apostila analise instrumental - eng alimentos (2012) - parte 5

IFMT – campus Cuiabá Bela Vista

Curso de Engenharia de Alimentos

Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos Profª Elaine A. O. Coringa

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4.5 Espectrofotometria de Absorção Atômica

Técnica: espectrofotometria de absorção atômica

Equipamento: espectrofotômetro de absorção atômica

Determinação: absorção de luz concentração em ppm

4.5.1 Introdução:

Na espectroscopia molecular, geralmente medimos a absorbância da luz numa

amostra liquida. Já na espectroscopia atômica, uma amostra liquida é aspirada (sugada)

para a chama, cuja temperatura está entre 2.000 e 3.000 ºC, o liquido evapora e o sólido

remanescente é atomizado (quebrado em átomos) na chama, que substitui a cubeta na

espectrofotometria molecular. O caminho ótico da chama geralmente é de 10 cm.

A absorção atômica é um método preciso para a determinação da presença e da

quantidade de um elemento metálico numa determinada amostra.

Na absorção atômica (EAA), é medida a absorção de luz proveniente de uma

outra fonte de emissão, luz esta que atravessa a chama onde é parcialmente absorvida

pelos átomos presentes na forma não excitada. A diminuição da intensidade de luz

incidente, medida por um fotodetector sensível, dá a medida da concentração de um

certo elemento na solução que foi vaporizada na chama; esta medida é expressa em

porcentagem de absorção ou em absorbância.

Uma das características da fonte de emissão é que ela contém o elemento a ser

analisado na chama. As lâmpadas de cátodo oco contêm no cátodo o elemento a ser

analisado na chama. Assim, se queremos determinar cobre, a lâmpada de cátodo oco

deve conter cobre no cátodo; portanto, a amostra vaporizada na chama será irradiada

pela lâmpada cujo cátodo contém o elemento a ser analisado.

A característica básica do processo de absorção atômica é que os átomos no

estado não excitado ou fundamental absorvem o comprimento de onda (λ) emitido pela

lâmpada cujo cátodo contém o mesmo tipo de átomo a ser analisado na chama.

A Absorção Atômica apresenta duas vantagens que favorecem o método:

a) Sensível, uma vez que detecta átomos no estado fundamental, sendo que estes

predominam em maior número na chama;

b) Específico ou seletivo, que elimina interferências óticas, pois se utiliza comprimentos

de onda do próprio elemento a ser analisado;

Atualmente, a absorção atômica pode determinar mais de 65 elementos por

métodos diretos, fornecendo resultados quantitativos em concentrações baixíssimas, na

ordem de ppm e até ppb.




80

4.5.2 O processo da absorção atômica:

Em resumo, a espectroscopia atômica abrange técnicas analíticas que possuem

os seguintes requisitos:

- Baseiam-se no USO DA CHAMA para aquecer e vaporizar a amostra líquida;

- Quando uma solução contendo um sal do metal ou outro composto do metal é

introduzida na chama, ocorrem os seguintes processos, em rápida sucessão:

RESUMINDO:

Quando uma solução de um sal metálico (ou outro composto metálico) for aspirada

por uma chama, forma-se um vapor que contém átomos do metal, e poderá ocorrer:

a) Alguns ÁTOMOS METÁLICOS GASOSOS podem ser PROMOVIDOS A UM

NÍVEL DE ENERGIA MAIS ELEVADO (1%), para permitir a EMISSÃO DE

RADIAÇÃO CARACTERÍSTICA DO METAL (ex. a cor amarela da chama do

átomo de sódio) - é a luz emitida na chama, originada pela excitação térmica dos

átomos, que é detectada e analisada - essa é a base da FOTOMETRIA DE

CHAMA;

b) Um no muito maior de ÁTOMOS permanecerá no ESTADO FUNDAMENTAL

(99%), e são capazes de ABSORVER A RADIAÇÃO EM SEUS

COMPRIMENTOS DE ONDA ESPECÍFICOS, que é o comprimento de onda que

os átomos emitiriam se fossem excitados; SE A LUZ DESSE COMPRIMENTO

DE ONDA FOR PASSADA ATRAVÉS DE UMA CHAMA QUE CONTENHA

OS ÁTOMOS EM QUESTÃO, uma parte da luz será ABSORVIDA, e a extensão

da absorção será proporcional ao no de átomos no estado fundamental, presentes na

chama - mede-se a absorção de luz proveniente de uma outra fonte de emissão, luz




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esta que atravessa a chama onde é parcialmente absorvida pelos átomos no estado

fundamental - essa é a base da Espectroscopia de Absorção Atômica (EAA);

Representação esquemática da absorção e emissão de átomos numa chama. Na

absorção atômica, os átomos absorvem parte da luz vinda da fonte e a luz restante

alcança o detector. A emissão atômica é proveniente de átomos que estão num estado

excitado devido à alta energia térmica da chama. O átomo pode emitir o mesmo

comprimento de onda que foi absorvido ou pode cair para outros estados energéticos e

emitir outros comprimentos de onda.

Nebulização da amostra em solução (aerossol)

Amostra nebulizada é misturada com os gases combustível e oxidante que produzem a

chama.

