análise genômica e funcional da cianobactéria nostoc sp. cena67
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA
DANILLO OLIVEIRA DE ALVARENGA
Análise genômica e funcional da cianobactéria Nostoc sp. CENA67
e caracterização da sua comunidade microbiana associada
Piracicaba
2015
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DANILLO OLIVEIRA DE ALVARENGA
Análise genômica e funcional da cianobactéria Nostoc sp. CENA67
e caracterização da sua comunidade microbiana associada
Tese apresentada ao Centro de Energia Nuclear naAgricultura da Universidade de São Paulo para aobtenção do título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Biologia na Agricultura e noAmbiente
Orientadora: Profa. Dra. Marli de Fátima Fiore
Co-orientador: Prof. Dr. Artur Luiz da Costa da Silva
Piracicaba2015
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER
MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE
QUE CITADA A FONTE
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Alvarenga, Danillo Oliveira de
Análise genômica e funcional da cianobactéria Nostoc sp. CENA67 e
caracterização da sua comunidade microbiana associada / Danillo Oliveira de
Alvarenga; orientadora Marli de Fátima Fiore; co-orientador Artur Luiz da Costa da
Silva. - - Piracicaba, 2015.
115 f. : il.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de
Concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia Nuclear na
Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Bactérias fixadoras de nitrogênio 2. Bioinformática 3. Ecologia microbiana
4. Genética bacteriana 5. Genomas 6. Metabolismo secundário 7. Microbiologia do
solo 8. Terra preta antropogênica I. Título
CDU 579.262 : 575.111
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AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Marli de Fátima Fiore, pela orientação, suporte, conselhos e
ensinamentos valiosos aos longos destes anos.
À Profa. Dra. Maria Paula Cruz Schneider e ao Prof. Dr. Artur Luiz da Costa da Silva,
pelo apoio, pelas discussões e por compartilharem seu laboratório conosco.
Ao Prof. Dr. Robert Edwards, pela oportunidade de estagiar em seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Alessandro de Mello Varani, por sua disponibilidade e ajuda
indispensável nas análises genômicas.
Ao Prof. Dr. Augusto Etchegaray Jr., pelas discussões e colaborações.
À Dra. Janaina Rigonato, pelas lições, apoio e amizade.
Às(aos) colegas do Laboratório de Ecologia Molecular de Cianobactérias, Andresa
Maíra da Fonseca, Ana Paula Dini Andreote, Bruno Costa Evangelista de Souza, Bruno
Weiss, Caroline Hoff Risseti, Caroline Souza Pamplona da Silva, Elaine Crespim, Gabriela
Machineski da Silva, Karina Heck da Silva, Maria Estela Stenico, Mariana Garcia Leal,
Patricia Dayane Carvalho Schaker, Paula Cabral Tamasauskas, Stella Thomaz de Lima e
Talita Schiavolin pela ajuda no laboratório, pelo companheirismo e pela amizade.
À Profa. Dra. Danielle Costa Carrara Couto, à Profa. Dra. Regiane Silva Kawasaki
Francês e ao Prof. Dr. Rommel Tiago Jucá Ramos, pelo acolhimento e pelas lições de
bioinformática.
A Genivaldo Gueiros Zacarias Silva e Fabyano Alvares Cardoso Lopes, pelo auxílio
nas análises e pelas trocas de informações.
À Profa. Dra. Celia Regina Montes, pela ajuda na microscopia eletrônica de varredura.
A Marília Ribeiro Garcia Henyei, pela revisão e correção da formatação da tese.
Ao Programa de Pós-Graduação do Centro de Energia Nuclear na Agricultura e a toda
a equipe deste Centro, por todo o auxílio fornecido.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo financiamento da
pesquisa e pela bolsa de estudos.
À minha família, a maior responsável pela pessoa que hoje sou, que, mesmo à
distância, nunca deixou de se mostrar presente.
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para a
realização deste trabalho.
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A visão da evolução como uma competição sangrenta crônica entre indivíduos e espécies,
uma distorção popular da noção darwiniana de “sobrevivência do mais apto”, se dissolve
perante uma nova visão de cooperação contínua, forte interação e interdependência entre as
formas de vida. A vida não dominou o globo pelo combate, mas pela criação de redes. Formas
de vida se multiplicaram e se tornaram complexas cooptando outras, não apenas matando-as.
Lynn Margulis
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RESUMO
ALVARENGA, D. O. Análise genômica e funcional da cianobactéria Nostoc sp. CENA67
e caracterização da sua comunidade microbiana associada. 2015. 115 f. Tese (Doutorado)
– Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2015.
Nostoc é um gênero cianobacteriano com distribuição ubíqua que tem importância em
diversos ecossistemas. Contudo, poucos genomas estão atualmente disponíveis para esse
gênero. Enquanto Nostoc spp. são as cianobactérias mais comumente relatadas em relações
simbióticas com fungos, animais, plantas e outros organismos, associações com outros
micro-organismos não receberam atenção similar. Como consequência das fortes interações
entre cianobactérias e heterótrofos, culturas não axênicas são geralmente obtidas no
isolamento dessas bactérias, o que proporciona uma oportunidade interessante para o
desenvolvimento tanto de estudos genômicos quanto metagenômicos. Este trabalho teve como
objetivo investigar as características genômicas e funcionais da linhagem Nostoc sp.
CENA67, isolada de terra preta antropogênica, bem como estudar sua comunidade associada.
Para esse fim, células de uma cultura não axênica de Nostoc sp. CENA67 foram sequenciadas
com as plataformas MiSeq e Ion PGM e analisados com ferramentas genômicas e
metagenômicas. A linhagem CENA67 de fato pertence à família Nostocaceae e possui
algumas características em comum com cianobactérias do gênero Nostoc, porém diverge em
certos aspectos morfológicos e filogenéticos do grupo típico de Nostoc, sugerindo que seja
representante de um novo táxon. Além disso, seu genoma apresenta diferenças em relação aos
genomas atualmente disponíveis para cianobactérias relacionadas ao gênero. A mineração
desse genoma revelou 31 agrupamentos gênicos hipoteticamente relacionados à síntese de
metabólitos secundários, a maioria dos quais não mostrou similaridade significativa com
agrupamentos conhecidos. A análise de um agrupamento gênico de microviridina desvendou
uma maior diversidade de genes para precursores dessa molécula do que se acreditava
anteriormente, sugerindo que um número considerável de variantes ainda está a ser
descoberta. A análise taxonômica da comunidade associada confirmou a dominância de
cianobactérias na cultura, mas também revelou a presença de grande número de gêneros
microbianos que normalmente são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e estabelecer
simbiose com plantas, incluindo Mesorhizobium, Sinorhizobium e Starkeya, entre outros.
Rascunhos genômicos foram obtidos para Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium
japonicum, Burkholderia lata e Hyphomicrobium nitrativorans. Todavia, genes para fixação
de nitrogênio não foram detectados nesses genomas, apesar de serem encontrados no genoma
da cianobactéria e no metagenoma da comunidade, o que sugere que algumas populações
podem estar sob pressão de seleção para a perda da capacidade de fixação de nitrogênio,
provavelmente devido a este nutriente estar sendo fornecido pelo organismo mais abundante
nesta comunidade, a cianobactéria. A análise funcional indicou vias exclusivas tanto à
cianobactéria quanto à comunidade associada, e sugeriu a complementariedade de certos
metabolismos. Os resultados possibilitam o aumento do conhecimento sobre a diversidade
molecular e química do filo Cyanobacteria e levantam possíveis interações com
micro-organismos simbiontes.
Palavras-chave: Consórcios microbianos. Microbiologia do solo. Interações microbianas.
Metabolismo secundário. Microviridina.
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ABSTRACT
ALVARENGA, D. O. Genomic and funcional analysis of the cyanobacterium Nostoc sp.
CENA67 and characterization of its associated microbial community. 2015. 115 f. Tese
(Doutorado) – Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo,
Piracicaba, 2015.
Nostoc is a cyanobacterial genus with ubiquitous distribution that is important in several
ecosystems. However, few genomes are currently available for this genus. While Nostoc spp.
are the most commonly reported cyanobacteria in symbiotic relationship with fungi, animals,
plants, and other organisms, associations with other microorganisms have not received similar
attention. As a consequence of tight interactions between cyanobacteria and heterotrophs,
non-axenic cultures are usually achieved in the isolation of these bacteria, which provides an
interesting opportunity for carrying out both genomic as metagenomic studies. This work
aimed to investigate the genomic and functional characteristics of the strain Nostoc sp.
CENA67, isolated from anthropogenic dark earth, and to study its associated community. For
this purpose, cells from a non-axenic culture of Nostoc sp. CENA67 were sequenced with the
platforms MiSeq and Ion PGM and analyzed with genomic and metagenomic tools. The strain
CENA67 indeed belongs to the family Nostocaceae and presents some characteristics in
common with cyanobacteria of the genus Nostoc, but diverges in certain morphological and
phylogenetic aspects of the typical Nostoc group, suggesting that it is a representative of a
new taxon. In addition, its genome presents differences in relation to the genomes currently
available for cyanobacteria related to this genus. Genome mining revealed 31 gene clusters
hypothetically related to the synthesis of secondary metabolites, most of which did not show
significant similarity to known clusters. The analysis of a microviridin gene cluster unveiled a
larger diversity of precursor genes for this molecule than was previously believed, suggesting
that a considerable number of variants is still to be found. The taxonomic analysis of the
associated community confirmed the dominance of cyanobacteria in the culture, but also
revealed the presence of a great number of microbial genera that are usually capable of fixing
atmospheric nitrogen and establishing symbiosis with plants, including Mesorhizobium,
Sinorhizobium, and Starkeya, among others. Genomic drafts were obtained for
Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia lata, and
Hyphomicrobium nitrativorans. Nevertheless, genes for nitrogen fixation were not detected in
these genomes, despite being found in the cyanobacterial genome and the community
metagenome, suggesting that some populations might be under selection pressure for the loss
of the ability to fix nitrogen, probably due to this nutrient being provided for the most
abundant organism in this culture, the cyanobacterium. Functional analysis indicated
pathways exclusive both to the cyanobacterium as to the associated community, and
suggested the complementarity of certain metabolisms. These results allow the increase of the
knowledge about the molecular and chemical diversity of the phylum Cyanobacteria and raise
possible interactions with symbiotic microorganisms.
Keywords: Microbial consortia. Soil microbiology. Microbial interactions. Secondary
metabolism. Microviridin.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................13
2. REVISÃO DA LITERATURA .........................................................................................15
2.1 O gênero Nostoc .................................................................................................................15
2.2 Associações ecológicas entre cianobactérias e outros organismos ....................................18
2.3 Produtos naturais cianobacterianos ....................................................................................22
2.4 Genômica cianobacteriana .................................................................................................24
2.5 Terra preta antropogênica ..................................................................................................29
3. HIPÓTESES .......................................................................................................................31
4. OBJETIVOS .......................................................................................................................32
4.1 Objetivo geral ....................................................................................................................32
4.2 Objetivos específicos .........................................................................................................32
5. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................33
5.1 Origem da amostra .............................................................................................................33
5.2 Obtenção de biomassa .......................................................................................................33
5.3 Caracterização morfológica ...............................................................................................34
5.4 Extração de DNA ...............................................................................................................34
5.5 Reconstrução filogenética ..................................................................................................35
5.6 Sequenciamento de DNA ...................................................................................................37
5.7 Pré-processamento de sequências e montagem .................................................................37
5.8 Anotação e detecção de produtos naturais .........................................................................38
5.9 Análises comparativas ........................................................................................................38
5.10 Diversidade taxonômica e funcional ................................................................................39
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................40
6.1 Caracterização morfológica e filogenética ........................................................................40
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6.2 Sequenciamento, montagem e anotação genômica ............................................................44
6.3 Detecção de metabólitos secundários ................................................................................50
6.4 Análises genômicas comparativas .....................................................................................59
6.5 Diversidade taxonômica de micro-organismos associados ................................................71
6.6 Caracterização funcional da comunidade associada ..........................................................79
7. CONCLUSÕES ..................................................................................................................88
REFERÊNCIAS .....................................................................................................................89
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1. INTRODUÇÃO
Novas tecnologias de sequenciamento de ácidos desoxirribonucleicos foram
disponibilizadas para a comunidade científica a partir da década de 2000. Essas inovações
tecnológicas se baseiam em metodologias que permitem a análise de um volume muito maior
de nucleotídeos que o possível com o tradicional método de Sanger, que se manteve como o
método-padrão de sequenciamento por mais de três décadas. Com as novas gerações de
sequenciadores de DNA, a realização de projetos envolvendo genômica e metagenômica se
tornou menos onerosa e mais rápida. Consequentemente, projetos desse gênero passaram a ter
maior acessibilidade.
A bioinformática tem buscado acompanhar esse avanço, disponibilizando um número
considerável de programas computacionais para a análise do crescente volume de informação
que se torna possível pelas novas plataformas. Contudo, a despeito dos avanços na área,
vários obstáculos ainda permanecem carentes de superação. A genômica cianobacteriana é um
campo que ainda tem caminhado a passos relativamente lentos, consequência de uma série de
peculiaridades inerentes ao estudo desses micro-organismos. Isso resulta em um número de
genomas cianobacterianos ainda diminuto quando em comparação com a enorme variedade de
sequências genômicas atualmente disponíveis para bactérias de outros filos.
Como produtores primários, os organismos do filo Cyanobacteria interagem
ecologicamente tanto com eucariotos quanto com bactérias e arqueias, podendo estabelecer
fortes associações com estes organismos. Em decorrência disso, o isolamento completo de
linhagens cianobacterianas raramente é bem sucedido. As dificuldades de obtenção de
culturas puras de cianobactérias e os desafios técnicos inerentes ao estudo de culturas mistas
são fatores que contribuem fortemente para a complexidade desse tema.
Apesar disso, um número cada vez maior de grupos de pesquisa ao redor do mundo
vêm buscando adentrar esse campo emergente. Uma tendência que pode ser claramente
observada nos projetos que têm sido conduzidos nos anos mais recentes é o reconhecimento
da necessidade de se estudar cianobactérias de grupos taxonômicos cuja diversidade ainda é
pouco compreendida e/ou que provenham de ambientes pouco explorados. Os biomas
brasileiros são uma ótima fonte de micro-organismos com essas características, já que
estimativas apontam naqueles a existência de hábitats com alta diversidade microbiana, cuja
maior parte segue desconhecida.
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Entre as cianobactérias de maior destaque, encontra-se Nostoc, um gênero de ampla
distribuição mundial que apresenta importância ecológica, evolutiva, biogeoquímica,
biotecnológica e ecotoxicológica em muitos ecossistemas terrestres e aquáticos. Os
organismos desse gênero disponibilizam carbono e nitrogênio fixados em diversos hábitats, e
várias de suas espécies já foram relatadas em simbiose com outros organismos. Esse táxon
apresenta grande diversidade metabólica, com várias moléculas bioativas tendo sido isoladas
e caracterizadas a partir de extratos de linhagens pertencentes a esse gênero. Todavia, o
gênero é polifilético e sua diversidade intergenérica é, no momento, bastante confusa, fato que
também traz importância taxonômica ao seu estudo.
CENA67 é uma linhagem cianobacteriana proveniente da região amazônica brasileira.
Isolada a partir de terra preta antropogênica como um organismo de vida livre, CENA67 foi
identificada por métodos clássicos no gênero Nostoc. Como isolados de Nostoc spp. obtidos a
partir de solos da Amazônia costumam se agrupar em clados distintos em árvores
filogenéticas, essa linhagem provavelmente apresenta diferenças significativas em relação às
outras cianobactérias do gênero. Dessa forma, o estudo do genoma dessa cianobactéria
possibilita o aumento do conhecimento sobre a diversidade do filo Cyanobacteria, bem como
uma melhor compreensão a respeito de seu metabolismo secundário e de sua capacidade de
estabelecer interações ecológicas.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O gênero Nostoc
Nostoc Vaucher ex Born. et Flah. é o gênero-tipo da família Nostocaceae. Essa família
agrupa cianobactérias filamentosas heterocitadas que são caracterizadas por tricomas
isopolares obrigatoriamente unisseriados, com células que se dividem perpendicularmente ao
eixo do tricoma, e que não apresentam ramificação ou zonas meristemáticas (KOMÁREK;
ANAGNOSTIDIS, 1989; KOMÁREK, 2010a; KOMÁREK, 2013). Os gêneros dessa família
são tradicionalmente distinguidos entre si pela morfologia de filamentos e de células
vegetativas, posição de heterócitos e tipo de formação de acinetos, bem como pela forma da
colônia, formato das células terminais, presença de bainha ou aerótopos e ciclo de vida
(RAJANIEMI et al., 2005).
Membros do gênero Nostoc são tradicionalmente diferenciados do restante da família
por sua morfologia metamérica, com formação apo-heterocítica de acinetos, e pela alta
complexidade em seu ciclo de vida. Alguns membros desse gênero são capazes de produzir
colônias gelatinosas macroscópicas que podem ser visualizadas como mantos finos na
superfície de plantas aquáticas e de substratos submersos ou como esferas ocas de até vários
centímetros, que podem protegê-los contra o ambiente (SAND-JENSEN, 2014). Seu
complexo ciclo de vida, caracterizado por estágios iniciais com tricomas encerrados dentro de
bainhas mucilaginosas esféricas, heterócitos polares, um tipo especial de germinação de
acinetos e produção de hormogônios com motilidade, não é encontrado em nenhum dos
demais gêneros da família (KOMÁREK; ANAGNOSTIDIS, 1989; KOMÁREK, 2013).
A ubiquidade do gênero é bastante marcante, tendo sido encontrados representantes do
gênero Nostoc em todos os continentes. Além de observadas em diversos ecossistemas
americanos, africanos, asiáticos, europeus e oceânicos, incluindo solos de deserto, pântanos,
estuários, arrozais e fontes termais, colônias destas cianobactérias foram detectadas em
regiões extremamente frias e secas de vales da Antártica e do Ártico. Nos anos 1960, o gênero
também foi relatado a 1.000 m de profundidade no Oceano Índico e no Mar Mediterrâneo,
porém este dado permanece questionável. Relatos de Nostoc spp. em ambiente aquático
indicam quase exclusividade para água doce, geralmente com preferência por pH alcalino
(POTTS, 2000).
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Diversas colônias de Nostoc spp. podem adquirir proporções macroscópicas e exalar
odores característicos de terra molhada. Consequentemente, elas têm despertado interesse
humano ao longo dos séculos. Seu primeiro relato conhecido data de por volta de 1.600 AP,
na China, durante a Dinastia Jin (séculos 4 e 5 EC). Durante essa época, o médico e
alquimista Hong Ge introduziu colônias de N. commune na alimentação do Imperador Yuan,
Rui Sima, que as batizou de Ge-Xian-Mi (“arroz do imortal Ge”). Colônias secas eram
conhecidas popularmente na China da Dinastia Jin como Fa-Cai (“cabelo vegetal”). Na Idade
Média, acreditava-se que estas colônias tinham origem sobrenatural ou que caíam do céu ao
solo, e isto lhes rendeu em alguns locais da Alemanha, da França, do Reino Unido, da
Escandinávia e das Filipinas denominações populares equivalentes a “flor do sol”, “estrela
cadente”, “geleia das bruxas” e “manteiga das fadas”, entre outras. Outras superstições as
associavam à mítica “pedra filosofal”. Esferas coloniais de Nostoc continuam a ser
consumidas como alimento nos dias atuais, especialmente por algumas populações chinesas,
equatorianas, fijianas, japonesas, javanesas, mexicanas, mongóis, peruanas, siberianas e
tailandesas (POTTS, 1997; 2000).
Foi no século 15 EC, mais de 200 anos antes de Leeuwenhoek descrever
“animálculos” em um microscópio rudimentar pela primeira vez, que o suíço Aureolus
Philippus Theophrastus Bombastus von Hohenheim, conhecido como Paracelsus, cunhou o
nome pelo qual esses organismos são ainda hoje conhecidos. Nostoc é o resultado de um jogo
de palavras que une a palavra inglesa Nosthryl à alemã Nasenloch – ambas significando
“narina”. Paracelsus optou por esse nome devido à semelhança visual que acreditava haver
entre secreções nasais e o característico polissacarídeo extracelular frequentemente
encontrado em colônias dessa cianobactéria (POTTS, 1997).
