Da Genômica ao MelhoramentoLuis E. Aranha Camargo

Dept. Entomologia, Fitopatologia e Zoologia AgrícolaESALQ/USPPiracicaba

Genômica

Ciência que analisa estrutura, composição e

funcionalidade de genomas

Sequenciamento

Análise estrutural

Análise comparativa

Análise funcional (várias abordagens: SAGE, microarranjos, RT-PCR, análise in silico, etc)

Objetivo:Identificar genes e suas funções

Grande volume de informação

Genômica

Mineraçãoou garimpagem

gene fenótipogenética vegetal

variação genética variação fenotípicamelhoramento vegetal

O melhorista objetiva relacionar variantes de um gene (alelos)com variaçõesem fenótipos de modo a identificar os melhores alelos

ESTsseqüências genômicas SAGE

proteômica análise de mutantes

bioinformática

FENÓTIPO

melhoristas usam uma variedade de estratégias para separar os efeitos

da variância genética da ambiental ...F = G + A

-se baseia na análise de médias e variâncias para selecionar melhoresgenótipos

-pouco se sabe sobre os genes que controlam a característica

-seleção baseada no somatório dos efeitos dos genes que controlam a característica

idéia é associar variações alélicas em certos genes candidatos com variações em fenótipos

idéia tornou-se palpável a partir do desenvolvimento da Genômica

mas o que são genes candidatos?

Efeito menor em maisina eresistência

Resistência a lagarta da espiga (McMullen et al., PNAS 95, 1998)

Efeito maior em maisinae resistência

Outros locos,efeito na

resistênciamas não em

maisina

Projetos ESTs são fontes de genes cadidadtos

TIGR Soybean Gene Index (GmGI)

PALperoxidades Lipoxigenase

Necessidade de conhecimento de vias metabólicas

Genes RPr proteínas

variedade resistente0% doença

variedade suscetível60% doença

pal atccctcatttggGatctaggtg atccctcatttggTatctaggtglox cggtacacgtttaccagggtcA cggtacacgtttaccagggtcGpr-1 ggcttgacatgcaaatcagga ggcttgacatgcaaatcaggaetc...

Associação de alelos com fenótipos (análise de ligação) – cruzamentos experimentais

Progênie de linhagens recombinantes é classificada de acordo com genótipos esperados no gene pal

genótiposparentais

em gene candidatos

genes candidatos

atccctcatttggGatctaggtg atccctcatttggTatctaggtg

Doença 17% 37%

Presença do alelo G a no locus pal está associada com uma reduçaõ de 54% na quantidade de doença

ProblemaProblema: a lista de genes candidatos ainda é pequena

pois a maioria das vias metabólicas que controlam características de importância agronômica é incompleta

e aqui é onde a Genômica Funcional entra…e aqui é onde a Genômica Funcional entra…para completar esta vias metabólicas por meio de uma série de

técnicas (genética reversa e direta, análise de expressão gênica via microarranjos, SAGE, e de bancos

de EST, etc.)

SAGE(aguardem…)

Hibridização in silico:auxílio na seleção de

marcadores candidatos

Comparações entre bibliotecas de ESTs geradas sob condições distintas podem servir

de base para identificar marcadores candidatos

inoculação Expressão de genes de resistência

Produtos dos genes estarãoPresentes na amostra de RNAm

Comparar com biblioteca feita de RNAm de planta não inoculada

27.1

20.4

11.9

9.9

6.8

6.1

5.9

3.0

2.7

2.7

1.6

0.9

0.8

0.3

19.9

19.6

10.9

11.7

8.6

7.2

9.0

2.7

2.4

3.9

1.4

1.1

1.4

0.1

0 5 10 15 20 25 30

Photosynthesis

Conserved of unknown function

General metabolism

Macromolecule metabolism

Low hit (E>10e-5)

Cellular process

No hit

Non-classified

Abiotic stress

Biotic stress

Signal transduction

Disease resistance related domains

Ubiquitination pathway

Retrotransposons

% of Bean ESTs

PVEPSE3PVEPLE1+ PVEPSE2

Comparação entre bibliotecas ESTs de feijoeiro geradas de plantas inoculadas ou não com Colletotrichum

inoculadanão inoc.

Genes candidatos para cruzamentosexperimentais

Expressão diferencial com Auxílio de arranjos

Hibridização em microarranjos(microarrays)

Permite estudar a expressão de vários genes de uma só vez

Genes são dispostos em lâminas ou “chips”

(Sanghyeob et al., 2004)(Gibly et al., 2004)

………………………………………………………………………………………………

Microchipcontendo

genes

RNAm de planta inoculada

RNAm de planta não inoculada

Expressão gênica diferencial

Síntese de cDNA e marcação commarcadores fluorescentes

cDNA

cDNA

hibridização

Genes somente expressos em plantas inoculadas

Gene somente expresso em plantas não inoculadas

Expressão em ambas situações

Análise de expressão gênica de indivíduos fenotipicamente distintos - descoberta de genes candidatos

e.g.- análise da expressão gênica de fenótipos extremos de uma população segregante

Schadt et al., Nature 2003, 422:297-302

Perfil de expressãoDiferenças em expressão gênica devem

Ser específicas ao fenótipo eGenótipo que separam os grupos

Genes candidatos

RNAmRNAm

EST

Vias metabólicas

SAGE

Análise in silico

SN

Ps

GENÔMICA

MELHORAMENTO

para análise de ligação em cruzamentos experimentais

Microarranjos

Sequenciamento genômico

Obrigado!

Luis E. Aranha Camargoleacamar@esalq.usp.br