UNIVERSIDADE DO OESTE PAULISTA-UNOESTECURSO DE FARMÁCIA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DO EXTRATO DE ROMÃ Punica granatum L. NO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS

PRESIDENTE PRUDENTE2015

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DO EXTRATO DE ROMÃ Punica granatum L. NO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS

Projeto de Pesquisa apresentado ao Comitê de Ética da Universidade do Oeste Paulista – Unoeste Presidente Prudente, sob orientação do professor Decio.

Presidente Prudente2015

Conteúdo1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................................4

1.1 APRESENTAÇÃO DO TEMA..........................................................................................4

1.2 PROBLEMA..........................................................................................................................5

1.3 JUSTIFICATIVA....................................................................................................................6

1.4 OBJETIVOS..........................................................................................................................6

1.4.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................................6

1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................................7

2. REFERENCIAL TEÓRICO........................................................................................................7

2.1 TUMOR DE EHRLICH..........................................................................................................7

2.2 PLANTAS MEDICINAIS.......................................................................................................9

2.3 ROMÃ.................................................................................................................................10

2.4 IMPORTANCIA FITOTERAPICA DA ROMÃ......................................................................11

2.5 PROPRIEDADES MEDICINAIS.........................................................................................11

3. METODOLOGIA......................................................................................................................12

3.1 TIPO DE PESQUISA..........................................................................................................12

3.2. EQUIPAMENTOS..............................................................................................................13

3.3 OBTENÇÃO E PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA ROMÃ..........................................13

3.4 INOCULAÇÃO DO TUMOR...............................................................................................13

3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA ROMÃ.................................................14

3.6 DETERMINAÇÃO DO NUMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS................................................14

3.7 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR................................................................14

3.8 AVALIAÇÃO DA MEDULA ÓSSEA....................................................................................14

4. RECURSOS.............................................................................................................................15

4.1 RECURSOS FÍSICOS........................................................................................................15

4.2 RECURSOS HUMANOS....................................................................................................15

4..3 RECURSOS MATERIAIS..................................................................................................15

4.4RECURSOS FINANCEIROS...............................................................................................16

5. CRONOGRAMA......................................................................................................................17

6. REFERÊNCIAS........................................................................................................................18

1. INTRODUÇÃO

1.1 APRESENTAÇÃO DO TEMA

O termo neoplasia pode ser compreendido como proliferação celular anormal,

autônoma e descontrolada, as células diminuem ou perdem a capacidade de

diferenciação, resultando em alterações nos genes reguladores do crescimento e

diferenciação celular (FILHO, PEREIRA, GUIMARÃES, 2004).

O câncer também conhecido como neoplasia é uma doença de natureza crônica

que possuem como característica em comum o crescimento desordenado de células

que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo.

As células cancerosas se replicam rapidamente e possuem a tendência de ser muito

agressivas e incontroláveis as que determinarão a formação de tumores ou neoplasias

malignas. O principal objetivo do tratamento das neoplasias é obter a completa

irradiação de células tumorais, podendo ser realizado através de cirurgias que é o meio

simples e seguro para remover tumores sólidos. E pode ser obtido por quimioterapia,

um tratamento que envolve o uso de fármacos citotóxicos, e por radioterapia que pode

ser curativa para tumores localizados. (KUMAR; COTRAN, 2000)

No Brasil, as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam a ocorrência de

aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não

melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. Sem os casos de

câncer da pele não melanoma, estima-se um total de 385 mil casos novos. Os tipos

mais incidentes serão os cânceres de pele não melanoma, próstata, pulmão, cólon e

reto e estômago para o sexo masculino; e os cânceres de pele não melanoma, mama,

colo do útero, cólon e reto e glândula tireoide para o sexo feminino. (INCA,2012)

Segundo dados do Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2011) a doença já é a

segunda causa de morte no Brasil. A OMS alerta para o fato de que se não forem

tomadas medidas de prevenção a incidência de câncer aumentará em 100% nos

próximos 20 anos ( BRASIL, 2003).