Apesar de árvores filogenéticas construídas com sequências de genes de RNAr 16S
apontarem o agrupamento monofilético de grande parte dos representantes deste gênero, suas
distâncias evolutivas sugerem que este clado contenha mais de um gênero (RAJANIEMI et
al., 2005). A polifilia deste gênero não é uma descoberta recente, já que, em 1931, Elenkin já
havia dividido o gênero Nostoc em quatro gêneros distintos: Amorphonostoc, Nematonostoc,
Sphaeronostoc e Stratonostoc, tomando como critério principal a forma final das colônias;
todavia, esta divisão não foi disseminada, e atualmente Stratonostoc é o único aceito dentre
estes (KOMÁREK; ANAGNOSTIDIS, 1989; KOMÁREK, 2010b). Além disso, com exceção
de um clado que consiste de uma mistura de isolados simbiontes e de vida livre, a maior parte
das linhagens de cianobactérias atualmente classificadas no gênero Nostoc que vivem em
associação simbiótica se organiza filogeneticamente em clados distintos dos membros de vida
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livre (SVENNING; ERIKSSON; RASMUSSEN, 2005). Tentativas de dividir este táxon
continuam a ser realizadas e novos gêneros vêm sendo descritos a partir de isolados
inicialmente identificados morfologicamente como pertencentes a esse táxon (GENUÁRIO et
al., 2015; HROUZEK et al., 2013; ŘEHÁKOVÁ et al., 2007), mas uma revisão profunda do
gênero ainda permanece por ser feita.
Devido à sua versatilidade metabólica, que inclui não apenas a habilidade de fixação
de carbono atmosférico, mas também de nitrogênio, cianobactérias do gênero Nostoc são
importantes membros da comunidade microbiana em diversos hábitats, incluindo solos. No
solo, Nostoc spp. podem regular o pH, aumentar a concentração de carbono e nitrogênio,
reduzir a quantidade de sódio em ambientes de alta salinidade, atuar como antagonistas de
fitopatógenos, insetos e nematoides, degradar agrotóxicos e reduzir a contaminação com
metais pesados como cobre e cromo (SINGH; PANDEY; SINGH, 2011).
Nostoc spp. isoladas de solo ou sedimento de áreas tropicais costumam estar
relacionadas filogeneticamente, e há a possibilidade de que representem uma nova unidade
taxonômica (PAPAEFTHIMIOU et al., 2008). Predominantemente terrestres, colônias desse
gênero são dotadas de uma notável capacidade de resistência à dessecação e de rápida
retomada do metabolismo após a reidratação, características essenciais para organismos que
não possuem acesso a reservas de umidade do subsolo e/ou que podem estar sujeitos a
resfriamento (DODDS; GUDDER; MOLLENHAUER, 1995).
A exemplo do observado a nível de gênero, a diversidade intergenérica neste táxon é
bastante heterogênea e continua sem ser resolvida, especialmente quando se considera as
espécies que são classificadas dentro do gênero, mas que não formam colônias
macroscópicas. A despeito de as espécies exclusivamente microscópicas desempenharem
diferentes papéis de importância ecológica na biosfera, há poucos estudos sobre elas, cujo
número pode ser maior que o que está atualmente descrito (MATEO et al., 2011). Mais de
200 espécies já foram descritas dentro do gênero Nostoc; porém, com o conhecimento atual,
apenas cerca de 40 espécies são reconhecidas, as quais provavelmente constituem pelo menos
dois subgêneros (KOMÁREK; HAUER, 2013). Logo, diversidade taxonômica, genômica e
química maior do que é atualmente conhecida é provável de ser encontrada em cianobactérias
relacionadas a este gênero.
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2.2 Associações ecológicas entre cianobactérias e outros organismos
O conjunto de capacidades anabólicas das cianobactérias as leva a desempenhar
importantes papéis ecológicos em diversos ambientes e a estabelecer interações mutualistas
com um grande número de organismos. Simbioses epibióticas ou endobióticas entre
cianobactérias e eucariotos como animais (ascídios, vermes equiurídeos, larvas de
nematóceros, esponjas), cromalveolados (diatomáceas, dinoflagelados), fungos (líquens,
Geosiphon) e plantas (antocerotófitas, cicadófitas, hepáticas, musgos, Azolla, Gunnera) são
bem documentadas (ADAMS, 2000; ADAMS et al., 2013).
Além de conter cianobactérias de vida livre, Nostoc é o gênero cianobacteriano mais
frequentemente relatado em associações ecológicas, normalmente contribuindo com
nitrogênio biodisponível em interações simbióticas (BERGMAN; RAI; RASMUSSEN,
2007). Em amostras isoladas de solos e sedimentos de várzea e igapó na bacia amazônica
brasileira, espécies conhecidas e potencialmente novas de Nostoc foram apontadas como
sendo as mais abundantes cianobactérias fixadoras de nitrogênio (FIORE et al., 2005). Além
da maior abundância, alguns desses isolados também apresentavam as maiores taxas de
fixação de nitrogênio dentre os isolados obtidos no trabalho citado.
Diversas linhagens de Nostoc spp. estabelecem associações simbióticas com plantas,
tais como as briófitas Blasia spp. e Anthoceros spp., a angiosperma Gunnera spp. e
cicadófitas (CHAPMAN; MARGULIS, 1998). Devido às numerosas vantagens que essas
associações apresentam, a criação de simbioses artificiais entre cianobactérias e plantas que
não interagem naturalmente é um assunto que tem recebido atenção (AHMED; STAL;
HASNAIN, 2010; GUSEV et al., 2003). Nostoc spp. são também os mais comuns simbiontes
cianobacterianos em líquens (RIKKINEN, 2009). Em solo, uma espécie de Nostoc foi
encontrada habitando dentro de uma “bexiga” multinucleada unicelular nas pontas das hifas
de Geosiphon pyriformis, uma micorriza arbuscular, possivelmente fornecendo carbono e
nitrogênio fixados ao hospedeiro (SCHÜΒLER, 2002). Colônias de algumas espécies podem,
ainda, estabelecer mutualismo com larvas de dípteros do gênero Cricotopus (SABATER;
MUÑOZ, 2000). Um dos fatores que podem estar relacionados com a capacidade de simbiose
nesse táxon é uma intensa produção de hormogônios (PAPAEFTHIMIOU et al., 2008).
Enquanto associações entre cianobactérias e eucariotos foram bastante estudadas,
associações entre cianobactérias e outras bactérias ou arqueias, por outro lado, não receberam
atenção similar. Não obstante, diversos micro-organismos heterotróficos podem se beneficiar
de associações com bactérias capazes de fotossíntese oxigênica, de fixação de nitrogênio e,
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ocasionalmente, de produzir determinados metabólitos secundários, características
encontradas em um número considerável de cianobactérias. De fato, cianobactérias
estabelecem associações simbióticas com micro-organismos heterotróficos, incluindo alguns
em firme contato com seu envelope celular ou mesmo dentro de seu glicocálice
(ZHUBANOVA et al., 2013) (Figura 1). Biofilmes dominados por cianobactérias possuem
alta qualidade nutricional e podem sustentar grande biomassa de consumidores primários
(NAGARKAR et al., 2004; YAMAMURO, 1999).
Figura 1 – Micrografias de uma cultura unicianobacteriana não axênica obtidas por
microscopia eletrônica de varredura, onde células de outros micro-organismos
são observadas em filamentos da cianobactéria cultivada. As setas apontam
exemplos de agregados de células microbianas aderidas aos filamentos
Associações cianobacterianas com outros micro-organismos foram estimadas entre as
mais antigas formas de vida conhecidas, fornecendo importantes interações ecológicas por
bilhões de anos. Exopolissacarídeos secretados por cianobactérias são constantemente
colonizados por micro-organismos, e podem dar origem a biofilmes e mantos microbianos
complexos e com alta riqueza e abundância, onde autótrofos e heterótrofos encontram amplo
espaço para interagir (COLE et al., 2014; PAERL; PINCKNEY; STEPPE, 2000).
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Como observado em estromatólitos, mantos dominados por cianobactérias em diversos
ecossistemas podem suportar comunidades microbianas altamente desenvolvidas e com
interações bastante complexas (COHEN; GUREVITZ, 2006). De maneira semelhante, a
reprodução cianobacteriana massiva que comumente surge em resposta à eutrofia em corpos
d’água – um fenômeno conhecido como “floração cianobacteriana” – pode também ser
acompanhada por associações com alta diversidade de bactérias heterotróficas, com várias
destas sendo capazes de estimular o crescimento cianobacteriano (BERG et al., 2009).
Em decorrência das interações entre cianobactérias e outros micro-organismos,
bactérias heterotróficas podem rapidamente se sobrepor às células da cianobactéria-alvo
durante seu processo de isolamento; consequentemente, a purificação se torna um processo
bastante complexo e dispendioso (WATERBURY, 2006). Apesar de diversas técnicas de
purificação de cianobactérias compreendendo tanto separação física quanto tratamentos
químicos terem sido publicadas, culturas cianobacterianas axênicas continuam sendo muito
difíceis de ser alcançadas, já que a maioria dos métodos é específica a uma determinada
linhagem e possui baixa taxa de sucesso (CHOI et al., 2008; SENA et al., 2008). Portanto,
micro-organismos heterotróficos recalcitrantes são uma preocupação constante durante a
purificação de culturas cianobacterianas, uma situação que é potencialmente mais complicada
para linhagens de ambientes de alta diversidade microbiana, tais como solos.
Em alguns casos, uma cultura axênica é considerada virtualmente impossível de ser
obtida devido às fortes associações entre cianobactérias e micro-organismos simbiontes.
Algumas técnicas, tais como lavagem e centrifugação de células, são capazes de reduzir o
número de micro-organismos não fixados que sejam menores ou maiores que as células-alvo
(SENA et al., 2008; VÁZQUEZ-MARTÍNEZ et al., 2004), mas não podem remover
micro-organismos com fortes conexões às bainhas cianobacterianas. Além disso, a substância
fibrosa formada por carboidratos encontrada em mucilagens de células cianobacterianas pode
estabelecer firmes agregados com outros micro-organismos, resultando em fortes ligações,
capazes até mesmo de protegê-los da ação de antibióticos (VÁZQUEZ-MARTÍNEZ, 2004).
Consequentemente, a maioria dos esforços convencionais de isolamento
cianobacteriano termina com culturas não axênicas, consistindo de consórcios microbianos
compostos primariamente por cianobactérias e alguns micro-organismos proximamente
associados. Apesar de essa condição poder ser vista como uma desvantagem,
micro-organismos em consórcio podem agir sinergicamente e se tornar mais eficientes que
culturas axênicas em alguns processos, ou podem desempenhar funções complexas, com
passos múltiplos, que se tornam possíveis somente com o cocultivo de populações distintas
21
(BRENNER; YOU; ARNOLD, 2008). O estudo de genomas cianobacterianos através do
sequenciamento de culturas não axênicas também é potencialmente capaz de otimizar o tempo
de pesquisa, já que, ao contornar a etapa de purificação, o tempo necessário para a obtenção
de resultados é drasticamente reduzido.
Como mutualismo, competição, predação/parasitismo, comensalismo, amensalismo e
neutralismo desempenham um papel central na modelagem da estabilidade e da dinâmica de
comunidades em consórcio, o cocultivo permite a descoberta de complexas redes de interação
estabelecidas dentro de tais sistemas, as quais geralmente são mediadas por trocas de
moléculas que dependem ou independem de contato (FAUST; RAES, 2012; SONG et al.,
2014). Consórcios também tornam possível a condução de estudos sobre interação ecológica e
coevolução (BRENNER; YOU; ARNOLD, 2008). Em um consórcio microbiano,
cianobactérias podem ajudar a criar melhores condições para a comunidade desempenhar uma
determinada tarefa (ZHUBANOVA et al., 2013). É possível, ainda, que cianobactérias
facilitem o desenvolvimento de bactérias não previamente cultivadas, como observado em
culturas não axênicas de outros micro-organismos fotossintetizantes, tais como clorófitas do
gênero Chlorella (OTSUKA et al., 2008).
Em contraposição às abordagens convencionais de genômica microbiana, que
pressupõem dados provenientes de amostras axênicas, a metagenômica trabalha com dados
resultantes de amostras mistas, compostas por misturas de diferentes populações de
micro-organismos (MCHARDY; RIGOUTSOS, 2010). Abordagens metagenômicas se
mostraram úteis para o desvelamento da composição, da genética e do metabolismo de
comunidades microbianas naturais e artificiais, e são, portanto, apropriadas para a avaliação
de consórcios microbianos (SONG et al., 2014).
Avaliações de culturas cianobacterianas não axênicas por sequenciamento em larga
escala são similares a análises de sequências obtidas de estratégias metagenômicas de
enriquecimento, focadas na investigação de consórcios microbianos em meios líquidos que
estimulam o crescimento de um micro-organismo em específico (SCHLOSS;
HANDELSMAN, 2004). Tal abordagem tem algumas vantagens sobre a análise de amostras
ambientais, já que a montagem de metagenomas é mais eficiente sob condições de menor
riqueza e maior coerência genômica, onde enfrenta menor interferência de sequências
irrelevantes (TEELING; GLÖCKNER, 2012). Dessa forma, culturas não axênicas de
cianobactérias são mais adequadamente analisadas sob a ótica da metagenômica, e oferecem a
oportunidade de realizar tanto a avaliação genômica da cianobactéria-alvo quanto o estudo
metagenômico da comunidade microbiana associada à mesma.
22
2.3 Produtos naturais cianobacterianos
Uma ampla gama de substâncias químicas é sintetizada por cianobactérias, tanto sob
condições axênicas quanto simbióticas, em sistemas artificiais ou naturais. Espécies do gênero
Nostoc foram descritas como produtoras de variantes já conhecidas ou inéditas de
hidrocabonetos, arsenolipídeos, ácidos graxos, terpenoides, carotenoides, macróciclos,
sacarídeos, peptídeos, lipopeptídeos e derivados de aminoácidos, com muitas dessas
moléculas sendo empregadas em interações ecológicas, tais como a competição
(DEMBITSKY; ŘEZANKA, 2005) ou a simbiose (LIAIMER et al., 2015).
Diversas moléculas com atividades antitumorais, antibacterianas, antiprotozoárias,
imunomodulatórias e inibidoras de protease, entre outras, foram descritas, apontando para as
cianobactérias como uma fonte prolífica para a produção de moléculas bioativas (SINGH et
al., 2011). Alguns autores consideram que o potencial para descoberta de produtos naturais
desses organismos é somente superado pelo potencial de mixobactérias e do gênero
actinobacteriano Streptomyces (NUNNERY; MEVERS; GUNNERY, 2010). Apesar do papel
ecológico da maioria desses metabólitos ainda não ser conhecida, a ecologia química deste
filo é um tópico de crescente exploração (LEÃO et al., 2012a).
Nostoc se encontra entre os gêneros cianobacterianos que apresentam potencial para a
geração de compostos medicinais exclusivos (DODDS et al., 1995). Em espécies de Nostoc,
podem ser encontrados diversos metabólitos secundários bioativos, como microcistina
(inibidora de fosfatases), nostoficina (com atividade citotóxica), criptoficina (inibidora da
polimerização de tubulinas), nostociclamida (inibidora do crescimento de algas e bactérias),
nostocarbolina (inibidora de acetilcolinesterase), nostocina A (inibidora do crescimento de
algas e plantas), muscorida A (com atividade antibacteriana) e cianobacterina (que inibe o
crescimento de Synechococcus) (KURMAYER, 2011).
A produção de metabólitos secundários bioativos por cianobactérias é bastante
conhecida. Esses micro-organismos comumente produzem uma grande diversidade de
peptídeos, alcaloides e lipopolissacarídeos bioativos (BÖRNER; DITTMANN, 2005;
DITTMANN; NEILAN; BÖRNER, 2001), muitos dos quais com modos de ação
desconhecidos ou pouco explorados. Algumas das substâncias conhecidas têm efeito anti-
inflamatório, anti-infeccionante, antitumoral ou ação neurológica (NUNNERY; MEVERS;
GERWICK, 2010). Contudo, as moléculas que tornam o filo Cyanobacteria notório são as
cianotoxinas, moléculas que geralmente apresentam ações citotóxicas, hepatotóxicas ou
neurotóxicas sobre animais, ou ação contra alguns organismos do zooplâncton e fitoplâncton e
23
até mesmo contra outras cianobactérias (KAEBERNICK; NEILAN, 2001). Atualmente, a
maior parte dos estudos sobre cianotoxinas é voltada aos seus efeitos à saúde de seres
humanos (KOREIVIENĖ et al., 2014; ZANCHETT; OLIVEIRA-FILHO, 2013).
O papel ecológico e evolutivo das cianotoxinas ainda não é compreendido, porém
diversas hipóteses já foram levantadas. Elas podem ser agrupadas em estratégias para auxílio
fisiológico, focadas no aprimoramento da homeostasia, da fotossíntese e do crescimento, e
estratégias para vantagem competitiva, voltadas para defesas celulares em resposta à predação
e à disputa por recursos (HOLLAND; KINNEAR, 2013). Mesmo cianobactérias em simbiose
podem produzir cianotoxinas, mas suas funções e consequências para os outros organismos da
associação também ainda são desconhecidas (GEHRINGER et al., 2012; KAASALAINEN et
al., 2013a; 2013b).
O filo Cyanobacteria não é considerado uma fonte tradicional de produtos naturais
para a indústria, já que o estudo de moléculas bioativas nestes micro-organismos se restringiu
primariamente aos mecanismos de produção de cianotoxinas. Não obstante, pesquisas
desenvolvidas nas últimas décadas demonstraram em diversas cianobactérias a síntese de uma
fascinante variedade de enzimas envolvidas em diversos processos bioquímicos, incluindo
uma grande quantidade de moléculas exclusivas ao grupo ou raramente encontradas em outros
organismos (KEHR; PICCHI; DITTMANN, 2011). Contudo, a tradicional subestimação da
biodiversidade cianobacteriana, fruto das limitações de seus sistemas clássicos de
classificação, provoca a falsa percepção de que apenas poucos gêneros são responsáveis por
uma rica produção de metabólitos secundários (ENGENE et al., 2011). Apesar disso, produtos
naturais cianobacterianos continuam a ser negligenciados, com quedas contínuas nos relatos
de novos metabólitos deste filo desde 2012 (BLUNT et al., 2015).
Abordagens genômicas se mostram cada vez mais poderosas para a descoberta de
novas fontes de produtos naturais à medida que o número de sequências de genomas
disponíveis aumenta. Por meio de estratégias que permitem partir da sequência gênica e
chegar à predição da estrutura final da molécula, é possível agora averiguar mais facilmente a
diversidade metabólica de micro-organismos cuja relevância como fontes de metabólitos era
antes desconhecida ou subestimada devido às restrições metodológicas e à dispendiosidade
dos protocolos clássicos, baseados na fermentação e na posterior detecção de substâncias de
interesse por bioensaios ou análises químicas em extratos brutos, que impedem a exploração
do verdadeiro potencial biossintético microbiano (WINTER; BEHNKEN; HERTWECK,
2011). A mineração de genomas tem levado à descoberta de novos produtos naturais e de
novos mecanismos de biossíntese a partir da caracterização de sequências gênicas que
24
codificam peptídeo sintetases não ribossômicas, policetídeo sintases e terpeno sintases, entre
outras (CORRE; CHALLIS, 2009). Através da mineração genômica, mesmo vias
biossintéticas que permaneceram desconhecidas por 70 anos têm sido elucidadas
(CRAWFORD; CLARDY, 2012). Contudo, a maioria dos agrupamentos gênicos levantados
por mineração genômica ainda possui produtos desconhecidos (CALTEAU et al., 2014).
As pesquisas em genômica de micro-organismos nas últimas décadas se voltaram
amplamente para o estudo de linhagens bacterianas patogênicas a animais ou a plantas com o
objetivo de estabelecer inventários de genes que promovessem o estabelecimento de alvos
para novos antibióticos, a disponibilização de novos candidatos para a produção de vacinas e
avanços na compreensão da biologia desses patógenos, com a descoberta de genes envolvidos
na síntese de produtos naturais sendo, portanto, um resultado meramente incidental
(DONADIO; MONCIARDINI; SOSIO, 2007). Nos últimos anos, contudo, o aumento do
número de projetos genômicos voltados para recursos com relevância ambiental passou a
favorecer o descobrimento de novos metabólitos secundários (WINTER; BEHNKEN;
HERTWECK, 2011).
