apostila analise instrumental - eng alimentos _2012_parte 1

Profª Drª Elaine de A. Oliveira Coringa

Bacharel e Licenciada em Química (UFMT) Especialista em Processamento e Controle de Qualidade de Alimentos (UFLA-MG)

Mestre em Agricultura Tropical (UFMT) Doutora em Agricultura Tropical / Química e Mineralogia do Solo (UFMT/Esalq)

Cuiabá - 2012

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso - Campus Cuiabá – Bela Vista Curso de Engenharia de Alimentos Disciplina: Análise Instrumental Aplicada a alimentos

IFMT – campus Cuiabá Bela Vista Curso de Engenharia de Alimentos

Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos Profª Elaine A. O. Coringa

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SUMÁRIO

1. Introdução aos métodos instrumentais de análise 1.1 Definição de análise química 1.2 Escolha do método analítico 1.3 Esquema geral da análise química 1.4 Classificação dos métodos analíticos 1.5 O método instrumental 1.6 O instrumento analítico

2. Eficiência do método analítico

2.1 Fontes de erros em análise química 2.2 Validação de resultados analíticos

3. Calibração em análise instrumental 3.1 Tipos de Calibração 3.2 Medidas da eficiência da análise instrumental

4. Técnicas instrumentais aplicadas a alimentos: 4.1 Potenciometria 4.2 Condutimetria 4.3 Refratometria e Polarografia 4.4 Técnicas espectrofotométricas

4.4.1 Espectrofotometria UV/Visível 4.4.2 Fluorescência 4.4.3 Espectrofotometria IR 4.4.4 Espectrofotometria de Absorção Atômica 4.4.5 Espectrofotometria de Emissão

4.5 Cromatografia 4.5.1 Cromatografia Gasosa (GC) 4.5.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

5. Parte experimental (aulas práticas)



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1. Introdução aos métodos instrumentais de análise A análise de alimentos é uma área muito importante no ensino das ciências que

estudam alimentos, pois ela atua em vários segmentos do controle de qualidade, do processamento e do armazenamento dos alimentos processados.

Atualmente existe uma grande quantidade de métodos analíticos instrumentais para a análise de substâncias em alimentos (com limite de detecção cada vez mais baixo), tanto é que rapidamente pode-se perder a visão geral dos métodos aplicáveis para determinadas questões analíticas.

A Química analítica (ou Análise Química) envolve a separação, identificação e quantificação das espécies químicas presentes em uma amostra. Quando aplicada a alimentos, avalia-o desde a produção, coleta, transporte da matéria-prima, até a venda como alimento natural ou industrializado, verifica se o alimento se enquadra nas especificações legais, detecta a presença de adulterantes, aditivos que são prejudiciais à saúde, se a esterilização é adequada, se existiu contaminação com tipo e tamanho de embalagens, rótulos, desenhos e tipos de letras e tintas utilizadas. Enfim, tem a ver com todos os diferentes aspectos que envolvem um alimento, com isso permitindo o juízo sobre a qualidade do mesmo.

1.1 Definição de análise química:

Aplicação de um processo ou uma série de processos para identificar ou quantificar uma substância, ou os componentes de uma solução ou mistura ou, ainda, para determinar a estrutura de compostos químicos

• Pra que serve a química analítica em alimentos?

o Como caracterizar um alimento? � Qual a concentração de vitaminas ? � Há substâncias nocivas (antibióticos, hormônios, pesticidas)?

o Como está a qualidade da água para consumo humano? o Concentração de metais tóxicos nos alimentos?

Entretanto, a Química Analítica (ou Análise Química) pode ser dividida em duas

partes, de acordo com o que estamos buscando como resultado nessa análise:

• Química Analítica Qualitativa – quando se deseja determinar quais substâncias estão presentes em determinada amostra. Ex.: essa amostra de carne bovina está contaminada com hormônios? Há presença de chumbo nessa amostra de sardinha enlatada? O QUE TEM NA AMOSTRA?

• Química Analítica Quantitativa – quando se deseja determinar a quantidade de cada componente ou de certos componentes, presentes na amostra. Ex.: Qual a concentração de antibiótico presente no leite tipo C? A quantidade de Ferro em leite em pó corresponde à quantidade descrita no rótulo? O QUANTO TEM?



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Quais são as aplicações práticas da análise química?

- Desenvolvimento de novos produtos: onde se determinará se a composição da mistura apresenta certas características que adéquam à sua finalidade.

- Controle de qualidade de rotina: é utilizado tanto para checar a matéria prima que chega, como o produto acabado que sai de uma indústria, além de controlar os diversos estágios do processamento. Nestes casos, de análises de rotina, costuma-se, sempre que possível, utilizar métodos instrumentais que são bem mais rápidos que os convencionais.

- Fiscalização: é utilizado para verificar o cumprimento da legislação, através de métodos analíticos que sejam precisos e exatos e, de preferência, oficiais.

- Pesquisa: é utilizada para desenvolver ou adaptar métodos analíticos exatos, precisos, sensíveis, rápidos, eficientes, simples e de baixo custo na determinação de um dado componente do alimento

Figura 1- Relações entre a química analítica, outras áreas da química e outras ciências. A localização central da química analítica no diagrama representa sua importância e a abrangência de sua interação com muitas outras

disciplinas.

1.2 Escolha do método analítico:

Existem dois tipos básicos de métodos em análise de alimentos: métodos

convencionais e métodos instrumentais. Os primeiros são aqueles que não necessitam de nenhum equipamento

sofisticado, isto é, utilizam apenas a vidraria e reagentes, e geralmente são utilizados em gravimetria e volumetria. Os métodos instrumentais, como o próprio nome diz, são



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realizados em equipamentos eletrônicos mais sofisticados. São utilizados, sempre que possível os métodos instrumentais no lugar dos convencionais.