1.2 PROBLEMA

A utilização de produtos naturais como terapia é muito antiga e por muito tempo

foi o único arsenal terapêutico disponível. Com a Revolução Industrial e com a

descoberta da Indústria Química, as plantas foram caindo em desuso e os produtos

químicos ganharam força de uso, um dos fatores que facilitou essa mudança de hábitos

foi a facilidade de obtenção de compostos puros, facilidade de utilização e pelo grande

poder da Industria Farmacêutica (RATES, 2001).

Vale ressaltar que no Brasil, a utilização de plantas medicinais é também

difundida e ampliada pela crise econômica que afeta o país, coligada ao difícil acesso

da população à assistência médica e farmacêutica, elevado custo dos medicamentos

industrializados e a crescente tendência dos consumidores a utilizarem produtos

naturais decorrente de uma “consciência ecológica” estabelecida nos últimos anos

(SILVEIRA, BANDEIRA, ARRAIS, 2008).

Sabe-se que ainda há grande número de plantas medicinais utilizadas em todo o

mundo, por todas as idades e para diversos fins, mesmo sem a devida comprovação

científica de sua ação farmacológica.

Considerando que o Brasil possui a flora mais rica do mundo em matéria prima

para a produção de fitofármacos (cerca de 1/3 do total) e que apenas cerca de 8%

foram estudadas, é de suma importância que se busque nestas plantas uma fonte

alternativa de medicamentos, visando no futuro a obtenção de novos fármacos mais

eficazes e específicos ( BRAZ- FILHO, 1994; SIMÕES etal ., 1999).

1.3 JUSTIFICATIVA

O câncer constitui a segunda causa de mortes por doença no mundo considerado

problema de saúde pública.

Os tratamentos atuais não são totalmente eficazes na maioria dos cânceres com

efeitos colaterais e reações adversas intensas.

As plantas medicinais são amplamente utilizadas, por diversos motivos, utilizadas

para diversos fins, que variam de preventivo a curativo. Em diversas regiões as plantas

medicinais são uma das principais formas de tratamento, onde a população utiliza por

muitas vezes de forma errônea, com preparo e quantidades inadequadas, e sem saber

se o efeito biológico é comprovado.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade antitumoral do extrato bruto de romã em camundongos com

TAE.

1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar se a planta púnica granatum L. modifica o desenvolvimento do tumor

ascítico de Ehrlich (TAE) em camundongos.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera a quantidade de volume

ascítico de animais portadores do tumor ascítico de Ehrlich.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera a quantidade de células totais e

tumorais da cavidade peritoneal.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera o número total das celulas na

medula óssea.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera o número dos leucócitos

sangüíneos totais e diferenciais dos animais com tumor.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 TUMOR DE EHRLICH

O tumor de Ehrlich foi introduzido por Erlich em 1886 e descrito em 1906 como

um carcinoma mamário de camundongos fêmeas. Inicialmente, o tumor foi

desenvolvido experimentalmente sob a forma solida, sendo então transplantado em

animais da mesma espécie. Em 1932, com Loenwnthal & Jahn , surgiu em forma

ascitica, ou seja, aquela que se desenvolve no peritônio de animais inoculados com

células tumorais (GUERRA, 1983).

A indução experimental dessa neoplasia em camundongos é feito por intermédio

do transplante das células tumorais retiradas de um animal já com a neoplasia

desenvolvida. Essa inoculação poderá ser feita diretamente no peritônio do receptor,

levando ao desenvolvimento da forma ascitica, diretamente no subcutâneo ou no

coxim plantar, ambas as localizações levando a formação do tumor solido. No exame

microscópio da forma ascitica, após o 7 dia já é possível observar expressivo

crescimento da massa tumoral, um fluido discretamente viscoso e de aspecto leitoso,

na qual continua crescendo: após o décimo dia de inoculação intraperitoneal do

tumor, cerca de 90% das células são tumorais. Pode-se observar a migração das

células para os linfonodos regionais. O tumor possui células inflamatórias, estroma

escasso e alto índice mitótico e de invasidade: constituindo um excelente

instrumento didático para o entendimento do comportamento dos tumores malignos

(GERRA, 1983)