2.4 Genômica cianobacteriana
Em 1996, foi finalizado o sequenciamento e a anotação do primeiro genoma de
cianobactéria, Synechocystis sp. PCC 6803 (KANEKO et al., 1996). Atualmente, pouco mais
de 200 genomas cianobacterianos completos estão disponíveis em bancos de dados públicos,
um número ínfimo perto dos mais de 30.000 genomas pertencentes a organismos de 50 filos
de bactérias e de 11 filos de arqueias já sequenciados (LAND et al., 2015). A maioria desses
genomas cianobacterianos é proveniente de linhagens de água marinha ou doce, depositadas
na coleção de culturas do Instituto Pasteur, em Paris, na França, constituindo, portanto, uma
mera amostra da enorme diversidade deste filo.
Poucos genomas identificados no gênero Nostoc foram disponibilizados até o
momento. Além disso, em decorrência da polifilia desse táxon, apenas o genoma de uma
espécie pertencente ao grupo do qual a espécie-tipo faz parte, N. punctiforme PCC 73102, foi
sequenciado. O posicionamento taxonômico de Nostoc (Anabaena) PCC 7120 ainda está sob
discussão, mas provavelmente esta linhagem representa um gênero distinto de ambos
(SVENNING; ERIKSSON; RASMUSSEN, 2005). Assim como PCC 7120, a linhagem 0708,
um simbionte obrigatório, foi inicialmente classificada como Anabaena (RAN et al., 2010).
Neste momento, ela pode ser encontrada identificada como Trichormus azollae em alguns
25
bancos de dados, cujo gênero está representado por outro genoma, depositado como
Anabaena variabilis ATCC 29413. As linhagens Nostoc sp. PCC 7107 e Nostoc sp. PCC 7524
também se mostram relacionadas ao gênero Trichormus. Como verificado na Tabela 1, outros
sete projetos de sequenciamento genômico de organismos identificados no gênero Nostoc
estão registrados no banco de dados GenBank (disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Tabela 1 – Projetos de sequenciamento genômico de linhagens do gênero Nostoc sendo
desenvolvidos atualmente
Linhagem Número de
Acesso Centro Responsável Hábitat
Nostoc piscinale CENA21 PRJNA288507 Universidade Federal do Pará /
University of California in San Diego
sedimentos,
Rio Solimões
Nostoc sp. 'Peltigera
membranacea cyanobiont N6' PRJNA279350 University of Iceland não especificado
Nostoc sp. 'Lobaria pulmonaria
(5183) cyanobiont' PRJNA275880 University of Iceland não especificado
Nostoc linckia PRJNA274736 University of Hong Kong não especificado
Nostoc sp. CCAP 1453/38 PRJNA266493 Biology Centre ASCR não especificado
Nostoc sp. sp2 PRJNA262403 DOE Joint Genome Institute não especificado
Nostoc sp. sp3 PRJNA262218 DOE Joint Genome Institute associada a musgo,
floresta boreal
De acordo com sua história evolutiva, as cianobactérias, responsáveis pela oxigenação
da atmosfera terrestre, podem ser consideradas como um elo de ligação entre organismos
anaeróbicos e organismos obrigatoriamente aeróbicos (HAREL et al., 2015). O ancestral mais
recente das cianobactérias foi estimado como tendo aproximadamente 4,5 Mpb e de 1.678 a
3.291 genes, dos quais apenas entre 4 e 6 % permanece exclusivo aos genomas das
cianobactérias modernas, os quais apresentam como inovações sequências para formação de
filamentos, diferenciação de heterócitos, diazotrofia e competência simbiótica (LARSSON;
NYLANDER; BERKMAN, 2011).
A alta diversidade genética nesses micro-organismos é evidenciada por ampla
distribuição e hipervariabilidade de elementos transponíveis, os quais chegam a constituir até
10,95 % do genoma total de algumas linhagens (LIN et al., 2010). Alto percentual desses
elementos pode ser detectado em genomas de cianobactérias que habitam ambientes
considerados extremos, o que pode estar relacionado à sua capacidade de adaptação às
26
condições encontradas nesses ambientes (KIDWELL; LISCH, 2001; LIN et al., 2010). Além
disso, a transferência horizontal de genes também é responsável por gerar alta diversidade
molecular nesses micro-organismos (ZHAXYBAYEVA et al., 2006).
O material genético das cianobactérias geralmente é composto, assim como o de
outras bactérias, por uma ou mais moléculas de plasmídeo e por DNA cromossômico, o qual,
em média, pode variar em tamanho entre 1,4 e 8,2 Mpb (MEEKS et al., 2001; ZEHR et al.,
2008). Análises do número de cópias de cromossomos em células de cianobactérias indicam
que neste filo pode-se observar a ocorrência de monoploidia, oligoploidia ou poliploidia, de
modo que algumas cianobactérias podem apresentar até 218 cópias durante sua fase
exponencial (GRIESE; LANGE; SOPPA, 2011), o que poderia favorecer a recombinação.
Durante situações de estresse, estratégias de sobrevivência tornam esse número ainda maior.
Acinetos podem conter até 450 cromossomos, um número explicado pela necessidade de uma
rápida retomada da atividade metabólica e da divisão celular após a dormência da célula
(SUKENIK et al., 2012).
A divergência genômica geralmente reflete adaptações fisiológicas aos diferentes
nichos que as cianobactérias podem ocupar. Duas estratégias de adaptação podem ser
inferidas pelas análises de genomas do filo Cyanobacteria: a expansão genômica, que confere
amplo potencial adaptativo pelo aumento de famílias gênicas, e a redução genômica, que
resulta na eliminação de genes dispensáveis à adaptação a um nicho específico (LARSSON;
NYLANDER; BERKMAN, 2011). Pressões de seleção provocariam mudanças em fatores
como tamanho do genoma, percentual G-C, número de genes e taxa de evolução. Enquanto
cianobactérias podem desenvolver estratégias individuais de interação com o ambiente, outros
de seus sistemas são conservados globalmente (SIMM et al., 2015). Assim como ocorre em
outros organismos, há um conjunto de genes essenciais em cianobactérias que apresenta taxas
de conservação bastante elevadas e maior resistência à transferência horizontal, consistindo de
sequências geralmente envolvidas na produção de estruturas proteicas complexas e em vias
bioquímicas indispensáveis (LARSSON; NYLANDER; BERKMAN, 2011; SHI;
FALKOWSKI, 2008). É esse conjunto de genes, que encerra grande parte da história
evolutiva do organismo, o alvo de vários trabalhos recentes.
Disponibilizadas a partir de 2005, as novas gerações das tecnologias de
sequenciamento de DNA foram, em conjunto com as novas tecnologias computacionais, as
principais impulsoras da pesquisa em genômica e metagenômica nas últimas décadas.
Elas tornaram possível que fosse gerado um volume de dados muito maior e em menor tempo
que os obtidos com a antiga tecnologia de sequenciamento de Sanger et al. (1977), que havia
27
se tornado o método-padrão de sequenciamento de DNA. As plataformas de sequenciamento
de DNA de alta performance levaram a reduções drásticas tanto no custo econômico quanto
no esforço necessário para a caracterização de genomas, o que levou ao crescimento
exponencial dos artigos científicos descrevendo pesquisas genômicas. Essas pesquisas
saturaram o meio editorial, de modo que, apesar de terem fornecido dados fundamentais para
o avanço da genética e da evolução nos últimos 20 anos, apenas genomas com características
muito singulares e inovadoras ou análises comparativas de múltiplos genomas são
considerados para publicação atualmente (SMITH, 2013).
Através da genômica, têm se tornado possíveis os seguintes avanços: compreender a
trajetória dos genes de cianotoxinas, assim como o modo como são adquiridos, e levantar
informações para o entendimento de sua função ecofisiológica e evolução (MOUSTAFA et
al., 2009); predizer funções bioquímicas de genes de atuação ainda desconhecida (HUANG et
al., 2006); conhecer a história evolutiva do filo e da vida do planeta (MULKIDJANIAN et al.,
2006); estudar possíveis alterações geológicas e biogeoquímicas ocorridas em conjunto com
alterações na biota (BATTISTUZZI; FEIJÃO; HEDGES, 2004); e, por meio da filogenômica,
o aprimoramento da taxonomia (EISEN; FRASER, 2003; THOMPSON et al., 2015).
Pesquisas metagenômicas também têm realizado descobertas importantes, e revelaram o novo
filo Melainabacteria, que foi identificado como proximamente relacionado ao filo
Cyanobacteria (DI RIENZI et al., 2013; SOO et al., 2014).
Novas técnicas foram introduzidas à classificação taxonômica das cianobactérias para
questionar a tradicional ênfase em características morfológicas, levando à revisão de seus
critérios. O relativamente novo campo da genômica comparativa se destaca e pode levar a
uma nova revolução dentro da sistemática cianobacteriana. A filogenômica e a verificação da
presença de sequências de proteínas encontradas apenas em determinados táxons, assim como
a análise de inserções ou deleções conservadas em sequências de proteínas estruturais, se
mostram promissoras para o esclarecimento de graus de ancestralidade não passíveis de serem
inferidos por análises filogenéticas comuns. A união da filogenômica com as análises de
sinapomorfia e de proteínas exclusivas vem redefinindo a compreensão da evolução das
cianobactérias e tem dado maior robustez à classificação cianobacteriana moderna (GUPTA,
2009; GUPTA; MATHEWS, 2010; KOMÁREK et al., 2014).
Devido ao número relativamente baixo de genomas cianobacterianos atualmente
disponíveis, a aplicação de abordagens filogenômicas a análises em níveis taxonômicos mais
baixos (como gênero ou espécie) ainda não foi possível de ser realizada em larga escala com
sucesso. Contudo, ela ainda permanece como a ferramenta mais promissora para trazer para o
28
filo Cyanobacteria uma classificação mais natural, capaz de corrigir os erros produzidos pela
taxonomia tradicional, largamente baseada em morfologia, e esclarecer as complicadas
relações evolutivas dos diversos táxons polifiléticos que persistem na classificação
cianobacteriana, como, por exemplo, o gênero Nostoc e suas espécies. Potencialmente,
mesmo erros causados por transferência lateral de genes ou outros processos que obscurecem
o sinal filogenético são possíveis de serem resolvidos com a filogenômica (KAUFF; BÜDEL,
2011). Se neste momento há questões técnicas que dificultam o amplo uso taxonômico da
genômica para cianobactérias, o sequenciamento de genomas tende a se tornar cada vez mais
rápido e menos custoso, levando a um número crescente de genomas disponíveis.
Filogeneticamente, há um desequilíbrio na disponibilidade de sequências de
cianobactérias, que acarreta uma má representação da genômica do filo. Isso prejudica o
conhecimento da genética do filo, já que sequências de táxons negligenciados podem ajudar a
trazer respostas importantes (RICHARDS, 2015). O sequenciamento de genomas de
cianobactérias relacionadas a táxons pouco estudados possibilita não apenas o aumento do
conhecimento da biologia do filo, mas também da evolução e da diversidade de aspectos mais
gerais como morfologia, fotossíntese, metabolismo secundário e endossimbiose (SHI et al.,
2013). O alto número de sequências repetitivas encontradas no genoma de grande parte das
cianobactérias é um fator limitante para a montagem dos genomas destes organismos mesmo
com o aumento da cobertura do sequenciamento, fator que contribui para que a grande
maioria dos genomas atualmente disponíveis mantenha-se incompleta, no estado conhecido
como “rascunho”, com a omissão de alto número de sequências de nucleotídeos em regiões
significativas (WANG et al., 2012). Aproximadamente 90 % dos genomas sequenciados até o
presente momento não está completo (LAND et al., 2015).
Mesmo para linhagens cianobacterianas provenientes de culturas axênicas, os
sequenciamentos genômicos com alta cobertura e realizados por diferentes estratégias podem
se mostrar insuficientes para a montagem genômica em uma sequência contígua única, um
fato que ilustra o desafio proposto pelo alto número de repetições contido nos genomas de
organismos desse filo. Todavia, isso não prejudica a obtenção de dados que satisfaçam os
requerimentos necessários para a realização de análises genômicas comparativas (HUMBERT
et al., 2013).
29
2.5 Terra preta antropogênica
De acordo com evidências arqueológicas, algumas paisagens amazônicas foram
profundamente transformadas por antigas atividades humanas ao redor delas (KERN et al.,
2009). Em contraste com solos comumente encontrados na região amazônica, que são
normalmente ácidos e pobres em nutrientes, a terra preta antropogênica é um solo amazônico
rico em matéria orgânica e com alta fertilidade química criado por ocupações humanas nativas
estabelecidas mais de um milênio antes da colonização europeia do continente americano
(COSTA et al., 2009; WOODS et al., 2009). Solos de terra preta amazônica são caracterizados
por cor escura e altos níveis de Ca, Mg, Zn, Mn, P e C, que são resultantes principalmente de
carvão residual de fogueiras para cozimento e da deposição de cinzas, cascas, restos de caça e
coleta e dejetos humanos no local (KERN et al., 2009). Atividades humanas tendem a ter
impacto negativo sobre cianobactérias de solo, especialmente durante processos de
urbanização, mas poucas informações sobre como cianobactérias são impactadas em
ambientes seminaturais e em solos de cultivo estão disponíveis (SHARMA, 2015).
Como resultado dessas características, os antrossolos podem em alguns casos
apresentar comunidades microbianas distintas quando comparados com solos adjacentes de
mesma mineralogia, porém não modificados. Por outro lado, essas comunidades microbianas
podem ser comparativamente semelhantes às comunidades de outros antrossolos, mesmo
quando estes foram formados a partir de diferentes tipos de solos e estão atualmente
submetidos a práticas e coberturas consideravelmente dissimilares. Esse fato indica que, nesse
ambiente, o histórico do solo pode ter maior influência sobre sua estrutura microbiana do que
a composição do mesmo (GROSSMAN et al., 2010).
Antrossolos de características semelhantes tanto em termos de formação como de
ecologia são hoje encontrados em sítios arqueológicos no norte da Alemanha, podendo ser
considerados “terra preta nórdica” (WIEDNER et al., 2015). De forma similar ao ocorrido em
terras amazônicas, esses solos foram formados como produto do sistema de subsistência
viquingue/eslávica há pelo menos 1.000 anos AP, após a deposição contínua e prolongada de
dejetos, tais como esterco humano e não humano, restos de caça e matéria orgânica
carbonizada. Consequentemente, apresentam cor escura e são densos e enriquecidos com
elementos como C, N, P, Ca, Mg, K, Na, Fe, Cu, Zn, Mn e Ba.
30
Além da caracterização de filos bacterianos negligenciados, tais como o filo
Cyanobacteria, o conhecimento da diversidade microbiana geral também pode se beneficiar
da caracterização de ambientes quimicamente díspares (SCHLOSS; HANDELSMAN, 2004).
Estima-se que um número considerável de espécies de cianobactérias é ainda desconhecido, e
acredita-se que há muito conhecimento a ser adquirido da caracterização da biodiversidade
deste filo em regiões geográficas inexploradas (NABOUT et al., 2013). Cianobactérias
também podem contribuir direta ou indiretamente para o aumento da concentração de
nitrogênio, fósforo, potássio, ferro e outros minerais no solo e favorecer a eficiência de seu
uso por plantas (KUMAR et al., 2015). Esses argumentos indicam a importância da
caracterização de linhagens cianobacterianas e das comunidades com quem interagem de
ambientes pouco explorados, como a terra preta antropogênica.
31
3. HIPÓTESES
Nostoc sp. CENA67 é uma cianobactéria que se diferencia do restante dos
micro-organismos atualmente classificados em seu gênero, o que pode ser verificado por
métodos clássicos e genômicos. Consequentemente, essa linhagem apresenta agrupamentos
gênicos envolvidos na síntese de metabólitos secundários ainda desconhecidos. Culturas não
axênicas dessa cianobactéria apresentam micro-organismos em associação com a mesma, que
são passíveis de estudo por ferramentas metagenômicas.
32
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Este trabalho teve como objetivo geral a avaliação dos aspectos morfológicos,
moleculares, genômicos e metabólicos da linhagem cianobacteriana Nostoc sp. CENA67,
isolada a partir de solo de terra preta antropogênica da floresta amazônica brasileira, bem
como a análise de características dos micro-organismos associados a essa cianobactéria em
uma cultura não axênica.
4.2 Objetivos específicos
Entre os objetivos específicos deste projeto, encontram-se:
- Caracterizar a cianobactéria morfologicamente;
- Verificar suas relações filogenéticas com outras cianobactérias;
- Caracterizar o genoma da cianobactéria-alvo;
- Comparar o genoma obtido com genomas de linhagens proximamente relacionadas;
- Avaliar agrupamentos gênicos envolvidos na síntese de metabólitos secundários;
- Analisar a diversidade taxonômica e funcional da comunidade microbiana associada.
33
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Origem da amostra
A linhagem Nostoc sp. CENA67 foi isolada a partir de uma amostra de terra preta
antropogênica coletada em 2004 nos primeiros 20 cm de solo do sítio arqueológico Hatahara
(3º16’29”S e 60º12’16”O), localizado no município de Iranduba, a 30 km a sudoeste de
Manaus-AM. O sítio Hatahara encontra-se na margem esquerda do Rio Solimões, próximo à
confluência com o Rio Negro. Essa linhagem é mantida em cultivo no Laboratório de
Biologia Celular e Molecular do CENA/USP em meio de cultura líquido AA/4
(ALLEN; ARNON, 1955), composto pelos seguintes reagentes e concentrações: K2HPO4
132,68 mg·L-1; MgSO4.7H2O 62,5 mg·L-1; NaCl 62,5 mg·L-1; CaCl2.2H2O 18,75 mg·L-1;
FeSO4.7H2O 4,982 mg·L-1; KOH 1,891 mg·L-1; H3BO3 715 µg·L-1; MnCl2.4H2O 450 µg·L-1;
Na2MoO4.2H2O 76,375 µg·L-1; ZnSO4.7H2O 55 µg·L-1; CuSO4.5H2O 19,75 µg·L-1;
CoCl2.6H2O 10 µg·L-1; e NH4VO3 5,75 µg·L-1. As células foram acondicionadas a 25±1 ºC
sob iluminação fluorescente de 40 µmol fótons·m-2·s-1 e com fotoperíodo de 14 horas de luz e
10 horas de escuro. Essa é uma cultura não axênica, sendo composta, dessa maneira, tanto por
células de Nostoc sp. quanto de alguns micro-organismos não cianobacterianos associados a
elas.
5.2 Obtenção de biomassa
Para obtenção de biomassa, culturas de CENA67 foram incubadas em frascos
Erlenmeyer de 1 L contendo 500 mL de meio líquido AA/4. Após três semanas de
crescimento, as células foram concentradas em tubos de 50 mL por centrifugação a 7690 ×g
durante 10 minutos em uma centrífuga Hettich Universal Mikro320R (Hettich, Tuttlingen,
Alemanha). Em seguida ao descarte dos sobrenadantes, foram feitas três lavagens das células
através da adição de 50 mL de água ultrapura seguida de homogeneização em vórtex,
centrifugação a 7690 ×g durante 10 minutos e descarte dos sobrenadantes. As células
concentradas foram submetidas a uma nova lavagem com a adição de uma solução de extran
0,05 % seguida de homogeneização, centrifugação a 2370 ×g durante 10 minutos e descarte
dos sobrenadantes. Este procedimento foi repetido duas vezes com solução de lavagem
(NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 2,5 mM pH 8,0 e etanol 50 %) a 4650 ×g e
uma vez com solução salina 0,85 % a 7690 ×g. As células lavadas e concentradas foram
armazenadas a -20 ºC até a extração de DNA.
34
5.3 Caracterização morfológica
Para examinar as características morfológicas da linhagem CENA67, amostras de
culturas líquidas com 14 dias e 45 dias de crescimento foram coletadas e observadas sob um
microscópio óptico Zeiss Axiostar Plus (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) de acordo com os
critérios de Papaefthimiou et al. (2008). Medidas morfométricas foram tomadas das amostras
com o auxílio de um micrômetro ocular pela observação das células com um aumento de
1000 ×. O comprimento e a largura de vinte e cinco células vegetativas e heterócitos
intercalares e terminais, selecionados aleatoriamente, foram medidos. Para tentar estimular a
produção de acinetos pela linhagem, a cultura foi mantida sob escuro absoluto ou a luz
constante e a temperaturas de 25±1 ºC ou 10±1 ºC, sendo constantemente monitorada para
verificação da produção destas células. Além das dimensões celulares, seu formato (cônico,
arredondado, abarrilado ou oval) também foi verificado. Os filamentos foram classificados em
relação ao seu formato (em espiral, ondulados ou retos) e seu tamanho (curtos, se formados
por menos de 50 células, e longos, se filamentos de mais de 50 células estivessem presentes).
