fundamentos de extração de dna e rna

MSc. Ana Liedke

Fundamentos de Extração de DNA e RNA

Importância

Uso de DNA para estudos de natureza variada:

• diagnóstico (sensível e específico);

• medicina (estudo do câncer; identificação doenças);

• processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais);

• genoma

• investigações de perícia, paternidade...

Uso de RNA para estudos de natureza variada:

• Transcrição Reversa do RNA (cDNA);

• Análises de expressão gênica

• Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA

Organismosbactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais

A extração e a purificação de ácidos nucléicos é uma etapa fundamental para

se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em

cadeia da polimerase (PCR).

Organismosbactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais

Tipos de DNA

Eucariontes (núcleo individualizado)

• DNA nuclear;

• DNA mitocondrial;

• DNA cloroplasto;

Tipos de DNA

Procariontes (sem núcleo)

• DNA circular;

• DNA plasmidial;

Fator adicional: parede celular

Extração de DNA/RNA


Passos principais:

• lise das membranas plasmáticas e nucleares;

• degradação proteínas;

• purificação do DNA/RNA.

Para cada tipo de amostra, vários protocolospodem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.


Passos principais:


solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.

detergentes


Passos principais:


solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.

detergentes

micelas


Passos principais:

• lise + degradação proteínas;

detergentes

Proteinase k


Passos principais:


detergentes

Proteinase k

A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album;

É capaz de digerir a queratina (Keratin), daí o nome “Proteinase K”.

Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA


Passos principais:


detergentesDigestão em banho-maria com

temperatura próxima a 50°C Proteinase k

O tempo de incubação pode variar. Importante é que a amostra se apresente totalmente digerida

Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes orgânicas Aviso: O fenol é um produto altamente tóxico, irritante para a pele e

mucosas

Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1): eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgânica mais densa.

Clorofórmio: retira resíduos de fenol



Passos principais:

• purificação do DNA/RNA (eliminação de resíduos orgânicos)

A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, desta maneira, tende a formar um aglomerado de moléculas quando em meio alcoólico.

Uso de álcool para a precipitação

formação do Pellet

• A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.);

• DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes;

• Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas...

Notas - Extração de RNA

• Extração usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de células e tecidos;

• DNAse;

• O RNA total é livre de contaminações por DNA ou proteínas.

Quantificação DNA/RNA

Espectrofotômetro

• Qualidade da extração

• Determinação da quantidade de

DNA/RNA extraído

260 e 280 nm

razão 260/280 =

nucleotídeos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm

280 nm para estimar a contaminação com proteínas

1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequada

Um valor inferior indica contaminação com proteínas e um valor superior indica contaminação com RNA.

Conservação da amostra

• Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em álcool

absoluto imediatamente após a coleta, e trocado após 24h.

• Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com sílica.

• Para todas amostras congeladas em estoque, é preferível o fracionamento em pequenas alíquotas para que o material não sofradescongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do DNA.

• O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados

Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório

tenha os equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos

procedimentos. O material mínimo necessário é o seguinte:

a) Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos

b) Capelas de exaustão.

c) Banho-maria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura.

d) Microtubos de polipropileno.

e) Micropipetas automáticas para volumes diversos (com ponteiras).

Material Necessário

MSc. Ana Liedke

Fundamentos de Eletroforese Agarose (AGE) e

Poliacrilamida (PAGE)

• É um método simples e muito eficiente para separar, para identificar e

para purificar fragmentos de DNA, RNA e de proteínas.

• Ela consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua

carga elétrica e seu peso molecular.

• Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e

moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo).

Eletroforese

A migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de potencial é chamada de eletroforese.

Existem dois modelos básicos de eletroforese:

Gel de agarose

Eletroforese

AGE

+-


Gel de agarose

Gel de poliacrilamida

Eletroforese

PAGE

+-AGE

+-


Gel de agarose

Gel de poliacrilamida

Eletroforese

PAGE

+-AGE

+-

Fonte

Eletroforese

Pólo +

Pólo -

Equipamento - Agarose

• Ágar-ágar (ágar ou agarose)

• É um hidrocolóide componente da parede celular, extraído de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta;

• insolúvel em água fria

• dissolve em água quente (absorve uma quantidade de água de cerca de vinte vezes o seu próprio peso) formando um gel não-absorvível, não-fermentável e com importante característica de ser atóxico.

• Concentrações de 0,5 – 2,5% Diluídos no tampão TBE ou TAE.(Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)

Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose

•Tamanho do DNADiferentes tamanhos de moléculas, diferentes taxasde migração no gel de agarose

•Concentração da agarose

•Conformação do DNA

•Tamanho do DNA


•Conformação do DNA


•Tamanho do DNA


•Conformação do DNAem ≠ formas ou conformação do DNA,a migração ≠ velocidades

DNA superenrolado mais lentoDNA linear mais rápida


Equipamento - Agarose

Agarose tampão aquece

Despeja na formacom o pente

Cuba com Tampão TBE ou TAE

Equipamento

DNA + marcador migração(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)

marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra

High...)

(+)

DNA com fragmentos de tamanho conhecido

aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço)adicionar cor às amostrasPermite acompanhar a corrida

Equipamento

DNA + marcador migração(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)

Coloração com brometo de Etídio (EtBr) (0,0001%).

marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra High...)

(+)

Depois de migrar o suficiente.....

Transiluminador (caixa de luz UV)

aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço)adicionar cor às amostrasPermite acompanhar a corrida

Brometo de Etídio

AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório.

Intercala entre as fitas de ácidos nucléicos

Fluorescente na luz ultravioleta

Equipamento - Poliacrilamida

Utilizado tanto para Proteínas quanto para DNA/RNA

Composto por Acrilamida e Bis-AcrilamidaAVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou

absorvido pela pele. Causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.

Concentrações diferentes – quanto mais acrilamida, menores os poros

Proteínas: a carga e a forma devem ser excluídas, com adição de SDS (dodecilssulfato de sódio) que possui carga negativa

– converte proteínas em estrutura linear

Equipamento - Poliacrilamida

Coloração com:

Brometo de Etídio (EtBr),

prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e

análise de amostra diluída)

SYBR Green (menos mutagênico)

Coomassie Blue se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. É menos sensível que corar com a pratamas efetivo também, além de ser fácil de corar

Fotodocumentação

Transluminador

Caixa acoplada máquina fotográfica

Computador

AGE X PAGE

É mais difícil de ser preparado e muito tóxico quando em pó ou em solução.

menor capacidade de resolução, porém apresenta maior extensão de separação. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)

Fácil preparo, não-tóxico.

tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base).

podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença.

também usados para separação de proteínas

fundamentos de extração de dna e rna

Documents