kits de extração / purificação de dna/rna - himedia

K i t s d e E x t r a ç ã o / P u r i f i c a ç ã o d e D N A / R N A

INTRODUÇÃOPág. 3

Kit de Extração de DNA Genômico de Sangue Miniprep HiPura™ - MB504 Pág. 6

Pág. 7

Pág. 8

Pág. 9

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Pág. 11

Pág. 12

Pág. 13

Pág. 15

Pág. 14

Pág. 16

Kit de Extração de DNA Genômico de Bactérias Miniprep HiPura™- MB505

Kit de Extração de DNA Genômico de Plantas Miniprep HiPura™ - MB507

Kit de Extração de DNA Plasmidial Miniprep HiPura™ - MB508

Kit de Purificação de Produtos da PCR Miniprep HiPura™ - MB512

Kit de Purificação DNA de Gel Miniprep HiPura™ - MB539

Kit de Purificação DNA do Solo Miniprep HiPura™ - MB542

Kit de Purificação DNA de Fungos Miniprep HiPura™ - MB543

Kit de Purificação DNA de Leveduras Miniprep HiPura™ - MB552

Kit de Purificação DNA de Múltiplas Amostras Miniprep HiPura™ - MB554

Kit de Purificação RNA de Múltiplas Amostras Miniprep HiPura™ - MB602

Sumário Sumário

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Extração / Purificação de DNA e RNA

LISE

As Colunas Spin contém resina de sílica que promove a ligação seletiva de DNA/RNA dependendo da concentração de sal e outros fatores que são influenciados pelo método de extração. Entenda como funciona o princípio da sílica presente na Coluna Spin dos Kits de Extração/Purificação.

Lise

Ligação do DNA/RNA

Lavagem

Eluição do DNA/RNA

DNA/RNA Purificado

O isolamento dos ácidos nucléicos começa a partir da lise ou quebra das paredes celulares. A quebra das estruturas proteicas é necessária para liberar os ácidos nucléicos que estão posicionados no núcleo das células. A lise de tecidos não rígidos ou de células é mais fácil quando comparada com a de tecidos rígidos (por exemplo, plantas, ossos, madeira) que requerem o congelamento por nitrogênio líquido e, subsequentemente, a pulverização destes tecidos em um pó fino. A fórmula da lise varia conforme a extração de DNA e RNA, mas ambos utilizam como base um tampão de lise que contém alta concentração de sais caotrópicos. Esses sais fazem a quebra das ligações de hidrogênio, interações de van der Waals e hidrofóbicas. As proteínas são desestabilizadas, incluindo as nucleases e as associações de ácidos nucléicos com água é rompida criando condições para a membrana de ligação de sílica. Por outro lado, os caotrópicos são usualmente utilizados como detergentes para auxiliar na lise, solubilização de proteínas e precipitação. Também pode se utilizar enzimas para a lise, dependendo do tipo da amostra. Por exemplo, a Proteinase K (um tipo de enzima), funciona muito bem como tampão desnaturante, ao contrário da Lisozima. Por isso, o tratamento com Lisozima normalmente é feito antes de adicionar os sais de desnaturação.

INTRODUÇÃO

4 TM


LAVAGEMLIGAÇÃO

Os kits de extração oferecem o melhor protocolo para isolar os ácidos nucléicos das amostras. Em resumo, o uso das colunas aumenta o rendimento das amostras e em um tempo mais curto de isolamento comparado a extração convencional a partir de solventes. O kit melhora a qualidade do rendimento do ácido nucléico e melhora a sua qualidade quando purificado para uso em aplicações posteriores. O método de purificação pela Coluna Spin também envolve a troca iônica e a tecnologia da membrana de sílica. Quando a membrana de sílica é utilizada para purificação, é essencial a presença de sais caotrópicos ou sais de alta concentração para a desnaturação de proteínas melhorando a ligação seletiva de ácidos nucléicos com carga negativa na membrana de sílica. Além disso, para aumentar e influenciar a ligação dos ácidos nucléicos na membrana de sílica é adicionado etanol no tampão de ligação. Estas condições levam a uma situação energeticamente favorável para que os ácidos nucléicos (DNA/RNA) sejam absorvidos na membrana de sílica. Durante a etapa de absorção do DNA/RNA, primers indesejados, impurezas como sais, enzimas, agarose, corantes, nucleotídeos não incorporados, detergentes, óleos e proteínas irão passar diretamente pela membrana e não irão se ligar a membrana de sílica.

