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UNIVERSIDADE DO OESTE PAULISTA-UNOESTECURSO DE FARMÁCIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DO EXTRATO DE ROMÃ Punica granatum L. NO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS
PRESIDENTE PRUDENTE2015
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DO EXTRATO DE ROMÃ Punica granatum L. NO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS
Projeto de Pesquisa apresentado ao Comitê de Ética da Universidade do Oeste Paulista – Unoeste Presidente Prudente, sob orientação do professor Decio.
Presidente Prudente2015
Conteúdo1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................................4
1.1 APRESENTAÇÃO DO TEMA..........................................................................................4
1.2 PROBLEMA..........................................................................................................................5
1.3 JUSTIFICATIVA....................................................................................................................6
1.4 OBJETIVOS..........................................................................................................................6
1.4.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................................6
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................................7
2. REFERENCIAL TEÓRICO........................................................................................................7
2.1 TUMOR DE EHRLICH..........................................................................................................7
2.2 PLANTAS MEDICINAIS.......................................................................................................9
2.3 ROMÃ.................................................................................................................................10
2.4 IMPORTANCIA FITOTERAPICA DA ROMÃ......................................................................11
2.5 PROPRIEDADES MEDICINAIS.........................................................................................11
3. METODOLOGIA......................................................................................................................12
3.1 TIPO DE PESQUISA..........................................................................................................12
3.2. EQUIPAMENTOS..............................................................................................................13
3.3 OBTENÇÃO E PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA ROMÃ..........................................13
3.4 INOCULAÇÃO DO TUMOR...............................................................................................13
3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA ROMÃ.................................................14
3.6 DETERMINAÇÃO DO NUMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS................................................14
3.7 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR................................................................14
3.8 AVALIAÇÃO DA MEDULA ÓSSEA....................................................................................14
4. RECURSOS.............................................................................................................................15
4.1 RECURSOS FÍSICOS........................................................................................................15
4.2 RECURSOS HUMANOS....................................................................................................15
4..3 RECURSOS MATERIAIS..................................................................................................15
4.4RECURSOS FINANCEIROS...............................................................................................16
5. CRONOGRAMA......................................................................................................................17
6. REFERÊNCIAS........................................................................................................................18
1. INTRODUÇÃO
1.1 APRESENTAÇÃO DO TEMA
O termo neoplasia pode ser compreendido como proliferação celular anormal,
autônoma e descontrolada, as células diminuem ou perdem a capacidade de
diferenciação, resultando em alterações nos genes reguladores do crescimento e
diferenciação celular (FILHO, PEREIRA, GUIMARÃES, 2004).
O câncer também conhecido como neoplasia é uma doença de natureza crônica
que possuem como característica em comum o crescimento desordenado de células
que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo.
As células cancerosas se replicam rapidamente e possuem a tendência de ser muito
agressivas e incontroláveis as que determinarão a formação de tumores ou neoplasias
malignas. O principal objetivo do tratamento das neoplasias é obter a completa
irradiação de células tumorais, podendo ser realizado através de cirurgias que é o meio
simples e seguro para remover tumores sólidos. E pode ser obtido por quimioterapia,
um tratamento que envolve o uso de fármacos citotóxicos, e por radioterapia que pode
ser curativa para tumores localizados. (KUMAR; COTRAN, 2000)
No Brasil, as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam a ocorrência de
aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não
melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. Sem os casos de
câncer da pele não melanoma, estima-se um total de 385 mil casos novos. Os tipos
mais incidentes serão os cânceres de pele não melanoma, próstata, pulmão, cólon e
reto e estômago para o sexo masculino; e os cânceres de pele não melanoma, mama,
colo do útero, cólon e reto e glândula tireoide para o sexo feminino. (INCA,2012)
Segundo dados do Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2011) a doença já é a
segunda causa de morte no Brasil. A OMS alerta para o fato de que se não forem
tomadas medidas de prevenção a incidência de câncer aumentará em 100% nos
próximos 20 anos ( BRASIL, 2003).