Na chama: vaporização do solvente à evaporação da amostra à dissociação das

moléculas gasosas à átomos metálicos gasosos livres

Passagem de radiação do metal na chama (através da lâmpada de catodo oco) para

absorção pelos átomos metálicos gasosos no estado fundamental:




82

4.5.3 Instrumentação:

Espectrofotômetros de Absorção Atômica

Esquema de um espectrofotômetro de absorção atômica:

FONTE (EAA) CHAMA

NEBULIZADOR

SELETOR DE

COMPRIMENTO DE

ONDA

DETECTOR

LEITURA




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Esquemas de um espectrofotômetro de absorção atômica

O espectrofotômetro de absorção atômica é constituído basicamente por:

a. FONTE DE EMISSÃO (LÂMPADA DE CÁTODO OCO): emite o λ do metal

que vai ser analisado na amostra.

As fontes mais populares e eficientes são as chamadas lâmpadas de cátodo oco,

um tubo cheio de gás raro cujo cátodo é feito com o elemento metálico (ou liga de

elementos metálicos) desejado. O cátodo oco emite linhas espectrais bem estreitas e de

intensidade estável.

A lâmpada de cátodo oco consiste em dois eletrodos onde o cátodo tem a forma

de um cilindro de vidro com janela de quartzo, feito com o metal especificado (ou uma

liga) e o ânodo é um fio de tungstênio; a lâmpada é preenchida com gás nobre a baixa

pressão; a descarga de corrente elétrica produzirá uma descarga luminosa, com a

emissão vinda de dentro do cátodo. As radiações consistem em λ do metal que serão

direcionadas para a amostra na chama.

O cátodo dessas lâmpadas tem um só elemento, mas pode ter também uma liga

contendo mais de 2 elementos, permitindo radiação característica de vários elementos

emitidos com intensidade adequada e possibilitando a determinação de dois ou mais

elementos. Ex.: liga de Cu, Zn e Pb ou de Cu, Ag, Cd e Zn.




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b. SISTEMA NEBULIZADOR-QUEIMADOR, que provoca uma névoa fina da

solução amostra e o distribui na chama. A solução é atomizada no queimador (ou

combustor), junto com os gases da chama.

São os elementos mais importantes do aparelho, devem ser constantes e estáveis.

Não devem estar sujeitos a corrosões e devem deixar passar soluções relativamente

concentradas sem provocar entupimentos.

Sua função é converter a solução amostra num aerossol ou névoa, introduzindo a

solução na chama em um ritmo estável e reprodutível; a formação de gotas menores da

amostra é chamada nebulização. Uma fina suspensão de partículas liquidas em um gás é

chamado aerossol.

A abertura do atomizador, essencialmente pequena, pode ser facilmente

bloqueada por partículas sólidas existentes no ar ou na solução, como também por

produtos de corrosão do queimador, ou por sais da própria solução.

c. A CHAMA PARA ABSORÇÃO ATÔMICA deve produzir temperaturas >

2.000ºC. Para isso, deve-se queimar um GÁS COMBUSTÍVEL NUM GÁS

OXIDANTE. A chama constitui o fator de maior limitação e interferências. A

chama usa oxigênio, que complica ainda mais algumas análises. Outras vezes, a

chama não é suficientemente quente para certa análise. Embora haja técnicas sem

chama, ela ainda é a fonte de calor mais acessível e mais econômica.

- GÁS COMBUSTÍVEL = propano, gás natural (metano), hidrogênio, acetileno

- GÁS OXIDANTE = oxigênio diluído com nitrogênio ou argônio, ar, óxido nitroso

Para um grande número de elementos usa-se chama produzida pela mistura de

ar-acetileno ou acetileno-oxigênio, que atinge 2300 ºC. Para os chamados elementos

refratários, que necessitam maiores temperaturas para a decomposição de seus

compostos, usa-se o óxido nitroso (N2O) – acetileno. Esta chama atinge 3000ºC.




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A temperatura da chama não afeta muito as características de absorção, uma vez

que a temperatura seja suficientemente alta para produzir o vapor atômico do elemento

a ser analisado. Porém, é preciso considerar que, por outro lado, nestas altas

temperaturas ocorrem fenômenos de ionização ou excitação de alta porcentagem dos

átomos presentes, o que diminui o número de átomos no estado fundamental.

Composição da chama:

acetileno + ar = determina mais de 30 metais

propano + ar = determina metais facilmente convertidos à vapor atômico

acetileno + óxido nitroso = determina metais como Al e Ti que formam óxidos

refratários.

Tabela 1 – Temperaturas máximas obtidas com várias misturas gasosas

Gás combustível Temperatura ºC

Em ar Em oxigênio

Gás de iluminação 1700 2700

Propano 1925 2800

Butano 1900 2900

Hidrogênio 2100 2780

Acetileno 2200 3050

Cianogênio - 4550

Hidrogênio queimado em flúor 4000

Desvantagens da chama:

- Interferências (composição da chama)

- Formação de óxidos refratários (reação na chama)

- Amostra sob a forma de solução

Requisitos:

- Pressão dos gases e a velocidade de nebulização da solução devem ser

constantes

- Chama firme e estável

d. MONOCROMADOR: colocado depois da chama, ajustado para ler a intensidade

do comprimento de onda do metal transmitido pela chama. Seleciona o

comprimento de onda na região UV e Visível, através de um prisma de quartzo ou

rede de difração. Sua função no espectrofotômetro de absorção atômica é isolar

qualquer radiação transmitida na chama de comprimento de onda diferente do metal

analisado, após a amostra absorver a radiação da fonte. Por isso, ele é colocado

após a chama que contém a amostra.




