Área – Sociedade, Ciência e Tecnologia

Núcleo Gerador 7

Domínio de Referência 2 – Processos e Métodos Científicos

Professor: Graça Mendonça

Trabalho Realizado: Ana Fonseca nº3

Marta Dinis nº13

DNA Fingerprint

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Índice Introdução................................................................................................................................. 3

DNA Fingerprint – O que é ? .................................................................................................... 4

DNA Fingerprint – O que é ? (Continuação) ............................................................................. 5

Técnicas de obtenção do DNA .................................................................................................. 6

Aplicações do DNA Fingerprint .............................................................................................. 11

Conclusão ............................................................................................................................... 13

Webgrafia ............................................................................................................................... 14

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Introdução Para o domínio de referência 2, decidimos dar de certa forma continuidade ao nosso

trabalho para o DR1 “ A célula e o ADN”. Vamos falar do DNA Fingerprint ou

impressões digitais e os seus usos e benefícios para a nossa sociedade. Achamos que

isto é importante e influência a nossa sociedade pois é possível identificar as pessoas

através do seu a DNA, para testes de maternidade, identificar criminosos, até identificar

ossos encontrados em escavações e saber qual era a espécie.

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DNA Fingerprint – O que é ?

Para entender o que é DNA fingerprint é necessário entender o que é herança genética.

Herança genética é processo pelo qual um organismo adquire características

semelhantes à do organismo que o gerou, através de informações codificadas (código

genético) que são transmitidas à descendência. Todos os organismos vivos são

compostos de células, que possuem material genético. Esse material encontra-se reunido

em estruturas celulares chamadas cromossomas. Em organismos unicelulares como as

bactérias, a célula-filha herda o seu genoma da célula-mãe. Em organismos diplóides,

como os seres humanos, os cromossomos ocorrem aos pares. Cada par destes

cromossomas é constituído tanto de informação genética de origem materna quanto de

origem paterna, normalmente em partes iguais.

No processo de fecundação, quando o espermatozóide paterno se une ao óvulo materno,

metade das informações genéticas de cada progenitor unem-se para formar o genoma da

célula embrionária resultante. Assim, esta contém informações genéticas maternas e

paternas. A formação do embrião dá-se por subdivisões celulares sucessivas a partir

dessa primeira célula. Na divisão celular, as informações genéticas são replicadas.

Assim, cada nova célula do indivíduo possui a mesma informação genética presente na

primeira célula zigótica.

O DNA Fingerprint é um método de identificação que compara fragmentos de ácido

desoxirribonucleico (DNA). O DNA é o material genético que se encontra no núcleo

(ou não se o organismo for procarionte) das células de todos os seres vivos. Com

exceção de gémeos idênticos, o DNA completo de cada indivíduo é único.

A estrutura química do DNA de todos é o mesmo. A única diferença entre as pessoas

(ou qualquer animal) é a ordem dos pares de bases. Há tantos milhões de pares de bases

no DNA de cada pessoa que cada pessoa tem uma sequência diferente.

Usando estas sequências, cada pessoa pode ser identificada unicamente pela sua

sequência de pares de base. No entanto, porque há tantos milhões de pares de bases, a

tarefa seria muito demorada. Em vez disso, os cientistas são capazes de usar um método

mais rápido, por causa da repetição de padrões de DNA.

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DNA Fingerprint – O que é ? (Continuação)

Esses padrões DNA são capazes de determinar se duas amostras de DNA são da mesma

pessoa, pessoas relacionadas, ou não-relacionados com as pessoas.

No DNA Fingerprint as sequências de DNA são reconhecidas e cortadas por

determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas

dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e refletem as

diferenças entre os alelos dos vários loci.

Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos

a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à ação de um

campo elétrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de

indivíduo para indivíduo.

Fig. 1 – Padrão de bandas de DNA.

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Técnicas de obtenção do DNA Existem várias técnicas de obtenção das impressões digitais genéticas, entre as quais a

de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism/Polimorfismo de comprimento

de fragmentos de restrição) , a mais utilizada, e ainda a de PCR (Polymerase Chain

Reaction/ Reação de polimerização em cadeia), que graças à alta sensibilidade e

especificidade é possível analisar um fio de cabelo com bulbo ou caspas eliminadas do

couro cabeludo. A técnica de Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição

baseia-se no princípio que a sequência nucleotidica da molécula de DNA é exclusiva de

cada indivíduo, excepto no caso dos gémeos verdadeiros, esta técnica permite

estabelecer relações de parentesco entre diferentes indivíduos. A RFLP foi desenvolvida

por Alec Jeffreys na Inglaterra, no inicio dos anos 80, apesar de apresentar as suas

desvantagens, os marcadores requerem grandes quantidades de DNA relativamente

puro, sondas específicas de DNA e marcação por radioatividade no sistema de detecção,

actualmente a RFLP tem sido vista como um meio para chegar às identidades de

criminosos, apurar a paternidade de crianças e muitas outras situações.