1.2 PROBLEMA
A utilização de produtos naturais como terapia é muito antiga e por muito tempo
foi o único arsenal terapêutico disponível. Com a Revolução Industrial e com a
descoberta da Indústria Química, as plantas foram caindo em desuso e os produtos
químicos ganharam força de uso, um dos fatores que facilitou essa mudança de hábitos
foi a facilidade de obtenção de compostos puros, facilidade de utilização e pelo grande
poder da Industria Farmacêutica (RATES, 2001).
Vale ressaltar que no Brasil, a utilização de plantas medicinais é também
difundida e ampliada pela crise econômica que afeta o país, coligada ao difícil acesso
da população à assistência médica e farmacêutica, elevado custo dos medicamentos
industrializados e a crescente tendência dos consumidores a utilizarem produtos
naturais decorrente de uma “consciência ecológica” estabelecida nos últimos anos
(SILVEIRA, BANDEIRA, ARRAIS, 2008).
Sabe-se que ainda há grande número de plantas medicinais utilizadas em todo o
mundo, por todas as idades e para diversos fins, mesmo sem a devida comprovação
científica de sua ação farmacológica.
Considerando que o Brasil possui a flora mais rica do mundo em matéria prima
para a produção de fitofármacos (cerca de 1/3 do total) e que apenas cerca de 8%
foram estudadas, é de suma importância que se busque nestas plantas uma fonte
alternativa de medicamentos, visando no futuro a obtenção de novos fármacos mais
eficazes e específicos ( BRAZ- FILHO, 1994; SIMÕES etal ., 1999).
1.3 JUSTIFICATIVA
O câncer constitui a segunda causa de mortes por doença no mundo considerado
problema de saúde pública.
Os tratamentos atuais não são totalmente eficazes na maioria dos cânceres com
efeitos colaterais e reações adversas intensas.
As plantas medicinais são amplamente utilizadas, por diversos motivos, utilizadas
para diversos fins, que variam de preventivo a curativo. Em diversas regiões as plantas
medicinais são uma das principais formas de tratamento, onde a população utiliza por
muitas vezes de forma errônea, com preparo e quantidades inadequadas, e sem saber
se o efeito biológico é comprovado.
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antitumoral do extrato bruto de romã em camundongos com
TAE.
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar se a planta púnica granatum L. modifica o desenvolvimento do tumor
ascítico de Ehrlich (TAE) em camundongos.
Determinar se este tratamento, nesta dose, altera a quantidade de volume
ascítico de animais portadores do tumor ascítico de Ehrlich.
Determinar se este tratamento, nesta dose, altera a quantidade de células totais e
tumorais da cavidade peritoneal.
Determinar se este tratamento, nesta dose, altera o número total das celulas na
medula óssea.
Determinar se este tratamento, nesta dose, altera o número dos leucócitos
sangüíneos totais e diferenciais dos animais com tumor.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 TUMOR DE EHRLICH
O tumor de Ehrlich foi introduzido por Erlich em 1886 e descrito em 1906 como
um carcinoma mamário de camundongos fêmeas. Inicialmente, o tumor foi
desenvolvido experimentalmente sob a forma solida, sendo então transplantado em
animais da mesma espécie. Em 1932, com Loenwnthal & Jahn , surgiu em forma
ascitica, ou seja, aquela que se desenvolve no peritônio de animais inoculados com
células tumorais (GUERRA, 1983).
