bases da análise genômica: estado da arte

7/10/2012

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Bases da análise

genômica: estado da

arte

Cesar Martins [email protected]

Departamento de MorfologiaInstituto de Biociências UNESP – Universidade Estadual PaulistaBotucatu, SP

Avanços nas tecnologias para estudar genes e genomas

- Enzimas de restrição e tecnologia do DNA recombinante;- Sequenciamento nucleotídico;- PCR – Reação em Cadeia da Polimerase;- Sequenciamento em larga escala;- Bioinformática.

Análise genômica: presente e futuro

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Conhecendo os genomas...

# Mapeamento físico do genoma

# Mapeamento genético (mapa de ligação)




# Mapeamento físico cromossômico

# Mapeamento físico por restrição enzimática

# Mapeamento físico de seqüência nucleotídica


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Avanços no conhecimento dos genomas

- Restrição enzimática

- Construção de bibliotecas genômicas

- PCR – Reação em Cadeia da Polimerase



Potencial das enzimas de restrição na manipulação do material genético

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Potencial das enzimas de restrição na manipulação do material genético

Arber, Smith e NathansPrêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 1978


Sítio de clivagem Fragmentos gerados

Finais retos

Finais

coesivos


Enzimas de Restrição

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Produção de moléculas recombinantes

Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição e produção de moléculas recombinantes


Propagação de moléculas de DNA

DNA recombinante

Bactéria P-

Bactéria P+

DNA exógeno

Bactéria P+

plasmídeonucleóide

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Vetores de clonagem para propagação

de DNA de interesse

Plasmídeo Fago Cosmídio

YAC

limite de clonagem

100-1000 kb

limite de clonagem

35- 50 kb

limite de clonagem

Até 20 kb

limite de clonagem

100-10.000 pb

BAClimite de clonagem

100-300 kb

Construção de bibliotecas genômicas


O que é um BAC?

Bacterial Artificial Chromosome

Construção recombinante baseada

no plasmídeo F de E. coli

Vetor de clonagem para propagação

de um DNA de interesse


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BAC – Bacterial Artificial Chromosome

Vantagens:

→ 100-300 kb

→ maior estabilidade

→ menor quimerismo

→ cópia única


Análise

Genomic DNA

Large fragments used

to construct BAC

lybrariesBAC clone

Construção de bibliotecas em BACs e sua

utilização como sondas cromossômicas


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Construção de

bibliotecas em BACs

Abrir com enzima de restrição

Ligar com fragmento de DNA genomico

SacBII

promoter

oriF

Cm(R)

pBACe3.6

EES

11.5 kb

SacB+: SacBII codifica levansucrase,

que converte sucrose em levan,

um composto tóximo para a bacteria.

grande fragmento, 300kb

oriFCm(R)

promoter

SSacBII

SacB-: Não há a pordução de levan:

seleção positiva de recombinantes.

BACs como vetores de clonagem


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Vetor BAC utilizado para construção de

bibliotecas de O. niloticus (Tilápia do Nilo)

BACs como vetores

de clonagem


pBAC-lac-

pBAC-lac+Clivagem com

HindIII e

defosforilação

Células

espermáticasConstrução de

bibliotecas em BACsDigestão parcial

do DNA genômico

com HindIII1

DNA genômico de

alta qualidade

purificado

PFGE para

separar

fragmentos

digeridos

E. Coli DH10B

Purificação dos

fragmentos

digeridos

Ligação

(1:10, excesso de BAC)

Clones

recombinantes


2008%20Uberlandia%20Curso%202%20anexo2a.ppt

2008%20Uberlandia%20Curso%202%20anexo1.ppt





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E. Coli DH10B

pBAC-lac-Construção de

bibliotecas em BACs pBAC-lac+

Eletroporação

Número de colônias a

serem estocadas ?

Estocagem das

colônias em

placas 384 wells

Seleção de

recombinantes3a


Construção de

bibliotecas em BACs

Número de colônias a serem estocadas ????

Depende do tamanho médio dos

fragmentos de DNA inseridos nos BACs

Tamanho do genoma: O. Niloticus –

genoma de 1.000.000.000 nt

Número de clones para cobrir totalmente

o genoma da espécie

BACs com insertos médios de 200 kb:

5.000 clones – 1x genoma

Biblioteca de O. niloticus:

30.000 BAC-clones

Cobertura de 6x o genoma


2008%20Uberlandia%20Curso%202%20anexo3a.ppt

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Construção de

bibliotecas em BACs

Número de colônias a serem estocadas ????