A escolha de um método apropriado para a abordagem do problema analítico requer respostas para as questões: • Que exatidão e precisão são necessárias? • Qual é a quantidade de amostra disponível? • Qual é o intervalo de concentração do analito? • Que componentes da amostra poderão causar interferência? • Quais as propriedades físicas e químicas da matriz? • Quantas amostras serão analisadas? • Recursos disponíveis (instrumentos, pessoal, etc.) A escolha do método analítico vai depender de uma série de fatores: • Quantidade relativa do componente desejado: Os componentes podem ser classificados em maiores (mais de 1%), menores (0,01 – 1%), micros (menos de 0,01%) e traços (ppm e ppb) em relação ao peso total da amostra. No caso dos componentes maiores, são perfeitamente empregáveis os métodos analíticos convencionais, como os gravimétricos e volumétricos. Para os componentes menores e micros, geralmente é necessário o emprego de técnicas mais sofisticadas e altamente sensíveis, como os métodos instrumentais. • Exatidão requerida: Os métodos clássicos podem alcançar uma exatidão de 99,9%, quando um composto analisado se encontra em mais de 10% na amostra. Para componentes presentes em quantidade menores que 10%, a exatidão cai bastante, e então a escolha do método deve recair sobre os instrumentais. • Composição química da amostra: A presença de substâncias interferentes é muito constante em alimentos. A escolha do método vai depender da composição química dos alimentos, isto é dos possíveis interferentes em potencial. Em análise de materiais de composição extremamente complexa, o processo analítico se complica com a necessidade de efetuar a separação dos interferentes antes da medida final. • Recursos disponíveis: muitas vezes não é possível utilizar o melhor método de análise em função do seu alto custo, que pode ser limitante em função do tipo de equipamento ou até mesmo ao tipo de reagente ou pessoal especializado.



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1.3 Esquema Geral Da Análise Química:

As etapas gerais de uma análise química são: a. Formulação da questão (problema) b. Obtenção da amostra c. Preparação da amostra d. Seleção dos procedimentos analíticos e. Análise química (clássica e/ou instrumental) f. Tratamento e Interpretação dos resultados g. Conclusões OBTENÇÃO DA AMOSTRA: A amostra deve ser representativa do sistema; sua integridade deve ser mantida; seus dados de coleta devem ser documentados. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA: Uma porção da amostra é preparada para análise por pesagem ou medida do seu volume, e por processos físicos e/ou químicos, como secagem, moagem, dissolução, etc. PROCEDIMENTO ANALÍTICO: - Obter peso ou volume da amostra preparada - Preparação de soluções padrões do analito, necessárias para calibração do instrumento ou para comparação ou reação com o analito da amostra. - Padronização de soluções ou calibração do equipamento. - Execução do procedimento de análise. TRATAMENTO DOS DADOS: Requer a confecção de gráficos de curvas de calibração, da qual os resultados podem ser calculados. Métodos estatísticos estão geralmente envolvidos, como desvio padrão, média e coeficiente de variação dos resultados obtidos. CÁLCULO DOS RESULTADOS: Um cálculo final pode ser necessário para obter os resultados desejados, como por exemplo, a transformação de uma leitura instrumental em concentração do analito (ppm, g/L, %, mol/L, etc.).

Assim, o analista precisa deter conhecimentos sobre as metodologias de análise

de todos os parâmetros de interesse:

- metais potencialmente tóxicos (Cr, Cd, Pb, As, Hg, etc.), - compostos orgânicos (pesticidas como DDT, solventes como benzeno), - gases (NOx, SO2, CO, CO2, H2S), - parâmetros físicos e físico-químicos de água e solo ( DBO, DQO, pH, temperatura, turbidez, condutividade elétrica, teor de cloro, teor de fósforo, carbono total, etc.),



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1.4 Classificação Dos Métodos Analíticos:

Podemos dizer que existem dois tipos básicos de métodos em análise química:

MÉTODOS CONVENCIONAIS E MÉTODOS INSTRUMENTAIS.

Os métodos convencionais são aqueles que não necessitam de nenhum equipamento sofisticado, isto é, utilizam apenas a vidraria e reagentes, e geralmente são utilizados em gravimetria e volumetria. Só para lembrar: gravimetria trabalha com a perda/ganho de massa de uma amostra, por reação química ou aquecimento. Já a volumetria, mede a quantidade de reagente (em volume) gasta na titulação do componente desejado na amostra.



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Os métodos instrumentais, como o próprio nome diz, são realizados em equipamentos eletrônicos, e são utilizados, sempre que possível, no lugar dos métodos convencionas, pelas seguintes vantagens:

• Menor tempo de análise • Maior precisão dos resultados • Maior sensibilidade do método • Não necessita preparação prévia da amostra • Muitos são métodos não-destrutivos • Maior reprodutibilidade dos resultados • Possibilidade de realização de um maior nº de análises • Menor gasto de reagentes analíticos e vidrarias

Mas, em alguns casos, os métodos instrumentais apresentam desvantagens, tais como: • A aparelhagem necessária para os procedimentos clássicos é barata e encontra-se com facilidade em todos os laboratórios; muitos instrumentos, no entanto, são caros e a sua adoção só se justifica quando são muitas as amostras a analisar, ou quando se trata da determinação de substâncias em quantidades diminutas (análise de traços). • Nos métodos instrumentais é necessário efetuar uma operação de calibração, em que se usa amostra do material com a composição conhecida como substância de referência. • Enquanto um método instrumental é o ideal para a execução de um grande número de determinações de rotina, no caso de uma análise episódica, fora da rotina, é muitas vezes mais simples usar um método clássico do que Ter o trabalho de preparar os padrões indispensáveis e calibrar o instrumento. • Alto custo do equipamento e reagentes. • Necessidade de treinamento especializado, em algumas técnicas instrumentais.

Ainda hoje os laboratórios empregam muitos métodos clássicos de separação e determinação de compostos, mas sua aplicação está diminuindo em função dos novos métodos instrumentais.