O Processo da técnica de RFLP

Materiais que podem ser colectados:

Origem Animal Origem Vegetal

Sangue Folhas

Secreções (como esperma) Caule

Saliva Raiz

Urina Semente

Tecidos moles Pólen

Pêlos com folículos Pétalas e outros

Caspa

Dentes

Ossos e outros

O material mais utilizado é o sangue. O DNA é retirado dos glóbulos brancos, umas vez

que os glóbulos vermelhos humanos não possuem núcleo.

1ºPasso – Extracção e purificação do DNA

Torna-se difícil obter o DNA de uma amostra caso esta seja escassa, esteja degradada

ou ainda contaminada. O DNA é purificado através da utilização de métodos químicos

(ex:fenol, chelex, etc.)

Fig. 2- Obtenção de saliva.

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2ºPasso (facultativo) - Processo de PCR

No caso de a amostra de DNA ser inferior ao necessário para realizar a sua análise, a

reação de polimerização em cadeia permite obter cópias de uma parte do material

genético em quantidade suficiente.

3ºPasso – DNA é submetido a enzimas de restrição específicas

Esta passo baseia-se na existência de padrões repetitivos no DNA denominados de

DNA minissatélites ou ainda de VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats/

Número variável de repetições em cadeia). Os VNTRs exibem uma enorme

variabilidade e são constituídos de até centenas de pares de bases repetidos

sequencialmente. Por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA,

correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo. Os cientistas

seleccionam determinadas enzimas de restrição, que dividem o DNA nestes segmentos

de restrição cujas dimensões, composição em nucleótidos e localização variam muito de

pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.

Fig. 3 – Segmentos de DNA

4ºPasso – Electroforese

Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos

a electroforese. Esta técnica, também denominada separação electroforética, baseia-se

na migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico. Este

processo é frequentemente usado para separar e algumas vezes purificar

macromoléculas, especialmente proteínas e ácidos nucleicos, com base no seu tamanho,

peso molecular, carga eléctrica ou conformação.

A electroforese de DNA é realizada em gel de agarose. Prepara-se o gel de agarose que

é imerso numa tina de electroforese com uma solução-tampão que estabelece a

condução eléctrica com a fonte de alimentação. Uma vez aplicadas as amostras de DNA

e o padrão de pesos moleculares nos poços, inicia-se a electroforese. A aplicação do

campo eléctrico é efectuada através de 2 eléctrodos situados paralelamente à fileira de

poços.

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Quando sujeitos a este campo eléctrico, os ácidos nucleicos migram em direcção ao

pólo positivo, uma vez que apresentam carga negativa. A agarose funciona como uma

rede cujos poros deixam passar mais facilmente as moléculas de menor tamanho, que

vão, portanto, migrar mais do que as de maiores dimensões. A migração de um

fragmento de DNA na forma circular, como um plasmídeo não digerido, é diferente da

migração do mesmo plasmídeo sob a forma linear (após digestão com uma enzima de

restrição).

Por outro lado, moléculas com uma configuração mais compacta migram mais

rapidamente do que moléculas com uma conformação molecular mais distendida. A

electroforese em gel é frequentemente utilizada para estimar o tamanho de fragmentos

de ácidos nucleicos. Através da comparação da distância percorrida pelos fragmentos

com a percorrida por fragmentos de peso molecular conhecido (padrões de peso

molecular) é possível inferir sobre o peso molecular de cada fragmento da amostra a

analisar.

Fig. 4- Eletroforese em gel.

5º Passo – método de Southern blot

Desnaturação

Terminada a separação electroforética, o gel deve ser tratado com uma solução alcalina

(geralmente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla hélice

de DNA, separando-a em simples hélices.

Fig. 5 – Desnaturação.

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Transferência do DNA para uma membrana

Uma membrana de nitrocelulose ou nylon é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada

uniformemente sobre o gel, ou recorrendo-se à sucção, ou pondo-se sobre a membrana

uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima.

Fig. 6 - Transferência do

DNA para uma membrana.

Isto leva a que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele adere.

A membrana é então aquecida, no caso de ser nitrocelulose, ou é exposta a radiação

ultravioleta, no caso de a membrana ser de nylon, de modo a ligar o DNA

permanentemente à membrana.