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e. FOTODETECTOR: transforma o sinal luminoso em sinal elétrico. Utilizam-se

tubos fotomultiplicadores, que medem radiação no intervalo de 2100 a 6800

ângstrons, cujo resultado é em absorbância e/ou concentração.

4.5.4 Otimização do espectrofotômetro de absorção atômica:

Ao se realizar uma analise por absorção atômica, deve-se seguir os

procedimentos de otimização (ajuste) do aparelho:

• Alinhar a fenda do queimador com o caminho ótico da fonte de emissão

(L.C.O.)

• Verificar a composição da chama para o elemento a ser analisado

• Acender a chama, aspirar a solução e calibrar para o λ de máxima absorção.

Devem-se observar os seguintes itens quando se opera um espectrofotômetro de

absorção atômica:

• O aparelho deve estar em local ventilado, com sistema de exaustão, pois alguns

solventes orgânicos, especialmente os clorados, produzem gás tóxico na chama.

• Manter os cilindros de gás amarrados num compartimento ventilado, longe de

qualquer fonte de calor ou chama, devidamente identificados.

• Fechar adequadamente a válvula do cilindro de gás combustível, depois de usar

o equipamento.

• Verificar periodicamente vazamentos.

• Tomar cuidado ao usar na chama solventes orgânicos voláteis e inflamáveis.

• Nunca olhar diretamente para a chama ou para a lâmpada de cátodo oco.




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4.5.5 Interferências em absorção atômica:

Espectral: observada quando a medida da radiação absorvida é erroneamente

mais alta devido à absorção de uma espécie que não seja o metal de interesse.

Ex.: determinação do Hg (λ=253,652 nm) com interferência do Co (λ=253,649

nm) em [Hg] > 200 mg/L.

Ex.: determinação do Fe (λ=352,43 nm) com interferência do Ni (λ=352,45 nm).

Leitura: maior

Controle: usar a menor largura de fenda do monocromador ou remover o

interferente da amostra.

Absorção de fundo ou background: causada por espalhamento da luz por

partículas na chama ou por absorção da radiação provenientes da lâmpada

(fonte) por moléculas presentes na chama.

Ocorre em λ < 300 nm

Leitura: maior

Controle: aspirar solução “branco” antes das medidas

De matriz: causada pela viscosidade ou natureza do solvente da amostra.

Ex.: solventes orgânicos aumentam 2 a 4x a absorção numa dada concentração

em comparação com o meio aquoso.

Controle: preparar soluções padrões com o mesmo solvente da amostra.

Química: resulta da incompleta dissociação dos compostos do elemento em

estudo na chama ou de uma reação química com a formação de óxidos ou

hidróxidos termicamente estáveis do metal de interesse com outros compostos

presentes na chama (interferentes).

Afeta a dissociação da amostra na chama durante a formação dos átomos no

estado fundamental e o nº de átomos passíveis de absorção atômica.

Leitura: menor

Controle: aumento da energia da chama, usando-se uma composição de gases

que resulte numa chama mais quente ou adição de um outro elemento que forme

compostos termicamente estáveis com o interferente.

De ionização: o número de átomos excitados termicamente na chama depende

da temperatura e o número de átomos restantes no estado fundamental quase não

é afetado pela variação de temperatura. Para chamas de temperaturas

suficientemente elevadas maior número de átomos será excitado, diminuindo,

pois o número de átomos no estado fundamental e prejudicando a absorção.

Este efeito é notável no caso de elementos alcalinos e alguns alcalino-terrosos,

que apresentam potenciais de ionização relativamente baixos e, portanto, são

ionizados nas chamas mais quentes. Os compostos dos metais alcalinos já estão

completamente dissociados em seus vapores atômicos em temperaturas de 2000

a 3000 ºC, encontrando-se alguns átomos ionizados. Potássio a 2000ºC está mais

de 80% ionizado, deixando apenas 20% de átomos disponíveis para a absorção

atômica. Em chama fria de ar/gás de iluminação, apenas alguns átomos de K

estão ionizados.

Causada por chamas de temperaturas elevadas, onde parte dos átomos no estado

fundamental passará ao estado excitado e daí para o ionizado.




88

Mais comum em metais alcalinos e alcalinos terrosos.

Leitura: menor

Controle: Adição de um reagente supressor de ionização.

4.5.6 Aplicações da Absorção Atômica:




89

4.6 FOTOMETRIA DE C HAMA

Técnica: fotometria de chama

Equipamento: fotômetro de chama

Determinação: emissão de luz (E) concentração

4.6.1 Introdução:

Na espectrofotometria de absorção UV/Vis, a amostra era submetida a um feixe de

radiação (luz) proveniente de uma lâmpada de dentro do espectrofotômetro, que emitia

uma radiação no comprimento de onda específico para que a substância absorva. A

quantidade de luz que ela absorvia naquele comprimento de onda era proporcional à sua

concentração na amostra.