1.5 O método instrumental: Devido ao desenvolvimento tecnológico a que os processos estão sujeitos, a

análise química também se desenvolveu e, atualmente, a maioria das análises tanto qualitativas quanto quantitativas é realizada através de instrumentos ou aparelhos próprios, desenvolvidos para realizar uma gama muito grande de análises, surgindo, então a Análise Instrumental.

A análise instrumental não dispensa, entretanto, o conhecimento das análises via úmida tradicionais (qualitativa e quantitativa), nem os fundamentos básicos da instrumentação utilizada, visto que o técnico químico não deve tornar-se um mero “seguidor de receitas ou de roteiros” e, muito menos, um “leitor de manuais de aparelhos”. Neste caso são utilizados equipamentos eletrônicos mais sofisticados.



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Mas, para que um instrumento seja utilizado com eficiência, devemos observar os seguintes critérios:

• Ambiente adequado (limpo, seco, condicionado) • Conhecimento do conteúdo de manual do equipamento • Registros das manutenções e uso do equipamento • Realização de manutenções preventivas, periódicas, e programadas • Calibração do instrumento de acordo com padrões certificados • Realização de análises interlaboratoriais

Os métodos instrumentais podem ser classificados em: eletroanalíticos (ou

elétricos), de separação e espectroanalíticos (ou óticos). Veja o esquema abaixo:

A natureza do sinal fornece o nome ao método instrumental: •Método eletroanalítico: sinal medido é elétrico •Método espectroanalítico ou ótico: sinal medido é do tipo ótico (relacionado ao espectro eletromagnético) •Métodos de separação modernos, acoplados a detectores: cromatografia

Método clássico



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Os principais métodos instrumentais empregados na análise quantitativa de alimentos são:

• MÉTODOS INSTRUMENTAIS ELÉTRICOS (ou eletroanalítico s): envolvem a medição de corrente elétrica, de voltagem (tensão), ou de resistência, em função da concentração de certa espécie em solução. As técnicas que podem se incluídas nessa categoria são:

o Potenciometria (medida do potencial de um eletrodo em equilíbrio com um íon a ser determinado);

o Condutimetria (medida da condutividade elétrica de uma solução); o

• MÉTODOS INSTRUMENTAIS ÓTICOS (ou espectroanalíticos): dependem ou da medição da quantidade de energia radiante de certo comprimento de onda que é absorvida pela amostra (métodos de absorção), ou da emissão de energia radiante e da medição da quantidade emitida com um certo comprimento de onda (métodos de emissão). Podem ser divididos em:

o Métodos de absorção de luz: envolve a determinação da quantidade de

luz absorvida pela amostra através de uma fonte de energia luminosa (lâmpada) que emite radiação em determinadas freqüências do espectro eletromagnético.

� Espectrofotometria no visível (colorimetria) � Espectrofotometria no ultravioleta � Espectrofotometria no infravermelho. � Espectroscopia de absorção atômica � Turbidimetria

o Métodos óticos de emissão de luz: envolvem o tratamento da amostra pelo calor ou pela eletricidade, de modo que os átomos são promovidos a estados excitados que proporcionam a emissão de energia; mede-se a intensidade desta energia emitida.

� Espectroscopia de emissão atômica; � Fotometria de chama;

• MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE SEPARAÇÃO: como a Cromatografia, é um processo de separação empregado para separar as substâncias de um mistura, amplamente utilizada para identificar componentes e determiná-los quantitativamente. A mistura a ser separada se divide em duas fases (sólida, liquida e/ou gasosa) e separa-se através da sua solubilidade ou afinidade química. Posteriormente, as fases são separadas e os componentes da mistura recuperados e quantificados. Pode ser dividida em: Cromatografia Líquida e Cromatografia Gasosa.



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TABELA 1 - Propriedades físicas e químicas empregadas nos métodos instrumentais

Tabela 2 – Critérios para seleção dos métodos analíticos

Precisão dos resultados Limite de detecção do instrumento Sensibilidade do instrumento Faixa de concentração do analito Seletividade do método Velocidade de análise Habilidade requerida do operador Facilidade e conveniência Custo e disponibilidade do instrumento Custo por amostra

1.6 O instrumento analítico: Um instrumento para análise química converte a informação armazenada nas características físicas e químicas do composto em um determinado tipo de informação, que pode ser manipulada ou interpretada pelo homem.

Como as técnicas instrumentais acima apresentadas têm diferentes graus de complicação, sensibilidade, seletividade, custo e tempo, é importante escolher a melhor técnica para realizar uma determinação analítica. Para isso, é necessário levar em consideração:

a) Tipo de análise: elementar ou molecular, rotineira ou episódica.



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b) Problemas decorrentes da natureza do material investigado: substâncias corrosivas, radioativas, afetadas pela água, calor, etc. c) Interferências de outros componentes do material. d) Intervalo de concentração que precisa ser investigado. e) Exatidão exigida. f) Facilidades disponíveis (tipo de equipamento) g) Tempo necessário para completar a análise h) Número de análises de mesmo tipo que devem ser efetuadas. i) Natureza da amostra j) Espécie de informação que se procura k) Quantidade da amostra disponível

� Como o instrumento consegue emitir um sinal da propriedade da substância e convertê-lo em um número?

A função do instrumento é traduzir a composição química em uma informação

diretamente observável pelo operador. Os instrumentos transformam um sinal analítico que usualmente não é diretamente detectável ou entendido pelo ser humano em um sinal que pode ser medido.

Processo completo de uma medida instrumental

Qualquer que seja o método instrumental, o sinal analítico será sempre uma

função da concentração do analito.

A medida do sinal se fundamenta em uma propriedade físico-química que se relaciona diretamente com a concentração do analito.



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Tabela 3 – Alguns exemplos dos componentes dos instrumentos

� Como é a seqüência de uma análise instrumental?

Uma vez escolhida a técnica analítica instrumental (potenciometria, condutimetria, espectrofotometria, etc.), a análise deverá ser realizada em réplicas (duplicata ou, preferivelmente, em triplicata), e o resultado final será a média das replicatas.