Os ácidos nucléicos (DNA/RNA) são absorvidos na superfície da membrana de sílica, enquanto a maioria das outras moléculas passa através da coluna. Entretanto, a membrana continua contaminada com resíduos de proteínas e sais. Os ácidos nucléicos (DNA/RNA) ligam-se na membrana da Coluna Spin e são lavados com as soluções tamponadas próprias para remover as impurezas das colunas como proteínas e polissacarídeos presentes na amostra. As etapas de lavagem removem estas impurezas. A primeira etapa de lavagem sempre possui uma baixa quantidade de sais caotrópicos para remover as proteínas e parte dos contaminantes. Este passo é acompanhado da adição de etanol para remover resíduos de sais. O percentual e o volume de etanol interferem no rendimento de ácido nucléico no tampão de eluição, ou seja, normalmente etanol 80% irá permitir uma ótima ligação dos ácidos nucléicos na membrana, enquanto 70% ou uma concentração menor irá reduzir drasticamente a ligação. Uma alta quantidade de etanol irá aumentar a ligação dos ácidos nucléicos degradados na membrana de sílica. Por outro lado, o uso de pequenas quantidades de etanol irá reduzir a eficiência do tampão de lavagem na retirada dos sais da membrana. O HiShredder™ substitui a etapa dos protocolos convencionais para remoção de resíduos e precipitados da centrifugação na qual é difícil a separação e preparação de amostras para obter um lisado perfeito.

Colunas Spin Miniprep HiElute™

HiShredder™


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A etapa final é a liberação dos ácidos nucléicos (DNA/RNA) da membrana de sílica. A eluição eficiente depende do pH e das concentrações de sais do Tampão de Eluição. A eluição é mais eficiente sob condições alcalinas e baixas concentrações de sais. A baixa concentração de sais permite a renaturação dos ácidos nucléicos (DNA/RNA), fazendo com que eles tenham uma alta afinidade com a membrana de sílica. Para as preparações de DNA pode-se utilizar o Tampão Tris 10 mM com pH entre 8-9. O DNA é mais estável sob condições com pH levemente alcalino e dissolve mais rápido. A eficiência máxima da eluição do DNA é alcançada por um pH entre 7.0 a 8.5. A água com grau de biologia molecular tende a ter o pH mais baixo, entre 4-5 e, assim as moléculas de DNA/RNA com alto peso molecular não são reidratadas completamente em um curto espaço de tempo. Quando a água é utilizada para eluição garanta que o pH esteja entre 7.0 e 8.5. Além disso, a eluição do DNA/RNA pode ser aumentada permitindo com que o tampão seja depositado na membrana por alguns minutos antes da centrifugação. O DNA/RNA eluido em água deve ser armazenado a -20°C para evitar a degradação do DNA na falta do tampão. A eluição com o Tampão TE (Tris HCl 10 Mm, EDTA 1 Mm, pH 8.0) não é recomendado por o EDTA pode inibir reações enzimáticas subsequentes como a PCR e digestão por enzimas de restrição.

SECAGEM DA COLUNA SPIN ELUIÇÃO

Após a lavagem com o etanol a maioria dos protocolos possui uma etapa para a secagem da Coluna Spin. Esta etapa é necessária para remover o etanol e deixar o DNA/RNA eluido em uma solução sem impurezas. Caso esta etapa não se seja realizada pode ocorrer baixos rendimentos de ácidos nucléicos. Quando o Tampão de Eluição (Tris 10 mM ou Água com grau de Biologia Molecular) é adicionado na membrana para a eluição os ácidos nucléicos tornam-se hidratados e são liberados da membrana. Na presença de resíduos de etanol na coluna os ácidos nucléicos não podem ser completamente reidratados.

