EFEITOS DOS AGROTEFEITOS DOS AGROTÓÓXICOS XICOS SOBRE AS ABELHAS SEM SOBRE AS ABELHAS SEM

FERRFERRÃÃOOProfa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo

TakasusukiUniversidade Estadual de Maringá

Departamento de Biotecnologia, Genética eBiologia Celular

Colony Collapse Disorder (CCD)

• Final do ano de 2006 nos EUA - Milhares de colônias foram dizimadas – perdas consideráveis para a agricultura em função da falta de polinizadores.

• A Sindrome do Colapso das abelhas (CCD) corresponde ao desaparecimento repentino das abelhas ou a redução, em poucas semanas ou dias, do tamanho da colônia, mesmo na presença de crias, pólen e mel, porém sem deixar vestígios de morte de abelhas.

ProvProv ááveis causas para o desaparecimento das abelhas: veis causas para o desaparecimento das abelhas:

– Manejo das colônias - estresse– Ácaro Varroa destructor e patógenos associados– Desnutrição das abelhas – polinização de monoculturas

– acesso a somente um tipo de pólen de cada vez– pragas e patógenos recém-descobertos ou aumento de

virulência de patógenos existentes e interações entre duas ou mais das hipóteses acima

– Pesticidas

• Departamento de Agricultura dos EUA - Maio de 2013 a morte de quase 1/3 das abelhas

• Redução, em 6 anos, de 30,5% do número de colônias de abelhas nos EUA.

• Santa catarina – relatos do desaparecimento de um terço das 300.000 abelhas do Estado bateu asas em 2012

• Defensivos agrícolas, particularmente os pesticidas neonicotinoides, como uma das principais hipóteses para explicar o CCD.

ORGANOFOSFORADOS – Inibidores de acetilcolinaesterases

NEONICOTINOIDES – derivados da molécula de nicotina – age m nos receptores nicotínicos

FIPRONIL – grupo químico fenilpirazol - . Seu mecanismo de ação baseia-se no bloqueio pré e pós-sináptico da passagem dos íons cloro pelos neurotransmissores GABA, matando os parasitas por hiper-excitação

REGULADORES DE CRESCIMENTO - agem sobre a estrutura do tegumento dos insetos e sobre os mecanismos de controle da metamorfose e ecdise (troca de pele), atuando, principalmente, nas fases imaturas dos insetos.

HERBICIDAS�Novaluron - herbicida sistêmico seletivo de ação de pós - emergência�Paraquat - É um composto quaternário do amônio utilizado

como herbicida e altamente perigoso para os humanos, caso ingerido.

INSETICIDAS

Receptor nicotínico

Abelhas e res íduos de inseticidas

• Polinizadores de muitas espécies de plantas cultivadas e matas naturais

• As abelhas são responsáveis por 40 a 90% da polinização em áreas naturais

• O que acontece se esses insetos se contaminam com inseticidas ou outros compostos xenobióticos?

• O que acontece com a sua cria, o ninho ou colmeia e com os seus produtos que muitas vezes são utilizados por nós?

4 espécies de abelhas do gênero Tetragonisca• Tetragonisca buchwaldi – Costa Rica, Equador

e Panamá• Tetragonisca weyrauchi – restrita a Amazônia

• Tetragonisca angustula – Desde o M éxico até o sul do Brasil (n ão ocorre no Chile)

• Tetragonisca fiebrigi – Argentina, bolívia, Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paran á, Rio Grande do Sul, São Paulo), Paraguai

Quatro classes de agrotóxicos de acordo com a CL50 para abelhas:

•Classe 1- extremamente tóxicos CL50 > 2µg/abelha• Classe 2- altamente tóxicos CL50 entre 22µg e 10,99µg/abelha• Classe 3- moderadamente tóxicos CL50 entre 11µg e 100µg/abelha• Classe 4- pouco tóxicos CL50 < 100µg/abelha

(Larini, 1999; Hunt, 2000)

Toxicidade dos inseticidas medida CL50 (concentração letal que proporciona a morte de 50% da população)

Como os experimentos são montados

• Fizemos experimentos para estimar a CL50 em Apis mellifera contaminadas com inseticidas:

