aula 10 eletroforese
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EletroforeseDocente: Dyego Miranda
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Métodos Após:
ExtraçãoQuantficaçãoPCR
Visualização do resultado da amplificação pelo procedimento de Eletroforese
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Princípio Eletroforese Consiste na migração e separação de partículas em
uma matriz (suporte), submetidas a uma diferença de potencial elétrico;
Os suportes podem ser:Papel de filtroAcetato de celuloseGel de agaroseGel de poliacrilamida
A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas
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Eletroforese em gelEletroforese em gel é eficiente em promover a separação de
partículas de acordo com o seu tamanhoGel de poliacrilamida
Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas
Gel de agarose Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas
grandes
O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo
Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
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Princípio
-
+A amostra é inserida nos “pocinhos”
Uma corrente elétrica é aplicada
Partículas de menor tamanho ou carga mais negativa corre primeiro
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PrincípioQuando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão
de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho.
O ladder é formado por diferentes tamanhos de DNA e serve como marcador de peso molecular
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Gel de agaroseA agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha
vermelha;Dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria;Mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA
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Gel de agaroseÉ utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonteUma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter
estáveis as condições de pH do meio
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IntercalantesBrometo de etídio
Agente intercalante do DNA Cancerígeno!
Composto fluorescente à luz UVNitrato de prataGel Red
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Visualização do gel de agarose em luz UV
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Gel de poliacrilamidaA poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a
eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;
Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas);
Melhor resolução do que a eletroforese em gel de agarose;
Desvantagem: Neurotóxica
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Gel de poliacrilamidaÉ realizada em uma cuba de eletroforese vertical.