O que você viu até agora, foram os métodos de absorção de luz!

Entretanto, existem outros métodos óticos que tratam da luz emitida pela substancia

na amostra: eles são chamados métodos de emissão de luz, porque captam a luz que a

substancia emite ao ser submetida a uma forma de energia (calor de uma chama) que irá

decompor a amostra em átomos no estado gasoso. Estes átomos no estado gasoso, irão

emitir radiação (luz) em determinados comprimentos de onda específicos, que serão

medidos e quantificados, proporcionalmente à concentração na amostra.

Dentre os métodos óticos de emissão mais comuns está a FOTOMETRIA DE

CHAMA (também chamada de Espectrofotometria de Emissão de Chama).

4.6.2 O processo de emissão de luz:

A amostra liquida é decomposta em átomos no estado gasoso pelo calor de uma

chama, e em seguida, esses átomos irão emitir luz, cuja intensidade é proporcional à

concentração na amostra.

Em temperatura bastante alta, a maioria dos compostos se decompõe em átomos na

fase gasosa. A principal vantagem desse tipo de técnica instrumental é que podemos

determinar substancias em uma concentração muito menor na amostra, da ordem de

mg/L (ou ppm = partes por milhão), pois é quantificado a emissão de luz por cada

átomo da substancia no estado gasoso, e não de moléculas no estado liquido, como na

espectrofotometria de absorção UV/Vis.

Assim, podemos resumir as diferenças entre as espectrofotometrias de absorção e de

emissão na tabela abaixo:




90

4.6.3 Princípio do método:

Na espectrofotometria de absorção UV/VIS, geralmente medimos a absorbância da

luz numa amostra liquida, que é colocada em uma cubeta.

Já na fotometria de chama, uma amostra liquida é aspirada (sugada) para dentro da

chama, cuja temperatura é muito alta (1.700 a 3.000ºC), o liquido evapora e os átomos

gasosos assim formados vão emitir luz, de acordo com a sua concentração na amostra.

Por isso, podemos definir a fotometria de chama como uma técnica de medida da

concentração de um determinado produto químico, alcalino e alcalino terroso,

quando este é introduzido em uma chama na forma de aerossol. Mas esta técnica tem uma limitação: ela só é empregada para análise de metais

alcalinos Na e K (mais freqüente) e alguns alcalino-terroso como Ca e Li (menos

freqüente), em amostras liquidas.

4.6.4 Instrumentação – Fotômetro de Chama:

O instrumento utilizado é o fotômetro de chama, que contém os seguintes componentes:

1- capilar para sugar a amostra

2- atomizador: forma uma névoa (spray) da solução amostra para ser enviada à chama

3- chama: converte os átomos no estado liquido para gasoso, e daí emitirem luz

4- detector: converte a radiação emitida em leitura de Intensidade de Emissão de luz

(E)

Mais especificamente, o fotômetro de chama pode ser assim esquematizado:




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Mecanismo de funcionamento:

A solução amostra é sugada pelo tubo capilar (5 a 25 mL/minuto) para o

atomizador, onde há a misturação com a corrente de ar, e forma uma névoa fina

A névoa produzida da amostra entra no combustor (chama) e ocorre a queima.

A chama é produzida pela combustão do gás GLP (gás de cozinha)

A radiação produzida na chama passa através de uma lente e de um filtro ótico que

só dá passagem à radiação de comprimento de onda específico do elemento a ser

analisado (no caso, sódio ou potássio)

Esta radiação atinge o detector e converte em leitura através de um sistema

eletrônico apropriado, com um painel digital, na forma de uma leitura da quantidade

de luz emitida (emissão = E), proporcional à concentração do elemento na solução

amostra.

Cuidados no manuseio do fotômetro de chama:

Certos cuidados e detalhes devem ser observados para o perfeito funcionamento

desse sistema, tais como:

Acúmulo de sujeira na câmara de mistura, obstruindo a passagem da amostra

provoca oscilações na medida. Após muitas amostragens, o nebulizador acumula

resíduos de elementos que podem influir na leitura. Então deixe o aparelho aspirar

água deionizada por algum tempo

Obstrução do tubo capilar, impede a entrada da amostra; Se a amostra não estiver

sendo aspirada, o cateter pode estar entupido. Limpe-o introduzindo em seu interior

um fio fino de aço ou equivalente

Válvulas de ar e/ou gás travadas, não permitem o correto ajuste da chama; Se a

chama estiver mal regulada, regule-a através da válvula de controle de fluxo de gás

até obter uma chama em forma de cones pequenos de coloração azul clara.

A maior parte dos aparelhos de emissão de chama, destinados a análises de rotinas

em determinação de Na, K, Li e Ca (sódio, potássio, lítio e cálcio), utiliza como

combustível o gás liqüefeito de petróleo (GLP), fornecido em botijões de fácil

reposição, observando apenas se não há vazamentos, com auxilio de espuma, em

suas conexões; ou registros. Quando o gás está se esgotando, o resíduo final do

botijão provoca oscilações no fluxo com conseqüente instabilidade da chama. Nesse

caso troque o botijão.