Abaixo estão os indicadores que detectam a contaminação por etanol:• As amostras não aparecem no gel de agarose mesmo na presença do corante.• As amostras não congelam mesmo armazenadas em – 20°C.

5TM

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Extração / Purificação de DNA

Transporte e armazenamento em temperatura

ambiente

50 preparações

250 preparaçõesAPLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional e PCR em Tempo Real;• Southern blot;• Sequenciamento;• Genotipagem SNP (Polimorfismo de única base);• Estudos farmacogenômicos;• Revelação e validação de Polimofirsmo de única base (SNP).

O Kit de Extração de DNA Genômico de Sangue HiPurA™ purifica o DNA a partir de amostras de sangue recém coletadas, amostras armazenadas por mais de 24 horas ou de sangue congelado. O protocolo implica na lise das células que é realizada através da incubação a 55°C do sangue total em uma solução contendo íons caotrópicos na presença de Proteinase K.

A lise é preparada para a ligação inicial do DNA na Coluna Spin e impurezas como proteínas, polissacarídeos, metabólitos de baixo peso molecular e sais sejam removidos em poucas etapas de lavagem. O formato da Coluna Spin da HiMedia permite o processamento rápido de múltiplas amostras. As colunas possuem uma alta capacidade de ligação com um dna de alta qualidade essencial para aplicações posteriores.

Kit de Extração de DNA Genômico de SANGUE Miniprep HiPura™

MB504

Razão de A260/A280:1.6-1.9

Rendimento Total de DNA:4-12 µg

Volume de Eluição:200 µL

Volume de Sangue Total:200 µL

DNA obtido de sangue humano usando o Kit de Extração de DNA

Genômico de Sangue HiPura (MB504)

• Amostras a partir de sangue recém coletado, armazenado por mais de 24 horas ou de amostras congeladas.

• Processamento de múltiplas amostras.

MÉTODO/TECNOLOGIA:Método da Coluna Spin com membrana de sílica.

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ambiente

50 preparações

250 preparações

MB505

Kit de Extração de DNA Genômico de BACTÉRIAS Miniprep HiPura™

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional e PCR em Tempo Real;• Southern blot;• Sequenciamento;• Genotipagem SNP;• Estudos farmacogenômicos;• Reveleção e validação de SNP

O Kit de Extração de DNA Genômico de Bactérias HiPurA™ purifica o DNA a partir de bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas. A purificação do DNA pela membrana de sílica tem alta capacidade de ligação com o DNA de para aplicações posteriores. A lise nas bactérias Gram-Positivas é mais difícil devido a parede celular de peptideoglicanas, compara com as bactérias Gram-Negativas. Para a lise eficiente das bactérias Gram-negativas é necessário apenas o uso da Proteinase K, ao contrário das bactérias Gram-Positivas que necessitam da combinação da Proteinase K e a Lisozima.

Razão de A260/A280:1.6-1.9

Rendimento Total de DNA:20 µg


Volume de Amostra Total:1.5 mL de meio de cultura

Linhas 1,2 e 3: DNA extraído de E. coli.Linhas 4, 5 e 6: DNA extraído de S. aureus.

• Extração de DNA a partir de bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas.

• Uso de Proteinase K e Lisozima para a lise da parede celular.


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ambiente

50 preparações

250 preparações

Kit de Extração de DNA Genômico de PLANTAS Miniprep HiPura™

MB507

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional e PCR em Tempo Real;• Southern blot, RFLP, AFLP;• Sequenciamento;• Análises com microssatélites.

O Kit de Extração de DNA Genômico de Plantas HiPurA™ purifica o DNA a partir de tecidos vegetais que são difíceis de processar devido a presença de celulose e polissacarídeos em suas membranas. Para a disrupção das paredes o material é macerado em nitrogênio líquido, juntamente com o tampão de lise. A precipitação de proteínas é seguida da remoção de outros contaminantes usando o HiShredder. A fração sobrenadante é mistura com uma Solução de Ligação para garantir a ligação do DNA na membrana da Coluna Spin. Posteriormente, são realizadas as etapas de lavagem para que seja obtido um DNA de alta qualidade o qual é eluido no Tampão de Eluição.

