mais simples é uma

aproximação da técnica original, descrita

por Tiselius, porém emprega-se um tubo

capilar, preenchido com um eletrólito,

conforme o próprio nome sugere.

• Pode ser usada na determinação de

hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas

hidro e lipossolúveis, aminoácidos, íons

inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos,

catecolaminas, substâncias quirais,

proteínas, peptídeos, etc.

Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz

Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (Universidade Estadual de Campinas,

Instituto de Química),

http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm

• Uma característica é a sua capacidade

única para separar macromoléculas

carregadas eletricamente de interesse tanto

em indústrias de biotecnologia quanto em

pesquisas biológicas.

• No projeto Genoma Humano foi necessário

distinguir os diversos polinucleotídeos, com

massas molares, por volta de 200 a 500

Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre

si por um único nucleotídeo.

• Somente a EC tem resolução suficiente

para este tipo de separação.

• Além disso, o DNA humano contém cerca

de 3 bilhões de nucleotídeos e as altas

velocidades de análises, obtidas pela EC,

permitiram que milhares de nucleotídeos

fossem seqüenciados em um único dia

• O funcionamento do equipamento

envolve a aplicação de alta voltagem,

tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de

diâmetro reduzido gerando correntes na

faixa de 10 a 100 mA.

• O uso do capilar apresenta várias

vantagens, particularmente com respeito

ao aquecimento Joule.

• A alta resistência elétrica do capilar

permite a aplicação de campos elétricos

altos pois gera um aquecimento mínimo.

• Além disso o formato de capilar propicia

uma dissipação eficiente do calor gerado.

• O uso de campos elétricos altos resulta

em tempo de análise curto, alta eficiência

e resolução.

• O capilar é preenchido com uma solução

tampão e suas extremidades são

mergulhadas em recipientes, que contém

a solução tampão, e onde é aplicado um

campo elétrico, que gera uma corrente no

interior do capilar.

• Os eletrodos são feitos de um material

inerte, tal como, platina, e são também

mergulhados na solução para fechar o

circuito.

• O capilar passa através de um detector,

usualmente um detector

espectrofotométrico de absorção no

UV/Vis

VANTAGENS

• Rapidez

• Versatilidade

• Baixo custo por análise

• Alto poder se separação (resolução)

• Consumo mínimo de amostras, reagentes

e solventes.

• Possibilidade de automação e detecção

on-line.

DESVANTAGENS

• Não é adequada para a determinação de

compostos voláteis, não-polares e de

massa molar baixa, os quais são melhores

determinados por cromatografia gasosa.

• Também não é muito adequada para a

análise de polímeros não iônicos de

massa molar alta

• Não é tão sensível quanto a cromatografia

líquida de alta performace

HPLC

Metodologia automatizada que a partir da cromatografia por

troca iônica permite separar e definir a porcentagem de

diferentes hemoglobinas de uma forma precisa e rápida.

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