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Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec
Graduação em Biotecnologia
09/08/2013
ELETROFORESES
TÉCNICAS INSTRUMENTAIS
Marcelo Mendonça
Princípio • Eletroforese Consiste na migração e separação de
partículas em uma matriz (suporte), submetidas a uma Diferença de Potencial Elétrico (DDP)
• A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas
Gel de Agarose
Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
- Sodium dodecyl sulfate
- Dodecil sulfato de sódio
Os matriz podem ser:
DNA / RNA Proteínas / DNA / RNA
Eletroforese em gel
• Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho
– Gel de Poliacrilamida
• Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas
– Gel de Agarose
• Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas grandes - Usado mais para DNA e RNA
• O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo
• Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
Princípio
A amostra é
inserida nos
“pocinhos”
Corrente elétrica
é aplicada
Partículas de
menor tamanho ou
carga mais
negativa correm
primeiro
Princípio • Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas
• Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho
O ladder (marcador) é formado por diferentes tamanhos de DNA e serve como marcador de peso molecular
• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte
• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter estáveis as condições de pH do meio
Gel de Agarose
Gel de Agarose
• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha
• Dissolve em tampão quente e então gelifica quando esfria
Preparação do gel
Visualização
Fotodocumentador com luz UV
Tampões utilizados para preparo do gel e na cuba de corrida
(migração)
Gel de Agarose
Concentrado e diluídos para o uso
Tampões comumente usado
TBE: Tris-Borato-EDTA
Diluído para 0,5x – Fornece poder tamponante suficiente,
Maior poder tamponante do que outros
TAE: Tris-Acetato-EDTA
Diluído para 1x – Resolução melhor para alguns DNAs
(maiores)
TPE: Tris-Fosfato-EDTA
Intercalantes Corantes
• Brometo de Etídio
–Agente intercalante do DNA • Cancerígeno!
–Composto fluorescente - luz UV
• GelRed
• GelGreen
Visualização do gel de agarose em luz UV
Transluminador – UV
(Fotodocumentador)
Gel de poliacrilamida • A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel
para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;
• Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas);
• Melhor resolução do que a eletroforese em gel de agarose;
• Desvantagem: Neurotóxica
(Acrilamida em forma liquída)
Gel de Poliacrilamida SDS-PAGE
• É realizada em uma cuba de eletroforese vertical