Se a amostra não estiver sendo aspirada, o cateter pode estar entupido. Limpe-o

introduzindo em seu interior um fio fino de aço ou equivalente.

Após muitas amostragens, o nebulizador acumula resíduos de elementos que podem

influir na leitura. Então deixe o aparelho aspirar água deionizada por algum tempo.

Se isso não resolver, faça o aparelho aspirar uma solução de ácido diluído a 1%

(nítrico ou clorídrico)




92

Quando a amostra a ser analisada esta muito concentrada, a solução deve ser diluída

para que sua concentração esteja dentro da faixa de linearidade do método.

4.6.5 Calibração:

A primeira calibração que se faz é com o BRANCO, geralmente água destilada:

aspira-se uma quantidade suficiente de água destilada e zera a emissão (leitura) do

aparelho.

A segunda calibração serve para determinarmos a concentração de sódio e potássio

na amostra, utilizando a CURVA DE CALIBRAÇAO.

O método segue a lei de Beer Quantidade de luz emitida é proporcional à

concentração do elemento na amostra.

Por isso, a concentração do elemento é calculada utilizando-se a CURVA DE

CALIBRAÇÃO, construída da mesma forma que na espectrofotometria UV/VIS, com

no mínimo 5 soluções padrões, cujas leituras e concentrações são colocadas em gráfico

de dispersão (xy), e a equação da reta deverá ser encontrada.

Só que agora a leitura é em emissão, e não em transmitância ou absorbância.

4.6.6 Aplicações:

A fotometria de chama se restringe aos metais alcalinos e alcalinos terrosos (Na,

K. Ca, Li) porque a energia térmica da chama não é suficientemente elevada para

atomizar, ou seja “quebrar em átomos gasosos” os outros elementos de configuração

eletrônica mais complexa, como o Fe, Hg, Al, Cu e outros. Daí, para esses elementos se

utiliza outra técnica instrumental mais precisa e sensível.

As características técnicas do fotômetro de chama, sua construção simples, baixo

custo e facilidade de manutenção tornaram a fotometria de chama um dos métodos mais

importantes em laboratórios de indústrias, análises clínicas e pesquisa.

Pode ser aplicada na determinação de metais alcalinos e alcalino terrosos em

solos, cimento, minérios, águas, alimentos diversos como frutas e vinhos, sucos,

soluções energéticas, amostras de origem biológica como urina, em vegetais, etc.,

determinação de Na, K, Ca, Li em solos, cimento, água, minérios, alimentos, bebidas,

sucos frutas, soluções energéticas, urina, vegetais.




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4.7 CROMATOGRAFIA GASOSA

Técnica: cromatográfica a gás

Equipamento: cromatógrafo gasoso (CG)

Determinação: picos normalizados concentração

4.7.1 Introdução:

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está

fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre

devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase

estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a

torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é

atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos

componentes de extratos de folhas.

Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna

de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o

extrato, levou à separação dos componentes em faixas coloridas.

Este é provavelmente o motivo pelo qual a técnica é conhecida como

cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar à errônea idéia de que o

processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que também poderiam ser

considerados precursores do uso dessa técnica, a cromatografia foi praticamente

ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na

área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos,

levaram-na a um elevado grau de sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial

de aplicação em muitas áreas.

A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por

comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos,

separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma

mistura.

Segundo a Internacional Union of Pure and Applied Chemistryu (IUPAC), a

“cromatografia é uma técnica usada para separação dos componentes de uma amostra,

os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária e outra móvel. A fase

estacionária pode ser um sólido, um líquido retido sobre um sólido ou gel. A fase móvel

pode ser líquida ou gasosa”.

Cromatografia Gasosa: “tipo de cromatografia que utiliza como Fase Móvel um gás,

denominada Gás de Arraste, cuja finalidade é transportar as moléculas dos componentes

através da coluna, baseando-se na diferente distribuição desses componentes da amostra

FASE MÓVEL líquido ou gás que, ao passar por sobre a fase estacionária, arrasta

consigo alguns componentes da amostra que lhe tenham afinidade.

FASE ESTACIONÁRIA sólido ou líquido (embebido em um suporte sólido), que

retém consigo outros componentes da amostra que lhe tenham afinidade.




94

entre as Fases Estacionária (sólida ou líquida) e a Fase Móvel (gás) – utiliza para isto

um aparelho denominado Cromatógrafo à Gás.”

A cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas. Além de

possuir um alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção

em escala de nano a picogramas (10–9-10-12 g). A grande limitação deste método é a

necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente, embora amostras não

voláteis ou instáveis possam ser derivadas quimicamente. Pode ser utilizada para

separações preparativas apenas na faixa de microgramas a miligramas, não sendo muito

empregada para esse fim.

4.7.2 Classificação:

Cromatografia Gás-Sólido (CGS) - a fase estacionária é um sólido com grande

área superficial (adsorvente). A separação baseia-se em mecanismos de adsorção

das substâncias neste sólido. Usada principalmente na análise de gases permanentes

e compostos apolares de baixa massa molecular.

Cromatografia Gás-Líquido (CGL) - a fase estacionária é um líquido pouco

volátil, recobrindo um suporte sólido. A separação baseia-se em mecanismos de

partição das substâncias entre as fases líquida e gasosa. Devido ao grande número de

fases estacionárias líquidas disponíveis no mercado, a utilização da cromatografia

gás-líquido corresponde a cerca de 95% do total de aplicações.