Por fim, as bainhas foram observadas após a adição de nanquim às lâminas e classificadas
como difusivas (se não havia bordas nítidas na microcolônia) ou como envelopes (se uma
bainha delicada e não envelopada se expandia por 2-5 µm ao redor do filamento).
5.4 Extração de DNA
Para as extrações de DNA, foram coletadas células na fase exponencial de crescimento
pela concentração em centrífuga durante 10 minutos a 7392 ×g. A extração foi realizada a
partir de modificações no protocolo descrito por Lin et al. (2010), reproduzidas a seguir. As
células de CENA67 coletadas foram inicialmente ressuspendidas em 500 µL de tampão de
lise (composto por Tris-HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 9,0 e NaCl 100 mM) e
digeridas com 5 µL de uma solução de lisozima 100 mg·mL-1 a 37 ºC por 30 minutos.
Seguiu-se a adição de 10 µL de proteinase K 20 mg·mL-1 e 20 µL de SDS 10 % aos
microtubos e a incubação a 55 ºC durante 1 hora. Em seguida, 600 µL de uma solução de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) foram adicionados aos tubos, os quais foram
então homogeneizados e centrifugados a 7392 ×g por 5 minutos. Posteriormente, os
sobrenadantes foram transferidos para novos tubos, aos quais foram adicionados 600 µL de
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), sendo novamente homogeneizados e centrifugados a
7392 ×g por 5 minutos. Os sobrenadantes foram mais uma vez transferidos para novos tubos,
35
acrescidos de 4 µL de RNAse A 10 mg·mL-1 e incubados a 37 ºC por 20 minutos. O DNA
extraído foi então precipitado com 100 µL de acetato de sódio 3 M pH 4,8 e 600 µL de
isopropanol a -80 ºC durante 1 hora e centrifugado por 10 minutos a 7392 ×g. Por fim, o DNA
foi lavado com 500 µL de etanol 70 % e centrifugado a 7392 ×g por 5 minutos. Após secagem
a 37 ºC, o DNA foi ressuspendido em água ultrapura estéril. A integridade das amostras foi
verificada em gel de agarose 1 % após corrida eletroforética em tampão TBE 0,5 X
(Tris-borato 22 mM e EDTA 0,5 mM pH 8,0) com o corante SYBR Green (Molecular Probes,
Eugene, OR, EUA). O registro do gel foi realizado por meio do fotodocumentador Gel Logic
212 Imaging System (Molecular Imaging System Carestream Health, Inc, Rochester, NY,
EUA). A quantificação do DNA se deu com o fluorômetro Qubit, utilizando o reagente
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
5.5 Reconstrução filogenética
O DNA genômico extraído foi submetido à amplificação por reação em cadeia da
polimerase (PCR) do DNAr 16S com os oligonucleotídeos iniciadores 27F1 e 1494Rc
(NEILAN et al., 1997). A amplificação foi feita em solução contendo tampão PCR 1X
(Tris HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM), 0,2 mM de cada dNTP, MgCl2 3 mM, 1 U de
Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen), 10 ng de DNA, 5 ρmol de cada iniciador e água
ultrapura (Millipore) esterilizada. A reação foi realizada em um termociclador Techne TC-412
(Bibby Scientific Limited, Stone, Staffordshire, Inglaterra) sob as seguintes condições:
desnaturação a 95 ºC durante 3 minutos; 30 ciclos a 94 ºC por 10 segundos, 50 ºC por
20 segundos e 72 ºC por 1 minuto; e extensão final a 72 ºC durante 7 minutos. A integridade
da amplificação foi analisada por eletroforese, conforme descrito anteriormente, por
comparação com o marcador de massa molecular Low Mass DNA Ladder (Invitrogen). Os
produtos da amplificação foram clonados e inseridos em células de Escherichia coli DH5α
com pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, Madison, WI, EUA) por choque térmico
(SAMBROOK; RUSSEL, 2001; ZHOU; CLARK; GOMEZ-SANCHEZ, 1995). A presença
dos insertos foi checada através de PCR com os iniciadores CYA359F, CYA781Ra e
CYA781Rb, sob condições descritas anteriormente (NÜBEL et al., 1997). Colônias positivas
foram conduzidas ao sequenciamento pelo método de Sanger et al. (1977) no aparelho ABI
PRISM 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com DYEnamic ET
Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire,
Inglaterra) e os iniciadores M13F, M13R, 341-357F, 357-341R, 685-704F, 704-685R,
36
1099-1114F e 1114-1099R. As sequências geradas foram analisadas com o pacote de
programas Phred/Phrap/Consed (EWING et al., 1998; EWING; GREEN, 1998; GORDON et
al., 1998). As sequências dos iniciadores utilizados neste trabalho encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para análise filogenética
Iniciador Sequência Referência
27F1 5’-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3’ NEILAN et al., 1997
1494Rc 5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’ NEILAN et al., 1997
CYA359F 5’-GGGGAATYTTCCGCAATGGG-3’ NÜBEL et al., 1997
CYA781Ra 5’-GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3’ NÜBEL et al., 1997
CYA781Rb 5’-GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-3’ NÜBEL et al., 1997
M13F 5’-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’ MESSING, 1983
M13R 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ MESSING, 1983
341-357F 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’ LANE, 1991 (modificado)
357-341R 5’-CTGCTGCCTCCCGTAGG-3’ LANE, 1991 (modificado)
685-704F 5’-GTAGSGGTGAAATSCGTAGA-3’ LANE, 1991 (modificado)
704-685R 5’-TCTACGSATTTCACCSCTAC-3’ LANE, 1991 (modificado)
1099-1114F 5’-GCAACGAGCGMRACCC-3’ LANE, 1991 (modificado)
1114-1099R 5’-GGGTYKCGCTCGTTGC-3’ LANE, 1991 (modificado)
Visando compreender melhor as relações evolutivas entre CENA67 e outras linhagens
relacionadas ao gênero Nostoc, a sequência resultante foi comparada com outras sequências
depositadas no banco de dados GenBank, com a ferramenta BLAST (ALTSCHUL et al.,
1990). A sequência obtida foi alinhada junto a sequências proximamente relacionadas com
MUSCLE 3.8.31 (EDGAR, 2004) e o melhor modelo evolutivo para o alinhamento foi
estimado com jModelTest 2.1.7 (DARRIBA et al., 2012; GUINDON; GASCUEL, 2003).
Árvores filogenéticas foram reconstruídas pelos métodos de máxima verossimilhança
(FELSENSTEIN, 1981), utilizando o programa RAxML 8.2.3 (STAMATAKIS, 2006), e
inferência bayesiana (MAU; NEWTON; LARGET, 1999), realizada com o programa
MrBayes 3.2.5 (RONQUIST; HUELSENBECK, 2003). A árvore final foi visualizada com
Figtree 1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e editada com Inkscape 0.48.5
(http://inkscape.org).
37
5.6 Sequenciamento de DNA
O DNA genômico foi utilizado para o preparo de bibliotecas genômicas com Nextera
XT DNA Sample Prep Kit (Illumina) de acordo com as instruções do fornecedor, resumidas a
seguir. O DNA genômico foi inicialmente fragmentado por transposases e recebeu sequências
adaptadoras às suas extremidades após incubação em termociclador a 55 ºC por 5 minutos. As
enzimas foram neutralizadas com o tampão Neutralize Tagment (Illumina) à temperatura
ambiente por 5 min e, em seguida, ocorreu a amplificação do DNA com os iniciadores i7 e i5,
específicos aos adaptadores adicionados, com a seguinte ciclagem térmica: 72 °C por 3 min;
95 °C por 30 s; 12 ciclos de 95 °C por 10 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; e 72 °C
por 5 min. Os produtos da amplificação foram purificados com 25 µL de microesferas
magnéticas AMPure XP 0,5 X e etanol 80 %. Após purificada, a biblioteca foi normalizada
para o sequenciamento. Após os produtos da biblioteca serem desnaturados e diluídos, eles
foram transferidos para um cartucho de reagentes. Uma célula de fluxo foi limpa com água
ultrapura estéril e inserida no sequenciador, seguida dos reagentes para sequenciamento e do
cartucho contendo as sequências da biblioteca. O sequenciamento foi realizado com MiSeq
Reagent Kit (Illumina) no Centro de Genômica Funcional Aplicada à Agropecuária e à
Agroenergia, da Universidade de São Paulo, em Piracicaba-SP, segundo instruções do
fabricante.
Um sequenciamento com Ion PGM (Life Technologies) também foi realizado no
Laboratório de Polimorfismo de DNA, na Universidade Federal do Pará, em Belém-PA. Para
esse sequenciamento, 5 µg do DNA extraído anteriormente foram utilizados na construção de
bibliotecas de pares com 3 Kpb de distância entre si com Ion PGM Template OT2 400 Kit
(Life Technologies) seguindo instruções do fabricante e procedimentos descritos
anteriormente (RAMOS et al., 2013). Os produtos das bibliotecas foram depositados em um
Ion 318 Chip v2 (Life Technologies) e o sequenciamento ocorreu com Ion PGM Sequencing
400 Kit (Life Technologies) segundo instruções do fabricante.
5.7 Pré-processamento de sequências e montagem
As qualidades das leituras brutas obtidas foram verificadas com o programa FastQC
0.10.1 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). PEAR 0.9.6 (ZHANG et
al., 2014) foi utilizado para unir pares com extremidades que se sobrepunham. Bases com
índice de qualidade menor que Phred 30, bases ambíguas e sequências menores que 50 pb
38
foram filtradas com Seqyclean 1.3.12 (http://cores.ibest.uidaho.edu/software/seqyclean) e
PRINSEQ 0.20.4 (SCHMIEDER; EDWARDS, 2011a). Sequências com similaridade a
contaminantes metagenômicos conhecidos foram removidas com DeconSeq 0.4.3
(SCHMIEDER; EDWARDS, 2011b). O conjunto de dados resultante do pré-processamento
foi montado com SPAdes 3.1.1 (BANKEVICH et al., 2014) e QUAST 2.3 (GUREVICH et
al., 2013) foi utilizado para avaliar os resultados das montagens. O tamanho genômico total
foi estimado com o programa Kmer Spectrum Analyzer (WILLIAMS et al., 2013).
5.8 Anotação e detecção de produtos naturais
O arquivo gerado ao final dos procedimentos de montagem foi anotado
automaticamente com Prokka 1.8 (SEEMANN, 2014) e com o servidor RAST (AZIZ et al.,
2008; OVERBEEK et al., 2014). Para a detecção de genes provenientes de agrupamentos
gênicos potencialmente envolvidos na síntese de metabólitos secundários, utilizou-se o
programa antiSMASH 3.0.3 (BLIN et al., 2013; MEDEMA et al., 2011; WEBER et al.,
2015). Outros genes de interesse foram identificados a partir de alinhamentos locais com
bancos de dados customizados com BLAST+ 2.2.29 (ALTSCHUL et al., 1990; CAMACHO
et al., 2009). A anotação automática de regiões de interesse foi averiguada e, quando
necessário, corrigida por meio de curadoria manual com Artemis 16.0.0 (RUTHERFORD et
al., 2000) e BLAST (ALTSCHUL et al., 1990). Quando necessário, árvores foram construídas
conforme descrito anteriormente.
5.9 Análises comparativas
Comparações genômicas da linhagem Nostoc sp. CENA67 com genomas de linhagens
disponíveis em bancos de dados públicos foram realizadas com o servidor RAST para
verificação da proximidade com outros genomas e sintenia, enquanto GET_HOMOLOGUES
11032014 (CONTRERAS-MOREIRA; VINUESA, 2013) foi utilizado para a comparação de
sequências proteicas em larga escala e estimativas de tamanho do pangenoma e do genoma
essencial dos genomas das cianobactérias já classificadas dentro do gênero Nostoc. Após a
detecção do agrupamento gênico de DNAr dentre as sequências montadas, MUSCLE 3.8.31
foi utilizado para o alinhamento do espaço intergênico 16S-23S de CENA67 junto a
sequências de espaços intergênicos provenientes de táxons relacionados depositadas em
bancos de dados públicos. A identificação de regiões conservadas foi realizada de acordo com
39
Iteman et al. (2000). As regiões D1-D1' e Box B foram selecionadas para a previsão de
estruturas secundárias com Mfold (ZUKER; STIEGLER, 1984; ZUKER, 2003), que foram
visualizadas com RnaViz 2 (DE RIJK et al., 2003).
5.10 Diversidade taxonômica e funcional
Sequências contíguas do metagenoma montado foram analisadas e identificadas com
Kraken 0.10.4 (WOOD; SALZBERG, 2014). Anotações do metagenoma da comunidade
associada e dos genomas obtidos foram fornecidos, respectivamente, pelos servidores
MG-RAST (MEYER et al., 2008) e RAST (AZIZ et al., 2008; BRETTIN et al., 2015;
OVERBEEK et al., 2014). Quando necessário, a curadoria manual das anotações foi realizada
com Artemis 16.0.0 (RUTHERFORD et al., 2000) e BLAST (ALTSCHUL et al., 1990). A
afiliação taxônomica dos micro-organismos associados a Nostoc sp. CENA67 foi explorada
inicialmente em dados não montados com FOCUS 0.26 (SILVA et al., 2014) para também
avaliar a abundância relativa dos táxons. Alternativamente, o DNAr 16S das leituras
sequenciadas foi recuperado com SortMeRNA 2.0 (KOPYLOVA; NOÉ; TOUZET, 2012) e
analisado com QIIME 1.9 (CAPORASO et al., 2010a) usando uclust 2.21 (EDGAR, 2010),
PyNAST 1.2.2 (CAPORASO et al., 2010b) e o banco de dados Greengenes 13_8
(DESANTIS et al., 2006). Além disso, o DNAr 16S foi montado com EMIRGE 0.60
(MILLER et al., 2011). O resultado das identificações foi utilizado para investigar as
diferenças funcionais entre a cianobactéria e a comunidade associada. Vias metabólicas foram
comparadas no servidor MG-RAST com o banco de dados KEGG. Real Time Metagenomics
(EDWARDS et al., 2012) foi utilizado para comparações de subsistemas.
40
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Caracterização morfológica e filogenética
CENA67 é uma cianobactéria filamentosa com características típicas da família
Nostocaceae, apresentando tricomas isopolares unisseriados, divisão celular perpendicular ao
eixo do tricoma, ausência de ramificação e de zonas meristemáticas, e diferenciação de
heterócitos. Os filamentos de CENA67 são longos e ondulados e se reproduzem por
hormogônios igualmente ondulados, porém curtos, e imóveis. Ambos são envoltos por
bainhas do tipo envelope. As células vegetativas desses filamentos se diferenciam em
heterócitos intercalares, que podem ter formato arredondado ou abarrilado, ou em heterócitos
terminais arredondados. As características morfológicas de CENA67 podem ser observadas na
Figura 2.
Em média, as células vegetativas dessa linhagem possuem 7 µm de comprimento e
3,7 µm de largura, o equivalente a uma proporção comprimento/largura de 1,9. Os heterócitos
intercalares possuem em média 8 µm de comprimento e 6,9 µm de largura, enquanto os
heterócitos terminais possuem média de 5,3 µm de comprimento e 5 µm de largura, com
proporções comprimento/largura de aproximadamente 1,2 e 1, respectivamente. Mesmo sob
as diferentes condições de estresse a que foi submetida (que incluíram longos períodos de
cultivo, baixas temperaturas, luminosidade constante e ausência de luminosidade), não foi
observada nas culturas de CENA67 a formação de acinetos, essenciais para o início da
formação colonial classicamente observada no gênero.
A ausência de acinetos impede nessa cianobactéria um ciclo de vida que se aproxime
do ciclo típico do gênero Nostoc. Por consequência, colônias macroscópicas também não são
encontradas na linhagem estudada. É pouco provável que o observado seja um artefato do
cultivo, pois ao passo que o formato dos tricomas e as dimensões celulares nesse táxon variam
em isolados de acordo com o meio de cultura utilizado, as características do ciclo de vida
permanecem estáveis sob diferentes condições de cultura, motivo pelo qual são
constantemente utilizadas para a distinção de espécies (MATEO et al., 2011). Dessa forma,
apesar de morfologicamente poder ser identificada como pertencente ao gênero Nostoc de
acordo com critérios clássicos, CENA67 não possui algumas das características típicas
descritas para este gênero.
41
Figura 2 – Fotomicrografias ópticas evidenciando a morfologia de CENA67. Escala: 20 µm
O sequenciamento do DNAr 16S de Nostoc sp. CENA67 gerou uma sequência de
1411 pb, a qual apresenta maior proximidade com Nostoc ellipsosporum V, linhagem com a
qual compartilha 97 % de identidade. Todavia, apesar da relativa alta identidade, a análise
filogenética desse gene também apontou haver divergências entre a linhagem CENA67 e o
restante das cianobactérias atualmente classificadas dentro do gênero Nostoc (Figura 3).
Como pode ser observado, CENA67 se comporta filogeneticamente como um grupo externo a
um grande número de linhagens atualmente classificadas no gênero Nostoc e em alguns
gêneros relacionados, como Desmonostoc, Halotia, Nodularia, Roholtiella e Trichormus, bem
como a algumas linhagens de Anabaena.
42
Figura 3 – Árvore filogenética do DNAr 16S de Nostoc sp. CENA67 gerada por inferência
bayesiana. As sequências obtidas no presente trabalho se encontram destacadas em
negrito. Linhagens já classificadas no gênero Nostoc com genomas disponíveis se
encontram destacadas com pontos. Nos nós dos ramos encontram-se as
probabilidades posteriores bayesianas precedidas por percentuais de reamostragem
maiores que 50 % em ramos também observados por máxima verossimilhança
43
Percentuais de identidade de DNAr 16S entre gêneros diferentes na ordem Nostocales
podem chegar a 98 %, maior que o observado entre gêneros de outras ordens. Por
consequência, sequências provindas de cianobactérias da ordem Nostocales frequentemente
possuem posições instáveis em árvores filogenéticas e são atraídas por sequências não
relacionadas, tornando difícil a separação de gêneros pela utilização exclusiva de sequências
de DNAr 16S. Isso provavelmente ocorre devido ao ancestral dessa ordem ter divergido muito
cedo das outras cianobactérias, o que deixou em seus descendentes alta distância evolutiva em
relação aos seus táxons mais próximos e menor distância entre si (CASAMATTA; GOMEZ;
JOHANSEN, 2006; KORELUSOVÁ, 2008). Nesses casos, sequências de genes funcionais
podem fornecer um sinal filogenético mais claro, permitindo distinguir entre cianobactérias de
alta similaridade morfológica e ribossômica (HENSON et al., 2002).
Marcada por uma história bastante conturbada, a sistemática de cianobactérias foi alvo
de diversas tentativas de conciliar morfologia, filogenética e outros fatores, principalmente na
última década (HOFFMANN; KOMÁREK; KAŠTOVSKÝ, 2005; KOMÁREK, 2010b;
KOMÁREK, 2014). Diversas presunções baseadas em critérios morfológicos têm sido
derrubadas à medida que aumenta o conhecimento da diversidade desses micro-organismos.
Uma das mais profundas reavaliações ocorreu após a percepção de que a ocorrência de
filamentos ramificados, anteriormente considerada monofilética, surgiu independentemente
em um grande número de táxons do filo (GUGGER; HOFFMANN, 2004; SINGH et al.,
2015a). Mesmo ao longo dessas reavaliações, a definição da família Nostocaceae permaneceu
estável, e nesse momento ainda inclui exclusivamente gêneros com filamentos não
ramificados (KOMÁREK et al., 2014). Contudo, novos gêneros com ramificação vêm sendo
identificados nessa família por evidências filogenéticas (BOHUNICKÁ et al., 2015;
KAŠTOVSKÝ et al., 2014).
Esses fatos demonstram mais uma vez que, quando sozinhos, os caracteres
morfológicos, mesmo os mais tradicionais e os tidos como estáveis, não são capazes de guiar
com segurança a inferência de padrões evolutivos no filo Cyanobacteria. De maneira
semelhante, a filogenética baseada exclusivamente em sequências do DNAr 16S tem se
mostrado limitada para alguns grupos taxonômicos, como observado entre gêneros da ordem
Nostocales. A taxonomia polifásica, baseada no consenso de diferentes análises, foi adotada
pela sistemática cianobacteriana para tentar contornar essa limitação (KOMÁREK, 2005;
VANDAMME, 1996). Formas de aprimorar esse método continuam a ser propostas
(MISHRA et al., 2015; PALINSKA; SUROSZ, 2014). Atualmente, o método mais promissor
para a resolução dos problemas da sistemática bacteriana é a inclusão de análises de genomas
44
(CHUN; RAINEY, 2014; THOMPSON et al., 2015; VANDAMME; PEETERS, 2014).