Fig. 7 - Transferência do DNA para uma membrana.

Tratamento com a sonda

A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora - que é uma molécula de

DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica, ou então complementar, aquela

sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da

dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz escolher uma sonda

que seja idêntica ou complementar à sequência procurada).A sonda de DNA é marcada

de tal forma que permite ser detectada a sua presença.

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Essa marcação é normalmente feita incorporando-se a ela átomos radioativos ou

ligando-se a ela corantes fluorescentes ou cromogéneos (substâncias incolores que

produzem cor ao interagirem com um determinado meio).Essa sonda irá fazer

emparelhar com qualquer sequência de DNA complementar a ela.

Portanto se a sequência procurada não estiver presente na amostra não haverá o

emparelhamento. Então o excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não

hibridizada será removida.

Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está

presente) é revelada por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo

aparecimento de uma cor caso a marcação cromogénea tenha sido usada.

Fig. 8- Tratamento com sonda hibridizadora.

Fig. 9 - Tratamento com sonda hibridizadora.

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Aplicações do DNA Fingerprint

Análise forense

A dactiloscopia genética é uma técnica utilizada na ciência forense onde se analisam as

diferenças entre os DNA minissatélites, já referidos, provenientes de material biológico

deixado num local (sangue, cabelo, esperma, etc.). A hipótese de dois indivíduos sem

qualquer relação de parentesco possuírem exactamente os mesmos minissatélites é

muito remota, sendo assim a dactiloscopia do DNA constitui um teste viável. Os

padrões de bandas de DNA obtidos por indivíduos diferentes podem ser comparados e

as diferenças são facilmente detectadas e as pessoas distinguidas. Isto permite a

identificação de cadáveres e a identificação de criminosos, incluindo violadores.

Contudo, na análise dos suspeitos de um crime, por exemplo, é de ter em conta se estes

têm irmãos gémeos verdadeiros, uma vez que, através das impressões digitais genéticas,

não se podem distinguir dois gémeos monozigóticos, pois os padrões de banda são os

mesmos visto possuírem igual material genético.

Fig. 10 – Exemplo do uso do DNA Fingerprint na análise forense.

Determinação de paternidade

Como cada indivíduo herda a disposição dos seus nucleótidos dos seus pais,

comparando os padrões de banda de um indivíduo com os dos alegados progenitores,

podem-se obter probabilidades de parentesco que nos levem a excluir a paternidade ou a

confirmá-la com um elevado grau de certeza. Se os dois padrões forem suficientemente

semelhantes (tendo em conta que só metade do DNA é herdado de cada progenitor),

então a paternidade confirma-se.

Fig. 11 - A ilustração apresenta o resultado de um teste de paternidade obtido pelo método de DNA Fingerprint.

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Diagnóstico de doenças

Esta tecnologia pode ser usada para prever a nossa saúde futura. Pode ser utilizada para

localizar os genes de doenças hereditárias. Se um padrão particular de DNA aparece

repetidamente em diferentes doentes, os cientistas podem verificar qual o gene ou

genes, ou pelo menos qual porção de DNA ou quais porções de DNA, poderão estar

envolvidos. Como o conhecimento dos genes envolvidos na susceptibilidade a uma

doença dá pistas sobre fisiologia subjacente à doença, o auxilia no desenvolvimento de

terapias. Também pode ser usado no período pré-natal para detectar possíveis anomalias

hereditárias, como a distrofia muscular ou a doença de Huntington, de forma a que

possa ser disponibilizado aconselhamento médico e possam ser adoptadas as devidas

precauções.

Diagnóstico molecular

É possível fazer o rastreamento de mutações não caracterizadas e ainda a análise da

eficiência de transplante de medula, para se verificar o quimerismo. Também permite

fazer o ensaio de mutações conhecidas como o caso de acondroplasia, a forma mais

comum de displasia, responsável pelo fenótipo que caracteriza o anão acondroplásico.

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Conclusão Com a realização deste trabalho ficamos a perceber como funcionam as técnicas de

obtenção de DNA e como são importantes para a nossa sociedade. É interessante

perceber como uma coisa tão simples como o DNA (que na verdade não é assim tão

simples) pode identificar cada um de nós.

Isto pode vir a ser uma área de interesse de estudo no futuro para ambas.

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Webgrafia

http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL006.htm

http://www.portalmedico.org.br/revista/bio2v5/odnacomounica.htm

http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel

http://www.icb.ufmg.br/big/genmed/southblot.html

http://www.biologia-ap.no.comunidades.net/index.php?pagina=1288163696