Este Kit pode ser utilizado para a extração de DNA de várias espécies de plantas como arroz, sorgo, menta, Okra, Eucalyptus e etc.


Razão de A260/A280:1.6-1.9

Rendimento Total de DNA:5-40 µg


Volume de Amostra Total:100 mg

1. DNA de sorgo. 2. DNA de folha de arroz. 3. DNA de folha de trigo.

• Extração para vários tipo de espécies de plantas, até mesmo para as mais difíceis de extrair.

• Protocolo completo para lise através de nitrogênio líquido.

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ambiente

50 preparações

250 preparações

MB508

Kit de Extração de DNA PLASMIDIAL Miniprep HiPura™

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional;• Sequenciamento automatizado de alta qualidade;• Digestão de restrição;• Transformação e ligação;• Transfecção de células robustas;• Transcrição e translação In vitro;

A purificação plasmidial é baseada no princípio da tecnologia da membrana de sílica no formato da Coluna Spin. O método é dividio em 4 etapas, Lise das células, absorção do DNA na membrana, lavagem de resíduos dos contaminantes e eluição do DNA plasmidial purificado. A lise é uma etapa peculiar na qual a lise alcalina e a neutralização ajudam eliminação do DNA genômico, mas conserva o DNA plasmidial. O kit é compatível com a extração de pequenas e grandes cópias de plasmídeos, mas o rendimento pode variar dependendo do tipo do plasmídeo.

Razão de A260/A280:1.6-1.9


Volume de Eluição:50µL

Volume de Amostra Total:1.5 mL

DNA purificado de diferentes amostras de plasmídeos.


• Compatível com plasmídeos de cópias grandes e pequenas.

• Rápido processamento em apenas 4 etapas.

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ambiente

50 preparações

250 preparações

Kit de Purificação de Produtos da PCR Miniprep HiPura™

MB512

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional;• Sequenciamento;• Análises de microarranjos;• Ligação e Transformação;• Digestão de restrição;• Identificação;

Método rápido e simples de purificação da molécula de DNA a partir da PCR ou de outra reação enzimática. Fragmentos de 100 pb a 10 kb podem ser purificados a partir de primers, nucleotídeos, polimerases e sais através da membrana de sílica. Contaminantes como nucleotídeos, primers (até 50 pb), proteínas, MgCl2, óleo mineral entre outros são completamente removidos nas etapas de lavagem. A purificação é feita com o DNA concentrado eluido em um pequeno voluma de tampão com baixa concentração de sal. O produto da PCR possui uma recuperação de 80-95% dependendo do tamanho de DNA.


Razão de A260/A280:1.6-1.9

Rendimento Total de DNA:80-90%

Volume de Eluição:30-50 µL

Volume de Amostra Total:25-50 µL da Reação de PCR

Linha 1: Marcador de DNA de 100 pb.Linha 2: Produtos da PCR após

purificação (O círculo vermelho indica os primer-dimers).

Linha 3: Produtos da PCR após purificação.

• Purificação de produtos com fragmentos de 100 pb a 10 kb.

• Recuperação de 80-95%.

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ambiente

50 preparações

250 preparações

MB539

Kit de Purificação DNA de GEL Miniprep HiPura™

APLICAÇÕES: O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional e transcrição in vitro;• Sequenciamento;• Análises de microarranjos;• Ligação e Transformação;• Digestão de restrição;• Identificação;• Microinjeção.