A indução experimental dessa neoplasia em camundongos é feito por intermédio
do transplante das células tumorais retiradas de um animal já com a neoplasia
desenvolvida. Essa inoculação poderá ser feita diretamente no peritônio do receptor,
levando ao desenvolvimento da forma ascitica, diretamente no subcutâneo ou no
coxim plantar, ambas as localizações levando a formação do tumor solido. No exame
microscópio da forma ascitica, após o 7 dia já é possível observar expressivo
crescimento da massa tumoral, um fluido discretamente viscoso e de aspecto leitoso,
na qual continua crescendo: após o décimo dia de inoculação intraperitoneal do
tumor, cerca de 90% das células são tumorais. Pode-se observar a migração das
células para os linfonodos regionais. O tumor possui células inflamatórias, estroma
escasso e alto índice mitótico e de invasidade: constituindo um excelente
instrumento didático para o entendimento do comportamento dos tumores malignos
(GERRA, 1983)
O tumor de Ehrlich possui capacidade de crescimento em quase todas as
linhagens de camundongos, provavelmente porque durante o processo de
transformação maligna suas células perderam os antígenos de histocompatibilidade
H-2 (CARRY, 1979). É um tumor considerado pouco imunogênico, pois não expressa
moléculas de MHC de classe II. Devido a sua baixa imunidade, esta neoplasia
apresenta crescimento bastante agressivo, com proliferação celular acelerada e
invasão de tecidos adjacentes. A virulência do tumor de Ehrlich não é alterada pela
linhagem do camundongo utilizada, porém cada linhagem apresenta uma reação
imunológica específica à presença do tumor, fato que altera a sobrevida de acordo
com a linhagem utilizada (KODAMA & KODAMA, 1975).O tumor de Ehrlich é bom
modelo para estudos envolvendo citologia, por crescer na forma ascítica, o que
permite a obtenção de células tumorais isoladas (HOSSNE, 2002)
Histologicamente, o tumor de Ehrlich apresenta extensas áreas de necrose.
Estas são oriundas da morte das células neoplásicas, a qual é bastante intensa já na
primeira semana pós-inoculação. Intensa atípica e células extremamente anaplásicas
são comumente vistas por toda a lâmina. O tumor possui poucas células
inflamatórias e estroma escasso. Alto índice mitótico e de invasividade caracterizam
essa neoplasia, a qual constitui excelente instrumento didático para o entendimento
do comportamento dos tumores malignos. ( DAGLI, 1989)
2.2 PLANTAS MEDICINAIS
Desde tempos remotos, o homem busca, na natureza, recursos que melhorem
sua condição de vida para assim aumentar suas chances de sobrevivência pela
melhoria de sua saúde (BRASIL, 2006).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 85% das pessoas do mundo
utilizam plantas medicinais para tratar da saúde
(OLIVEIRA;SIMOES:SASSI,2006).Nesse sentido, visando á diminuição do numero de
excluídos dos sistemas governamentais de saúde, a OMS recomenda aos órgãos
responsáveis pela saúde publica de cada país, que: a) procedam o levantamento
regionais das plantas e identifique-as botanicamente; b) estimulem e recomendem o
uso daquelas que tiverem comprovadas sua eficácia e segurança terapêutica; c)
desaconselhem o emprego das praticas medicina popular consideradas prejudiciais; d)
desenvolvam programas que permitam cultivar e utilizar as plantas selecionadas na
forma de preparações dotadas de eficácia, segurança e qualidade
(LORENZI&MATOS,2008).Um estudo realizado pelo RENISUS-Relação Nacional de
Plantas Medicinais, divulgada pelo Programa Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos do Ministério da Saúde teve como objetivos orientar a elaboração de uma
relação de fitoterápicos disponíveis para o uso da população, com segurança e eficácia
para o tratamento de determinadas doenças. Neste estudo, foram analisadas 71
espécies de plantas medicinais e dentre elas, encontra-se a romã, P. granatum
(MINISTERIO DA SAUDE, 2009).
O uso de plantas medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças tem
sido descrito por muitos povos desde os tempos mais remotos. Devido a esse uso,
surgiram interesses comerciais e científicos e, por isso, tornou-se necessária a
avaliação da eficácia e segurança dessas plantas. Para muitos, o conceito de natural
significa a ausência de produtos químicos, que são aqueles que podem representar
perigo. Esse conceito é equivocado, já que muitas plantas contêm substâncias com
ações tóxicas sobre organismos vivos. A função dessas substâncias para os produtores
é de defesa contra predadores, por isso não é de surpreender que muitas plantas
acumulem substâncias de elevada toxicidade (MENGUE et al., 2001).