O tumor de Ehrlich possui capacidade de crescimento em quase todas as

linhagens de camundongos, provavelmente porque durante o processo de

transformação maligna suas células perderam os antígenos de histocompatibilidade

H-2 (CARRY, 1979). É um tumor considerado pouco imunogênico, pois não expressa

moléculas de MHC de classe II. Devido a sua baixa imunidade, esta neoplasia

apresenta crescimento bastante agressivo, com proliferação celular acelerada e

invasão de tecidos adjacentes. A virulência do tumor de Ehrlich não é alterada pela

linhagem do camundongo utilizada, porém cada linhagem apresenta uma reação

imunológica específica à presença do tumor, fato que altera a sobrevida de acordo

com a linhagem utilizada (KODAMA & KODAMA, 1975).O tumor de Ehrlich é bom

modelo para estudos envolvendo citologia, por crescer na forma ascítica, o que

permite a obtenção de células tumorais isoladas (HOSSNE, 2002)

Histologicamente, o tumor de Ehrlich apresenta extensas áreas de necrose.

Estas são oriundas da morte das células neoplásicas, a qual é bastante intensa já na

primeira semana pós-inoculação. Intensa atípica e células extremamente anaplásicas

são comumente vistas por toda a lâmina. O tumor possui poucas células

inflamatórias e estroma escasso. Alto índice mitótico e de invasividade caracterizam

essa neoplasia, a qual constitui excelente instrumento didático para o entendimento

do comportamento dos tumores malignos. ( DAGLI, 1989)

2.2 PLANTAS MEDICINAIS

Desde tempos remotos, o homem busca, na natureza, recursos que melhorem

sua condição de vida para assim aumentar suas chances de sobrevivência pela

melhoria de sua saúde (BRASIL, 2006).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 85% das pessoas do mundo

utilizam plantas medicinais para tratar da saúde

(OLIVEIRA;SIMOES:SASSI,2006).Nesse sentido, visando á diminuição do numero de

excluídos dos sistemas governamentais de saúde, a OMS recomenda aos órgãos

responsáveis pela saúde publica de cada país, que: a) procedam o levantamento

regionais das plantas e identifique-as botanicamente; b) estimulem e recomendem o

uso daquelas que tiverem comprovadas sua eficácia e segurança terapêutica; c)

desaconselhem o emprego das praticas medicina popular consideradas prejudiciais; d)

desenvolvam programas que permitam cultivar e utilizar as plantas selecionadas na

forma de preparações dotadas de eficácia, segurança e qualidade

(LORENZI&MATOS,2008).Um estudo realizado pelo RENISUS-Relação Nacional de

Plantas Medicinais, divulgada pelo Programa Nacional de Plantas Medicinais e

Fitoterápicos do Ministério da Saúde teve como objetivos orientar a elaboração de uma

relação de fitoterápicos disponíveis para o uso da população, com segurança e eficácia

para o tratamento de determinadas doenças. Neste estudo, foram analisadas 71

espécies de plantas medicinais e dentre elas, encontra-se a romã, P. granatum

(MINISTERIO DA SAUDE, 2009).

O uso de plantas medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças tem

sido descrito por muitos povos desde os tempos mais remotos. Devido a esse uso,

surgiram interesses comerciais e científicos e, por isso, tornou-se necessária a

avaliação da eficácia e segurança dessas plantas. Para muitos, o conceito de natural

significa a ausência de produtos químicos, que são aqueles que podem representar

perigo. Esse conceito é equivocado, já que muitas plantas contêm substâncias com

ações tóxicas sobre organismos vivos. A função dessas substâncias para os produtores

é de defesa contra predadores, por isso não é de surpreender que muitas plantas

acumulem substâncias de elevada toxicidade (MENGUE et al., 2001).