Para métodos de análise instrumentais, muitos instrumentos são acoplados a computadores e os resultados analíticos podem ser expostos num monitor e registrados na impressora.

Um cálculo simples converterá os dados experimentais na percentagem do componente presente na amostra.

Veja na figura abaixo, o esquema geral de uma análise instrumental:



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� Qual é a dimensão quantitativa da análise instrumental?

Pode ser em escala de macro, meso, micro e ultramicroanálise, dependendo da concentração detectável no instrumento ou técnica. Veja na figura abaixo a diferença entre essas escalas analíticas:

Obter a amostra

Preparar a amostra

Executar a análise instrumental:

Tratar os dados

- Tabular os dados e calcular as médias das replicatas e o desvio padrão;

- Fazer o gráfico de calibração e o ajuste estatístico da curva;

- Calcular a concentração da amostra

Calcular os resultados

- Pesar ou medir o volume da amostra preparada - Preparar as soluções padrões do analito para calibrar o

instrumento - Calibrar o equipamento - Obter os resultados para a amostra (leitura)



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2 Eficiência do método analítico

As medidas instrumentais e clássicas invariavelmente envolvem erros e incertezas. Apenas alguns deles ocorrem devido a equívocos cometidos pelo analista. Mais comumente, os erros são causados por padronizações ou calibrações malfeitas ou variações aleatórias e incertezas nos resultados.

Calibrações freqüentes, padronizações e análises de amostras conhecidas podem ser usadas, algumas vezes, para minimizar todos esses fatores, exceto os erros e as incertezas aleatórios. No limite, entretanto, os erros envolvidos nas medidas são uma parte inerente do mundo quantitativo em que vivemos.

Por conta disso, é impossível realizar uma análise química que seja totalmente livre de erros ou incertezas. Apenas podemos desejar minimizar os erros e estimar sua grandeza com uma exatidão aceitável.

2.2 Fontes De Erros Na Analise Química:

• Amostragem • Preparo de amostras • Preparo de reagentes • Material de referência certificado inapropriado (padrão) • Calibração do instrumento • Durante a leitura • Processamento dos dados • Apresentação dos resultados • Interpretação dos resultados

Tipos de erros:



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a) Erros determinados ou sistemáticos: possuem um valor definido e podem ser medidos ou computados no final.

Exemplos (na preparação da amostras):

• Contaminação o Pelo ar o Impurezas em reagentes o Materiais

• Perda de elementos o Por volatilização o Por adsorção

• Decomposição incompleta das amostras

b) Erros indeterminados ou aleatórios: não possuem valor definido, não são mensuráveis e flutuam de um modo aleatório. Ex.: resultados de replicatas:

Nesses casos, o valor mais provável é a média aritmética de todos os valores. Resumidamente:

Erros determinados (sistemáticos) e indeterminados ( incertezas) na análise química:



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2.3 Validação dos resultados analíticos: Existem critérios quantitativos para avaliar o funcionamento dos instrumentos

analíticos e a eficiência do método, e que podem ser utilizados para decidir se um determinado método instrumental é o adequado para resolver um problema analítico. Estas características se expressam em termos numéricos e estatísticos, chamados parâmetros de qualidade instrumentais, e estão listados na tabela abaixo:

Tabela 4 – Critérios numéricos para selecionar um método analítico de acordo

com a sua eficiência.

Critério Parâmetro de qualidade Significado Precisão Desvio padrão absoluto

Desvio padrão relativo Coeficiente de variação

Grau de concordância mútua entre os dados que foram obtidos do mesmo modo, em uma serie de medidas (replicatas). Fornece uma medida do erro aleatório, ou indeterminado, de uma análise.

Sensibilidade Sensibilidade de calibração A sensibilidade de um instrumento ou método é uma medida de sua habilidade em discriminar pequenas diferenças na concentração de um analito.

Limite de detecção Branco + 3x desvio padrão do branco

Concentração ou massa mínima do analito que pode ser detectada em um nível confiável no aparelho.

Seletividade Coeficiente de seletividade Refere-se ao grau em que o método esta livre de interferência de outras espécies contidas na matriz da amostra. Infelizmente nenhum método analítico está totalmente livre de interferência de outras espécies e, assim, procura-se minimizá-las.



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2.3.1 Precisão x exatidão:

A precisão descreve a reprodutibilidade das

medidas – em outras palavras, a proximidade entre os resultados que foram obtidos exatamente da mesma forma. Geralmente, a precisão de uma medida é prontamente determinada simplesmente pela repetição da medida em réplicas da amostra.

Três termos são amplamente empregados para descrever a precisão de um conjunto de dados de réplicas: desvio-padrão, variância e o coeficiente de variação. Os três são uma função de quanto um resultado individual xi difere da média, o que é denominado desvio em relação à média, di.

A exatidão indica a proximidade da medida do valor verdadeiro, ou aceito, e é

expressa pelo erro. A Figura 5-2 ilustra as diferenças entre exatidão e precisão. Observe que a exatidão mede a concordância entre um resultado e o valor aceito. A precisão, por outro lado, descreve a concordância entre os vários resultados obtidos da mesma forma.

Podemos determinar a precisão medindo as réplicas da amostra. A exatidão é com freqüência mais difícil de

ser determinada porque o valor verdadeiro é geralmente desconhecido. Então, um valor aceito precisa ser utilizado em seu lugar. A exatidão é expressa em termos do erro absoluto ou erro relativo.



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Representação da precisão e exatidão:

2.3.2 Tipos de erros em análise química que afetam a precisão e a exatidão do método instrumental:

� Erro Absoluto O erro absoluto E, na medida de uma quantidade x, é dado pela equação:

em que xv é o valor verdadeiro, ou aceito, da quantidade.

EXEMPLO:

Se retornarmos aos dados mostrados na Figura 5-1, o erro absoluto do resultado

imediatamente à esquerda do valor verdadeiro de 20,00 ppm é de -0,2 ppm de Fe; o resultado 20,10 ppm apresenta um erro de +0,1 ppm de Fe.