As plantas medicinais desempenham papel importante na medicina, na indústria
e na economia, uma vez que podem fornecer fármacos extremamente importantes e
difíceis de serem obtidos através da síntese química. As fontes naturais fornecem
compostos que podem ser levemente modificados, tornando-os mais eficazes ou
menos tóxicos. Diante da grande importância dos fitoterápicos, verifica-se que vários
países da Europa (dentre eles Alemanha e França), estão intensificando esforços para
unificar a legislação que regulamenta a comercialização dos fitoterápicos. Entretanto,
nos Estados Unidos, a grande maioria das preparações que possuem derivados de
plantas medicinais pode ser comercializada livremente por ser classificada como
suplementos nutricionais. Esta classificação faz com que não seja necessário submeter
dados de segurança e eficácia destes produtos ao órgão regulamentador Food and
Drug Administration (FDA) (TUROLLA e NASCIMENTO, 2006).
2.3 ROMÃ
Punica granatum L.,ou popularmente denominada de romãzeira,pertencente á
família Punicaceae,é um arbusto ramoso ou arvoreta de até 3m de altura,com folhas
simples,cartáceas, dispostas em grupos de 2 ou 3, de 4-8 cm de
comprimento.Contem flores solitárias, constituídas de corola vermelho-alaranjada e
um cálice esverdeado, duro e coriácio. Frutos de tipo baga, globoides, medindo até
12 cm, com numerosas sementes envolvidas por um arilo róseo, cheio de um liquido
adocicado. É, muito provavelmente, originaria da Ásia e espalhada em toda região do
Mediterrâneo, sendo cultivada em quase todo mundo, inclusive no Brasil
(LORENZI&MATOS, 2008).
2.4 IMPORTANCIA FITOTERAPICA DA ROMÃ
Conforme estudos realizados por LORENZI & MATOS (2008), a analise
fotoquímica da romãzeira registra a presença de até 28% de taninos gálicos na
casca do caule e dos frutos e, em menor quantidade, nas folhas; nas sementes 7%
de um óleo essencial, que entre seus ácidos graxos esta principalmente o acido
punícico.
Atualmente muitos trabalhos científicos são feitos estudando as propriedades
medicinais da romãzeira. No entanto, há ainda poucos estudos etnobotânicos, de
farmacognosia e toxicológicos suficientes para elucidar os mecanismos de ação e
efeitos dos constituintes químicos derivados da romã(MACHADO et al.,2003)
2.5 PROPRIEDADES MEDICINAIS
Com o objetivo de pesquisar o uso tradicional de plantas medicinais usadas em
Ladakh, na Índia, BALLABH et al.(2008) coletaram informações de 105 aldeias onde
fazem uso de varias espécies de plantas, incluindo P. granatum, contra distúrbios
renais e urinários. Os resultados mostraram a eficácia dos sistema tradicional da
medicina para estes povos.
A avaliação da toxicidade do extrato da P. granatum realizada por WERKMAN
(2009) por meio de cultura celular com duas linhagens: fibroblastos humanos de
mucosa oral e células de carcinoma epidermoide. Os resultados mostraram que op
extrato inibiu a citoxicidade celular nas concentrações 0,5%, 0,25%, 0,125% e
0,031%. Esses resultados estão relacionados com a propriedade anticarcinogenica
da romã.
Estudos in vitro realizados por DAI et al. (2010) demonstram que o extrato da
romã inibe a proliferação do câncer mamário. Os dados sugerem que o extrato é um
suplemento dietético e tem futuro no tratamento de câncer de mama.
A atividade citotóxica de P. granatum foi avaliada por OLIVEIRA ET AL.(2010).
Os resultados revelaram que o extrato possui potencial antitumoral in vitro e in vivo.
3. METODOLOGIA
3.1 TIPOS DE PESQUISA
Pesquisa Experimental
Serão utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) fêmeas, pesando
entre 30-80g provenientes do Biotério da Unoeste, divididos em 3 grupos e cada grupo
acomodado em 3 gaiolas.
