1. VOLTAMETRIA

A voltametria compreende um grupo de métodos eletroanalíticos nos quais a

informação sobre o analito é obtida através de medidas de correntes em função do potencial

aplicado e em condições que estimulam a polarização de um eletrodo indicador ou de

trabalho. Geralmente, para aumentar a polarização, os eletrodos de trabalho na voltametria são

microeletrodos com áreas superficiais máximas de alguns poucos milímetros quadrados e, em

algumas aplicações, de poucos micrometros quadrados ou menos.

A voltametria está baseada na medida de uma corrente que se desenvolve em uma

célula eletroquímica sob condições de polarização completa por concentração. Ao contrário,

as medias potenciométricas são feitas com correntes que se aproximam de zero e nas quais a

polarização está ausente. Na voltametria ocorre o consumo mínimo do analito.

1.1 FUNDAMENTOS

Historicamente, o campo da voltametria se desenvolveu a partir da polarografia, que é

um tipo particular de voltametria que foi descoberto pelo químico Jaroslav Heyrovsky no

início dos anos 1920. A polarografia que ainda é um ramo muito importante da voltametria

difere de outros tipos de voltametria porque o microeletrodo tem a forma de um eletrodo

gotejante de mercúrio(DME).

A voltametria é largamente usada pelos químicos inorgânicos, físico-químicos e

bioquímicos para finalidades não-analíticas, incluindo estudos fundamentais de processos de

redução e oxidação em vários meios, processos de adsorção em superfícies, mecanismo de

transferência de elétrons em superfície de eletrodos quimicamente modificada.

O advento dos amplificadores operacionais de baixo custo permitiu o desenvolvimento

comercial de equipamentos relativamente baratos que incorporaram muitas dessas

modificações e as disponibilizaram para os químicos. O resultados foi o ressurgimento recente

do interesse em aplicações de métodos voltamétricos para a determinação de muitas espécies,

particularmente de interesse farmacológico, ambiental e biológico. Além disso, a voltametria

acoplada a cromatografia líquida de alta eficiência tornou-se uma poderosa ferramenta para a

análise de misturas complexas de diferentes tipos. A voltametria moderna também continua a

ser uma potente ferramenta usada por químicos interessados no estudo de processos de

oxidação e redução, assim como em processos de adsorção.

1.2 INSTRUMENTAÇÃO

A célula é constituída de três eletrodos imersos em uma solução contendo o analito e

também um excesso de eletrólito não-reativo chamado eletrólito suporte. Um dos três

eletrodos é o microeletrodo ou eletrodo de trabalho, cujo potencial varia linearmente com o

tempo. Suas dimensões são mantidas pequenas para aumentar sua tendência a tornar-se

polarizado. O segundo eletrodo é um eletrodo de referencia cujo potencial permanece

constante durante o experimento. O terceiro eletrodo é um contra-eletrodo, que geralmente é

um fio enrolado de platina ou um poço de mercúrio que simplesmente serve para conduzir

eletricidade da fonte de sinal através da solução para o microeletrodo. A fonte de sinal é um

gerador de voltagem de varredura linear similar ao circuito integrado.

Figura 1 – Sistema para voltametria potenciostática de varredura linear com três eletrodos.

No início, a voltametria era feita com um sistema de dois eletrodos e não com três,

como mostra a Figura 1. Com um sistema de dois eletrodos, o segundo eletrodo deve ser ou

um eletrodo metálico grande, como u poço de mercúrio, ou um eletrodo de referência grande

o suficiente para impedir sua polarização durante um experimento. Quase todos os trabalhos

de voltametria são feitos agora com o sistema de três eletrodos.

1.3 MICROELETRODOS

Os microeletrodos empregados em voltametria têm vários formatos e tamanhos. Com

freqüência, são discos pequenos de um condutor que é prensado em um cilindro de material

inerte, como Teflon ou Kel-F que tenha embebido em si um fio para contato, como é

mostrado na Figura 2. O condutor pode ser um metal inerte como platina ou ouro, grafite

pirolítico ou carbono vítreo, um semicondutor como óxido de estanho ou óxido de índio, ou

ainda um metal recoberto com um filme de mercúrio.

Figura 2 – Eletrodo em disco.

Os microeletrodos de mercúrio têm sido amplamente empregados em voltametria por

várias razões. Uma delas é a faixa de potencial negativo relativamente ampla. Além disso,

uma nova superfície metálica é formada rapidamente, simplesmente pela produção de uma

nova gota, e isso é importante porque as correntes medidas em voltametria são bastante

sensíveis à limpeza e a ausência de irregularidades. Uma vantagem adicional dos eletrodos de

mercúrio é que muitos íons metálicos são reduzidos reversivelmente a amálgamas na

superfície de um eletrodo de mercúrio, o que simplifica a química do processo.