Observe que mantemos o sinal quando expressamos o erro absoluto. O sinal negativo, no primeiro caso, mostra que o resultado experimental é menor que o valor aceito, enquanto o sinal positivo, no segundo caso, indica que o resultado experimental é maior que o valor aceito.

� Erro Relativo: Em geral, o erro relativo Er é uma

quantidade mais útil que o erro absoluto. O erro relativo porcentual é dado pela expressão:



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A precisão de uma medida é prontamente determinada pela comparação dos

dados de réplicas cuidadosas de experimentos. Infelizmente, uma estimativa da exatidão não é tão fácil de ser obtida. Para determinar a exatidão, temos de conhecer o valor verdadeiro, que geralmente é o que se busca em uma análise.

Os resultados podem ser precisos sem ser exatos e exatos sem ser precisos. O perigo de considerar que resultados precisos também são exatos é ilustrado na Figura 5-3, que resume os resultados obtidos na determinação de nitrogênio em dois compostos puros. Os pontos mostram os erros absolutos de réplicas de resultados obtidos por quatro analistas. Observe que o analista 1 obteve precisão e exatidão relativamente elevadas. O analista 2 teve uma precisão baixa, mas uma exatidão boa. Os resultados do analista 3 são surpreendentemente comuns. A precisão é excelente, mas existe um erro significativo na média numérica dos dados. Ambas, a precisão e a exatidão, são baixas nos resultados do analista 4.

As Figuras 5-1 e 5-3 sugerem que as análises químicas são afetadas por pelo

menos dois tipos de erros. Um tipo, chamado erro aleatório (ou indeterminado), faz que os dados se distribuam de forma mais ou menos simétrica em torno do valor médio. Veja novamente a Figura 5-3 e observe que a dispersão dos dados, e conseqüentemente o erro aleatório, para os analistas 1 e 3 são significativamente inferiores, quando



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comparados com os dos analistas 2 e 4. Em geral, o erro aleatório de uma medida é refletido por sua precisão.

Um segundo tipo de erro, denominado erro sistemático (ou determinado), faz que a média de um conjunto de dados seja diferente do valor aceito. Por exemplo, a média dos resultados mostrados na Figura 5-1 tem um erro sistemático de cerca de –0,2 ppm de Fe. Os resultados dos analistas 1 e 2, na Figura 5-3, têm erros sistemáticos pequenos, mas os dados dos analistas 3 e 4 revelam erros sistemáticos de cerca de –0,7% e –1,2% para o nitrogênio. Geralmente, os erros sistemáticos presentes em uma série de réplicas de medidas fazem que os resultados sejam muito baixos ou muito altos. Um exemplo de um erro sistemático é a perda despercebida do analito durante o aquecimento de uma amostra.

Um terceiro tipo de erro sistemático é o erro grosseiro. Os erros grosseiros diferem dos erros indeterminado e determinado. Ocorrem, normalmente, apenas de forma ocasional, são freqüentemente grandes e podem causar resultados tanto altos quanto baixos. Esses erros são, com freqüência, resultado de erros humanos.

Por exemplo, se uma parte de um precipitado for perdida antes da pesagem, os resultados analíticos serão mais baixos. Tocar um pesa-filtro com os dedos quando sua massa vazia já foi determinada fará a leitura da massa de um sólido pesado no frasco contaminado ser mais alta. Os erros grosseiros levam à ocorrência de valores anômalos, resultados que diferem marcadamente de todos os outros dados de um conjunto de réplicas de medidas.

Como os erros sistemáticos fazem parte da análise instrumental, vamos falar um pouco mais sobre eles.

Os erros sistemáticos têm um valor definido e uma causa identificável e são da mesma ordem de grandeza para réplicas de medidas realizadas de maneira semelhante. Existem três tipos de erros sistemáticos: (1) Erros instrumentais – causados pelo comportamento não ideal de um instrumento, por calibrações falhas ou pelo uso de condições inadequadas. (2) Erros de método – surgem do comportamento químico ou físico não ideal de sistemas analíticos. (3) Erros pessoais – resultam da falta de cuidado, falta de atenção ou limitações pessoais do analista.

� Erros Instrumentais:

Todos os dispositivos de medida são fontes potenciais de erros instrumentais

sistemáticos. Por exemplo, pipetas, buretas e frascos volumétricos podem conter ou dispensar quantidades levemente diferentes daquelas indicadas em suas graduações.

Os instrumentos eletrônicos estão sujeitos a erros instrumentais sistemáticos. Esses erros podem ter inúmeras origens. Por exemplo, os erros podem surgir devido ao decréscimo da voltagem de uma bateria, em decorrência do seu tempo de uso. Os erros também podem ocorrer se os instrumentos não forem calibrados freqüentemente, ou se forem calibrados incorretamente. As variações de temperatura provocam alterações em inúmeros componentes eletrônicos, o que pode levar à ocorrência de modificações nas respostas e a erros. Alguns instrumentos são suscetíveis ao ruído induzido por fontes de corrente alternada (ca), e esse ruído pode influenciar a precisão e a exatidão. Em muitos casos, erros desse tipo são detectáveis e corrigíveis.

� Erros de Método:

O comportamento químico ou físico não ideal de reagentes e de reações nos

quais uma análise está baseada, muitas vezes, introduz erros de método sistemáticos.



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Essas fontes de não idealidade incluem a lentidão de algumas reações, a incompletude de outras, a instabilidade de algumas espécies, a falta de especificidade da maioria dos reagentes e a possível ocorrência de reações laterais que interferem no processo de medida. Por exemplo, um erro de método comum na análise volumétrica resulta do pequeno excesso de reagente necessário para provocar a mudança de cor do indicador que acusa o final da reação. A exatidão dessa análise é então limitada pelo próprio fenômeno que torna a titulação possível.