Os animais serão mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, em temperatura
entre 22 e 25°C, com água a vontade e ração ad libitum. Os nossos protocolos para
experimentos com animais serão projetados de maneira que o animal tenha o mínimo
de sofrimento possível e com limite de animais sacrificados. Os procedimentos
adotados com os animais seguirão os Princípios Éticos, de acordo com a resolução
1000 de 11/05/2012 do Conselho Federal de Medicina Veterinária. Os protocolos para
experimentos com animais serão projetados de maneira que o animal tenha o mínimo
de sofrimento possível e com limite de animais sacrificados. Após o experimento os
animais serão sacrificados por inalação, com a substância inalatória anestésica
isoflurano, com posterior deslocamento da coluna cervical, a fim de minimizar
sofrimento dos animais.
3.2. EQUIPAMENTOS
Balança analítica (Bel Engineerring®);
Leitora de Elisa ( LabsystemsMultiskan MS®);
Centrífuga de eppendorff;
Espectrofotômetro (Digimed® DME 21)
3.3 OBTENÇÕES E PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA ROMÃ
Os extratos serão preparados no Laboratório de Pesquisa da Universidade do
Contestado, segundo as recomendações da Farmacopeia Brasileira 2ª edição (1959) e
adaptações de SILVA et al. (2006) e SILVA (2008).
Os extratos etanolicos serão obtidos a partir da folhas e frutos fresco pelo
processo de maceração a frio. Serão utilizadas 500g de cada material vegetal
dissolvido em álcool etílico.
Inicialmente, as folhas e os frutos serão devidamente selecionados, higienizadas,
pesadas em balança eletrônica e acondicionadas em vidros com tampa rosqueada por
quatorze dias com o solvente extrator, sendo agitados periodicamente. Após esse
período, o extrato será filtrado, e levado a secura em banho-maria para a evaporação
do solvente.
3.4 INOCULAÇÕES DO TUMOR
Será inoculado na cavidade peritoneal 0,2ml de tumor ascítico, nele contendo
5x106 células tumorais em cada camundongo.
3.5 AVALIAÇÕES DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA ROMÃ
Os animais serão tratados com o extrato etanolico de romã via oral pelo método
de gavagem.
3.6 DETERMINAÇÃO DO NUMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS
O número total de células será determinado através da contagem em câmara de
Neubauer, usando o microscópio óptico. Para a viabilidade celular as células serão
diluídas em corante vital azul de Tripan.
3.7 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR
Os animais serão separados em três grupos. Todos receberão 5X106 células
tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle receberá o veículo de diluição do
extrato e o grupo tratado receberá os extrato da planta diluído no mesmo veículo por
gavagem 2 X ao dia por 7 dias.
Para determinar o crescimento do tumor será avaliado o peso dos camundongos
no 1º e no 8º dia do experimento. A cavidade peritoneal será lavada (após a morte do
animal) com 5 mL de salina, sendo determinado o volume do recolhido e o número de
células contidas neste volume.
A contagem será determinada em câmara de Neubauer ao microscópio óptico.
3.8 AVALIAÇÕES DA MEDULA ÓSSEA
Para avaliar a medula óssea será extraído o fêmur de cada animal, sendo que as
suas extremidades serão seccionadas de maneira que todos tenham a mesma medida
de aproximadamente 1 cm de comprimento. O canal interno de cada fêmur será lavado
com 3 mL de soro fisiológico e o líquido resultante será corado com cristal violeta. A
contagem será realizada em câmara de Neubauer.
4. RECURSOS
4.1 RECURSOS FÍSICOS
O preparo do extrato da graviola será realizado no Laboratório da Unoeste.
Todos os experimentos comportamentais e bioquímicos serão realizados no laboratório
de pesquisa da mesma instituição.
4.2 RECURSOS HUMANOS
Este trabalho será realizado por um grupo de pesquisadores do curso de
Farmácia e um professor orientador.