Com base no método da membrana de sílica todos os géis de agarose padrões ou de baixo ponto de fusão são dissolvidos a 57°C no Tampão de Ligação de Gel. O tampão ajuda na ligação do DNA na membrana de sílica. O DNA absorvido é lavado para a remoção de sais e impurezas da amostra original para a obtenção do DNA purificado o qual é eluido no Tampão de Eluição. O indicador de pH está presente no tampão para detectar a mudança de pH. Uma vez que o pH da solução determina se a ligação do DNA na membrana será ou não eficiente. Inibidores da PCR como cátions divalentes e proteínas são completamente removidos nas etapas de lavagem, purificando os ácidos nucléicos que serão eluidos na etapa de Eluição através do Tampão de Eluição e estarão prontos para uso em aplicações posteriores. O kit tem capacidade de isolar o DNA (250 pb – 10 kb) de todos os tipodes de agaroses com cerca de 90% de recuperação.

Razão de A260/A280:1.6-1.9

Rendimento Total de DNA:80-90%

Volume de Eluição:30-50µL

Volume de Amostra Total:400 mg de gel com DNA

Linhas 1 a 5: Gel extraído com banda de 1 kb.Linha 6: Marcador de 1 kb.

• Capacidade de isolamento de DNA (250 pb-10 kb) de todos os tipos de agarose.

• Até 90% de recuperação.


12TM



ambiente

50 preparações

250 preparações

Kit de Purificação DNA do SOLO Miniprep HiPura™

MB542

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional;• Identificação;• Digestão por enzimas de restrição.

O solo é uma das amostras mais difíceis de trabalhar devido a vários parâmetros como matéria orgânica, pH, ácido húmico, metais e outros. Estes componentes dificultam no rendimento da extração do DNA ou na eluição de interferentes. Os interferentes eluidos são inibidores que dificultam em procedimentos posteriores como PCR e digestão por enzimas de restrição. O kit apresenta um método rápido e fácil para a purificação de DNA total de amostras do meio ambiente contendo ácido húmico em grandes quantidades bem como outros compostos e sedimentos normalmente encontrados no solo. A Solução de Removedora de Inibidores (IRSH) fornecida no kit é eficiente na remoção dos inibidores da PCR mesmo das amostras de solo mais difíceis. A amostra do solo é lisada e homogeneizada através de uma etapa de disrupção (bead-beating). O DNA genômico total obtido liga-se a membrana da Coluna Spin, é lavado e eluido.


Razão de A260/A280:1.6-1.9



Volume de Amostra Total:250-500 mg

Figura 1. Linhas 1 a 3: DNA de Vermicompostagem.

Linha 4: Marcador de DNA.

Figura 2.Linhas 1 a 3: DNA de solo composto de Geranium.

Linha 4: Marcador de DNA.

• Purificação completa do DNA total, mesmo contendo compostos e sedimentos que dificultam a purificação.

• Etapa diferencial de Bead-beating para disrupção do material.

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ambiente

50 preparações

250 preparações

MB543

Kit de Purificação DNA de FUNGOS Miniprep HiPura™

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional;• Southern blot;• Digestão por enzimas de restrição;• Reações de identificação;• Sequenciamento.

Os fungos possuem uma estrutura encapsulada de aspecto viscoso e parede celular rígida, tornando a lise difícil. Sendo assim, é necessário realizar a lise através da disrupção dos tecidos. A lise enzimática na solução de sais caotrópicos é utilizada para a extração de DNA das células de fungos. A amostra é macerada em nitrogênio líquido juntamente com o Tampão de Lise. A precipitação das proteínas é seguida da remoção dos contaminantes através do HiShredder. Em seguida, o sobrenadante é misturado com a solução que permite a ligação do DNA na membrana da Coluna Spin. A solução passa através da membrana e, em seguida, são realizadas as etapas de lavagem para remover os contaminantes. Ao final, o DNA purificado de alta qualidade é eluído no Tampão de Eluição.

Razão de A260/A280:1.6-1.9

Rendimento Total de DNA:2-30 µL (dependendo da espécie)


Volume de Amostra Total:100-150 mg

DNA extraído de várias culturas de fungos.Linhas 1 a 3: Trichoderma spp.Linhas 4 a 6: Aspergillus niger.

Linhas 7 a 9: Penicillium notatum.


• Remoção de contaminantes através do HiShredder.

• Lise enzimática para a extração eficiente das células de fungos.