Os erros inerentes a um método são, freqüentemente, difíceis de ser detectados e, conseqüentemente, são os mais sérios entre os três tipos de erros sistemáticos.

� Erros Pessoais:

Muitas medidas demandam julgamentos pessoais. Os exemplos incluem a

estimativa da posição de um ponteiro entre duas divisões de uma escala, a cor de uma solução no ponto final de uma titulação ou o nível de um líquido em relação à escala graduada de uma pipeta ou bureta. Julgamentos desse tipo são muitas vezes objeto de erros sistemáticos, unidirecionais. Por exemplo, uma pessoa pode estimar a posição de um ponteiro de maneira consistentemente mais alta, outra pode ser ligeiramente lenta no disparo de um cronômetro e uma terceira pode ser menos sensível a mudanças de cor.

Um analista que é insensível a mudanças de cor tende a usar excesso de reagente em uma análise volumétrica. Os procedimentos analíticos sempre devem ser ajustados para que qualquer limitação física conhecida do analista não provoque erros pequenos e irrelevantes.

Uma fonte universal de erros pessoais é o prejulgamento, ou tendência. A maior parte de nós, não importa quão honestos sejamos, tem a tendência de estimar leituras de escalas na direção da melhoria da precisão em um conjunto de resultados. Alternativamente, podemos ter uma noção preconcebida do valor verdadeiro de uma medida. De forma inconsciente, fazemos que os resultados se mantenham próximos a esse valor.

O viés numérico é outra fonte de erros pessoais que varia consideravelmente de pessoa para pessoa. O viés numérico mais freqüente encontrado na estimativa da posição de um ponteiro em uma escala é a preferência pelos números 0 e 5. Também é comum o prejulgamento favorecendo números pequenos em relação aos maiores e os números pares, em relação aos ímpares.

2.3.3 Detecção dos erros sistemáticos instrumentais e pessoais: Alguns erros sistemáticos instrumentais podem ser determinados e corrigidos

pela calibração.

CALIBRAÇÃO: Processo que relaciona o sinal analítico medido (leitura) com a concentração conhecida da substancia em uma solução padrão de referencia.

PADRÃO OU SOLUÇÃO PADRÃO: solução preparada em laboratório de concentração exatamente conhecida da substância que se quer analisar na amostra. Contém todos os reagentes adicionados na amostra.



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Salvo poucas exceções, as técnicas instrumentais são denominadas de técnicas secundárias, ou seja, é necessário que o analista forneça referências ao equipamento para que este correlacione os dados para identificar a concentração do componente de interesse (analito) na amostra.

A forma mais usual de se executar a calibração de um instrumento é através da curva analítica (ou curva de calibração), que consiste em preparar padrões com concentrações conhecidas do analito e matriz (amostra menos o analito) o mais próximo da realidade da amostra em estudo. Na maioria das vezes, existirá uma relação linear entre concentração do analito e sinal de resposta do equipamento.

Veremos mais adiante os tipos de calibração instrumentais! A calibração periódica de equipamentos é sempre desejável devido à variação,

com o tempo, da resposta da maioria dos instrumentos, resultante do desgaste, da corrosão ou da manutenção inadequada.

Muitos erros sistemáticos instrumentais envolvem interferências nas quais as espécies presentes na amostra afetam a resposta do analito. Uma simples calibração não corrige esses efeitos.

A maioria dos erros pessoais pode ser minimizada por meio de cuidado e disciplina. Um bom costume consiste em verificar sistematicamente as leituras de instrumentos, os registros no caderno de laboratório e os cálculos em geral. Os erros devido a limitações do analista podem ser evitados pela escolha cuidadosa do método analítico.

2.3.4 Detecção de erros sistemáticos de método:

O viés em um método analítico é particularmente difícil de ser detectado.

Podemos adotar um ou mais entre os procedimentos a seguir para reconhecer e tentar livrar um método analítico de um erro sistemático.

a) Análise de Amostras Padrão:

A melhor maneira de estimar a tendência de um método analítico é pela análise de materiais de referência padrão, ou seja, materiais que contêm um ou mais analitos em níveis de concentração conhecidos. Os materiais de referência padrão são obtidos de várias formas.

Os materiais padrão podem ser preparados por meio de síntese. Aqui, quantidades cuidadosamente medidas dos componentes puros de um material são misturadas de forma que produza uma amostra homogênea cuja composição seja conhecida a partir das quantidades tomadas. A composição global de um material padrão sintético precisa ser muito próxima da composição da amostra que será analisada. Cuidados extremos precisam ser tomados para garantir que a concentração do analito seja exatamente conhecida. Infelizmente, um padrão sintético pode não revelar interferências inesperadas, assim a exatidão da determinação pode não ser conhecida. Além disso, essa estratégia muitas vezes não é prática.

Os materiais de referência padrão podem ser adquiridos a partir de inúmeras fontes governamentais e industriais. Por exemplo, o Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia norte-americano, o NIST (antigo Bureau Nacional de Padrões) oferece mais de 1.300 materiais de referência padrão, incluindo rochas e minerais, misturas de gases, vidros, misturas de hidrocarbonetos, poeira urbana, água de chuva e sedimentos de rios.



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As concentrações de um ou mais componentes desses materiais foram determinadas por uma das três maneiras que seguem: (1) pela análise por meio de um método de referência previamente validado; (2) pela análise por dois ou mais métodos de medida independentes e confiáveis; ou (3) pela análise por intermédio de uma rede de laboratórios cooperados, que são tecnicamente competentes, com um conhecimento completo acerca do material a ser testado.

b) Determinação do “Branco”:

Um branco contém os reagentes e solventes usados na determinação, mas não o analito. Por vezes, vários dos constituintes da amostra são adicionados para simular o ambiente do analito, freqüentemente denominado matriz da amostra. Em uma determinação em branco, todas as etapas da análise são desenvolvidas no material denominado branco. Os resultados são então aplicados na correção das medidas feitas com a amostra.