4.7.3 O mecanismo da eluição:

Uma amostra liquida volátil ou gasosa é injetada numa câmara aquecida dentro do

aparelho cromatógrafo, na qual ela se evapora rapidamente; o vapor é arrastado por uma

corrente de gás que passa continuamente pela coluna cromatográfica (gás de arraste He,

N2 ou H2) dentro do aparelho As substâncias presentes na amostra, depois de

separadas, chegam ao detector do aparelho, que gera um sinal para o registrador

(impressora), que imprime o cromatograma em forma de “picos”:

4.7.4 Fase estacionária:

Chamada de RECHEIO da coluna. Pode ser sólida (adsorvente) ou líquida

(recobrindo um suporte sólido inerte). Na CG existe um grande número de fases

estacionárias líquidas e sólidas disponíveis comercialmente, de modo que a natureza da

FE é a variável mais importante na otimização da seletividade.




95

Tem se empregado um grande número de substâncias como fase estacionária.

Para a seleção desta fase, deve-se conhecer a natureza da substância que se deseja

determinar. Geralmente se segue a conhecida regra: “a fase liquida deve ter

características de polaridade semelhantes à da substância a se analisar”. Assim, para

separar hidrocarbonetos saturados escolhe-se, por exemplo, um hidrocarboneto saturado

como fase estacionaria e um poliéster para um éster orgânico.

Fases estacionárias polares contem grupos funcionais como: -CN; -CO; -OH.

Fases estacionárias do tipo hidrocarbonetos e siloxanos não são polares, enquanto que

fases de poliésteres são altamente polares. Solutos polares incluem: álcoois, ácidos e

aminas. Solutos de polaridade média incluem éteres, cetonas e aldeídos.

Hidrocarbonetos saturados são apolares. Geralmente a polaridade da fase estacionaria

deve combinar com a dos componentes da amostra.

Tipos de Fase Estacionária Sólida:

Fase estacionária sólida

Polímeros porosos (estireno e divinilbenzeno –

Porapak e Chromosorb)

Carvão ativo e sílica

Alumina

Mecanismo da adsorção das substâncias na FE sólida

Tipos de Fase Estacionária Líquida:

Fase estacionária líquida Polaridade Aplicação

Carbowax 20M Polar Álcoois, éteres, glicóis, solventes

Carbowax 1540 Polar Ácidos livres, álcoois, aldeídos, acrilatos, nitrilos,

cetonas

100% dimetilpolisiloxano (goma) Apolar Fenóis, hidrocarbonetos, aminas, compostos

sulfurados, pesticidas.

100% dimetilpolisiloxano (fluido) Apolar Óleos e derivados de aminoácidos.

14% cianopropil 86% fenil

polisiloxano

Intermediária Drogas, esteroides, pesticidas




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Mecanismo de absorção das substâncias na FE liquida

As FE líquidas são as mais empregadas em CG, enquanto que as FE sólidas

(carvão ativo, sílica, peneiras moleculares e polímeros porosos) são aplicadas para

separação de gases e compostos de baixa massa molar.

Em princípio, para um líquido ser usado como FE em CG ele deve ser pouco

volátil (pressão de vapor até 0,1 mmHg ou 13,332 Pa na temperatura de trabalho) e

termicamente estável.

Para esta fase ser empregada em uma separação em particular, ela precisa:

- ser um bom solvente para os componentes da amostra, caso contrário o efeito

será o mesmo de temperaturas de coluna excessivamente altas (os compostos ficarão

quase que o tempo todo no gás de arraste, sendo eluidos muito rapidamente e sem

separação);

- ser um bom solvente diferencial, isto é, além de dissolver bem todos os

constituintes da amostra, fazê-lo com solubilidades suficientemente diferentes para que

eles possam ser separados;

- ser quimicamente inerte em relação à amostra.

4.7.5 A fase móvel:

O gás de arraste (FM) tem a função de levar as substâncias presentes na amostra

para fora da coluna, quando elas não estiverem interagindo com a FE.

Gases mais utilizados: nitrogênio, hélio, hidrogênio e argônio.

Requisitos da Fase Móvel:

- não deve interagir com o recheio da coluna (FE)

- ser compatível com o detector usado no cromatógrafo

- ser disponível comercialmente

- ter custo baixo (grande volume)

- Ter alta pureza




97

4.7.6 O Sistema Cromatográfico:

Hoje, mais de 30 fabricantes de instrumentos oferecem cerca de 130 modelos

diferentes de equipamentos para cromatografia gasosa, a custos variando de 1.500 a

40.000 dólares.

O esquema básico de um cromatógrafo à gás é mostrado na figura abaixo:

Cromatógrafo gasoso




98

Fonte do gás de arraste (fase móvel):

Um cilindro contendo o gás sob alta pressão serve como fonte do gás (FM). É

aconselhável um filtro de sílica-gel ou peneira molecular acoplado entre o cilindro e o

cromatógrafo, na entrada do gás no equipamento, para eliminar traços de água ou

hidrocarbonetos (filtro = traps).

