Genômica e Proteômica

Genômica e Proteômica

O que é Genômica ?

Subdivisão da genética de mapeamento, sequenciamento e análise do funcionamento de genomas inteiros (Thomas Roderick, 1986)

Revista Genômica

1) Estrutural

2) Funcional

Visa a caracterização física do genoma

Caracterização do Transcriptoma (transcritos produzido) Caracterização do Proteoma (proteínas codificadas)

1) Genômica Estrutural

Atribuição de loci a cromossomos

específicos

localização destes loci nos cromossomos

obtenção das sequências

nucleotídicas destes loci

Mapas Cromossômicos: Níveis crescentes de resolução

Genômica e Proteômica

1) Genômica Estrutural

Mapeamento Meiótico por Recombinação

Inicialmente utilizava-se marcadores fenotípicos qualitativos

Limitações: - precisa realizar cruzamentos controlados - necessidade de obtenção de um grande número de descendentes

É aplicado principalmente a organismos experimentais (Drosophila, Arabidopsis, Neurospora, etc)

Nestes organismos, existem muitos marcadores fenotípicos já mapeados

Entretanto, intervalos entre marcadores ainda era grande

Intervalos não podiam ser mapeados por análise de ligação pois não haviam outros marcadores nestas regiões

Baseado na análise da frequência de recombinantes

Genômica e Proteômica

Marcadores Moleculares

Sítio de heterozigose para algum tipo de variação neutra de DNA Preenchem os intervalos entre os marcadores fenotípicos

RFLPs (Restriction Fragment-Length Polymorphisms)

Minissatélite

Microssatélite

RAPDs (Randonly Amplified Polymorphic DNAs)

AFLPs (Amplified Fragment-Length Polymorphisms)

SSCPs (Single-Strand Conformational Polymorphisms)

DGGEs (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

SNPs (Single Nucleotide Polymorphysms)

1) Genômica Estrutural

Mapeamento Meiótico por Recombinação

Ex. 1: Uso de marcadores Microssatélite

Genômica e Proteômica

1) Genômica Estrutural

Posicionamento de loci em Mapas Citológicos:

Hibridização in situ

Marcação com sonda radioativa (cromossomo politênico de

Drosophila)

Marcação com sonda fluorescente – FISH

(Cromossomo humano 11)

Mapeamento Físico

É assim chamado pois é obtido pela manipulação direta de fragmentos de DNA, material físico do genoma

Meta: identificar um conjunto de fragmentos clonados superpostos que englobem todo o cromossomo ou o genoma

Biblioteca genômica

RFLP

Grupos superpostos de clones (contigs)

Clones

1) Genômica Estrutural

Genômica e Proteômica

Mapeamento Físico

Ordenamento dos clones por clivagem com enzimas de restrição

1) Genômica Estrutural

Marcação com sonda fluorescente - FISH

Mapa Citológico cromossomo 11

Ordenamento dos clones por FISH

Mapa Citológico cromossomo 11

Marcação com sonda fluorescente – FISH(Cromossomo humano 11)

Mapeamento Físico: Ordenamento por FISH

1) Genômica Estrutural

Genômica e Proteômica

Mapa de Ultra-Estrutura: Sequenciamento

Estratégias:

1) Sequenciamento aleatório de clones:

2) Sequenciamento de clones ordenados

1) Genômica Estrutural

1) Sequenciamento aleatório de clones:

- DNA é fracionado e clonado aleatóriamente

- As pontas dos clones são sequenciadas

- As regiões sequenciadas são usadas para ordenar os clones

2) Sequenciamento de clones ordenados

clones em YAC ordenados

subclonagem em BACs

BACs são novamente ordenados (STS)

subclonagem de inserções menores

sequenciamento aleatório dos clones

Genômica e Proteômica

2) Genômica Funcional

Dados de sequências em larga escala são o começo da genômica funcional

Algumas das análises que podem ser feitas:

a) Caracterização do proteoma por análise de ORFs

b) Perturbação gênica por nocaute

c) Silenciamento gênico por Interferência do RNA

d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido

e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA

f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas

a) Caracterização do proteoma por análise de ORF (sequências abertas de leitura)

Softwares de previsão analisam as sequências de DNA

- Examinam os 6 possíveis quadros de leitura

- Buscam sequências com códons de início e término de tradução

- Análise da função da ORF através da busca por sequências homólogas em bancos de dados

Ex.: Distribuição provisória dos genes pode ser deduzida

Genômica e Proteômica

b) Perturbação gênica por nocaute

Investiga a função da ORF Inativação do gene (nocaute) por mutagenese in vitro procura de qualquer fenótipo mutante Mais da metade das ORFs inativadas não apresentam efeitos fenotípicos

c) Silenciamento gênico por interferência do RNA (RNAi)

Investiga a função da ORF Duplas fitas de RNA são reconhecidas e clivadas. Silencia o gene procura de qualquer fenótipo mutante

2) Genômica Funcional

Genômica e Proteômica

2) Genômica Funcional

d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido

Investiga a interação entre proteínas

Proteína GAL4 de leveduras tem 2 domínios: a) ligação ao DNA b) ativação

Genômica e Proteômica

Avalia a expressão gênica em organismos, tecidos ou células em diferentes situações fisiológicas ou patológica

Analisa o nível de expressão de milhares de genes simultaneamente

Necessita confirmação posterior por Northern-blotting ou RT-PCR Quantitativo.

e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA

2) Genômica Funcional

Genômica e Proteômica

Fusão traducional entre o gene de interesse e a proteína GFP

Monitora a sintese e localização de proteínas específicas in vivo

f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas

2) Genômica Funcional