Determinações em branco revelam erros que ocorrem devido a interferentes presentes nos reagentes e frascos usados na análise. Os brancos também são usados para corrigir dados de titulações, em função do volume do reagente necessário para provocar a mudança de cor do indicador.

BRANCO (BR): Sinal do instrumento para matriz na ausência do analito � geralmente é água destilada ou o solvente utilizado em maior quantidade na amostra + reagentes que foram adicionados na amostra (indicadores, soluções extratoras, ácidos, álcalis, etc.). o sinal analítico (leitura) deverá corresponder a ZERO.



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3 Calibração em análise instrumental

A calibração é uma operação comum na análise instrumental, onde se relacionam concentrações conhecidas da substância a ser determinada e os correspondentes sinais analíticos (leitura do instrumento).

Essas concentrações conhecidas devem ser fornecidas por SOLUÇÕES PADRÃO.

Iremos fazer uma observação importante acerca das soluções padrão: a sua preparação. Esse processo é muito importante para o sucesso da calibração, pois em muitos casos, os erros de precisão e exatidão que ocorrem são devidos à preparação errada das soluções padrões.

- Preparação dos padrões:

Uma série de soluções-padrão da substância a analisar pode ser preparada de várias maneiras. Provavelmente a mais comum é por meio de várias diluições de uma solução padrão de reserva (solução estoque).

O padrão de reserva pode ser preparado pelo analista ou comprado de um vendedor de produtos químicos. Pode ser preparado por pesagem de uma quantidade do padrão primário da substância (usando uma balança analítica) para um balão volumétrico e diluindo até à marca desejada.

Também pode ser um padrão secundário preparado diluindo uma solução padrão estoque principal, que foi comprado de um vendedor de produtos químicos ou preparado em laboratório.

A série de padrões é então preparada por diluição de vários volumes da solução estoque a um volume menor, em balões volumétricos. Essas diluições exigem técnicas corretas de transferência, utilizando pipetas graduadas e calibradas para minimizar os erros indeterminados. Essa diluição pode ser feita em série, como mostra o exemplo abaixo:

Preparação de 50 mL de cada serie de soluções padrões nas concentrações de 1,0 – 3,0 – 5,0 – 7,0 ppm de Pb, a partir de uma solução estoque de Pb de 100 ppm: � Usando a equação de diluição em serie: Cb = concentração da solução padrão diluída (das séries de padrões) Vb = volume final da concentração da solução padrão diluída (100 mL) Ca = concentração da solução padrão estoque (100 ppm) Va = volume da solução padrão estoque (se quer determinar = ?)



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3.1 Tipos de calibração:

3.1.1 Calibração convencional ou com padrão externo:

Nesse tipo de calibração, prepara-se uma serie de soluções padrões (mínimo 5), cujo intervalo de concentração da substância inclui a concentração presente na amostra.

Construção da curva de calibração: - Preparo de uma série de soluções-padrão (contêm a concentração conhecida do

analito) - Medida dos sinais dos padrões e do “branco” no equipamento (leitura do branco e

dos padrões) - Construção da Curva de Calibração � eixo x = concentração dos padrões; eixo y =

leitura dos padrões.

A leitura correspondente de cada solução é relacionada com a concentração da substancia no padrão através de um gráfico de dispersão (xy). Esse gráfico é ajustado pela regressão linear, e uma equação da reta é produzida (y = ax + b), que estabelece uma relação linear entre o sinal e a concentração.

Vamos ver a seguir como construir a curva de calibração no EXCEL:

Concent. leitura



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1 – CONSTRUÇÃO DA TABELA DE DADOS (x = concentração e y = leituras) no Excel, após a leitura das soluções padrão:

• Construa a tabela com os dados das soluções padrão:

• Eixo x = concentração dos padrões

• Eixo y = leitura dos padrões



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2 – CONSTRUÇÃO DO GRÁFICO DE DISPERSÃO, com os dados da soluções padrão:

• Selecione a tabela que você montou

• Clique no ícone GRÁFICOS

• Selecione gráfico de DISPERSÃO (XY)

• Clique em avançar nas próximas telas



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• Clique em CONCLUIR.



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3. O GRÁFICO JÁ ESTÁ PRONTO:

4 Depois de construído o gráfico, vamos agora AJUSTAR A RETA e determinar a EQUAÇÃO DA RETA:

• Clicar com o botão direito do mouse sobre os pontos da reta

• Clicar em ADICIONAR LINHA DE TENDÊNCIA



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• Na palheta do quadro, selecionar OPÇÕES

• Marcar EXIBIR EQUAÇÃO E VALOR DE R-QUADRADO NO GRÁFICO.



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5. Já aparecem no gráfico a EQUAÇÃO DA RETA e o valor de R-Quadrado:

Parâmetros da curva de calibração:

Curva de calibração da resposta, Smeans, versus a concentração, CA.

A inclinação da curva de calibração é a sensibilidade da calibração (a = coeficiente angular).



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3.1.2 Calibração com adição de padrão:

Nesse método, a amostra é “contaminada” com uma quantidade ou

quantidades conhecidas de uma solução padrão contendo o analito. No método das adições de padrão, uma quantidade conhecida da solução padrão

contendo o analito é adicionada a uma porção da amostra. As respostas antes e depois da adição são medidas e posteriormente usadas para obter a concentração do analito.

Alternativamente, as múltiplas adições são feitas a diversas porções da amostra. A adição de padrão considera uma resposta linear. Isso deve ser sempre confirmado ou o método das adições múltiplas deve ser empregado para se verificar a linearidade.

Exemplo:

3.1.3 Método do Padrão Interno:

Um padrão interno é uma espécie de referência, química ou fisicamente similar ao analito, que é adicionada a amostras, padrões e brancos. A razão entre as respostas do analito e a do padrão interno é representada em um gráfico versus a concentração do analito.