A escolha do gás de arraste independe da amostra a ser separada. O parâmetro

mais importante é a sua compatibilidade com o detector (alguns detectores trabalham

melhor quando se usam determinados gases). Os gases mais empregados são H2, He e

N2 e a vazão do gás de arraste, que deve ser controlada, é constante durante a análise.

Controladores de vazão e reguladores de pressão do gás:

A vazão da FM deve ser constante durante a análise, para que haja

reprodutibilidade. As válvulas dos cilindros de gás servem como reguladores de

pressão. Mantendo-se constante a temperatura, a queda de pressão na coluna

cromatográfica também o será.

1 - Cilindro de Gás

2 - Reguladores de Pressão Primários

3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás

4 - Regulador de Pressão Secundário

5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo)

6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)

Sistema de injeção da amostra:

Permite a introdução de amostras líquidas,

gasosas ou sólidas no aparelho. Na CG, a seção do

cromatógrafo gasoso onde é feita a introdução da

amostra é o injetor (ou vaporizador). Na versão mais

simples, trata-se de um bloco de metal conectado à

coluna cromatográfica e à alimentação de gás de

arraste. Este bloco contém um orifício com um septo,

geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras

líquidas ou gasosas podem ser injetadas com

microseringas hipodérmicas de 0,1 a 10μL.

Controles de vazão de gás no cromatógrafo.

1

2

3

4

1

2

3

4




99

Amostras sólidas podem ser dissolvidas em um solvente adequado.

A amostra líquida é vaporizada instantaneamente e arrastada em forma de vapor

até a coluna. Além da injeção com microsseringa, existem outros tipos de injetores para

amostras líquidas: o injetor direto, o spliter e o on-column.

Os parâmetros a serem verificados durante a injeção da amostra são:

- Quantidade de amostra injetada: não deve ultrapassar a capacidade da coluna,

determinada pela quantidade de FE. A quantidade de amostra injetada depende da

coluna e do detector empregado. Para colunas empacotadas, volumes de 0,1 µl a 3,0 µl

de amostra líquida são típicos. Volumes altos prejudicam a qualidade de injeção

(alargamento dos picos) ou saturam a coluna cromatográfica. Um menor volume

possível é desejável, na faixa de 0,1 a 10 μL de amostra, a fim de evitar problemas de

saturação, excesso de amostra na coluna ou volatilização imcompleta da amostra.

- Temperatura do sistema de injeção: o sistema de injeção deve ser aquecido para

que ocorra vaporização total da amostra. Se a temperatura do injetor estiver muito

baixa, ocorre vaporização incompleta. Para evitar isso, deve-se trabalhar numa

temperatura acima da temperatura de ebulição do composto menos volátil da amostra.

Já as temperaturas muito elevadas poderão causar decomposição ou modificações na

amostra.

- Velocidade de injeção: a introdução da amostra no aparelho deve ser completa e

o mais rapidamente possível, injetando com a mesma velocidade e firmemente.

Coluna cromatográfica:

É onde fica a Fase Estacionária (sólida ou líquida) e se dá a separação dos

componentes da amostra, pela passagem da Fase Móvel (Gás de Arraste).

É um tubo longo, contendo a fase estacionária. Pode ser de cobre, aço inox,

alumínio, vidro, sílica fundida, teflon, etc. idealmente, o material de construção da

coluna não deve interagir com o recheio (Fase Estacionária).

Depois de injetada e vaporizada, a amostra é introduzida na coluna

cromatográfica, onde é efetuada a separação.

A coluna cromatográfica pode ser classificada em:

Coluna Empacotada (recheada analítica e preparativa):

- construída em aço inox (na maioria) ou vidro (para análise de substâncias

biológicas instáveis como esteróides e na de pesticidas).

- Seu formato varia com o aparelho; geralmente são espirais para ocupar menor

espaço.

- Dimensões: 1-3 m de comprimento

1-100 mm de diâmetro interno.

Microsseringa de 10μL




100

- mais usadas com Fase Estacionária Sólida adsorvente (recheio).

- Necessita de um volume maior da amostra (1-20 microlitros)

Coluna Capilar:

- Construídas em níquel, aço inox, vidro ou, preferivelmente, sílica fundida, por

ser altamente pura e produzir colunas flexíveis.

- mais finas e maiores que a coluna recheada.

- Dimensões: 30-150 m de comprimento

0,01-0,75 mm de diâmetro interno

- mais usadas com Fase Estacionária Líquida (recobrindo um suporte sólido

interno ou como filme).

- Mais eficiente que a coluna recheada: análises mais rápidas, alta resolução,

inércia química

- Desvantagens: preço elevado e fragilidade.

- Utiliza volumes menores de amostra (0,001-0,5 microlitros)

Coluna recheada Coluna capilar

Tipos de coluna cromatográfica

Influência da temperatura na eficiência da coluna:

Se a temperatura da coluna for excessivamente baixa, todos os constituintes da

amostra terão pressões de vapor muito baixas e ficarão quase que todo o tempo

dissolvidos na FE, fazendo com que a sua migração pela coluna será muito lenta. O

resultado pode ser um tempo excessivo de análise e picos muito largos e baixos (quanto

mais tempo a substância passa na coluna, mais ela se espalha). Eventualmente, o

composto pode nem sair da coluna.