Microeletrodos de mercúrio podem ter várias formas. O mais simples é um filme de mercúrio

formado pela eletrodeposição do metal sobre um eletrodo cilíndrico, como mostrado na

Figura 2, ou também o eletrodo de gota pendente de mercúrio, ilustrado na Figura 3.

Figura 3 – Eletrodo gotejante de mercúrio.

O eletrodo gotejante de mercúrio(DME) - Figura 3 - típico usado em primeiros

experimentos de polarografia, consiste em um tubo capilar fino(diâmetro interno de

aproximadamente 0,05 mm) de uns 10 cm de comprimento, colocado na base de uma coluna

de mercúrio de uns 50 cm de altura. O diâmetro do capilar é tal que uma nova gota se forma e

é solta em intervalos de 2 a 6 segundos. O diâmetro da gota varia de 0,5 a 1 mm e é altamente

reprodutível. Em algumas aplicações, o tempo do gotejamento é controlado por um martelo

mecânico que desaloja a gota a um determinado tempo após o início da sua formação.

O eletrodo que está disponível comercialmente consiste de um tubo capilar muito fino

conectado a um reservatório de mercúrio, como ilustrado na Figura 4. O metal é formado para

fora do capilar por um pistão controlado por uma rosca micrométrica. Esse micrômetro

permite a formação de gotas com áreas que são reprodutíveis em cinco por cento ou ainda

melhor.

Figura 4 – Eletrodo de mercúrio de gota pendente.

A Figura 5 mostra um eletrodo de mercúrio disponível comercialmente que pode ser

operado como eletrodo gotejante ou como eletrodo de gota pendente. O mercúrio gotejante ou

como eletrodo de gota pendente. O mercúrio está contido em um reservatório de plástico de

25cm acima da extremidade do capilar. Uma mola de compressão força o êmbolo com a ponta

de poliuretano contra a cabeça do capilar, impedindo assim o fluxo de mercúrio. Esse êmbolo

é levantado por ativação do solenóide por um sinal do sistema de controle. O capilar tem

diâmetro muito maior do que capilares típicos, por isso a formação da gota é extremamente

rápida.

Figura 5 – Eletrodo de mercúrio de gota estática.

1.4 VOLTAMETRIA HIDRODINÂMICA

A voltametria hidrodinâmica é realizada de vários modos. Um método envolve

agitação vigorosa da solução em contato com um microeletrodo fixo. A agitação é feita com

agitador magnético comum. Alternativamente, o microeletrodo sofre rotação com uma

velocidade alta e constante na solução, propiciando a agitação como mostra a Figura 6a. Um

outro modo de realizar a voltametria hidrodinâmica envolve fazer com que a solução do

analito flua através de um tubo no qual esteja montado o microeletrodo (Figura 7). Essa

técnica está sendo muito usada para a detecção de analitos oxidáveis ou redutíveis à medida

que saem de uma coluna de cromatografia líquida.

Figura 6 – (a) vista lateral de um eletrodo rotatório na forma de disco, mostrando o padrão de fluxo da solução. (b) Vista da base de um eletrodo com forma de disco. (c) Vista da base de um eletrodo do tipo anel-disco.

Figura 7 – Um sistema voltamétrico para detecção de espécies eletroativas à medida que elas saem de uma coluna.

1.4.1 Aplicações de Voltametria Hidrodinâmica

Atualmente, as aplicações mais importantes de voltametria hidrodinâmica incluem: (1)

detecção e determinação de espécies químicas à medida que elas saem de colunas

cromatográficas ou de equipamentos para análise por injeção em fluxo: (2) determinação

rotineira de oxigênio e de certas espécies de interesse bioquímico, como glicose, lactose e

sacarose; (3) detecção do ponto final em titulações coutométricas e volumétricas; (4) estudos

fundamentais de processos eletroquímicos.

1.5 VOLTAMETRIA CÍCLICA

O principal uso de voltametria cíclica é como ferramenta para estudos fundamentais e

de diagnóstico que fornecem informação qualitativa sobre processos eletroquímicos em várias

condições.

A voltametria cíclica, mesmo quando não usada em análises quantitativas rotineiras,

tornou-se uma ferramenta importante para o estudo de mecanismos e velocidades de

processos de oxidação/redução, particularmente em sistemas orgânicos e metalorgânicos. Esse

método é normalmente a primeira técnica selecionada para a investigação de um sistema que

pode ser tratado eletroquimicamente. Freqüentemente, os voltamogramas cíclicos revelarão a

presença de intermediários em reações de oxidação/redução(veja Figura 8). Geralmente usa-se

platina na construção de microeletrodos para essa técnica.

