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EXTRAÇÃO DE DNA

E ELETROFORESE

Isolamento de ácidos nucléicos de células e

tecidos

Extração de ácidos nucléicos

Obtenção do material:

• Vírus

• Bactérias; fungos

• Célula vegetal / célula animal

Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total


Requerimento essencial:

quantidade (rendimento)

pureza

integridade

Etapas na obtenção de ácidos nucléicos:

1) Lise física ou bioquímica das paredes e celulares e membranas

2) Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares

3) Precipitação


1. Rompendo membranas celulares

Lise das células liberação dos

componentes citoplasmáticos e/ou nucleares

Estratégia: de acordo com o tipo de célula

envolvida (deve ser o mais “gentil”

possível)


Bactérias (parede glicoproteica)

- tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede enfraquecimento rompimento em solução hipotônica);

- outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação.

Células de plantas ou animais presentes em tecidos:

Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual célula individual lise: digestão enzimática / homogeneização

Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.


Células sem cobertura externa ou em solução:

Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente

- SDS (dodecil sulfato de sódio)

- substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas

2. Desnaturando proteínas celulares:

- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.

- Fragmentos de membrana lipídica.

- Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos

Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos:

- Extração em baixas temperaturas

- Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas

- Agentes que retardam atividade das nucleases



Agentes que retardam atividade das nucleases:

- tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético)

- Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração

- RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC –dietil pirocarbonato )

3. Separando DNA / RNA / Proteínas

Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação

Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos)

interface: proteínas

camada do fenol


Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:

Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico)

3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA)


camada do fenol

Camada aquosa

Camada de proteínas

Camada do fenol

p

H

pH neutro

ou básico

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:

Extração de RNA (fenol com pH ácido)

3 fases: aquosa (RNA)


camada do fenol (DNA)

Camada aquosa

Camada de proteínas

Camada do fenol

p

HpH ácido


4. Precipitação e lavagem com álcool

DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 –(Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC -20º C

DNA precipitado

Gel de agarose 1% com 3 ml de DNA genômico

M 1 2 3

M - Marcador

1, 2 e 3 - amostras

de DNA genômico


Soluções utilizadas

tampão de extração

solução de lise

solução desnaturante de proteínas

fenol

clorofórmio

Etanol

Proteinase K

Extração de ácidos nucleicosFunção dos reagentes

Tampão: proporciona um pH ideal para manutenção

da integridade das moléculas de ácidos nucléicos;

inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE -

pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino

tetracético).

Detergentes: substâncias tensoativas que agem

dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e

dissolvendo os lipídios de membrana; SDS =

sodium dodecyl sulfate.

Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento

de DNA/RNA de amostras biológicas.

Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a

eficiência da extração de ácidos nucléicos.

Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA)

DEPC – dietil pirocarbonato).

Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de

ácidos nucléicos provocando a agregação das

moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos

de fenol e clorofórmio).

Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser

removida pela digestão com proteinase K

Extração de ácidos nucleicosFunção dos reagentes

Conceito

“Eletroforese em gel: é uma técnica deseparação de moléculas que envolve amigração de partículas em um determinado geldurante a aplicação de um potencial elétrico.As moléculas são separadas de acordo com asua carga elétrica e seu peso molecular, logoas de menor massa irão migrar maisrapidamente que as de maior massa”.

A eletroforese normalmente é utilizada paraseparar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

Breve Histórico...

• Inicialmente proposta por Arne Teselius (1937).

• A eletroforese era técnica empregada para visualização

de proteínas com suas diferenças de comprimento de

fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas.

• Atualmente, o uso desta técnica é comum também para

estudos com ácidos nucléicos (Brown 1998; Farah

2000), na visualização de material genético (ácido

desoxirribonucléico e ribonucléico, DNA e RNA).

Arne Tiselus

Prêmio Nobel de

Química em 1948

Princípios da Eletroforese

O princípio da eletroforese utilizada

para separação de DNA, baseia-se na

carga total negativa do DNA (dada

pelos oxigênios do grupamento

fosfato). Assim, fragmentos de DNA

obtidos da técnica de PCR, podem

ser separados pela aplicação de uma

voltagem. Ao final do processo, as

cadeias de DNA estarão próximas ao

pólo positivo.