As plantas medicinais desempenham papel importante na medicina, na indústria

e na economia, uma vez que podem fornecer fármacos extremamente importantes e

difíceis de serem obtidos através da síntese química. As fontes naturais fornecem

compostos que podem ser levemente modificados, tornando-os mais eficazes ou

menos tóxicos. Diante da grande importância dos fitoterápicos, verifica-se que vários

países da Europa (dentre eles Alemanha e França), estão intensificando esforços para

unificar a legislação que regulamenta a comercialização dos fitoterápicos. Entretanto,

nos Estados Unidos, a grande maioria das preparações que possuem derivados de

plantas medicinais pode ser comercializada livremente por ser classificada como

suplementos nutricionais. Esta classificação faz com que não seja necessário submeter

dados de segurança e eficácia destes produtos ao órgão regulamentador Food and

Drug Administration (FDA) (TUROLLA e NASCIMENTO, 2006).

2.3 ROMÃ

Punica granatum L.,ou popularmente denominada de romãzeira,pertencente á

família Punicaceae,é um arbusto ramoso ou arvoreta de até 3m de altura,com folhas

simples,cartáceas, dispostas em grupos de 2 ou 3, de 4-8 cm de

comprimento.Contem flores solitárias, constituídas de corola vermelho-alaranjada e

um cálice esverdeado, duro e coriácio. Frutos de tipo baga, globoides, medindo até

12 cm, com numerosas sementes envolvidas por um arilo róseo, cheio de um liquido

adocicado. É, muito provavelmente, originaria da Ásia e espalhada em toda região do

Mediterrâneo, sendo cultivada em quase todo mundo, inclusive no Brasil

(LORENZI&MATOS, 2008).

2.4 IMPORTANCIA FITOTERAPICA DA ROMÃ

Conforme estudos realizados por LORENZI & MATOS (2008), a analise

fotoquímica da romãzeira registra a presença de até 28% de taninos gálicos na

casca do caule e dos frutos e, em menor quantidade, nas folhas; nas sementes 7%

de um óleo essencial, que entre seus ácidos graxos esta principalmente o acido

punícico.

Atualmente muitos trabalhos científicos são feitos estudando as propriedades

medicinais da romãzeira. No entanto, há ainda poucos estudos etnobotânicos, de

farmacognosia e toxicológicos suficientes para elucidar os mecanismos de ação e

efeitos dos constituintes químicos derivados da romã(MACHADO et al.,2003)

2.5 PROPRIEDADES MEDICINAIS

Com o objetivo de pesquisar o uso tradicional de plantas medicinais usadas em

Ladakh, na Índia, BALLABH et al.(2008) coletaram informações de 105 aldeias onde

fazem uso de varias espécies de plantas, incluindo P. granatum, contra distúrbios

renais e urinários. Os resultados mostraram a eficácia dos sistema tradicional da

medicina para estes povos.

A avaliação da toxicidade do extrato da P. granatum realizada por WERKMAN

(2009) por meio de cultura celular com duas linhagens: fibroblastos humanos de

mucosa oral e células de carcinoma epidermoide. Os resultados mostraram que op

extrato inibiu a citoxicidade celular nas concentrações 0,5%, 0,25%, 0,125% e

0,031%. Esses resultados estão relacionados com a propriedade anticarcinogenica

da romã.

Estudos in vitro realizados por DAI et al. (2010) demonstram que o extrato da

romã inibe a proliferação do câncer mamário. Os dados sugerem que o extrato é um

suplemento dietético e tem futuro no tratamento de câncer de mama.

A atividade citotóxica de P. granatum foi avaliada por OLIVEIRA ET AL.(2010).

Os resultados revelaram que o extrato possui potencial antitumoral in vitro e in vivo.

3. METODOLOGIA

3.1 TIPOS DE PESQUISA

Pesquisa Experimental

Serão utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) fêmeas, pesando

entre 30-80g provenientes do Biotério da Unoeste, divididos em 3 grupos e cada grupo

acomodado em 3 gaiolas.

