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9/7/2013
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Bases da análise
genômica: estado da
arte
Cesar Martins ([email protected])Departamento de MorfologiaInstituto de Biociências , UNESP Universidade Estadual PaulistaBotucatu, SP
Avanços nas tecnologias para estudar genes e genomas
-Enzimas de restrição e tecnologia do DNA recombinante;
-Sequenciamento nucleotídico;
-PCR Reação em Cadeia da Polimerase;
-Sequenciamento em larga escala;
-Bioinformática.
Análise genômica 2013
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Conhecendo os genomas...
# Mapeamento genético
-mapa de ligação
# Mapeamento físico -cromossômico
# Mapeamento físico -restrição enzimática
# Mapeamento físico-seqüência nucleotídica
Análise genômica 2013
Conhecendo os genomas...
# Mapeamento genético (mapa de ligação)
# Mapeamento físico cromossômico
# Mapeamento físico por restrição enzimática
# Mapeamento físico de seqüência nucleotídica
Análise genômica 2013
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Conhecendo os genomas...
# Mapeamento genético (mapa de ligação)
# Mapeamento físico cromossômico
# Mapeamento físico por restrição enzimática
# Mapeamento físico de seqüência nucleotídica
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Thomas H. Morgan: (1911) propôs a hipótese de que os
fatores hereditários (genes) estariam localizados em lugares definidos
nos cromossomos e dispostos em uma ordem linear.
Mapa genético de ligação
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Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa genético de ligação:
-frequência de recombinação entre características
1% de recombinação entre dois genes ligados = 1 unidade de mapa
1 unidade de mapa = 1 centiMorgan (cM)
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa genético de ligação
1% de recombinação entre dois genes ligados = 1 unidade de mapa
1 unidade de mapa = 1centiMorgan (cM)
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Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa genético de ligação (clássico)
Exemplo de mapa de ligação: 4
cromossomos de Drosophila foram
mapeados extensivamente pelo estudo
genético de recombinantes
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa genético de ligação
(marcadores moleculares)
Lee et al. 2005, Genetics 170: 237 244
Análise genômica 2013
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Conhecendo os genomas...
# Mapeamento genético (mapa de ligação)
# Mapeamento físico cromossômico
# Mapeamento físico por restrição enzimática
# Mapeamento físico de seqüência nucleotídica
Análise genômica 2013
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa físico
cromossômico
Myrmecia pilosula, 2n=2
Ophioglossum reticulatum
Pteridófita (Samambaia), 2n=1260
Homo sapiens
2n=46
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Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa físico cromossômico
GenomaTermo cunhado em 1920 por Hans Winkler: conjugação de gene e cromossomo
Winkler escreveu (em tradução grosseira):I propose the expression Genome for the haploid chromosome set,
which, together with the pertinent protoplasm, specifies the material foundations of the species...
Chromosomos metafásicos humanos
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa físico
cromossômico
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Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa físico
cromossômico-hibridação in situ fluorescente;
-genes/fragmentos de DNA como sondas
cromossômicas;
-cromossomos inteiros ou segmentos;
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa físico
cromossômico
Humano
Muntiacus muntjak (Cervídeo)
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Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa comparativo
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Conhecendo os genomas...
# Mapeamento genético (mapa de ligação)
# Mapeamento físico cromossômico
# Mapeamento físico por restrição enzimática
# Mapeamento físico de seqüência nucleotídica
Análise genômica 2013
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Avanços no conhecimento dos genomas
- Restrição enzimática
- Construção de bibliotecas genômicas
Análise genômica 2013
Potencial das enzimas de restrição na manipulação do material genético
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Potencial das enzimas de restrição na manipulação do material genético
Arber, Smith e NathansPrêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 1978
Análise genômica 2013
Sítio de clivagem Fragmentos gerados
Finais retos
Finais
coesivos
Enzimas de Restrição
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Análise genômica 2013
Produção de moléculas recombinantes
Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição e produção de moléculas recombinantes
Análise genômica 2013
Propagação de moléculas de DNA
DNA recombinante
Bactéria P-
Bactéria P+
DNA exógeno
Bactéria P+
plasmídeonucleóide
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Análise genômica 2013
Vetores de clonagem para propagação
de DNA de interesse
Plasmídeo Fago Cosmídio
YAC
limite de clonagem
100-1000 kb
limite de clonagem
35- 50 kb
limite de clonagem
Até 20 kb
limite de clonagem
100-10.000 pb
BAClimite de clonagem
100-300 kb
Construção de bibliotecas genômicas
O que é um BAC?