Contudo, o baixo número de genomas cianobacterianos disponíveis inviabiliza a
implementação desse método em larga escala para este filo.
Não obstante, as diferenças morfológicas, ecológicas e filogenéticas entre CENA67 e
outras cianobactérias identificadas no gênero Nostoc observadas neste trabalho são indicativos
da possibilidade de a linhagem estudada representar um novo táxon, como uma nova espécie
de Nostoc ou mesmo um novo gênero da família Nostocaceae. Os dados levantados, contudo,
ainda não são suficientes para determinar com exatidão o reposicionamento taxonômico, visto
que um baixo número de organismos relacionados a essa linhagem está disponível para
análise no momento.
6.2 Sequenciamento, montagem e anotação genômica
De maneira geral, os dados sequenciados com a tecnologia Illumina apresentaram
valores de qualidade Phred consideravelmente mais elevados do que os obtidos com a
tecnologia Ion Torrent (Figura 4). O sequenciamento com Ion PGM gerou um total de
1.641.285.796 bases, provenientes de 9.365.430 leituras, cujos comprimentos variaram entre
valores de 50 e 572 pb após o pré-processamento, onde a maioria das leituras remanescentes
continha entre 201 e 250 pb de comprimento (Figura 5A). O sequenciamento com MiSeq
gerou 39.254.914 leituras, cuja sequência mais curta continha 50 pb de comprimento
enquanto a sequência mais longa possuía 592 pb de comprimento após o pré-processamento.
O processamento das sequências obtidas com MiSeq resultou em um conjunto de dados de
aproximadamente 11 GB contendo 16.666.240 sequências, totalizando 4.961.016.101 bases.
O comprimento da maioria das sequências no conjunto de dados final esteve entre 251 e
300 pb (Figura 5B).
45
Figura 4 – Qualidade de leituras obtidas em sequenciamentos de uma cultura de Nostoc sp.
CENA67. A e B: Conjunto de pares R1 e R2 (respectivamente) gerados por
sequenciamento com MiSeq; C e D: Pares F e R (respectivamente) de leituras
sequenciadas com Ion PGM
Apesar de o sequenciamento realizado com a tecnologia Ion Torrent ter sido capaz de
gerar algumas leituras que atingiram comprimentos próximos de 600 pb, a grande maioria das
sequências não ultrapassou 350 pb após os procedimentos de filtragem, ao passo que as
filtragens de sequências de MiSeq resultaram em uma melhor distribuição do comprimento de
suas leituras. Alguns trabalhos afirmam que o comprimento das leituras tem menor
importância para a montagem que o método utilizado (CHAISSON; BRINZA; PEVZNER,
2009). Todavia, é inegável que sequências mais longas e de melhor qualidade beneficiam as
montagens e aumentam sua confiabilidade, especialmente em casos de amostras com grande
número de micro-organismos, como em metagenomas, ou de genomas com alto número de
repetições, como os encontrados em cianobactérias.
46
Figura 5 – Distribuição dos comprimentos das sequências remanescentes após o
pré-processamento dos dados obtidos com os sequenciamentos. A: Sequências
obtidas com Ion PGM; B: Sequências obtidas com MiSeq
47
Apesar disso, mesmo sequências menores podem ajudar nos processos de montagem.
Nas novas gerações de tecnologias de sequenciamento de DNA, o comprimento e o grau de
confiabilidade das leituras é dependente da relação sinal/ruído, cujas fontes diferem em cada
tecnologia. Por consequência, as sequências produzidas por cada tecnologia também estão
suscetíveis a diferentes tipos de erros. Os erros mais comumente encontrados na tecnologia
Illumina são de substituição, onde uma base é confundida com outra, enquanto os erros mais
frequentes na tecnologia Ion Torrent são ocasionados por homopolímeros, onde repetições
sequenciais de uma mesma base são subestimadas ou superestimadas, resultando em inserções
ou deleções artificiais (MARDIS, 2013). Logo, uma combinação de ambas as tecnologia de
sequenciamento pode ser benéfica, já que é possível que os enganos de um sequenciador
sejam corrigidos com os dados obtidos com outro, levando menos erros e ambiguidades aos
programas montadores.
A montagem gerou 34.429 sequências contíguas, que totalizaram aproximadamente
182 Mpb, com um N50 de 44.962 e 36 × de cobertura média. A predição de genes apontou
197.635 genes únicos na montagem. Dentre essas sequências, foram detectadas
267 sequências cianobacterianas, totalizando aproximadamente 8,2 Mpb, com N50 de 58.528
e uma cobertura média de 224 ×. A montagem do genoma de um genótipo ou uma espécie
individual a partir de dados metagenômicos pode ser realizada com precisão quando a
cobertura deste genoma dentro do metagenoma é de pelo menos 20 ×; caso contrário, corre-se
maior risco de geração de quimeras dos genomas de linhagens próximas (LUO et al., 2011).
Dessa maneira, o genoma cianobacteriano montado apresenta baixo risco de quimeras.
O programa Kmer Spectrum Analyzer estimou o tamanho do genoma cianobacteriano
em 7,8 Mpb, próximo ao total das sequências detectadas na montagem. Além disso, o mais
próximo genoma cianobacteriano completo, pertencente à cianobactéria Nostoc sp.
PCC 73102, contém um total de 8,23 Mpb. Estimativas de tamanho genômico por métodos
bioinformáticos apresentam congruência com estimativas por eletroforese em gel de campo
pulsado (WILLIAMS et al., 2013). Devido à dificuldade do corte por enzimas de restrição em
decorrência do alto percentual de metilação no genoma de cianobactérias, também é possível
que o tamanho genômico tenha maior precisão na estimativa com bioinformática que com
análises baseadas em restrição e eletroforese. Em vista desses fatos e apesar do número de
sequências contíguas obtidas, o genoma montado possivelmente está próximo de completo.
Não obstante a alta cobertura obtida com o sequenciamento e a montagem do genoma
da cianobactéria-alvo, algumas regiões genômicas não puderam ser contempladas com este
procedimento, deixando-o em estado de rascunho. Um dos motivos mais prováveis para tal
48
resultado é um número elevado de regiões genômicas de repetição. Situação semelhante é
comumente encontrada em montagens de genomas de outras cianobactérias (WANG et al.,
2012). Em outras bactérias, repetições genômicas e elementos transponíveis também atuam
consistentemente na interrupção de montagens, podendo ser geralmente observada uma
correlação entre as regiões mais fragmentadas do genoma e a predição de ilhas genômicas
(RICKER et al., 2012).
Uma estratégia que vem sendo proposta para contornar os problemas inerentes à
montagem de regiões genômicas complexas é a utilização de leituras com até dezenas de Kpb
de comprimento (KOREN; PHILLIPPY, 2015). Sequências de comprimentos maiores que os
possíveis de serem obtidos atualmente têm se tornado viáveis com as tecnologias SMRT,
comercializada pela Pacific BioSciences (CHIN et al., 2013; HUDDLESTON et al., 2014;
ZHANG et al., 2012), e MinION, da Oxford Nanopore (QUICK; QUINLAN; LOMAN, 2014;
SCHNEIDER; DEKKER, 2012), porém com a desvantagem de terem menor qualidade que as
sequências obtidas com outras tecnologias atuais, o que requer maior cobertura. Essa
desvantagem busca ser contornada por um novo método de preparo de bibliotecas
disponibilizado para a tecnologia Illumina, o qual utiliza leituras marcadas de alta qualidade
que são reconstituídas em leituras longas sintéticas, que atingem até 18 Kpb de comprimento
(MCCOY et al., 2014).
Sequências obtidas com a tecnologia SMRT, sozinhas ou combinadas com outras
tecnologias, vem sendo utilizadas com sucesso na montagem dos genomas de algumas
cianobactérias em culturas axênicas (BILLER et al., 2014; KOPF et al., 2014; YAMAGUCHI
et al., 2015). A eficácia de tal método para a montagem de genomas provenientes de culturas
mistas, contudo, ainda permanece por ser testada, o que não permite afirmar se ele
beneficiaria a finalização do genoma estudado. A despeito disso, os sequenciamentos com
leituras longas se mostram promissores para esse fim.
A anotação detectou 7.190 genes no rascunho genômico de Nostoc sp. CENA67, os
quais foram identificados em 412 subsistemas (Figura 6). A maior parte dos genes
encontrados (73 %) está classificada fora de subsistemas, ou seja, pertence a grupos de
famílias proteicas ligadas a processos biológicos ainda desconhecidos. Desses genes,
aproximadamente 70 % codifica proteínas hipotéticas. Isso significa que há uma alta
diversidade genética inexplorada no genoma estudado, fornecendo amplo material para a
descoberta de vias potencialmente envolvidas na biossíntese de produtos naturais ainda
desconhecidos (MICALLEF et al., 2015; SHIH et al., 2013).
49
Figura 6 – Distribuição de subsistemas do genoma da linhagem cianobacteriana CENA67
Certos micro-organismos fotossintéticos também são atraentes para a recuperação de
áreas contaminadas devido às suas capacidades de biodegradação de xenobióticos e de
biossorção de metais pesados, a despeito de sua baixa adoção neste campo (DE PHILIPPIS et
al., 2011; IDI et al., 2015; KAPLAN, 2013). Algumas anotações genômicas observadas
sugerem que a cianobactéria estudada poderia ser útil em processos de biorremediação de
solos contaminados com xenobióticos, já que genes que codificam enzimas para as vias de
degradação de benzoato, fluorobenzoato, cloro-ciclo-hexano, clorobenzeno e tolueno foram
detectados. Genes para resistência a alguns metais pesados como cobre, mercúrio, cobalto,
zinco, cádmio e arsênio também foram observados entre as sequências genômicas dessa
linhagem cianobacteriana.
Genes para a biossíntese de auxinas foram anotados no genoma, corroborando
resultados obtidos anteriormente em ensaios bioquímicos (dados não exibidos). Ácido indol
acético tem um papel importante na colonização de raízes e na promoção de crescimento de
plantas por cianobactérias do gênero Nostoc (HUSSAIN et al., 2015). Nostoc spp. também
podem beneficiar plantas através do antagonismo a fitopatógenos e insetos herbívoros por
intermédio de metabólitos secundários (SINGH et al., 2015b). Micro-organismos de solo,
tanto abundantes quanto raros, possuem grande influência sobre o desenvolvimento de
plantas, incluindo aspectos como taxa de crescimento, resistência a doenças e tolerância a
estresse, de modo que a seleção sobre comunidades microbianas de solo pode resultar na
alteração de algumas funções vegetais (PANKE-BUISSE et al., 2015). Tendo em vista que a
cianobactéria estudada é proveniente de solo com traços interessantes para o cultivo de
plantas, é possível que seja capaz de produzir outras substâncias que também tenham papel
importante no estabelecimento de interações ecológicas nesse hábitat.
50
6.3 Detecção de metabólitos secundários
Apesar de ter sido detectado anteriormente por PCR e sequenciamento, não foi
detectado dentre as sequências montadas o gene sxtI, supostamente envolvido na síntese de
saxitoxina. Em contrapartida, foram detectados regiões contendo identidade com os genes
sxtV (86 %) e sxtW (88 %) de Cylindrospermopsis raciborskii T3, ambas contidas na porção
inicial de uma sequência contígua com 16.804 pb de comprimento. Análises de outros genes
dessa sequência contígua não apontaram outras regiões com identidade com genes previstos
como participantes da via biossintética das saxitoxinas. Os genes sxtV e sxtW, que codificam,
respectivamente, ferredoxina 4-Fe e 4-S e um homólogo de fumarato redutase/succinato
desidrogenase (KELLMANN et al., 2008), ainda não foram encontrados em genomas de
outros táxons. Esse par estaria envolvido na transferência de elétrons para SxtH e SxtT, com
SxtV produzindo fumarato pela extração de um par de elétrons do succinato e os transferindo
para SxtW (PEARSON et al., 2010).
A suposta via biossintética da saxitoxina é altamente complexa, com mais de
35.000 pb de comprimento e, em média, genes para 26 proteínas, com 30 funções catalíticas
(KELLMANN et al., 2008). Em algumas linhagens de Lyngbya wollei, um agrupamento
gênico de saxitoxina codificado por aproximadamente 36.000 pb pode ser encontrado com
diferenças bastante significativas quando comparado aos agrupamentos gênicos das outras
linhagens, tais como alguns genes adicionais exclusivos e a inativação do gene que codifica
uma O-carbamoiltransferase, sxtI (MIHALI et al., 2011). Dessa forma, o gene sxtI não é
essencial para a produção de saxitoxina nessas linhagens. Em contrapartida, o gene sxtA, que
codifica uma policetídeo sintase envolvida nos primeiros estágios da síntese de saxitoxina,
pode ser detectado também em linhagens não produtoras (CIRÉS et al., 2014). Logo, é
possível que, apesar da aparente conservação da via biossintética prevista para saxitoxinas,
variações notáveis possam ser encontradas em genomas de diferentes táxons. É também
possível que o gene sxtI, que foi encontrado anteriormente em CENA67, não seja essencial
para a produção de saxitoxinas e possa estar envolvido em outros processos celulares, assim
como os genes sxtV e sxtW. Análises químicas recentes não apontam a produção de saxitoxina
em culturas da linhagem estudada (dados não exibidos).
Foi demonstrado que uma linhagem de Nostoc sp. produz maiores quantidades de
microcistina e nostoficina em condições de estresse fisiológico, fato que mostra que a
regulação da produção de cianotoxinas e outros metabólitos secundários pode ter alguma
relação com certas condições ambientais, tais como temperatura, irradiância e disponibilidade
51
de nitrogênio e fósforo, variando entre táxons que ocupam diferentes nichos ecológicos
(KURMAYER, 2011). Dessa maneira, é possível que, ao longo do processo de cultivo, tenha
sido selecionada uma subpopulação não produtora de saxitoxina que, contudo, continha
alguns genes remanescentes do agrupamento, os quais foram recrutados para outras funções
celulares ou permaneceram inativados por regulação gênica.
A previsão de metabólitos secundários com antiSMASH com o algoritmo-padrão
resultou na predição de 31 agrupamentos gênicos, que incluíam os seguintes: seis
agrupamentos potencialmente envolvidos na produção de terpenos; cinco agrupamentos
contendo tanto genes que codificam peptídeo sintetases não ribossômicas (NRPS) quanto
genes codificando policetídeo sintases (PKS) tipo I; três contendo NPRS; dois que podem ser
responsáveis pela produção de microviridinas; dois possivelmente envolvidos na síntese de
bacteriocinas, bem como dois na síntese de lantipeptídeos; dois que contêm tanto genes que
codificam PKS tipo I quanto genes que codificam PKS ainda não classificadas; um
agrupamento com PKS tipo I; um agrupamento com PKS não classificada; e agrupamentos
que poderiam estar envolvidos com a síntese de laçopeptídeo, laderano e cianobactina.
Também foram encontrados quatro agrupamentos classificados como “outro”, um termo
utilizado para aquelas sequências que, apesar de terem seu envolvimento na síntese de
metabólitos secundários previsto com sucesso, ainda não podem ser enquadradas em uma
categoria específica (Tabela 3).
A detecção com o algoritmo ClusterFind apontou 66 agrupamentos adicionais no
rascunho genômico dessa linhagem, incluindo os seguintes: quarenta e nove agrupamentos
potencialmente envolvidos na produção de sacarídeos; três agrupamentos que possivelmente
resultam em moléculas híbridas sacarídeo-terpeno e um, em sacarídeo-bacteriocina; dois
potencialmente envolvidos na síntese de ácidos graxos; e um agrupamento que poderia gerar
um sacarídeo modificado por PKS de outro tipo. Esse algoritmo também detectou dezessete
agrupamentos hipotéticos que não foram passíveis de categorização. Treze dentre os
agrupamentos preditos com o algoritmo-padrão apresentaram similaridade com genes
envolvidos na produção de metabólitos secundários já caracterizados. Todavia, apenas um
desses agrupamentos hipotéticos apresentou 100 % de genes similares com algum
agrupamento conhecido, o do sesquiterpeno geosmina, enquanto o percentual dos outros
agrupamentos preditos variou entre 6 e 75 % (Tabela 3). Apenas quatro dentre os
agrupamentos gênicos preditos adicionalmente com o algoritmo ClusterFind apresentaram
similaridade com agrupamentos conhecidos, que não passou de 14 %.
52
Tabela 3 – Agrupamentos gênicos preditos no genoma de Nostoc sp. CENA67
Agrupamento Tamanho (pb) Categoria Agrupamento
Mais Similar Genes Similares (%)
1 22.731 laçopeptídeo não identificado –
2 58.765 PKS tipo I crocacina 47
3 50.025 NRPS / PKS tipo I nostopeptolídeo 50
4 55.670 NRPS aeruginosida 11
5 20.254 microviridina não identificado –
6 19.410 bacteriocina não identificado –
7 22.506 terpeno não identificado –
8 10.656 bacteriocina não identificado –
9 32.055 NRPS / PKS tipo I criptoficina 37
10 23.231 outra PKS ambiguina 6
11 19.931 terpeno não identificado –
12 51.142 NRPS nodularina 50
13 20.932 terpeno não identificado –
14 26.956 terpeno geosmina 100
15 32.951 outro não identificado –
16 24.056 outro não identificado –
17 59.994 NRPS / PKS tipo I nostoficina 27
18 19.335 bacteriocina-lantipeptídeo não identificado –
19 41.753 PKS tipo I / outra PKS glicolipídeo (heterócitos) 42
20 26.330 cianobactina não identificado –
21 29.836 PKS tipo I / outra PKS glicolipídeo (heterócitos) 71
22 13.587 microviridina microviridina K 50
23 35.823 NRPS cianopeptolina 42
24 23.452 bacteriocina-lantipeptídeo não identificado –
25 25.765 NRPS / PKS tipo I cianopeptina 75
26 17.926 NRPS / PKS tipo I não identificado –
27 15.483 laderano não identificado –
28 14.309 terpeno não identificado –
29 13.169 outro não identificado –
30 10.912 terpeno não identificado –
31 3.090 outro não identificado –
Diversos dos metabólitos secundários conhecidamente sintetizados por cianobactérias
são produzidos por meio de vias não ribossômicas com a participação de enzimas como
peptídeo sintetases não ribossômicas e/ou policetídeo sintases, e atuam em importantes
processos celulares, incluindo captação de ferro e fixação de nitrogênio (CALTEAU et al.,
53
2014). Vias que contêm ambos os tipos de enzimas, NRPS e PKS, são frequentemente
encontradas na biossíntese de produtos naturais cianobacterianos, assim como enzimas
híbridas que combinam domínios tanto de NRPS quanto de PKS em uma mesma cadeia
polipeptídica (KEHR; PICCHI; DITTMANN, 2011). Aproximadamente 70 % das
cianobactérias apresenta essas enzimas, cujos genes totalizam por volta de 5 % dos genomas
que as contêm, com média de cinco agrupamentos de NRPS e/ou PKS por genoma (SHIH et
al., 2013). No genoma estudado, o dobro desse valor, ou dez agrupamentos, foram preditos e
estimados com um total de 481.985 pb, ou aproximadamente 5,86 % do genoma montado,
percentual que, entretanto, pode ter sido superestimado pelo algoritmo de descoberta adotado.
Metabólitos secundários peptídicos podem ser gerados por modificações
pós-traducionais de proteínas ribossômicas, com a catálise de macrociclizações do peptídeo e
de alterações nas cadeias laterais de seus aminoácidos, ou pela ação de peptídeo sintetases não
ribossômicas (NRPS), enzimas multimodulares que contêm domínios responsáveis pela
incorporação de aminoácidos à cadeia polipeptídica e pela modificação dos mesmos.
Enquanto a síntese ribossômica está geralmente restrita a uma amostra de 20 aminoácidos, as
NRPS podem utilizar cerca de 300 substratos proteinogênicos e não proteinogênicos, gerando,
assim, maior diversidade molecular e funcional e se responsabilizando pela produção da
maior parte dos peptídeos atualmente conhecidos em cianobactérias. Os domínios de
condensação, de adenilação e carreador de peptidil são essenciais em NRPS e podem ser
complementados pelos domínios de metiltransferase, cetorredutase e epimerase (KEHR;
PICCHI; DITTMANN, 2011).