• Thiamethoxam (neonicotinoide): – A CL50 por ingestão foi de 4,7x10-5 a 10x1010-5 mg/mL

(0,000047 a 0,0001 mg/mL)– A CL50 por contato variou de 3,2 a 4,5 mg/mL– Aplicação por contato e por ingestão desse inseticida levou a

uma inibiinibi çãçãoo parcial da atividade relativa das esterases 1,2, 4 esterases 1,2, 4 e 5 e 5 das operárias – essas enzimas degradam compostos xenobióticos (estranhos ao organismo das abelhas)

• Organofosforados – methil-parathion e malathion– Com o malathion houve aumento aumento da atividade relativa da ESTEST--3 3

e inibiinibi çãção parcial da ESTo parcial da EST --4 4 . Com o metil-parathion inibiinibi çãção o parcial das ESTparcial das EST --3 e EST3 e EST--44

Abelhas jata í Tetragonisca angustula eTetragonisca fiebrigi

• Nesse estudo foram avaliadas as alterações ocorridas na expressão das esterases de abelhas do gênero Tetragonisca após contaminação com agrotóxicos

Perfil eletroforético das esterases em gel de poliacrilamida. A = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca fiebrigi e B = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca angustula.

A B

EST-2 EST-3

EST-4

EST-1

EST-4

+

Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiançaFipronil – contato 0,00062 0,00053 – 0,00075

Fipronil – ingestão 0,00123 0,00121 – 0,00127Malathion – contato 0,50 -----Malathion – ingestão 0,38 0,22 – 0,55

Nim - contato ----- -----Nim - ingestão ----- -----

Thiamethoxam -contato

0,79 0,61 – 1,04

Thiamethoxam –ingestão

0,21 0,17 – 0,27

Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca fiebrigi submetidas ao fipronil, malathion, Nim e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)

ConcentraçõesEsterases

EST-1 EST-2 EST-4Fipronil (%)

0,0001 - - -0,0005 - - -0,0006 - - -0,0007 - - -0,0011 - - -

Malathion (%)0,0017 - - -0,0018 - - -0,0019 - - -0,002 - - -0,004 - - -

Thiamethoxam (%) 0,7 - - -

0,8 - - -0,85 - - -0,9 - - ++1 - - -

Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca fiebrigiapós contato com fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (++) aumento de intensidade da banda

ConcentraçõesEsterases

EST-1 EST-2 EST-4Fipronil (%)

0,0011 - - -0,0012 + - +

0,00125 - - -0,0025 - - -0,025 - - -

Malathion (%)0,2 - - +0,3 - - -0,4 - - -

0,45 - - +0,5 - - -

Thiamethoxam (%)0,15 - - -0,2 - - -

0,22 - - -0,24 - - -0,5 - - -

Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca fiebrigiapós ingestão de fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

MalathionControle

EST-4

+

EST-3

Perfil eletroforético das esterases de extratos de cabeça/tórax de Tetragonisca angustula, mostrando a inibição parcial da EST-3 e EST-4, após contaminação por contato com o inseticida malathion na concentração de 0,003%.

Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiançaFipronil – contato 0,00053 0,00024 – 0,00064

Fipronil – ingestão 0,00056 0,00053 – 0,00059Malathion – contato 0,00315 -----Malathion – ingestão 1,33 0,54467 – 2,18486

Nim – contato ----- -----Nim – ingestão ----- -----

Thiamethoxam -contato

0,1622 0,06343 – 0,34581

Thiamethoxam –ingestão

0,2133 -0,00039 – 0,5357

Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca angustula submetidas ao fipronil, malathion, Nim e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)

ConcentraçõesEsterases

EST-3 EST-4Malathion (%)

0,0025 - +0,0028 - -0,003 + +0,004 - -

0,1 - -Thiamethoxam (%)

0,05 - -0,07 - -0,1 + +0,2 - -0,3 - -

Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após contato com malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

ConcentraçõesEsterases

EST-3 EST-4Malathion (%)

0,4 - -0,6 - -1 + +2 - +3 - -

Thiamethoxam (%)0,005 - -0,008 - -0,01 - -0,02 - -0,03 - -

Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após ingestão de malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

Herbicida Diluição (%) Concentração (g/ml)