Os animais serão mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, em temperatura

entre 22 e 25°C, com água a vontade e ração ad libitum. Os nossos protocolos para

experimentos com animais serão projetados de maneira que o animal tenha o mínimo

de sofrimento possível e com limite de animais sacrificados. Os procedimentos

adotados com os animais seguirão os Princípios Éticos, de acordo com a resolução

1000 de 11/05/2012 do Conselho Federal de Medicina Veterinária. Os protocolos para

experimentos com animais serão projetados de maneira que o animal tenha o mínimo

de sofrimento possível e com limite de animais sacrificados. Após o experimento os

animais serão sacrificados por inalação, com a substância inalatória anestésica

isoflurano, com posterior deslocamento da coluna cervical, a fim de minimizar

sofrimento dos animais.

3.2. EQUIPAMENTOS

Balança analítica (Bel Engineerring®);

Leitora de Elisa ( LabsystemsMultiskan MS®);

Centrífuga de eppendorff;

Espectrofotômetro (Digimed® DME 21)

3.3 OBTENÇÕES E PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA ROMÃ

Os extratos serão preparados no Laboratório de Pesquisa da Universidade do

Contestado, segundo as recomendações da Farmacopeia Brasileira 2ª edição (1959) e

adaptações de SILVA et al. (2006) e SILVA (2008).

Os extratos etanolicos serão obtidos a partir da folhas e frutos fresco pelo

processo de maceração a frio. Serão utilizadas 500g de cada material vegetal

dissolvido em álcool etílico.

Inicialmente, as folhas e os frutos serão devidamente selecionados, higienizadas,

pesadas em balança eletrônica e acondicionadas em vidros com tampa rosqueada por

quatorze dias com o solvente extrator, sendo agitados periodicamente. Após esse

período, o extrato será filtrado, e levado a secura em banho-maria para a evaporação

do solvente.

3.4 INOCULAÇÕES DO TUMOR

Será inoculado na cavidade peritoneal 0,2ml de tumor ascítico, nele contendo

5x106 células tumorais em cada camundongo.

3.5 AVALIAÇÕES DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA ROMÃ

Os animais serão tratados com o extrato etanolico de romã via oral pelo método

de gavagem.

3.6 DETERMINAÇÃO DO NUMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS

O número total de células será determinado através da contagem em câmara de

Neubauer, usando o microscópio óptico. Para a viabilidade celular as células serão

diluídas em corante vital azul de Tripan.

3.7 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR

Os animais serão separados em três grupos. Todos receberão 5X106 células

tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle receberá o veículo de diluição do

extrato e o grupo tratado receberá os extrato da planta diluído no mesmo veículo por

gavagem 2 X ao dia por 7 dias.

Para determinar o crescimento do tumor será avaliado o peso dos camundongos

no 1º e no 8º dia do experimento. A cavidade peritoneal será lavada (após a morte do

animal) com 5 mL de salina, sendo determinado o volume do recolhido e o número de

células contidas neste volume.

A contagem será determinada em câmara de Neubauer ao microscópio óptico.

3.8 AVALIAÇÕES DA MEDULA ÓSSEA

Para avaliar a medula óssea será extraído o fêmur de cada animal, sendo que as

suas extremidades serão seccionadas de maneira que todos tenham a mesma medida

de aproximadamente 1 cm de comprimento. O canal interno de cada fêmur será lavado

com 3 mL de soro fisiológico e o líquido resultante será corado com cristal violeta. A

contagem será realizada em câmara de Neubauer.

4. RECURSOS

4.1 RECURSOS FÍSICOS

O preparo do extrato da graviola será realizado no Laboratório da Unoeste.

Todos os experimentos comportamentais e bioquímicos serão realizados no laboratório

de pesquisa da mesma instituição.

4.2 RECURSOS HUMANOS

Este trabalho será realizado por um grupo de pesquisadores do curso de

Farmácia e um professor orientador.