14TM



ambiente

50 preparações

250 preparações

Kit de Purificação DNA de LEVEDURAS Miniprep HiPura™

MB552

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional;• Southern blot;• Digestão por enzimas de restrição.

As leveduras possuem suas paredes celulares constituídas com polissacarídeos que devem ser removidos para a extração do DNA. Sendo assim, estes polissacarídeos são convertidos na forma de Esferoplastos que é uma forma da célula sem a parede, mas sem perder a integridade citoplasmática. Os tampões sorbitol, juntamente com as enzimas de restrição Zimolase e Liticase levam a formação dos Esferoplastos. Uma vez o Esferoplastos formado, o processo para extração de DNA pode ser realizado normalmente com a lise, a ligação na membrana, as etapas de lavagem e a eluição. É recomendado que as leveduras sejam coletadas quando alcançarem a fase Log, pois a extração torna-se mais fácil.


Razão de A260/A280:1.6-1.9


Volume de Amostra Total:1 X 108 células na fase Log

DNA de S. cerevisiae.

• Protocolo específico para formação de Esferoplastos utilizando enzimas Zimolase e Liticase.

15TM



ambiente

50 preparações

250 preparações

MB554

Kit de Purificação DNA de MÚLTIPLAS AMOSTRAS Miniprep HiPura™

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• PCR Convencional;• Southern blot;• Digestão por enzimas de restrição;• Reações de identificação;• Sequenciamento.

A extração do DNA pode ser realizada a partir da extração de sangue (recém-coletado, congelado ou com mais de 24 horas), bactérias (Gram-Positivas e Gram-Negativas), tecidos e células. Para cada tipo de amostra o kit fornece os reagentes específicos bem como o protocolo direcionado para a lise de cada uma das amostras. O DNA com alto peso molecular (>30 kb) pode ser extraído facilmente através da membrana da Coluna Spin. O kit é ideal para atender uma variedade de amostras com um método rápido.


Razão de A260/A280:1.6-1.9

Volume de Amostra Total:200 µL

Volume de Eluição:4-12µg (sangue)

4-20µg (bactéria)30-45µg (tecido animal)10-20µg (cultura de células)

Linha 1: Marcador de DNA 1kb.Linha 2 e 3: DNA de tecido de aves.

Linha 1 a 3: DNA de tecido de caprinos.Linha 4: Marcador de DNA DE 1kb.

• Protocolos específicos para cada tipo de amostra.

• DNA obtido de amostras de sangue, bactérias, tecidos e células.

• Alto rendimento de DNA.

16TM

Extração / Purificação de RNA


ambiente

50 preparações

250 preparações

Kit de Purificação RNA de MÚLTIPLAS AMOSTRAS Miniprep HiPura™

MB602

APLICAÇÕES:O DNA purificado pode ser utilizado em uma grande variedade de aplicações como:• Análises de Northen;• Seleção de RNA Poli A+;• Extensão de primes;• Ensaios de proteção de Rnase e nucleasse n1;• RT-PCR (PCR em Tempo Real);• Análise de expressão de arranjos e ChIP;• Construção de bibliotecas de cDNA.


Razão de A260/A280:1.8-2.1

Volume de Eluição:100 µg

Volume de Amostra Total:1 X 107 células, 15-30 mg de tecido

RNA de células Jurkat.

• Protocolos específicos para cada tipo de amostra.

• RNA obtido de amostras de sangue, bactérias, tecidos e células.

• Alto rendimento de RNA.

A extração do RNA pode ser realizada a partir da extração de células e tecidos animais, bactérias, leveduras e de RNA de outras reações. O tampão de lise ajuda na disrupção e desnaturação das células. As amostras são centrifugadas no HiShredder removendo materiais insolúveis e reduzindo a viscosidade dos lisado. O etanol é adicionado ao lisado promovendo a ligação seletiva do RNA na membrana de sílica. Após a etapa de ligação do RNA, as impurezas como proteínas, polissacarídeos, metabólitos de baixo peso molecular e sais são removidos nas etapas de lavagem. O RNA de alta qualidade é eluido no Tampão de Eluição fornecido no kit.

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