Sanson 40 SCNicossulfuron 40 g/l

100 0,000375 0,00022550 0,0001510 0,000031 0,000003

Gramoxone 2001,1'−dimetil−4,4'−bipiri

dilio dicloreto (paraquat) 200g/l

100 0,001510 0,000151 0,000015

0,1 0,0000015

Análise de isoenzimas e citoquímica de Tetragonisca angustula and Tetragonisca fiebrigi

após contaminação com herbicide

Teste Concentração (%)

Concentração

(g/ml)

Mortas

Vivas % Indivíduos mortos

Controle(água

destilada) ---- 0 56 0

Sanson 40 SC®

(nicosulfuron)

1 0,000003 0 60 010 0,00003 4 57 6,550 0,00015 0 60 075 0,000225 4 46 8,0

100 0,0003 0 60 0Total 8 339

Controle(água

destilada)----

0 60 0

Gramoxone 200®

(paraquat)

0.1 0,0000015 0 40 01 0,000015 0 40 010 0,00015 0 40 0

100 0,0015 4 36 10,0Total 4 216

Mortalidade de T. angustula nos bioensaios com os herbicidas nicosulfuron (Sanson 40 SC®) e paraquat (Gramoxone 200®) após 24h de exposição.

Isoenzimas

Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-3 EST-4

Nicosulfuron (%)

1% + + + + +

10% + + + + +

50% + + + + +

75% + + + +- +-

100% + + + +- +-

Paraquat (%)

0,1% + + + + +

1% + + + +- +-

10% + + ++ - -

100% + + ++ - -

Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. angustula após contato com Nicosulfuron e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão.

Experimentos por longo tempo com Tetragonisca angutula

• Contaminação por contato com inseticidas reguladores de crescimento:– Natuneem e azamax – azadiractina – atua no

hormônio ecdisona (hormônio de muda)– Galaxy – novaluron – inibe a síntese de

quitina

• Utilizando papel filtro embebido no inseticida

• Análises feitas após 48, 120, 168 horas, 30 e 60 dias.

Azadiracta indica – nome popular nim ou amargosa

Inseticidas utilizados Concentrações em %

Gallaxy EC 100 0,5%

6,25%

10%

NatuNeem 0,5%

2,5%

100%

AzaMax 1%

5%

Scaptotrigona bipunctata -tubuna

• Testes por contato com natuneem –regulador de crescimento– Apresentou baixa toxicidade para as S.

bipunctata

– Não houve alteração na expressão das esterases

– Mas houve alteração em nível de cromatina, indicando que outras enzimas e proteínas aumentaram sua expressão após a contaminação

NatuNeem 0,5%

NatuNeem 2,5%

AzaMax1%

AzaMax5%

Gallaxy 0,5%

Gallaxy 6,25%

48 horas

s.a. + - s.a. s.a. s.a.120 horas

s.a. n.e s.a. s.a. s.a. n.e

168 horas

n.e n.e s.a. s.a. n.e n.e

30 dias - n.e n.e n.e s.a. n.e60 dias s.a. n.e + s.a. + n.e

Análise da intensidade relativa da esterase EST-4 em Tetragonisca angustula, após a contaminação por NatuNeem. Legenda: - = inibição parcial; + = aumento da atividade relativa; s.a. = sem alteração; n.e. = não estimado

Atualmente estamos realizando testes para verificar possíveis alterações na expressão

gênica em Tetragonisca angustula utilizando técnicas de PCR quantitativo em tempo real

– analisando a expressão de genes de estresse.

• Os resultados obtidos em relação a mortalidade das abelhas Tetragonisca submetidas a contaminação com inseticida thiamethoxam (neonicotinoide) e organofosforado, mostraram que há uma correlação dose resposta – Ou seja, quanto maior a quantidade de

inseticida utilizado maior a mortalidade das abelhas

• As Tetragonisca fiebrigi são mais suscetíveis aos inseticidas testados que as Tetragonisca angustula

• Os inseticidas reguladores de crescimento também causam alterações na expressão de enzimas esterases (detoxificação do organismo das abelhas) de Tetragonisca angustula mesmo depois de 60 dias da contaminação

Resultados iniciais tem mostrado que S. bipunctata são mais tolerantes ao inseticida

natuneem que as abelhas T. angustula.

Obrigada!