4..3 RECURSOS MATERIAIS
Pipetas volumétricas de vidro e pipetas automáticas;
Tubos de ensaio;
Estante para tubos de ensaio;
Placas de Petri;
Bastão de vidro;
Balão volumétrico;
Becker;
Balança analítica (Bel Engineerring®);
Leitora de Elisa – LabsystemsMultiskan MS
Material cirúrgico;
4.4RECURSOS FINANCEIROS
Considerando que todos os equipamentos e reagentes que serão utilizados já
fazem parte dos recursos permanentes da Unoeste, e encontram-se disponíveis para
utilização, estima-se que não será necessário investimento financeiro para execução
deste projeto.
5. CRONOGRAMA
mês
2015 2015 2015
Preparo do
extrato de romã
X
Avaliação da
dose terapêutica
do extrato de
romã
X
Avaliação do
efeito antitumoral
do extrato de
romã X
Revisão
bibliográfica X X X
Análise
estatística X X X
Elaboração do
Relatório
x x
X
6. REFERÊNCIAS
BALLABH,B.et AL.Traditional medicinal plants of cold desert Ladakh-used against kidney and urinary disorders.Journal of Ethonopharmacology, v.118, n.2, p.331-339, jul, 2008.
BRASIL. Ministério da Saúde: INCA. Estimativa da Incidência e Mortalidade por Câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 2007. Disponível em:http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/index.asp?ID=2
BRASIL. Ministerio da Saude. Secretaria da Ciencia. Tecnologia e insumos estratégicos.Departamento de assistência farmacêutica. A fitoterapia no SUS e o programa de pesquisa de plantas medicinais da central de medicamentos. Ministerio da saúde Brasilia, 2006. Disponivel em : < http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicaçoes/fitoterapia_no_sus.pdf>.Acesso em 20/10/2010.
BRASILEIRO FILHO, G. Bogliolo: Patologia. 6 ed. Belo Horizonte: Guanabara Koogan, 2000.
BREHMER, Juliane Seleme. Estudo de extrato de plantas medicinais no desenvolvimento do tumor ascítico de Ehrlich. 2005 72 f. Dissertação–Universidade do vale do Itajaí Centro de ciências da saúde, 2005. http://siaibib01.univali.br/pdf/Juliane%20Seleme%20Brehmer.pdf Acesso em: 08 de agosto de 2013
COTRAN, R.S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S.L. Patologia estrutural e funcional. 6.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. p.1400.
DAGLI, M. L. Z. Disseminação linfática do tumor de Ehrlich: estudo experimental. São Paulo: 1989. Tese (Doutorado em Patologia Experimental e Comparada). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo.
DAI,Z ET AL. Pomefranate extract inhibits the proliferation and viability of MMTV-Wnt-1 mouse mammary câncer stem cells in vitro. Oncology Reports, v.24, n.4, p.1087-1091, oct, 2010
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GUERRA,J.L. Aspectos do processo inflamatorio em camundongos. Ed portadores do tumor de Erlich. São Paulo, 1983. Tese de doutorado – FMVZ da Universidade de São Paulo.
LORENZI,H. & MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exoticas, 2
ed., p.350-351. São Paulo, 2008.
MACHADO, T.B et al. In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring
naphthoquinones and their analogues, against methicillin-resistant Staphilococcus
aureus. International Journal of Antimicrobial Agents, v.21, n.3, p.279-284,2003
MINISTERIO DA SAUDE. Portal da saude. MS elabora Relação de Plantas Medicinais
de Interesse ao SUS, fev., 2009. Disponivel em :
http://portal.saude.gov.br/portal/aplicaçoes/reportagensEspeciais/default.cmf?
pg=dspDetalhes&id_area=124&NOTICIA=10001.Acesso em 25/09/2010
OLIVEIRA, M.J.R.; SIMOES, M.J.S; SASSI, C.R.R. Fitoterapia no Sistema de Saude
Publica (SUS) no Estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Plantas
Medicinais, v.8, n.2, p.39-41, 2006
WERKMAN, C. Citotoxicidade da Punica granatum L. (romak) sobre cultura de
fibroblastos e de células de linhagem cancerígena. Tese apresentada a Universidade
Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São Jose dos Campos, s.n, p.115,
2009