De maneira similar às NRPS, policetídeo sintases (PKS) são enzimas multimodulares
que atuam na síntese não ribossômica de metabólitos secundários, porém utilizam ácidos
carboxílicos como substrato para a síntese de policetídeos. Os domínios de cetossintase,
aciltransferase e carreador de acila são geralmente encontrados nessas moléculas e podem ser
acompanhados pelos domínios de cetorredutase, desidratase e enoil redutase, os quais podem
levar a diferentes estados de redução dos grupos funcionais ceto do produto (KEHR; PICCHI;
DITTMANN, 2011). As PKS são tradicionalmente divididas em três tipos: I. enzimas
multifuncionais compostas por diversos módulos, que atuam por síntese linear; II. complexos
multienzimáticos com um único sítio ativo cada, com síntese iterativa; e III. enzimas com
vários módulos, com síntese iterativa; contudo, a diversidade de mecanismos e estruturas
nessa família de proteínas é significativamente subestimada por essa divisão (SHEN, 2003).
Algumas PKS incomuns que não possuem características claras de nenhum dos três tipos
permanecem por ser classificadas adequadamente.
54
Entre os peptídeos modificados pós-traducionalmente, encontram-se as bacteriocinas,
metabólitos secundários que possuem atividade antimicrobiana, cujos genes são amplamente
distribuídos em genomas bacterianos (COTTER; ROSS; HILL, 2013). Esses peptídios de
baixa massa molecular geralmente se originam com a clivagem de proteínas ribossômicas
precursoras seguida de modificações pós-traducionais, tais como formação de lantionina,
macrociclização, desidratação ou heterociclização, reações realizadas por proteínas
codificadas por genes localizados no genoma de maneira adjacente ao gene do precursor.
Apesar de pesquisas sobre bacteriocinas terem se focado principalmente sobre bactérias gram-
positivas, cianobactérias são uma fonte prolífica de bacteriocinas significativamente distintas
das encontradas em outros filos. Nesse filo, baixas taxas de conservação geram diversidade
suficiente para permitir sua divisão em sete grupos, de acordo com a composição de seus
domínios, de sua organização gênica e de sua filogenia (WANG; FEWER; SIVONEN, 2011).
Lantipeptídeos são uma subclasse de bacteriocinas formadas pela introdução adicional
de lantionina e metil-lantionina, aminoácidos que contêm grupos tioéter (WILLEY; DONK,
2007). Alta diversidade de lantipeptídeos em um gênero de cianobactérias foi relatada como
sendo resultante das atividades de uma única enzima sobre 29 precursores ribossômicos
diferentes, com papel específico ao hábitat ou à comunidade de origem (LI et al., 2010).
Grande diversidade de estruturas, atividades, mecanismos biossintéticos e organismos
produtores dessas moléculas tem sido encontrada recentemente, e acredita-se que centenas de
novos lantipeptídeos ainda permaneçam a ser descobertos em genomas bacterianos (KNERR;
DONK, 2012).
De maneira semelhante às bacteriocinas, cianobactinas e laçopeptídeos são
sintetizados a partir de peptídeos precursores, que são sintetizados ribossomicamente e
modificados pós-traducionalmente. Ao passo que cianobactinas passam por grandes
transformações pós-traducionais, lembrando em pouco seus peptídeos precursores,
laçopeptídeos sofrem um número bem menor de modificações (DONIA; SCHMIDT, 2011;
MAKSIMOV; LINK, 2014). A família das cianobactinas é composta tanto por moléculas
circulares como lineares de atividade anticancerígena, antiviral, antimalárica ou alelopática,
cujas vias estão presentes em aproximadamente 24 % dos gêneros cianobacterianos
(JASPARS et al., 2014; LEIKOSKI et al., 2013). Laçopeptídeos, por outro lado, recebem esse
nome por serem caracterizados por uma estrutura em formato de laço ou nó corrediço, e
podem apresentar atividade antimicrobiana, antiviral e antimetastática ou atuar como
inibidores enzimáticos e antagonistas de receptores, sendo encontrados em 2,5 % dos
genomas bacterianos (MAKSIMOV; PELCZER; LINK, 2012; MAKSIMOV; LINK, 2014).
55
Duas classes distintas de lipídeos foram preditas no genoma da cianobactéria estudada.
Laderanos são moléculas constituídas por anéis múltiplos de ciclobutano cuja função ainda é
desconhecida e que são geralmente encontradas em bactérias anaeróbicas que oxidam amônia
(RATTRAY et al., 2009; CHABAN et al., 2014). Terpenos são moléculas derivadas de
isopreno encontradas em todos os organismos vivos que, de maneira geral, proporcionam
algumas características mecânicas necessárias a membranas celulares, ou são secretadas,
volatilizadas ou catabolizadas em metabólitos com papel fisiológico ou ecológico, das quais
55.000 moléculas já foram descritas (OURISSON, 1990; SCHWAB et al., 2012). O
sesquiterpeno geosmina foi a única substância que apresentou 100 % de similaridade com
algum dos agrupamentos gênicos preditos. Três genes estão envolvidos em sua síntese, e
juntos somam pouco mais de 5 Kpb (Figura 7).
Figura 7 – Estrutura de agrupamentos gênicos presumidamente relacionados à síntese de
geosmina em Nostoc sp. CENA67 e em cianobactérias próximas
Assim como 2-metilisoborneol, a geosmina frequentemente é responsável por alterar
as características organoléticas da água potável, já que possui odor e sabor característicos de
terra molhada. A biossíntese de geosmina é conhecida em fungos, actinobactérias,
proteobactérias e cianobactérias. Actinobactérias são comumente a fonte de geosmina em
solos, enquanto cianobactérias são tidas como suas mais importantes produtoras em corpos
d’água, especialmente durante episódios de floração. Nesse filo, essa molécula ocorre nas
ordens Oscillatoriales e Nostocales, com destaque para espécies do gênero Nostoc
(SUURNÄKKI et al., 2015).
56
O outro agrupamento gênico ao qual a síntese de uma molécula já conhecida pôde ser
atribuída após curadoria manual das anotações foi o que recebeu o número 22, relacionado à
biossíntese de microviridina, que apresentou 50 % de similaridade com o agrupamento
biossintético descrito para a variante microviridina K. O agrupamento gênico anotado
apresentou doze genes, totalizando aproximadamente 9,5 Kpb, um dos mais longos entre os
agrupamentos presentes em outros genomas cianobacterianos que puderam ser descritos
(Figura 8). A curadoria manual do outro agrupamento predito na biossíntese de microviridina,
que recebeu o número 5, não apontou resultado semelhante.
Figura 8 – Estrutura de agrupamentos gênicos presumidamente relacionados à síntese dos
inibidores de protease microviridinas no genoma de Nostoc sp. CENA67 e nos
genomas de outras cianobactérias
Enquanto geosmina apresenta estruturas gênicas com alta conservação, a estrutura de
agrupamentos gênicos potencialmente envolvidos na produção de microviridinas é bastante
variável. Como observado, a variação mais marcante é observada em relação à quantidade de
genes de precursores peptídicos. A diversidade de precursores de microviridina é significativa
não apenas quando comparada entre linhagens, mas mesmo dentro de alguns genomas, que
podem conter de um a dez genes codificadores de precursores, semelhante ao observado em
agrupamentos gênicos envolvidos na biossíntese de cianobactinas (LEIKOSKI et al., 2013).
Os cinco genes codificadores de peptídeos precursores de microviridinas encontrados no
genoma de CENA67 apresentam identidades que variam de 62 a 91 % entre si e podem gerar
de 45 a 49 aminoácidos (Tabela 4).
57
Tabela 4 – Identidade entre genes que codificam precursores de microviridina encontrados no
genoma da linhagem CENA67
Gene Aminoácidos mdnA1 mdnA2 mdnA3 mdnA4 mdnA5
mdnA1 45 –
mdnA2 46 86 –
mdnA3 47 79 90 –
mdnA4 45 88 91 86 –
mdnA5 49 62 80 74 69 –
O alinhamento das sequências de aminoácidos de peptídeos precursores apresenta alta
variação, e algumas sequências são especialmente distintas em Anabaena variabilis ATCC
29413 e Nodularia spumigena CCY9414 (Figura 9). À primeira vista, o alto número de genes
que codificam precursores de microviridinas em alguns genomas parece ter se originado a
partir de eventos de duplicação gênica. Em diversos casos, as análises filogenéticas de fato
parecem fornecer suporte a essa hipótese (Figura 10). Em contrapartida, alguns precursores de
espécies diferentes estão mais proximamente relacionados entre si do que com outros
precursores do mesmo genoma, o que sugere que possa haver combinações de genes
parálogos e xenológos dentro de alguns agrupamentos. Não é possível descartar, todavia, a
hipótese de convergência evolutiva entre esses genes.
Figura 9 – Alinhamento de sequências de aminoácidos de peptídeos precursores de
microviridinas, evidenciando sua variedade
58
Figura 10 – Árvore filogenética reconstruída por inferência bayesiana com sequências de
aminoácidos de peptídeos precursores de microviridinas em genomas de
cianobactérias. Sequências da cianobactéria estudada no presente trabalho estão
destacadas em negrito. Probabilidades posteriores maiores que 50 % se
encontram nos nós dos ramos, precedidas pelos percentuais de reamostragem
dos ramos também observados na árvore reconstruída por máxima
verossimilhança
A microviridina é um depsipeptídeo tricíclico de ampla ocorrência em alguns gêneros
que, na maioria de suas variantes, atua como inibidor de proteases (ZIEMERT et al., 2010). A
primeira variante de microviridina, descoberta em 1990, recebeu esse nome por ter sido
isolada de Microcystis viridis (ISHITSUKA et al., 1990). Novas variantes desse grupo de
moléculas continuam a ser encontradas em amostras ambientais e isolados de cianobactérias
(GATTE-PICCHI et al., 2014). A diversidade molecular das microviridinas é provavelmente
maior que o que se acredita atualmente, tendo em vista que, conforme constatado nas
predições de agrupamentos gênicos, há maior diversidade de precursores que o conhecido
atualmente, que possivelmente permitem a expressão de novas variantes.
O sequenciamento do genoma da actinobactéria Streptomyces coelicolor é um
importante marco na descoberta de produtos naturais por métodos genômicos (BENTLEY et
al., 2002). A maioria das atuais ferramentas de predição de metabólitos secundários foi
59
desenvolvida com base em vias biossintéticas de actinobactérias, e por consequência disso as
análises realizadas pelas mesmas nem sempre se mostram adequadas para genomas
cianobacterianos, os quais frequentemente codificam vias para a síntese de moléculas cuja
ocorrência em outros filos é incomum (MICALLEF et al., 2015). Logo, é possível que outras
vias biossintéticas codificadas pelo genoma-alvo sejam descobertas à medida que as
ferramentas bioinformáticas sejam aprimoradas.
Nostoc sp. CENA67 produz moléculas antitumorais que são capazes de inibir o
desenvolvimento de células de câncer pulmonar e de carcinoma de cólon, fato que a coloca
como uma interessante fonte de moléculas de importância biotecnológica e farmacológica
(SILVA-STENICO et al., 2013a). Todavia, as moléculas responsáveis por essa ação não foram
caracterizadas química ou geneticamente, portanto não foi possível identificar seus
agrupamentos. Em cianobactérias, análises metabolômicas e genômicas têm se mostrado
complementares, e sua combinação desponta como uma estratégia sólida para a descoberta de
novos produtos naturais, permitindo tanto verificar se um agrupamento gênico hipotético está
sendo expresso como identificar os genes envolvidos na produção de uma determinada
molécula (KLEIGREWE et al., 2015). A complementação das predições no genoma de Nostoc
sp. CENA67 com análises químicas pode ajudar a esclarecer alguns dos agrupamentos
gênicos órfãos, cujas moléculas ainda não podem ter suas estruturas preditas com precisão.
6.4 Análises genômicas comparativas
Cromossomos de linhagens identificadas no gênero Nostoc que possuem sequências
genômicas disponíveis podem variar em tamanho de 5,35 a 8,23 Mpb e codificar entre 5.287 e
6.750 genes. Em comparação com essas sequências, o genoma da linhagem Nostoc sp.
CENA67 apresenta características bastante próximas às da linhagem simbionte
N. punctiforme PCC 73102, incluindo em tamanho, percentual GC, número de genes e
quantidade de sequências codificadoras de RNA (Tabela 5).
60
Tabela 5 – Características gerais do genoma de Nostoc sp. CENA67 comparadas às
sequências cromossômicas de linhagens relacionadas ao gênero Nostoc
Linhagem Hábitat de Origem Tamanho
(Mpb)
Percentual
GC Genes RNA Referência
Nostoc sp. CENA67 terra preta
antropogênica 8,2 41,4 7.190 84 este trabalho
Nostoc sp. PCC 7120
(NC_003272) água doce 6,41 41,3 5.287 64
KANEKO et al.,
2001
N. azollae 0708
(NC_014248)
simbionte de
Azolla filiculoides 5,35 38,4 4.989 55
RAN et al.,
2010
N. punctiforme PCC 73102
(NC_010628)
simbionte de
Macrozamia riedlei 8,23 41,4 6.750 88
MEEKS et al.,
2001
Nostoc sp. PCC 7107
(NC_019676) água doce 6,33 40,4 5.423 90
SHIH et al.,
2013
Nostoc sp. PCC 7524
(NC_019684) fonte termal 6,64 41,5 5.427 62
SHIH et al.,
2013
No tocante a agrupamentos gênicos potencialmente envolvidos na síntese de
metabólitos secundários, foram preditos 5, 11, 13, 15 e 21 agrupamentos nos genomas de
N. azollae 0708, Nostoc sp. PCC 7107, Nostoc sp. PCC 7120, Nostoc sp. PCC 7524 e
N. punctiforme PCC 73120, respectivamente. A exemplo do observado em CENA67, a
maioria desses agrupamentos não apresenta similaridade significativa com agrupamentos
conhecidos, com exceção de três agrupamentos detectados em PCC 73120 e relacionados à
biossíntese de nostopeptolídeo, geosmina e glicolipídeos de heterócitos.
O genoma de Nostoc sp. CENA67 tem como vizinho mais próximo o genoma de
N. punctiforme PCC 73102 (Tabela 6). Com exceção deste, o genoma sequenciado é mais
próximo de Nodularia spumigena CCY9414 que de outros genomas de cianobactérias
identificadas no gênero Nostoc, como Nostoc sp. PCC 7120, e Trichormus (Nostoc) azolae
0708. Anabaena variabilis ATCC 29413 também se encontra entre os genomas mais
próximos a CENA67. Nota-se, ainda, certa proximidade com genomas do gênero Cyanothece,
provavelmente em decorrência do baixo número de genomas próximos depositados.
61
Tabela 6 – Vizinhos mais próximos à linhagem CENA67, de acordo com o servidor RAST
Nº RAST Pontuação Linhagem
63737.11 507 N. punctiforme PCC 73102
313624.3 506 Nodularia spumigena CCY9414
63737.4 498 N. punctiforme PCC 73102
103690.1 472 Nostoc sp. PCC 7120
240292.6 471 Anabaena variabilis ATCC 29413
103690.10 462 Nostoc sp. PCC 7120
240292.6 461 Anabaena variabilis ATCC 29413
551115.6 416 Trichormus azollae 0708
533240.4 403 Cylindrospermopsis raciborskii CS-505
533247.5 331 Raphidiopsis brookii D9
203124.1 293 Trichodesmium erythraeum IMS101
65393.13 287 Cyanothece sp. PCC 7424
203124.1 283 Trichodesmium erythraeum IMS101
65393.13 278 Cyanothece sp. PCC 7424
395962.3 264 Cyanothece sp. PCC 8802
395962.3 255 Cyanothece sp. PCC 8802
376219.3 249 Arthrospira sp. PCC 8005
41431.3 242 Cyanothece sp. PCC 8801
118168.3 240 Microcoleus chthonoplastes PCC 7420
497965.6 233 Cyanothece sp. PCC 7822
41431.3 233 Cyanothece sp. PCC 8801
313612.3 201 Lyngbya sp. PCC 8106
449447.3 199 Microcystis aeruginosa NIES-843
449447.3 191 Microcystis aeruginosa NIES-843
43989.3 183 Cyanothece sp. ATCC 51142
497965.6 180 Cyanothece sp. PCC 7822
391612.3 179 Cyanothece sp. CCY 0110
43989.3 174 Cyanothece sp. ATCC 51142
391612.3 160 Cyanothece sp. CCY 0110
395961.4 153 Cyanothece sp. PCC 7425
62
Como pode ser observado na Figura 11, a maior parte dos genes de CENA67 possui
percentual de identidade relativamente baixo em relação aos genes de três de seus vizinhos
mais próximos. De maneira semelhante, a análise de sintenia aponta para variação
significativa em relação ao genoma de seu vizinho mais próximo, o que significa que
provavelmente há um tempo relativamente elevado de divergência entre esses táxons a partir
de sua população ancestral (Figura 12).
Figura 11 – Percentuais de identidade proteica de CENA67 em comparação com os genomas
das linhagens A. variabilis ATCC 29413 (círculo exterior), N. punctiforme PCC
73102 (centro) e Nostoc sp. PCC 7120 (círculo interior). MRB: melhor resultado
bidirecional; MRU: melhor resultado unidirecional
63
Figura 12 – Sintenia inferida por BLAST entre os genomas de Nostoc sp. CENA67 e de seu
vizinho genômico mais próximo, N. punctiforme PCC 73102
Comparando a região intergênica do DNAr 16S-23S de linhagens próximas ao gênero
Nostoc, pode ser identificado no genoma de Nostoc sp. CENA67 e da maioria das linhagens
relacionadas as regiões conservadas D1-D5, genes para RNAs transportadores de isoleucina e
alanina e os antiterminadores Box A e Box B (Figura 13). As maiores variações entre
linhagens são observadas em sequências da região D1-D1’, do antiterminador Box B e da
região D5, onde todas apresentam sequências exclusivas. As diferenças mais significativas em
regiões conservadas são encontradas em Nostoc azollae 0708, que apresenta uma inserção de
quatro nucleotídeos em D2, Desmonostoc sp. HA7617, que apresenta uma inserção de
30 nucleotídeos na região D5, e Nostoc muscorum CENA61, que não possui genes para RNAt
em sua sequência.
64
Figura 13 – Alinhamento do espaço intergênico DNAr 16S-23S em Nostoc sp. CENA67 e
linhagens de táxons próximos, destacando domínios conservados,
antiterminadores e genes de RNAt para isoleucina e alanina
65
As diferenças entre sequências do espaço intergênico DNAr 16S-23S das linhagens
comparadas são mais facilmente visualizadas nas estruturas secundárias da hélice D1-D1'
(Figura 14) e da hélice Box B (Figura 15). Em ambos os casos, as diferenças se tornam claras
no número e tamanho dos círculos formados e nas sequências basais. CENA67 se mostra
distinta mesmo de N. punctiforme PCC 73102, seu vizinho genômico mais próximo, porém
apresenta várias semelhanças com Desmonostoc sp. HA7617 LM4. Distinções dessas
estruturas têm sido consideradas importantes para a diferenciação de táxons cianobacterianos
próximos, como linhagens, espécies ou mesmo gêneros (ITEMAN et al. 2000; JOHANSEN et
al., 2011). Novamente nota-se, portanto, a grande variabilidade dentro do gênero Nostoc e a
necessidade de uma revisão sobre a biologia deste táxon.
