Eletroforese de DNA

IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica 05/02/2013

Elisa Beatriz Prestes

Arne Tiselius

Prêmio Nobel de Química – 1948

Eletroforese de DNA A partir de 1970, após advento da eletroforese de proteínas

Grupo fosfato

Pentose

Base nitrogenada

Qual a carga elétrica dos ácidos nucléicos?

Estrutura de um nucleotídeo

Em pH neutro, DNA tem carga elétrica negativa.

–

+

Cátodo

Ânodo

Eletroforese de ácidos nucléicos

Agarose

Poliacrilamida

Eletroforese de ácidos nucléicos

Agarose

Poliacrilamida

Eletroforese de ácidos nucléicos

Tipo de gel Moléculas pequenas

Moléculas médias

Moléculas grandes

Poliacrilamida 10 pb – 3 Kb

Agarose 100 pb – 60 Kb

PFGE* 50 Kb – 10 Mb

*Eletroforese de Campo Pulsado (do inglês Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Fragmentos de DNA

Fragmentos de DNA

Plasmídeos

Cromossomos

Eletroforese em Agarose

Polissacarídeo composto por subunidades de galactose

Obtida a partir do ágar

Compõe a parede celular de algas

Agarose

Gel horizontal

Eletroforese em Agarose

Concentração do gel (%)

Faixa de separação (Kb)

0,3 5 – 60

0,6 1 – 20

0,7 0,8 – 10

0,9 0,5 – 7

1,2 0,4 – 6

1,5 0,2 – 3

2,0 0,1 – 2

Tamanho dos poros na matriz é determinado por % de agarose

Eletroforese em Poliacrilamida

Poliacrilamida

Acrilamida é monômero neurotoxina absorvida pela pele, com efeitos cumulativos

29 monômeros acrilamida: 1 Bis-acrilamida

Gel vertical

Eletroforese em Poliacrilamida

Polimerização da poliacrilamida depende de radicais livres (persulfato – APS), estabilizados

por TEMED.

Reação rápida de polimerização.

Fatores que influenciam a migração

Tamanho do DNA

Migração de forma end-on

Fragmentos pequenos percorrem maiores distâncias

que fragmentos grandes

Fatores que influenciam a migração

Conformação do DNA

Migração mais rápida de moléculas mais condensadas: supercoiled > linear > circular

Observação de 3 bandas no gel:

Fatores que influenciam a migração

Voltagem

Taxa de migração do DNA linear é proporcional à voltagem baixa aplicada

Faixa de separação diminui com o aumento

da voltagem

Fatores que influenciam a migração

Direção do campo elétrico

Direção única em géis de agarose e poliacrilamida

Mas moléculas > 50-100 Kb tendem a migrar na mesma taxa se direção do campo for igual...

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Direção do campo elétrico muda, forçando moléculas a mudar de curso moléculas maiores

demoram mais para serem realinhadas

Separação de moléculas de até 10 Mb!

Fatores que influenciam a migração

Composição de bases e temperatura

Presença de corantes intercalantes

Mais importante para géis de poliacrilamida, em agarose estes fatores influenciam pouco

Brometo de etídio (grupo planar que se intercala entre as bases nitrogenadas) reduz a mobilidade do DNA em 5%

É vantajoso realizar a coloração após a corrida!

Corantes de ácidos nucléicos

Brometo de Etídio

Agente que se intercala ao DNA luz UV (laranja)

Carcinogênico, mutagênico e teratogênico

Corantes de ácidos nucléicos

SYBR Green

Agente que se intercala ao DNA luz UV (verde)

Potencialmente carcinogênico

Aplicação em PCR em tempo real (qPCR)

Fatores que influenciam a migração

Composição do tampão

Força iônica. Resistência ~ igual ao gel

Poucos íons: DNA migra pouco ou nada

Íons demais: condutância gera muito calor (gel derrete e DNA desnatura)

Aplicações da eletroforese

Separação de DNA por tamanho: Análise de resultado (PCR, diagnóstico) Purificação de fragmentos de interesse Blotting

Obrigada!