Princípios da Eletroforese

1.Separar partículas por diferença de carga

e massa

2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gel

3.Isolar fragmentos de DNA, RNA e

proteínas

Equipamentos

•Cuba Eletroforética

•Fonte de eletricidade

•Suporte para o gel

•Pentes

•Pipetas

Equipamentos

Gel de Agarose

• Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.

• Não-tóxico.

• Fácil de preparar.

• Possuem ampla capacidade de separação,mas baixa

resolução.

• Dependendo da concentração podem separar

fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.

• Custo elevado.

• Ao solidificar, após o aquecimento, os longos

filamentos de agarose formam uma matriz (malha) que

serve de "peneira" de separação de fragmentos de DNA.

•

•

Gel de Agarose

• Alguns fatores determinam a migração

do DNA através do gel de agarose:

a) tamanho da molécula de DNA

b) concentração da agarose

c) conformação do DNA

(formas circulares ou lineares)

d) a presença de brometo de etídio no gel

e) voltagem aplicada

f) tipo de agarose

g) tipo do tampão de eletroforese

Soluções e Reagentes

• Tampão

O gel é submerso em um tampão que possui

íons para a corrente passar e também para

manter o pH mais ou menos constante.

a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer –

Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)

b) TPE (Tris-phosphate-EDTA lectrophoresis buffer

Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)

c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer

Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA)


• Tampão de carregamento (loading

buffer)

É uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou

xileno cianol ) e glicerol, é misturado às amostras

antes de carregar o gel e possui três finalidades:

1) aumentar a densidade da amostra

2) adicionar cor às amostras

3) simplificar o processo de carregamento


• Coloração do gel:

1) Brometo de etídio

O brometo de etídio intercala-se com a molécula de

DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção

esse exerce uma ligação do tipo Van der Waals. A

radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o

DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível

no gel através de um dispositivo de transiluminação.

Como o brometo de etídio se intercala no DNA, esta

substância tem um poderoso efeito mutagênico e,

possivelmente pode ser cancerígeno ou teratogênico.

Marcadores de peso

molecular.A distância que o fragmento percorre a partir do ponto de

aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos

de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses

fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular),

misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e

eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel

no início do processo.

Montando a Eletroforese

•Preparação do Gel de Agarose

1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.

2. Adicionar 100mL de TAE 1X.

3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar

(sugestão: 2 a 2,5 min, potência 7).

4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte

de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba.

5. Acrescentar 5μL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar

com agitação leve.

6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas.

7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte.

8. Esperar a solução solidificar.

9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese.


•Preparação das Amostras (DNA)

1. Extrair 3μL da amostra de DNA.

2. Homogenizar com 1μL de tampão de corrida 5X

(Loading Buffer).

3. Aplicar as amostras nos poços.

4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida

(Ladder-1Kb).


•Montar a Cuba Eletroforética

•Adicionar o gel, previamente preparada

•Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a

superfície do gel.

•Adiciona as amostras a serem separadas

•Ajustar a voltagem desejada(média 80v)

e ligar a cuba

Eletroforese em gel

• Eletroforese em gel de poliacrilamida: a

poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros,

acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula

linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T".

Misturando essas duas moléculas, temos a formação de

uma "rede".O gel de poliacrilamida tem maior

capacidade de resolução e é mais efetivo para separar

pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de

base).

• Eletroforese Desnaturante: normalmente feita

em gel de agarose, inclui um agente desnaturante

(normalmente uréia), o que ajuda a tornar a separação

melhor entre moléculas que apresentam diferenciação

em suas estruturas secundárias.

Visualização após a

Eletroforese.Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e

olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.


Eletroforese.


Eletroforese

SYBR Green > Molecular Probes 1995

.

Revolucionou a detecção de DNA em géis.

A intensidade da fluorescência do SYBR

Green é aumentada em 100X quando se

liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas

de DNA.

Junto a sua sensibilidade superior o SYBR

Green tem outras vantagens sobre o EtBr:

- É muito menos mutagênico,

- Pode ser adicionado diretamente à

amostra antes da eletroforese.

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