Electroforese em Gel de

Poliacrilamida

Electroforese Técnica de separação que se baseia na migração de

proteínas carregadas num campo eléctrico quando administrada uma diferença de potencial.

Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas num determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial.

Electroforese em Gel

É um gel que facilita a migração de proteínas na electroforese

Separa as proteínas segundo a sua massa molecular

Poliacrilamida é uma mistura de 2 polímeros, que origina uma estrutura em “rede”:

Gel de Poliacrilamida

• Acrilamida • Bisacrilamida

Modificações nas concentrações dos 2 polímeros originam diferenças na separação das proteínas

• Gel de 15% de acrilamida usa-se para separar proteínas com massa molecular baixa

• Gel até 7,5% de acrilamida usa-se para separar proteínas com massa molecular elevada

SDS – PAGESodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Electroforese em gel que recorre ao detergente dodecil sulfato de sódio.

SDS É usado em produtos domésticos como pastas de dentes, shampôs, aspirinas, etc.

Depois da electroforese, as proteínas são visualizadas adicionando um corante como o Azul de Coomassie, que se liga às proteínas mas não ao gel.

Molécula carregada negativamente que supera a carga da proteína e faz com que ela migre em direcção ao eléctrodo positivo, quando uma voltagem é aplicada no campo eléctrico.

Corante de cor azul que facilita a visualização e identificação das proteínas;

Corante ácido, grupo cromóforo carregado negativamente; Tem uma estrutura apolar e liga-se a proteínas não específicas.

Azul de Coomassie

Western Blot

• Método utilizado para assegurar que temos a proteína pretendida, com a ajuda de um anticorpo específico.

Método de execução1. Preparação do tecido

2. Electroforese em gel

3. Transferência

4. Bloqueio

5. Detecção

6. Análise

1. Preparação do tecido

• Homogeneização das amostras:

Sonicação;Força mecânica.

• As amostras são fervidas numa solução tampão que tem um corante (DSS).

2. Electroforese em gel

• As proteínas são separadas segundo o seu peso molecular por electroforese em gel.

3. Transferência

• Proteínas movidas do gel para uma membrana:

Nitrocelulose;

PVDF.

4. Bloqueio

• Impede as interacções não específicas entre a membrana e os anticorpos.

• Coloca-se a membrana numa solução diluída de uma proteína – BSA ou leite desnatado, com uma pequena quantidade de detergente – Tween 20 ou carbono coloidal.

5. Detecção

• Trata-se a membrana com as proteínas de interesse

• Liga-se uma enzima reveladora a eles

5.Detecção

5.1 – Método de dois passos

5.2 – Método de um passo

5.1 – Método de dois passos

• Dois anticorpos:

Primário;

Secundário.

5.2 – Método de um passo

• Utiliza-se apenas um anticorpo sonda que reconheça a proteína de interesse e que tenha uma marcação detectável.

6. Análise

6.1 – Detecção colorimétrica

6.2 – Quimioluminescência

6.3 – Detecção radioactiva

6.4 – Detecção fluorescente

Protocolo

D – Visualização num gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes (SDS-PAGE), das amostras recolhidas ao

longo da expressão e purificação da proteína de

fusão

D.1. Preparação do gel de poliacrilamida

D.2. Preparação das amostras e electroforese

1. Diluir as amostras com solução desnaturante 2x

2. Aplicar as amostras no gel

3. Corar o gel por agitação

D.3. Aplicação das amostras no gel de poliacrilamida em condições desnaturantes

E – Electrotransferência das proteínas do gel de

poliacrilamida para uma membrana de PVDF e

imunodetecção (Western Blot)

E.1 – Electrotransferência para a membrana de PVDF

E.2 – Imunodetecção

E.3 a) Método ECF de revelação de imunoblot

b) Revelação do imunoblot usando um substrato cromogénico

Imunoblot