Biblioteca de O. niloticus:

30.000 BAC-clones

Cobertura de 6x o genoma

Placas de 384 wells

78 placas de 384 wells

Coleta dos clones das placas originais

e estocagem em placas 384 wells

Robotizado!!


Análises em PFGE após digestão com NotI de BACs

representativos das bibliotecas construídas

Construção de

bibliotecas em BACs

Katagiri et al. 2001, Animal Genetics 32: 200-204


http://www.youtube.com/watch?v=udx6eQKdJHk&feature=related


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Plotagem dos clones em

membrana de nylon (robô)

Hibridação para

busca de genes de

interesse

Construção de

bibliotecas em BACs


Construção de

bibliotecas em BACs

Checagem

Análise do BAC

identificado

Crescimento

do clone de

interesse

Purificação

dos BACs


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Bibliotecas em BACs

Aplicações...


Bibliotecas em BACs

Construção...







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Desvendando a complexidade dos genomas

Thomas H. Morgan: (1911) propôs a hipótese de que os

fatores hereditários (genes) estariam localizados em lugares

definidos nos cromossomos e dispostos em uma ordem linear.

Mapa genético de ligação


http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://nobelprize.org/medicine/laureates/1933/morgan.gif&imgrefurl=http://nobelprize.org/medicine/laureates/1933/morgan-bio.html&h=198&w=140&sz=12&hl=pt-BR&start=1&tbnid=OixFuyCRN8JrxM:&tbnh=104&tbnw=74&prev=/images?q=Thomas+h+morgan&svnum=10&hl=pt-BR&lr=&sa=N

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Mapa genético de ligação:

-frequência de recombinação entre características

1% de recombinação entre dois genes ligados = 1 unidade de mapa

1 unidade de mapa = 1 centiMorgan (cM)





1% de recombinação entre dois genes ligados = 1 unidade de mapa

1 unidade de mapa = 1centiMorgan (cM)

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Mapa genético de ligação (clássico)

Exemplo de mapa de ligação: 4

cromossomos de Drosophila foram

mapeados extensivamente pelo estudo

genético de recombinantes




(marcadores moleculares)

Lee et al. 2005, Genetics 170: 237–244


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Mapa físico

cromossômico

Myrmecia pilosula, 2n=2

Ophioglossum reticulatumPteridófita (Samambaia), 2n=1260

Homo sapiens2n=46


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Mapa físico cromossômico

“Genoma”Termo cunhado em 1920 por Hans Winkler: conjugação de “gene” e “cromossomo”

Winkler escreveu (em tradução grosseira):“I propose the expression Genome for the haploid chromosome set, which, together with the pertinent protoplasm, specifies the material foundations of the species...”

Chromosomos metafásicos humanos



Mapa físico

cromossômico


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Mapa físico

cromossômico-hibridação in situ fluorescente;

-genes/fragmentos de DNA como

sondas cromossômicas;

-cromossomos inteiros ou segmentos;



Mapa físico

cromossômico

Humano

Muntiacus muntjak (Cervídeo)


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Mapeamento físico por

restrição enzimática





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DNA genômico

Fragmentaçã por


Fragmentos utilizados

para construir

bibliotecas em BACs

(Bacteria Artificial

Chromosomes)Clivagem dos BACs e

verificação dos perfis

gerados

Mapeamento físico por restrição

enzimática de bibliotecas genômicas



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Fragmentação do BAC

por restrição

enzimática









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Mapa físico de bibliotecas genômicas


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Organização dos

BACs em contigs

Contig 1 Contig 2





BACs

Contigs

Segmento

cromossômico

Genome (chromosome) scaffold

*BAC-end sequencing





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Identificação de sequencias

repetitivas no genoma








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Mapa físico de seqüência

nucleotídica


Sanger et al. 1977, Nature 265: 687-695



nucleotídica


Montagem das sequências


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A evolução no sequenciamento de DNA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genbankstats-2008/


nucleotídica

bases da análise genômica: estado da arte

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