Figura 14 – Estruturas secundárias preditas para a região D1-D1' do espaço intergênico DNAr
16S-23S. A: Nostoc sp. CENA67; B: Nostoc sp. PCC 7120; C: Nostoc sp. PCC 7524; D:
Nostoc sp. PCC 7107; E: N. muscorum CENA18; F: N. muscorum CENA61; G: N.
piscinale CENA21; H: N. punctiforme PCC 73102; I: N. azollae 0708; J: Desmonostoc
sp. HA7617 LM4; K: Anabaena variabilis ATCC 29413; L: Nod. spumigena CCY9414
66
Figura 15 – Predição de estruturas secundárias da região Box B para o espaço intergênico do DNAr
16S-23S. A: Nostoc sp. CENA67; B: Nostoc sp. PCC 7120; C: Nostoc sp. PCC 7524; D:
Nostoc sp. PCC 7107; E: N. muscorum CENA18; F: N. muscorum CENA61; G: N.
piscinale CENA21; H: N. punctiforme PCC 73102; I: N. azollae 0708; J: Desmonostoc
sp. HA7617 LM4; K: Anabaena variabilis ATCC 29413; L: Nod. spumigena CCY9414
Na comparação de proteínas homólogas entre os genomas de Nostoc sp. CENA67 e de
linhagens já identificadas no gênero Nostoc (Nostoc sp. PCC 7120, N. azollae 0708,
N. punctiforme PCC 73102, Nostoc sp. PCC 7107 e Nostoc sp. PCC 7524), verificou-se
inicialmente a influência da escolha dentre os algoritmos disponíveis pelo programa
GET_HOMOLOGUES sobre os resultados. A análise dos resultados dos algoritmos melhor
resultado bidirecional (CONTRERAS-MOREIRA; VINUESA, 2013), COGtriangles
(KRISTENSEN et al., 2010) e OrthoMCL (LI; STOECKERT JR; ROOS, 2003) apontou alto
consenso dos algoritmos, com a interseção de aproximadamente 90 % dos genes detectados,
indicando pouca influência dessa escolha sobre os resultados (Figura 16).
67
Figura 16 – Comparação de previsões do número de proteínas em comum entre genomas de
Nostoc spp., indicando o número de proteínas ortólogas encontradas
exclusivamente com os algoritmos melhor resultado bidirecional (BDBH),
COGtriangles (COG) ou OrthoMCL (OMCL) e simultaneamente entre eles
O algoritmo OrthoMCL acusou o número de ortólogos entre CENA67 e as linhagens
PCC 7120, 0708, PCC 73102, PCC 7107 e PCC 7524 como sendo 3.929, 2.565, 4.536, 4.043
e 3.878, respectivamente, e apontou a existência de 1.256 genes parálogos no genoma de
Nostoc sp. CENA67 (Tabela 7). Esses fatores sugerem tendência ao cosmopolitismo e podem
ser parcialmente responsáveis sobre o tamanho genômico relativamente elevado dessa
linhagem. Nas análises do pangenoma e do genoma essencial de Nostoc spp., baseadas no
total de 45.295 genes contidos nos genomas comparados, curvas obtidas com o algoritmo
OrthoMCL estimaram o número de genes codificadores de proteínas do genoma essencial em
2.130, enquanto o pangenoma foi estimado por esse algoritmo como sendo composto por
10.590 genes (Figura 17). Contudo, as curvas refletiram a necessidade da disponibilização de
maior número de genomas deste grupo.
68
Tabela 7 – Número de genes parálogos detectados em genomas de linhagens relacionadas ao
gênero Nostoc e de genes ortólogos que apresentam em comum. O percentual de
identidade médio entre linhagens se encontra entre parênteses
Linhagem Parálogos 1 2 3 4 5 6
1. Nostoc sp. CENA67 1.256 –
2. Nostoc sp. PCC 7120 569 3.929
(75,6) –
3. N. azollae 0708 1.236 2.565
(75,5)
2.561
(75,3) –
4. N. punctiforme PCC 73102 1.392 4.536
(74,6)
4.042
(73,7)
2.614
(75,4) –
5. Nostoc sp. PCC 7107 649 4.043
(75,8)
4.207
(75,5)
2.599
(75,0)
4.028
(74,0) –
6. Nostoc sp. PCC 7524 376 3.878
(78,5)
4.082
(81,4)
2.599
(75,3)
3.832
(76,8)
3.809
(77,9) –
Figura 17 – Curvas de estimativas para os tamanhos do genoma essencial (A) e do pangenoma
(B) de cianobactérias relacionadas ao gênero Nostoc obtidos com o algoritmo
OrthoMCL.
O termo “pangenoma” foi cunhado em 2005 para expressar a diversidade genômica de
isolados de Streptococcus agalactiae (TETTELIN et al., 2005). A partir desse estudo,
observou-se que uma espécie bacteriana poderia ser representada pelo conjunto dos genes que
suas linhagens apresentam em comum, presumivelmente essenciais à manutenção de seus
processos vitais, e dos genes específicos a uma ou poucas linhagens, dispensáveis à sua
69
biologia básica e de função acessória, cuja soma constitui o pangenoma da espécie (MEDINI
et al., 2005). Desde então, diversas ferramentas têm sido desenvolvidas para o estudo de
pangenomas, que permitem estimar quantos genomas adicionais são necessários para
caracterizar uma espécie determinada (VERNICOS et al., 2015; XIAO et al., 2015). A análise
pangenômica efetuada somente foi possível ao nível de gênero em vista do baixo número de
genomas disponíveis para o táxon estudado, porém se mostra válida na exposição do que o
genoma obtido traz de novo ao que já está estabelecido, evidenciando a diversidade dos
organismos desse táxon e a necessidade de novos sequenciamentos.
N. punctiforme PCC 73102 é uma linhagem de metabolismo facultativamente
heterotrófico que tem competência para a simbiose com fungos e plantas terrestres. O
cromossomo dessa linhagem é relativamente longo, se aproximando de 8,23 Mpb. Dentre as
7.432 sequências codificantes que apresenta, 45 % codificam proteínas de função conhecida e
29 % parecem ser exclusivos dessa espécie. Além de numerosas sequências de inserção e
repetições, são encontrados genes para transposases e enzimas de modificação de DNA, o que
aponta alta plasticidade neste genoma. Essa linhagem parece apresentar grande potencial de
percepção e resposta a sinais ambientais, possuindo mais de 400 genes envolvidos em
processos de transdução de sinal, entre eles proteínas cinases, reguladores de resposta e
fatores de transcrição, que possivelmente contribuem também para sua diferenciação celular e
capacidade simbiótica (EKMAN et al., 2013; MEEKS et al., 2001).
Como verificado, apesar de N. punctiforme PCC 73102 ter sido apontada como
próxima da linhagem estudada, elas apresentam diferenças moleculares e ecológicas
significativas. As observações indicam que, a despeito de o genoma de algumas linhagens
identificadas no gênero Nostoc terem sido caracterizados, há ainda desconhecimento
considerável a respeito deste grupo de cianobactérias. A diversidade taxonômica tem sido um
importante fator na escolha de cianobactérias para sequenciamento genômico (SHIH et al.,
2013), porém ainda há grande carência de variedade de táxons e de hábitats em bancos de
dados de sequências deste filo.
A maioria dos genomas cianobacterianos disponíveis até o momento pertence a
micro-organismos aquáticos, porém há diferenças entre a ecologia química de cianobactérias
de ambientes terrestres, marinhos e de água doce que tornam divergências entre seu
tratamento inevitáveis (LEÃO et al., 2012a). Genomas de cianobactérias terrestres, como
Nostoc sp. CENA67, permanecem como um campo pouco explorado. Conforme observado
nas análises realizadas, o genoma dessa linhagem exibe algumas características inéditas até o
momento, diferentes mesmo dos genomas tidos como mais próximos dentre os atualmente
70
disponíveis, portanto contribui para o aumento do conhecimento sobre a diversidade genética
e bioquímica do filo Cyanobacteria. Os resultados encontrados reforçam a hipótese de que
CENA67 constitua um táxon distinto, porém é necessário que mais linhagens próximas sejam
isoladas e caracterizadas para que seja possível realizar seu posicionamento taxonômico com
a segurança necessária.
A montagem de sequências provenientes de amostras com múltiplos micro-organismos
é favorecida em amostras com baixa diversidade e composta por espécies bastante diferentes
(DE FILIPPO et al., 2012), como provavelmente encontrado na cultura estudada. Montagens
desse tipo geralmente podem ser aprimoradas pela separação prévia das leituras em grupos
representativos de um mesmo genoma ou de genomas próximos. Essa separação pode ser
tanto baseada em diferenças na composição das sequências, como a conservação no conteúdo
de nucleotídeos, quanto na homologia e na similaridade das mesmas com sequências
depositadas em bancos de dados. Todavia, leituras curtas geralmente não fornecem
informação o suficiente para que sejam separadas apenas por sua composição de nucleotídeos
e frequentemente necessitam também de sua comparação com alguma referência. Caso uma
sequência proximamente relacionada não esteja disponível, mesmo referências relacionadas
apenas ao nível de filo podem ser utilizadas para a separação de leituras (THOMAS;
GILBERT; MEYER, 2012).
No presente trabalho, a separação de sequências de acordo com sua identificação
taxonômica ocorreu após os procedimentos de montagem. Essa abordagem se fez necessária
em decorrência do ineditismo do genoma da cianobactéria estudada, que possivelmente
constitui um táxon novo e possui, portanto, um número considerável de segmentos
exclusivos, não encontrados nos genomas de referência disponíveis. Consequentemente, a
separação de leituras em uma etapa anterior à montagem levaria à perda de uma quantidade
substancial de sequências. O método utilizado se mostrou adequado para o estudo genômico
de cianobactérias provenientes de culturas não axênicas, e contorna as grandes dificuldades
encontradas nas etapas de remoção de outros micro-organismos da cultura, as quais, caso
sejam possíveis e bem sucedidas, podem acrescentar anos ao tempo necessário para o estudo
genômico de uma linhagem.
71
6.5 Diversidade taxonômica de micro-organismos associados
Como esperado, as sequências mais abundantes na comunidade foram identificadas
como Cyanobacteria (43 %), mas sua abundância foi acompanhada proximamente por
Alphaproteobacteria (33 %) (Figura 18A). Os mais abundantes gêneros não cianobacterianos
identificados foram Mesorhizobium, Sinorhizobium e Starkeya, seguidos por outros gêneros
que, em sua maioria, também são tipicamente encontrados em solo (Figura 18B).
Figura 18 – Abundâncias relativas dos táxons de maior predominância na cultura analisada. A:
Abundância de sequências identificadas em categorias taxonômicas de nível mais
elevado. B: Gêneros não cianobacterianos mais abundantes
72
Mesorhizobium, Sinorhizobium, Starkeya, Rhodopseudomonas, Frankia, Azoarcus,
Novosphingobium e Rhodospirillum são gêneros bacterianos que apresentam muitos membros
capazes de fixar nitrogênio. Provavelmente como consequência dessa habilidade, várias
espécies de Mesorhizobium, Sinorhizobium, Starkeya, Frankia e Azoarcus são capazes de
estabelecer relações simbióticas mutualistas com plantas (MOULIN et al., 2001;
PAWLOWSKI; SIRRENBERG, 2003; KRAUSE et al., 2006; ZAKHIA et al., 2006;
MASSON-BOIVIN et al., 2009). Além disso, Phycisphaera pode estabelecer associações com
algumas espécies de clorófitas (LAGE; BONDOSO, 2014). Rhodospirillum e
Rhodopseudomonas também são capazes de realizar fotossíntese (GIESBERGER, 1947;
LARIMER et al., 2004). Porém, como é típico em alfaproteobactérias, ela é inibida por
oxigênio (IMHOFF, 2006). Por outro lado, apesar de RubisCo ativa ter sido descrita em
Haloferax, este gênero aparentemente é incapaz de crescimento autotrófico (HÜGLER et al.,
2003). A fisiologia de Starkeya também é interessante, já que pode tanto produzir quanto
consumir dióxido de carbono (KAPPLER et al., 2012).
A maioria dos gêneros identificados é relatada como membro usual de comunidades
microbianas em hábitats de solo. Não obstante, a composição taxonômica da comunidade
microbiana associada à linhagem cianobacteriana estudada é incomum devido a um número
considerável desses micro-organismos comumente interagir com plantas, principalmente na
rizosfera. Uma exceção marcante a esse padrão é a presença do gênero Coprothermobacter,
cujos membros são normalmente encontrados em ambientes anaeróbicos e de alta temperatura
(RAINEY; STACKEBRANDT, 1993; TANDISHABO et al., 2012). Aparentemente, alta
abundância de Mesorhizobium associado a uma linhagem cianobacteriana capaz de fixação de
nitrogênio não é incomum, já que também foi relatada por Brauer et al. (2015).
O índice de alfa-diversidade calculado pelo servidor MG-RAST para este metagenoma
indicou 191,954 espécies, o que não é surpreendente, tendo em vista que solos da Amazônia
são potenciais reservatórios de diversidade microbiana intocada (BRUCE et al., 2012). Além
disso, a curva de rarefação calculada para este metagenoma está próxima de atingir a assíntota
(Figura 19), indicando que poucas espécies permanecem por ser descobertas nessa
comunidade. Logo, os esforços de amostragem e sequenciamento foram considerados
adequados para os propósitos deste trabalho.
73
Figura 19 – Curva de rarefação calculada para o metagenoma montado
A seleção de unidades taxonômicas operacionais (UTOs) por referências fechadas a
94 % a partir de sequências de DNAr 16S detectou 364 UTOs não cianobacterianas
representativas identificadas nos filos Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteriodetes,
Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes e Proteobacteria. Algumas dessas UTOs foram
designadas a identidades desconhecidas em níveis taxonômicos variados (Tabela 8). Além
disso, EMIRGE montou 11 sequências parciais de DNAr 16S, cuja maioria apresentou
identidade significativa com bactérias conhecidas (Tabela 9).
Tabela 8 – Identificação taxonômica de UTOs não cianobacterianas em fragmentos de DNAr
16S detectados em sequências não montadas
Filo Classe Ordem Família Gênero UTOs
– – – – – 3
Acidobacteria Acidobacteriia Acidobacteriales Acidobacteriaceae – 1
Acidobacteria Solibacteres Solibacterales Desconhecida – 3
Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales – – 1
Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Microbacteriaceae Microbacterium 4
Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Mycobacteriaceae Mycobacterium 11
Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Propionibacteriaceae Propionibacterium 1
Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales – – 1
Chloroflexi Ktedonobacteria – – – 2
Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus 3
Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Desconhecida – 1
Planctomycetes Planctomycetia Gemmatales Gemmataceae – 2
Planctomycetes Planctomycetia Gemmatales Gemmataceae Gemmata 13
Planctomycetes Planctomycetia Gemmatales Isosphaeraceae – 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria – – – 3
(continua)
74
Tabela 8 (conclusão)
Filo Classe Ordem Família Gênero UTOs
Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae – 4
Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae Desconhecido 8
Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae Phenylobacterium 2
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales – – 24
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Aurantimonadaceae – 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae – 5
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Afipia 5
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Bosea 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobium 3
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Desconhecido 13
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Desconhecida – 44
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae – 5
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Devosia 6
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Hyphomicrobium 17
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Rhodoplanes 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Methylocystaceae – 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae – 6
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Desconhecido 4
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Mesorhizobium 13
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae – 39
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Agrobacterium 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae – 28
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Sinorhizobium 5
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Xanthobacteraceae – 5
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae – 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Acetobacteraceae – 9
Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae – 7
Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae – 7
Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Blastomonas 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Desconhecido 9
Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Novosphingobium 11
Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingobium 1
Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingomonas 24
Proteobacteria Gammaproteobacteria – – – 1
Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales – – 1
Proteobacteria Gammaproteobacteria Xanthomonadales – – 1
Proteobacteria – – – – 3
75
Os resultados obtidos por análises de DNAr diferem significativamente dos resultados
taxonômicos baseados em análises de todo o metagenoma. Contudo, já que as sequências de
DNAr estão representadas aleatoriamente no conjunto de dados, elas não podem ser tomadas
como sendo representativas da comunidade total, diferentemente das análises do metagenoma
total. A despeito disso, essa abordagem é adotada por algumas metodologias de análise, como
a implementada pelo servidor EBI Metagenomics (HUNTER et al., 2013), a qual detecta
DNAr 16S em dados metagenômicos e infere a composição taxonômica da comunidade a
partir dessas sequências. Logo, resultados obtidos com base nesse método devem ser
abordados com cautela.
Tabela 9 – Similaridade de sequências de DNAr 16S montadas pelo programa EMIRGE em
relação a organismos conhecidos depositados no banco de dados GenBank obtida
com a ferramenta BLAST
Sequência Comprimento (pb) Sequência Mais Próxima Cobertura Identidade
2 1283 Ensifer sp. ZNC0028
(KM585589) 100 % 100 %
4 1392 Gemmata sp. Ha1-2
(GQ889431) 96 % 93 %
6 1528 Burkholderia cenocepacia HI2424
(CP000459) 100 % 100 %
10 1362 Paracraurococcus sp. ORS 1473
(AJ968702) 100 % 99 %
12 1441 Afipia sp. 1 MRT-114
(EF371496) 100 % 99 %
22 1251 Bosea lupini R-45681
(NR_108514) 100 % 99 %
35 1430 Nostoc ellipsosporum V
(AJ630450) 97 % 98 %
42 1360 Bryobacter aggregatus MOB76
(AM887762) 98 % 97 %
52 1284 Caulobacter leidyi
(AF331660) 100 % 100 %
53 1296 Nordella oligomobilis N21
(NR_114615) 96 % 99 %
74 1113 Hyphomicrobium aestuarii ATCC 27483
(NR_104954) 100 % 99 %
Bactérias de novos táxons podem ser encontradas em associação com cianobactérias,
como exemplificado por Hoeflea anabaenae, encontrada em heterócitos de Anabaena, e
Gracilimonas tropica, proveniente de uma cultura de Synechococcus (CHOI et al., 2009;
STEVENSON et al., 2011). Uma das sequências de DNAr 16S obtidas apresentou 93 % de
identidade com uma sequência de Gemmata, um indicativo de que possivelmente é
76
representante de um novo gênero da família Planctomycetaceae. Alguns planctomicetes
podem ser encontrados em forte associação com cianobactérias, e florações de cianobactérias
frequentemente estimulam o aumento do número de planctomicetes (WARD et al., 2006). A
análise da comunidade microbiana associada a Microcystis spp. apontou que, ao passo que
proteobactérias dominavam as comunidades presentes em sistemas de enriquecimento,
planctomicetes predominavam entre os micro-organismos mais fortemente aderidos às células
das cianobactérias analisadas (CAI et al., 2013).
Como as análises de DNAr apresentaram poucos gêneros em comum com os gêneros
apontados como mais abundantes na análise de metagenoma total, elas provavelmente
revelaram táxons de maior raridade nas amostras, que possivelmente fazem parte da chamada
“biosfera rara”, ou o conjunto de micro-organismos que permanecem sob baixa abundância
em determinados ambientes (SOGIN et al., 2006). Esse método levantou um número
considerável de UTOs em táxons desconhecidos, e algumas UTOs também foram incluídas
em categorias taxonômicas que conhecidamente possuem um grande número de bactérias que
atualmente não são cultivadas, como Ktedonobacteria (YOKOTA, 2012).
Atualmente, a maior parte das bactérias não é passível de desenvolvimento sob
condições de cultura (RAPPÉ; GIOVANNONI, 2003). Dentre essas bactérias,
micro-organismos obrigatoriamente simbiontes dependem de nutrientes ou de interações
celulares providas por outros micro-organismos para o seu desenvolvimento e apresentam,
portanto, baixas possibilidades de ser cultivados (WILSON; PIEL, 2013). Apesar de cocultivo
já ter sido proposto como uma opção alternativa para o desenvolvimento de estudos in vitro
de bactérias previamente não cultivadas (VARTOUKIAN; PALMER; WADE, 2010;
STEWART, 2012), baixa ênfase foi dada a cianobactérias como parceiras de cultivo. Não
obstante, bactérias fotoautotróficas e fixadoras de nitrogênio do filo Cyanobacteria estão em
uma ótima posição para desempenhar essa função, como consequência de sua extraordinária
capacidade metabólica.
Alta diversidade bacteriana acompanha florações cianobacterianas, e pode incluir
táxons ainda não descritos, incluindo possíveis novas espécies, gêneros, famílias ou mesmo
ordens (BERG et al., 2009; TUOMAINEN et al., 2006). Macrocolônias de algumas espécies
do gênero Nostoc também constituem ambientes interessantes para a descoberta de novos
táxons microbianos, já que fornecem condições únicas, não encontradas em outros ambientes
(INTHASOTTI; PATHOM-AREE, 2015). Conforme se verifica nas análises de DNAr 16S,
cianobactérias relacionadas ao gênero Nostoc que não formam macrocolônias também
estabelecem nichos viáveis para o desenvolvimento de micro-organismos ainda
77
desconhecidos, e, em consórcio, podem prover as condições necessárias para que alguns
micro-organismos previamente não cultivados se desenvolvam sob cocultivo, mesmo sob
baixa abundância.