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No método do padrão interno, uma quantidade conhecida da espécie que atua como referência é adicionada a todas as amostras, padrões e brancos. Então o sinal de resposta não é aquele do próprio analito, mas sim da razão entre o sinal do analito e o da espécie de referência.

É preparada, como de maneira usual, uma curva de calibração na qual o eixo y é a razão entre as respostas e o eixo x, a concentração do analito nos padrões. A Figura abaixo ilustra o uso do método do padrão interno para respostas na forma de pico.

Ilustração do método do padrão interno.

Uma quantidade fixa da espécie contida no padrão interno é adicionada a amostras, padrões e brancos. Os gráficos da curva de calibração contêm a razão entre o sinal do analito e o do

padrão interno contra a concentração do analito.

3.2 Medidas da eficiência da análise instrumental:

3.2.1 Avaliar a precisão:

A precisão é uma medida da reprodutibilidade de um resultado. Para se estabelecer a precisão de um método analítico que está sendo utilizado para determinar algum parâmetro em uma amostra, é necessária a obtenção de parâmetros estatísticos básicos, tais como:



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Tabela 4 – Parâmetros de qualidade para definir a precisão de um método analítico

Em análise quantitativa, considera-se uma precisão aceitável quando o CV <

10%. Para análise de resíduos de pesticidas, por exemplo, consideram-se aceitáveis coeficientes de variação (CV) de até 20%.

Entretanto, a precisão sempre terá distorções de medida, pois envolverá sempre uma variedade de fatores para gerar erros:

- corrente elétrica - formação de base do analista na forma de operação e interpretação - reagentes de lotes ou fabricantes diferentes - estado emocional do analista - iluminação do ambiente de trabalho - variabilidade intrínseca do equipamento (estabilidade ou tempo de

estabilização) - necessidade analítica para obter a destreza do primeiro resultado - diluições, derivações, alíquotas, temperatura ambiente e de armazenamento - transportes envolvidos até a realização da amostra - limpeza do material analítico e de coleta

3.2.2 Avaliar a exatidão:

Exatidão é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em

relação ao valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro. Quanto mais próximo for o valor obtido do valor teórico, mais exato é considerado o método

A checagem da Exatidão (“Validação”) é feita pela análise de materiais certificados de referência (CRMs) ou materiais referencia padrão (descritos anteriormente).

Outros procedimentos sugeridos para avaliar a exatidão de um método analítico incluem:

- avaliação de amostras de concentração conhecida comparando o valor medido com um valor tido como verdadeiro;



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- comparação dos resultados do novo método com os resultados de um método já validado;

- recuperação de uma concentração conhecida adicionada na amostra.

3.2.3 Avaliar a linearidade:

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de uma determinada faixa de concentração

A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta medida e a concentração do analito, através da Curva de Calibração.

A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser determinado na amostra real. Para isso, se faz o ajuste da reta por regressão linear.

Curva de calibração y = resposta medida (leitura do instrumento: absorbância, emissão, etc.); x = concentração da amostra; a = inclinação da curva de calibração � sensibilidade; b = interseção com o eixo y, quando x=0.

A lineraridade é dada pelo valor do Coeficiente de correlação linear (r): indica o

quanto a reta se aproxima do modelo ideal � r ≥ 0,90 A qualidade da curva obtida é avaliada assim: quanto mais o (r) for próximo de

1, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.



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A linearidade do gráfico quando é dada pelo coeficiente de correlação da reta

obtida, e pode ser classificada em: R = 1 Correlação perfeita

0,91 < R < 0,99 Correlação fortíssima 0,61 < R < 0,91 Correlação forte

0,31 < R < 0,60 Correlação média 0,01 < R < 0,30 Correlação fraca

R = zero Correlação nula

3.2.4 Avaliar a sensibilidade:

A sensibilidade de um instrumento ou método é uma medida da sua capacidade de diferenciar pequenas variações na concentração do analito.

Dois fatores limitam a sensibilidade: a inclinação da curva de calibração (a) e a reprodutibilidade ou precisão do sistema de medição.

Para métodos de igual precisão, será mais sensível aquele que ter a maior inclinação da curva de calibração. O método é mais sensível quando pequenas variações de concentração resultam em maior variação na resposta, ou seja, maior inclinação (valor de a).

Por isso, podemos dizer que: “o método é mais sensível quando pequenas variações de concentração resultam em maior variação na resposta, ou seja, maior inclinação (valor de a da equação da reta)”.

3.2.5 Avaliar a seletividade:

Parâmetro que indica o quanto o sinal analítico corresponde à espécie química de interesse, sem interferentes. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito também pode depender da concentração.



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Gráfico de absorção

Seletividade: capacidade de diferenciar (selecionar) dois ou mais componentes de uma amostra Como avaliar a seletividade? 1) Analisar um branco de reagentes, analisar o padrão, analisar a amostra com e

sem o analito de interesse (placebo). Caso o placebo não seja disponível fazer acréscimo controlado de padrão sobre a amostra.

2) Avaliar a amostra na presença de interferentes, ou seja, introduzir elementos que provoquem “stress”;

3.2.6 Determinar o Limite de detecção:

O limite de detecção (LD) é a menor concentração que pode ser distinguida com um certo nível de confiança. Toda técnica analítica tem um limite de detecção.

Sendo “a” a inclinação da curva de calibração e “s” o desvio-padrão de 10 medidas do branco. O limite de detecção é geralmente expresso em unidade de concentração.



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Exemplo:

Os parâmetros exatidão e precisão constituem a chave para o processo de validação. São requeridos para todos os estudos de validação de métodos, exceto para aqueles com propósito qualitativo, que se destinam apenas a acusar a presença de um analito. Para a análise quantitativa de elementos traços é necessário validar os limites de detecção e de quantificação.

Já para análises qualitativas é obrigatório validar apenas o limite de detecção. A avaliação do parâmetro da linearidade é obrigatória para métodos novos e análises qualitativas de componentes majoritários.

apostila analise instrumental - eng alimentos _2012_parte 1

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