4..3 RECURSOS MATERIAIS

Pipetas volumétricas de vidro e pipetas automáticas;

Tubos de ensaio;

Estante para tubos de ensaio;

Placas de Petri;

Bastão de vidro;

Balão volumétrico;

Becker;

Balança analítica (Bel Engineerring®);

Leitora de Elisa – LabsystemsMultiskan MS

Material cirúrgico;

4.4RECURSOS FINANCEIROS

Considerando que todos os equipamentos e reagentes que serão utilizados já

fazem parte dos recursos permanentes da Unoeste, e encontram-se disponíveis para

utilização, estima-se que não será necessário investimento financeiro para execução

deste projeto.

5. CRONOGRAMA

mês

2015 2015 2015

Preparo do

extrato de romã

X

Avaliação da

dose terapêutica

do extrato de

romã

X

Avaliação do

efeito antitumoral

do extrato de

romã X

Revisão

bibliográfica X X X

Análise

estatística X X X

Elaboração do

Relatório

x x

X

6. REFERÊNCIAS

BALLABH,B.et AL.Traditional medicinal plants of cold desert Ladakh-used against kidney and urinary disorders.Journal of Ethonopharmacology, v.118, n.2, p.331-339, jul, 2008.

BRASIL. Ministério da Saúde: INCA. Estimativa da Incidência e Mortalidade por Câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 2007. Disponível em:http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/index.asp?ID=2

BRASIL. Ministerio da Saude. Secretaria da Ciencia. Tecnologia e insumos estratégicos.Departamento de assistência farmacêutica. A fitoterapia no SUS e o programa de pesquisa de plantas medicinais da central de medicamentos. Ministerio da saúde Brasilia, 2006. Disponivel em : < http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicaçoes/fitoterapia_no_sus.pdf>.Acesso em 20/10/2010.

BRASILEIRO FILHO, G. Bogliolo: Patologia. 6 ed. Belo Horizonte: Guanabara Koogan, 2000.

BREHMER, Juliane Seleme. Estudo de extrato de plantas medicinais no desenvolvimento do tumor ascítico de Ehrlich. 2005 72 f. Dissertação–Universidade do vale do Itajaí Centro de ciências da saúde, 2005. http://siaibib01.univali.br/pdf/Juliane%20Seleme%20Brehmer.pdf Acesso em: 08 de agosto de 2013

COTRAN, R.S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S.L. Patologia estrutural e funcional. 6.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. p.1400.

DAGLI, M. L. Z. Disseminação linfática do tumor de Ehrlich: estudo experimental. São Paulo: 1989. Tese (Doutorado em Patologia Experimental e Comparada). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo.

DAI,Z ET AL. Pomefranate extract inhibits the proliferation and viability of MMTV-Wnt-1 mouse mammary câncer stem cells in vitro. Oncology Reports, v.24, n.4, p.1087-1091, oct, 2010

FILHO, Geraldo Brasileiro;PEREIRA, Fausto Edmundo Lima;GUIMARÃES,Romeu Cardoso. Disturbios do Crescimento e da Diferenciação Celular. In: Patologia Geral. 3 ed. Rio de Janeiro:Guanabara Koogan S.A, 2004, p.173-234

GUERRA,J.L. Aspectos do processo inflamatorio em camundongos. Ed portadores do tumor de Erlich. São Paulo, 1983. Tese de doutorado – FMVZ da Universidade de São Paulo.

LORENZI,H. & MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exoticas, 2

ed., p.350-351. São Paulo, 2008.

MACHADO, T.B et al. In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring

naphthoquinones and their analogues, against methicillin-resistant Staphilococcus

aureus. International Journal of Antimicrobial Agents, v.21, n.3, p.279-284,2003

MINISTERIO DA SAUDE. Portal da saude. MS elabora Relação de Plantas Medicinais

de Interesse ao SUS, fev., 2009. Disponivel em :

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OLIVEIRA, M.J.R.; SIMOES, M.J.S; SASSI, C.R.R. Fitoterapia no Sistema de Saude

Publica (SUS) no Estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Plantas

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WERKMAN, C. Citotoxicidade da Punica granatum L. (romak) sobre cultura de

fibroblastos e de células de linhagem cancerígena. Tese apresentada a Universidade

Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São Jose dos Campos, s.n, p.115,

2009