Dentre as sequências encontradas no metagenoma montado e que, a exemplo do
genoma de Nostoc sp. CENA67, puderam ser reconhecidas e somadas até constituírem
rascunhos genômicos, foram encontradas sequências identificadas como pertencentes às
alfaproteobactérias Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum e
Hyphomicrobium nitrativorans e à betaproteobactéria Burkholderia lata (Tabela 10). Apesar
de ser possível encontrar e identificar sequências de outras bactérias conhecidas no
metagenoma, elas se apresentam bastante fragmentadas, ou sua soma não alcança tamanhos
próximos aos de genomas de referência. Além disso, há a possibilidade de que outros
rascunhos genômicos presentes no metagenoma montado pertençam a táxons novos e, dessa
forma, não tenham sido identificados em espécies conhecidas, o que dificulta sua recuperação.
De fato, aproximadamente 89 % das sequências foram classificadas como desconhecidas pelo
programa Kraken. Contudo, essa pode ser uma limitação do método utilizado.
Tabela 10 – Características gerais dos rascunhos genômicos de algumas bactérias associadas à
cianobactéria Nostoc sp. CENA67
Organismo Sequências Tamanho
(Mpb)
Percentual
GC
Cobertura
Média Genes RNA
Bradyrhizobium diazoefficiens 266 9,28 64,21 7 × 9.101 49
Bradyrhizobium japonicum 289 8,23 63,72 6 × 8.026 69
Burkholderia lata 139 7,53 66,65 8 × 6.860 56
Hyphomicrobium nitrativorans 23 4,19 62,28 14 × 3.833 52
Não obstante o baixo número de trabalhos que trataram da diversidade de
micro-organismos associados a cianobactérias, a maioria dos quais se restringiu a ambientes
aquáticos, alguns táxons relacionados aos genomas obtidos já foram relatados em
simbiose com organismos do filo Cyanobacteria. Burkholderia e Bradyrhizobium foram
encontradas anteriormente em associação com Microcystis aeruginosa (BERG et al., 2009;
LI et al., 2011; SHI et al., 2011). Bactérias da família Burkholderiaceae também foram
observadas em associação com Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis aeruginosa,
Cylindrospermopsis raciborskii e Nostoc commune (EILER; BERTILSSON, 2004;
GRAHAM et al., 2014; SHI et al., 2009), e uma espécie do gênero Hyphomicrobium também
esteve presente em culturas de enriquecimento de Microcystis spp. (CAI et al., 2013).
78
Todavia, com exceção dos genomas de Blastomonas sp. e Rhodobacter sp., provenientes de
uma cultura não axênica de Cyanobium sp. (LIMA et al., 2014a; 2014b; 2014c), há poucas
informações sobre a genômica de bactérias heterotróficas associadas a cianobactérias em
culturas não axênicas.
Abordagens metagenômicas geralmente são baseadas na identificação e na separação
de sequências prévia ou posteriormente à montagem do metagenoma, com base em bancos de
dados de referência e/ou em diferenças de composição entre sequências (DRÖGUE;
MCHARDY, 2012; MANDE; MOHAMMED; GHOSH, 2012). Alternativamente, uma
estratégia de montagem e separação integradas, baseada em perfis diferenciais de cobertura
genômica, está apresentando resultados promissores (ALBERTSEN et al., 2013; NIELSEN et
al., 2014). Alguns programas que implementam esse método, tais como CONCOCT
(ALNEBERG et al., 2014), GroopM (IMELFORT et al., 2014) e MetaBAT (KANG et al.,
2014), têm sido disponibilizados.
Devido à pouca diferença de cobertura entre alguns genomas amostrados e às relações
próximas entre os organismos simbióticos da cultura estudada, as abordagens que independem
de bancos de dados não se mostram adequadas aos dados analisados, já que podem ter
dificuldade em discriminar sequências e, consequentemente, gerar resultados híbridos e de
baixa confiabilidade. Dessa forma, apesar de possivelmente haver táxons desconhecidos na
amostra sequenciada, a comparação das sequências com referências já conhecidas se mostra
como a alternativa mais confiável para a situação encontrada. À medida que os bancos de
dados públicos são aprimorados, novas respostas podem ser disponibilizadas.
Há relatos de especificidade de comunidades microbianas a algumas espécies
cianobacterianas (BAGATINI et al., 2014; SHI et al., 2009). Algumas cianobactérias
aparentam de fato possuir certa influência sobre a composição taxonômica de suas
comunidades associadas, exercitando controle através de mecanismos de competição e de
facilitação, como a liberação de carbono e nitrogênio fixados (BRAUER et al., 2015). Além
disso, metabólitos secundários de efeito alelopático, incluindo inibidores de protease e
bacteriocinas, podem ser liberados por diversas cianobactérias e essas moléculas poderiam,
portanto, impactar a comunidade e atuar como agentes de seleção de micro-organismos
(LEÃO et al., 2012b; SILVA-STENICO et al., 2011; 2013a; 2013b; WANG; FEWER;
SIVONEN, 2011). Logo, os organismos identificados provavelmente são o produto de uma
série de interações entre a linhagem cianobacteriana e os micro-organismos que, ao longo do
procedimento de cultura, remanesceram, enquanto outros eram eliminados por encontrar
condições pouco favoráveis, exacerbadas pela competição.
79
6.6 Caracterização funcional da comunidade associada
As anotações dos rascunhos genômicos montados revelaram um grande número de
sequências não incluídas em subsistemas no genoma de Nostoc sp. (73 %), um número maior
que o encontrado nos outros genomas (Figura 20). Genes para a biossíntese de auxinas foram
encontrados nos cinco rascunhos genômicos montados. A presença de vias biossintéticas para
este fitormônio não é surpreendente, tendo em vista que é provavelmente comum que essas
bactérias interajam com plantas em seu ambiente natural.
Figura 20 – Cobertura de subsistemas dos genomas obtidos a partir do metagenoma
A anotação apontou 429, 381, 550 e 413 subsistemas nos rascunhos genômicos de
Bra. diazoefficiens, Bra. japonicum, Bur. lata e H. nitrativorans, respectivamente (Figura 21).
Como esperado, genes para fotossíntese foram encontrados apenas entre as sequências
cianobacterianas dentre os cinco genomas obtidos. Todavia, genes para fixação de nitrogênio
também foram encontrados apenas entre sequências cianobacterianas, apesar de os outros
genomas pertencerem a gêneros que normalmente são capazes de fixar nitrogênio atmosférico
(Tabela 11).
80
Tabela 11 – Subsistemas relacionados ao metabolismo de nitrogênio detectados nos rascunhos
genômicos montados
Subsistema Nostoc sp. Bra. diazoefficiens Bra. japonicum Bur. lata H. nitrativorans
Fixação de nitrogênio 19 – – – –
Hidrólise de cianato 8 – – – –
Amonificação de
nitrato/nitrito 9 25 14 14 14
Assimilação de amônia 12 18 – 17 29
Utilização de alantoína – – 9 7 –
Estresse nitrosativo – 3 1 1 5
Nitrilase – – 1 2 –
Amidase / ureia e nitrila
hidratase – 2 1 – –
Redutase desnitrificante – 5 – – 12
Desnitrificação – 11 – – 24
Apesar de ser possível detectar genes a partir de sequências curtas, a montagem de
metagenomas fornece maior número de informações aos programas de predição funcional
(THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012), assegurando maior confiança em seus resultados.
Logo, as análises funcionais da comunidade microbiana associada à cianobactéria Nostoc sp.
CENA67 foram realizadas sobre as sequências metagenômicas após a montagem. A anotação
do metagenoma da comunidade associada revelou uma ampla gama de subsistemas (Figura
22). A comparação dos subsistemas do genoma cianobacteriano às anotações do metagenoma
de sua comunidade associada apontou nove subsistemas exclusivos (Tabela 12). O
procedimento oposto – a busca por subsistemas exclusivos à comunidade associada – revela
285 subsistemas, porém nenhum aparenta ser fundamental para cianobactérias.
81
Figura 21 – Distribuição de subsistemas nos rascunhos genômicos de bactérias heterotróficas
obtidos neste trabalho. A: Bra. diazoefficiens; B: Bra. japonicum; C: Bur. lata;
D: H. nitrativorans
82
Figura 22 – Distribuição de subsistemas da comunidade associada à cianobactéria CENA67
Aparentemente, os subsistemas exclusivos ao genoma cianobacteriano não favorecem
qualquer tipo de interação entre estas células e sua comunidade associada, já que a maioria
deles está relacionada direta ou indiretamente à fisiologia cianobacteriana comum. Vias
exclusivas também foram observadas no mapeamento metabólico (Figura 23).
Contudo, é possível que moléculas desconhecidas desempenhem algum papel nessa
interação, tendo em vista que anotações do servidor MG-RAST apontaram 46,8 % do
metagenoma da comunidade associada como proteínas desconhecidas. Além disso, entre
24,2 % (de acordo com comparações ao banco de dados COG) e 84,6 % (com base no banco
de dados NOG) das sequências classificadas em categorias funcionais foram incluídas em
processos pouco caracterizados.
Interações entre cianobactérias e heterótrofos em consórcios, apesar de específicas a
cada produtor primário, geralmente têm como padrão a troca mutualista de oxigênio e
carbono, liberados pelas células cianobacterianas, por metabólitos produzidos por células
heterotróficas, como nutrientes e vitaminas (COLE et al., 2014). Algumas análises
transcritômicas fornecem suporte a essa observação, e também indicam que uma situação
semelhante pode ser observada em relação ao nitrogênio fixado por cianobactérias
diazotróficas em cocultivo com bactérias heterotróficas (BELIAEV et al., 2014). Além do
trabalho presente, a associação entre cianobactérias diazotróficas e outras bactérias também
potencialmente diazotróficas, bem como associações entre cianobactérias e bactérias
fotossintéticas anoxigênicas ou bactérias mais comumente encontradas em raízes de plantas,
foi relatada anteriormente (GRAHAM et al., 2014; SÁNCHEZ et al., 2005). A fixação de
nitrogênio pode estimular a simbiose mesmo entre cianobactérias de espécies diazotróficas
(MOMPER et al., 2015).
83
Tabela 12 – Subsistemas exclusivos ao genoma de Nostoc sp. CENA67 quando comparado
com o metagenoma de sua comunidade associada
Subsistema Categoria Ocorrências
Formação de heterócitos em
cianobactérias Divisão celular e ciclo celular 8
Degradação de clorofila Cofatores, vitaminas, grupos prostéticos,
pigmentos, tetrapirróis 5
At2g44920 At1g12250 Miscelânea, genômica comparativa
planta-procarioto 4
Agrupamento Cmr CRISP Metabolismo de DNA, CRISPs 2
Caspases bacterianas Regulação e sinalização celular, morte celular
programada e sistemas toxina-antitoxina 2
Biossíntese de
glicosil-glicerídeos em plantas Ácidos graxos, lipídeos e isoprenoides 1
Hidrolases agindo em ligações
carbono-enxofre Metabolismo de enxofre 1
Desvio cianobacteriano no ciclo
do ácido tricarboxílico
Metabolismo central, ciclo do ácido
tricarboxílico 1
Adesão de Campylobacter Virulência, doença e defesa, adesão 1
A abundância das células cianobacterianas na comunidade é mantida em nível mais
elevado em relação às células de outras espécies, provavelmente devido ao fato de que as
condições fornecidas pelo meio de cultura estão direcionadas às necessidades da fisiologia
cianobacteriana. Consequentemente, apesar de genes para fotossíntese e fixação de nitrogênio
poderem ser encontrados no metagenoma da comunidade associada, as células
cianobacterianas possivelmente são a maior fonte de carbono e nitrogênio fixado neste
microambiente, dada a ausência de fontes de carbono e nitrogênio na composição do meio de
cultura. É provável que a cianobactéria esteja fornecendo a pelo menos alguns membros de
sua comunidade associada não apenas o carbono fixado que receberiam de plantas, mas
também nitrogênio fixado. A falta de genes para fixação de nitrogênio nos rascunhos
genômicos de bactérias heterotróficas obtidos sugerem que algumas populações bacterianas
podem estar se adaptando à grande oferta de metabólitos cianobacterianos à sua disposição
pela eliminação de genes que se tornaram redundantes neste contexto, o que, por sua vez,
pode torná-las mais dependentes das células cianobacterianas.
84
Figura 23 – Comparação de rotas metabólicas presentes no genoma cianobacteriano e/ou no metagenoma de sua comunidade associada obtidas
por comparações com o banco de dados KEGG. Rosa: processos comuns à cianobactéria e à comunidade associada. Vermelho: vias
específicas à comunidade associada. Azul: vias específicas à cianobactéria
85
Algumas cianobactérias não diazotróficas parecem não utilizar o nitrogênio fixado por
sua comunidade associada, mesmo em ambientes em que a eficiência desta é maior (LÓPEZ-
LOZANO et al., 2002). Em contrapartida, marcadores isotópicos indicam que pode ocorrer
transferência de fósforo entre cianobactérias e bactérias simbiontes em ambas as direções, de
modo que a comunidade associada pode ser vista como uma espécie de banco de fósforo
temporário para a cianobactéria (JIANG et al., 2007).
Em relação à captação de ferro, indispensável para a fotossíntese e para a fixação de
nitrogênio, entre outros processos, algumas bactérias associadas a cianobactérias são capazes
de adquirir esse elemento a partir de fontes diversas, e em taxas maiores que a cianobactéria à
qual se associam (ROE et al., 2012), e é possível que haja utilização pela cianobactéria de
parte do ferro captado por uma bactéria associada (BELIAEV et al., 2014). Esse fato é
importante tendo em vista que genes para sideróforos não são comuns em cianobactérias de
alguns ambientes (HOPKINSON; MOREL, 2009). Genes classificados no subsistema de
aquisição e metabolismo de ferro e sideróforos foram encontrados tanto no metagenoma da
comunidade associada como no genoma da linhagem cianobacteriana estudada, o que sugere
independência de ambas em relação às estratégias de obtenção desse elemento.
A variante microviridina J apresenta toxicidade a Daphnia (ROHRLACK et al., 2003;
2004). Dentre as dez variantes de microviridina que foram encontradas até o momento, as
variantes G e H foram descritas a partir de um espécime de Nostoc minutum (MURAKAMI et
al., 1997). A maior parte dos estudos de associações em ambientes naturais se concentrou em
florações de espécies de Microcystis, porém sequências de microviridina também foram
encontradas em trombólitos de Nostoc commune (GRAHAM et al., 2014). Alta expressão de
microviridina foi observada em uma floração de Microcystis, o que estimou-se não somente
contribuir para sua dominância competitiva, mas também conferir propriedades
antipredatórias à comunidade (PENN et al., 2014). Considerando que a associação com
determinadas espécies pode beneficiar certas cianobactérias e que o observado para
microviridina J poderia ser válido para outras variantes de microviridina, é provável que a
produção de microviridina por Nostoc sp. CENA67 constitua uma vantagem para os
micro-organismos que se associam a esta cianobactéria e que esta empregue microviridina no
recrutamento de simbiontes.
Ao passo que um número considerável de sobreposição entre vias foi observada no
mapeamento metabólico, alguns metabolismos sugerem a complementariedade entre vias
presentes exclusivamente na cianobactéria ou na comunidade associada. Como a maioria das
86
sequências cianobacterianas não foi identificada em subsistemas conhecidos e quase a metade
do metagenoma da comunidade associada foi identificado como proteínas desconhecidas, é
possível que fatores ainda não conhecidos expressos pelas células cianobacterianas possam
influenciar interações com seus micro-organismos associados. Da mesma maneira, fatores
incluídos no número considerável de proteínas desconhecidas e processos pouco
caracterizados no metagenoma associado podem desempenhar algum papel nessa interação.
De forma semelhante ao observado em raízes de plantas, certas actinobactérias
associadas a cianobactérias do gênero Nostoc promovem o crescimento desta como
consequência da produção de substâncias reguladoras de crescimento e de antibióticos, e
recebem nutrientes em troca desse serviço (INTHASOTTI; PATHOM-AREE, 2015). Na
rizosfera, a presença de micro-organismos sem função ecológica aparente é de certa forma
explicada pelo fato de que plantas podem digerir micro-organismos em suas raízes como
forma de obter nutrientes e promover crescimento (PAUNGFOO-LONHIENNE et al., 2010).
Ao passo que diversas bactérias são capazes de degradar células cianobacterianas para
consumo (RASHIDAN; BIRD, 2001), algumas cianobactérias, incluindo espécies de Nostoc,
são capazes de mixotrofia, ou a mistura de metabolismos autotróficos e heterotróficos, e
podem apresentar aumento de sua atividade antimicrobiana sob essa condição (NOWRUZI et
al., 2012). Logo, hipoteticamente, o estímulo do crescimento e o consumo e a predação de
ambas as partes da interação na cultura estudada poderia ocorrer.
Contudo, as interações entre a cianobactéria e sua comunidade associada
provavelmente são mais complexas que meras trocas de moléculas orgânicas, já que meios de
cultura acrescidos de extratos de cianobactérias não parecem causar impacto positivo sobre o
cultivo de bactérias associadas (INTHASOTTI; PATHOM-AREE, 2015). Flutuações na
composição da comunidade microbiana associada a cianobactérias ocorrem de acordo com o
período em que a colônia se encontra, e incluem a alternância da dominância (SHI et al.,
2009; 2011), o que provavelmente resulta em alterações na dinâmica dessa interação.
Em alguns casos, respostas ao estresse oxidativo podem desempenhar um papel nas
interações entre cianobactérias e bactérias heterotróficas (MORRIS et al., 2008). De fato,
algumas cianobactérias têm seu crescimento estimulado pelo cocultivo com
bactérias heterotróficas não somente devido ao aumento da concentração do dióxido de
carbono ou à captura de refugos de ciclagem, mas também à redução do estresse oxidativo
(BELIAEV et al., 2014; SHER et al., 2011). Além disso, é possível que fatores físicos e
morfológicos tenham influência sobre a associação entre a cianobactéria e os
87
micro-organismos heterótrofos. Cianobactérias aquáticas se beneficiam de agregados
microbianos por estes lhes conferirem proteção contra radiação ultravioleta, calor e ozônio
(TANG; DZIALLAS; GROSSART, 2011), e interações com micro-organismos associados
podem ser responsáveis por induzir a produção de mucilagem e modificar as características
morfológicas de colônias de cianobactérias (SHEN et al., 2011). Algumas bactérias podem ter
conexões ainda mais fortes com exopolissacarídeos que com as células das cianobactérias que
os secretam (SHIRAISHI et al., 2015).
Por ser unicianobacteriano e conter os resultados de anos de cultivo, a cultura estudada
proporciona um objeto de estudo com menor número de variáveis que interações observadas
em ambientes naturais. Contudo, dada a complexidade e a diversidade das associações entre
autótrofos e heterótrofos e em vista do alto número de sequências anotadas em funções
desconhecidas, é difícil assegurar neste momento o que Nostoc sp. CENA67 poderia ganhar
com as interações com sua comunidade associada. É necessário que as sequências e as
anotações em bancos de dados públicos se tornem mais abrangentes antes que esta questão
seja respondida.
88
7. CONCLUSÕES
A linhagem CENA67 diverge em certos aspectos de outras linhagens identificadas no
gênero Nostoc, e pode ser representante de um novo táxon. Contudo, devido ao atual baixo
número de linhagens conhecidas relacionadas, é difícil assegurar sua posição taxonômica,
sendo necessário isolar novas cianobactérias relacionadas a essa linhagem para que suas
relações evolutivas sejam esclarecidas e permitam uma descrição adequada desse táxon. Essa
distinção é refletida em seu genoma, que é significativamente distinto dos genomas
atualmente disponíveis de Nostoc spp. Consequentemente, o genoma dessa linhagem
apresenta diversos agrupamentos gênicos hipotéticos possivelmente envolvidos na síntese de
metabólitos ainda desconhecidos ou de novas variantes de moléculas conhecidas, incluindo
grande variedade de microviridinas. Um alto número de micro-organismos associados à
cianobactéria em cultura não axênica pertence a táxons comumente relatados em interações
com plantas, que têm à sua disposição neste ambiente não apenas o carbono fixado que
receberiam destas, mas também nitrogênio biodisponível. Essa condição parece estar
sujeitando algumas das populações bacterianas heterotróficas a pressões de seleção que as
levam a se adaptar pela eliminação de vias custosas que se tornaram redundantes, como a
fixação de nitrogênio, e as tornar mais dependentes da cianobactéria, tornando a axenia da
cianobactéria ainda mais difícil de ser alcançada. O baixo conhecimento a respeito da
genômica funcional de cianobactérias e de micro-organismos associados, refletido no alto
número de funções desconhecidas encontrado, não deixa claro se outros fatores desempenham
algum papel nessa interação.
89
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