Bacterial Artificial Chromosome
Construção recombinante baseada
no plasmídeo F de E. coli
Vetor de clonagem para propagação
de um DNA de interesse
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BAC Bacterial Artificial Chromosome
Vantagens:
100-300 kb
maior estabilidade
menor quimerismo
cópia única
Análise genômica 2013
Análise
Genomic DNA
Large fragments used to
construct BAC lybraries
BAC clone
Construção de bibliotecas em BACs e sua
utilização como sondas cromossômicas
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Análise genômica 2013
Construção de
bibliotecas em BACs
Abrir com enzima de restrição
Ligar com fragmento de DNA genomico
SacBII
promoter
oriF
Cm(R)
pBACe3.6
EES
11.5 kb
SacB+: SacBII codifica levansucrase,
que converte sucrose em levan,
um composto tóximo para a bacteria.
grande fragmento, 300kb
oriFCm(R)
promoter
SSacBII
SacB-: Não há a pordução de levan:
seleção positiva de recombinantes.
BACs como vetores de clonagem
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Vetor BAC utilizado para construção de
bibliotecas de O. niloticus (Tilápia do Nilo)
BACs como vetores
de clonagem
Análise genômica 2013
pBAC-lac-
pBAC-lac+Clivagem com
HindIII e
defosforilação
Células
espermáticasConstrução de
bibliotecas em BACsDigestão parcial
do DNA genômico
com HindIII1
DNA genômico de
alta qualidade
purificado
PFGE para
separar
fragmentos
digeridos
E. Coli DH10B
Purificação dos
fragmentos
digeridos
Ligação
(1:10, excesso de BAC)
Clones
recombinantes
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E. Coli DH10B
pBAC-lac-Construção de
bibliotecas em BACs pBAC-lac+
Eletroporação
Número de colônias a
serem estocadas ?
Estocagem das
colônias em
placas 384 wells
Seleção de
recombinantes3a
Análise genômica 2013
Construção de
bibliotecas em BACs
Número de colônias a serem estocadas ????
Depende do tamanho médio dos
fragmentos de DNA inseridos nos BACs
Tamanho do genoma: O. Niloticus
genoma de 1.000.000.000 nt
Número de clones para cobrir totalmente
o genoma da espécie
BACs com insertos médios de 200 kb:
5.000 clones 1x genoma
Biblioteca de O. niloticus:
30.000 BAC-clones
Cobertura de 6x o genoma
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Construção de
bibliotecas em BACs
Número de colônias a serem estocadas ????
Biblioteca de O. niloticus:
30.000 BAC-clones
Cobertura de 6x o genoma
Placas de 384 wells
78 placas de 384 wells
Coleta dos clones das placas originais
e estocagem em placas 384 wells
Robotizado!!
Análise genômica 2013
Análises em PFGE após digestão com NotI de BACs
representativos das bibliotecas construídas
Construção de
bibliotecas em BACs
Katagiri et al. 2001, Animal Genetics 32: 200-204
Análise genômica 2013
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Análise genômica 2013
Plotagem dos clones em
membrana de nylon (robô)
Hibridação para
busca de genes de
interesse
Construção de
bibliotecas em BACs
Análise genômica 2013
Construção de
bibliotecas em BACs
Checagem
Análise do BAC
identificado
Crescimento
do clone de
interesse
Purificação
dos BACs
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Bibliotecas em BACs
Aplicações...
Bibliotecas em BACs
Construção...
Análise genômica 2013
Mapeamento físico por
restrição enzimática
Desvendando a complexidade dos genomas
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Mapeamento físico por
restrição enzimática
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
Mapeamento físico por
restrição enzimática
Mapeamento físico por
restrição enzimática
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
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Mapeamento físico por
restrição enzimática
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapeamento físico por
restrição enzimática
Análise genômica 2013
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Fragmentação do BAC
por restrição enzimática
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
DNA genômico
Fragmentaçã por
restrição enzimática
Fragmentos utilizados
para construir bibliotecas
em BACs (Bacteria
Artificial Chromosomes)
Clivagem dos BACs e
verificação dos perfis
gerados
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
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Análise genômica 2013
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
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Análise genômica 2013
Mapa físico de bibliotecas genômicas
Desvendando a complexidade dos genomas
Organização dos
BACs em contigs
Contig 1 Contig 2
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Desvendando a complexidade dos genomas
Análise genômica 2013
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BACs
Contigs
Segmento
cromossômico
Genome (chromosome) scaffold
*BAC-end sequencing
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Análise genômica 2013
Análise genômica 2013
Mapeamento físico por restrição
enzimática de bibliotecas genômicas
Desvendando a complexidade dos genomas
Identificação de sequencias
repetitivas no genoma
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Desvendando a complexidade dos genomas
# Mapeamento genético (mapa de ligação)
# Mapeamento físico cromossômico
# Mapeamento físico por restrição enzimática
# Mapeamento físico de seqüência nucleotídica
Análise genômica 2013
Mapa físico de seqüência
nucleotídica
Desvendando a complexidade dos genomas
Sanger et al. 1977, Nature 265: 687-695
Análise genômica 2013
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Mapa físico de seqüência
nucleotídica
Desvendando a complexidade dos genomas
Montagem das sequências
Análise genômica 2013
A evolução no sequenciamento de DNA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genbankstats-2008/
Mapa físico de seqüência
nucleotídica
Análise genômica 2013