Por outro lado, uma temperatura muito alta implica pressões de vapor também

muito grandes e os compostos quase não passam tempo nenhum dissolvido na FE,

saindo muito rapidamente da coluna sem serem separados. Assim, a temperatura da

coluna é uma condição que deve ser ajustada para se obter uma determinada separação.

Além de considerações sobre a separação, a temperatura empregada deve ser

compatível com a FE empregada, pois as FE líquidas se volatilizam ou se degradam

com temperaturas excessivas. A temperatura da coluna deve ser rigorosamente

controlada, para assegurar a reprodutibilidade das análises.




101

Sistema de detecção:

As substâncias presentes na amostra passam através da coluna, onde são

separadas, e chegam ao sistema de detecção. Os detectores indicam em medem a

quantidade dos componentes individuais separados na coluna cromatográfica. Assim

como o sistema de injeção, os detectores devem ser operados com temperatura de 50ºC

acima da temperatura final da coluna, para evitar condensação da amostra, água ou

outras substâncias formadas.

Mecanismo geral da detecção: os detectores medem a variação da composição do

gás de arraste (FM) que sai da coluna.

4.7.7 Aplicações Da Cromatografia Gasosa:

A cromatografia gasosa é uma das técnicas de maior uso. É utilizada para a

separação e quantificação de produtos diversos, podendo também ser usada como

técnica de identificação, em casos especiais, principalmente quando acoplada a um

espectrômetro de massas ou outro detector qualitativo.

Assim, a cromatografia gasosa está sendo usada nas mais diversas áreas, como na

análise ambiental, nas indústrias químicas e farmacêuticas, na análise de alimentos e de

produtos petroquímicos, na medicina, na pesquisa e outras.

Na análise ambiental, podemos citar como exemplo, a utilização da cromatografia

gasosa no controle da poluição do ar, água, solos, na determinação de vários poluentes

como aldeídos, cetonas, hidrocarbonetos, compostos aromáticos, etc. Outros exemplos

interessantes estão ligados à análise de resíduos de pesticidas, herbicidas e fungicidas

em água, solos, alimentos.

As indústrias químicas e farmacêuticas podem utilizar a cromatografia gasosa,

desde a análise da matéria-prima até o produto acabado. Exemplo: análise de vitaminas.

Na indústria alimentícia pode-se usar a cromatografia gasosa para análise de

alguns constituintes dos alimentos, como lipídeos e carboidratos. Em alguns casos, com

técnicas adequadas de concentração da amostra, podem ser detectados constituintes

alimentícios em nível de traços, como por exemplo, esteróides e vitaminas. Além disso,

a cromatografia gasosa é frequentemente usada, em conjunto com a cromatografia em

camada delgada, para estudar a adulteração, contaminação e decomposição dos

alimentos.

A área médica e análises clínicas também encontram na cromatografia gasosa

uma ferramenta poderosa, tanto no estudo de substâncias endógenas, como no controle

terapêutico de certas drogas, ou em casos de intoxicação.

Porém, como toda técnica analítica, a cromatografia gasosa tem suas limitações:




102

- a amostra deve ter uma pressão de vapor apreciável à temperatura da coluna

(deve ser volátil).

- O cromatógrafo proporciona um número de dados limitado (tempo de retenção e

tamanho e forma do pico), comparado com a grande quantidade que se obtém das

diversas formas de espectroscopia.

Atualmente, cerca de 95% dos cromatógrafos vendidos são equipados com

colunas capilares. As colunas estão cada vez mais sofisticadas, e os fabricantes

sintetizam fases estacionarias para determinadas aplicações ou métodos. Praticamente a

totalidade dos cromatógrafos comercializados estão acoplados a um microcomputador,

para controle e processamento dos dados, usando softwares e amostradores

automáticos, que permitem o trabalho sem a presença constante do analista, e

realizando, alem disso, cálculos estatísticos.

Também, do ponto de vista analítico, o cromatógrafo gasoso pode ser acoplado a

detectores de varredura como o espectrômetro de massas, o espectrofotômetro de

infravermelho e ultravioleta/visível, o espectrofotômetro de emissão atômica, que

facilitam a análise estrutural dos componentes separados

Projeções para o futuro: as colunas não serão mais visíveis ou manuseadas

diretamente. A injeção manual será substituída por injetores capazes de introduzir

diretamente na coluna nanolitros de gás ou picolitros de líquidos, com precisão e sem

contaminação. Não haverá mais microsseringas e os amostradores automáticos terão

carrossel de 500 a 1000 amostras. Os cromatógrafos serão compactos, pequenos e

programáveis a distancia.




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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. CIENTIFUEGOS, F.; VAITSMAN, D. Análise Instrumental. Rio de Janeiro:

Interciência, 2000, 606p.

2. SKOOG, D.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5

ed. Porto Alegre: Bookman, 2002, 628 p.

3. HARRIS, D. C. Análise química quantitativa. 5 ed. Rio de Janeiro: LTC, 2001,

860p.

4. VOGEL, A. Análise química quantitativa. 5 ed. Rio de Janeiro: LTC, 1992.

apostila analise instrumental - eng alimentos (2012) - parte 5

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