Figura 8 – Voltamograma cíclico do inseticida parathion em tampão pH 5 de acetato de sódio 0,5 M, 50% em etanol. Eletrodo de mercúrio de gota pendente. Velocidade de varredura: 200mV/s

1.6 POLAROGRAFIA

A polarografia foi o primeiro tipo de voltametria inventado e usado. Ela difere da

voltametria hidrodinâmica em dois aspectos. Primeiro evita a convecção e segundo, um

eletrodo gotejante de mercúrio, como o mostrado na Figura 6c, é usado como eletrodo de

trabalho. Uma conseqüência da primeira diferença é que as correntes limites polarográficas

são controladas comente por difusão, em vez de difusão e convecção. Como a convecção está

ausente, as correntes limites polarográficas são geralmente uma ou mais ordens de grandeza

menores dos que as correntes limites hidrodinâmicas.

Inicialmente, os métodos polarográficos estavam baseados em medidas de corrente em

função do potencial aplicado a um eletrodo gotejante de mercúrio.

A corrente em uma célula contendo um eletrodo gotejante sofre flutuações periódicas

correspondentes, em freqüência, à velocidade de gotejamento.

Na maioria dos experimentos, esse eletrodo era preso ao terminal negativo de uma

fonte contínua e o potencial dessa fonte era aumentado linearmente até que a corrente

aumentasse exponencialmente em conseqüência da redução do solvente ou do eletrólito

suporte.

A Figura 9 ilustra um aparelho de polarografia.

Figura 9 – Aparelho de polarografia.

1.16.1 Aplicações da Polarografia

A polarografia de varredura linear foi usada para a determinação quantitativa de uma

ampla variedade de espécies orgânicas e inorgânicas, inclusive moléculas de interesse

bioquímico e biológico. Atualmente, os métodos de pulso suplantaram o método clássico

quase completamente devido à maior sensibilidade, conveniência e seletividade. Geralmente,

aplicações quantitativas estão baseadas em curvas de calibração nas quais as alturas dos

máximos são lançadas em gráfico em função da concentração do analito. Em algumas

situações, emprega-se o método de adição de padrão no lugar de curvas de calibração. Em

ambos os casos, é essencial que a composição dos padrões seja o mais próxima possível da

composição da amostra, com relação às concentrações de eletrólitos e pH. Quando isso é

feito, podem ser atingidas precisões e exatidõe3s relativas no intervalo de 1 a 3%.

1.16.1.1 Aplicações Inorgânicas

O método polarográfico é amplamente aplicável na análise de substâncias inorgânicas.

A maioria dos cátions metálicos, por exemplo, é reduzida no eletrodo gotejante. Mesmo os

metais alcalinos e alcalino terrosos sofrem redução, desde que o eletrólito suporte não reaja

nos altos potenciais necessários.

O método polarográfico também é aplicável n a análise de ânions inorgânicos, como

bromato, iodato, dicromato, vanadato, seleneto e nitrito. Em geral, os polarogramas para essas

substâncias são afetados pelo pH da solução porque o íon hidrogênio participa das suas

reduções. Conseqüentemente, o pH deve ser fixado por tampões eficazes para que os dados

sejam reprodutíveis.

1.16.1.2 Análise Polarográfica Orgânica

Praticamente desde o seu início, o método polarográfico tem sido usado para estudar e

determinar compostos orgânicos com muitas publicações sendo dedicadas a este assunto.

Vários grupos funcionais comuns são reduzidos no eletrodo gotejante, tornando possível a

determinação de muitos compostos orgânicos. Entretanto, o número de grupos funcionais que

podem ser oxidados em um eletrodo gotejante de mercúrio é relativamente limitado porque

potenciais anódicos maiores do que +0,4 V (vs. SCE) não podem ser empregados devido à

oxidação do mercúrio. Todavia, grupos funcionais orgânicos oxidáveis podem ser estudados

voltametricamente em microeletrodos de platina, ouro ou carbono.

2. ELETROFORESE

A eletroforese é um método de separação baseado na diferença de velocidade de

migração de espécies carregadas em uma solução-tampão através da qual tenha sido aplicado

um campo elétrico de corrente contínua.

A eletroforese foi aplicada a vários problemas de separação analíticos difíceis: ânions e

cátions inorgânicos, aminoácidos, catecolaminas, drogas, vitaminas, carboidratos, peptídeos,

proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, polinucleotídeos e numerosas outras espécies.

2.1 FUNDAMENTOS

Uma característica particular da eletroforese é a sua habilidade única de separar

macromoléculas carregadas de interesse da indústria biotecnológica e de pesquisas em

biologia e bioquímica. Por muitos anos, a eletroforese é a sua habilidade única de separar

macromoléculas carregadas de interesse da indústria biotecnológica e de pesquisas em

biologia e bioquímica. Por muitos anos, a eletroforese foi um poderoso método de separação

de proteínas (enzimas, hormônios, anticorpos) e de ácidos nucléicos (DNA, RNA) para a qual

oferecia resolução sem igual. Por exemplo, para seqüenciar DNA, é necessário distinguir

entre polinucleotídeos de cadeia longa com massa molecular variando de 200 a 500 e

diferindo entre si por apenas um nucleotídeo. Apenas a eletroforese tem poder de resolução

suficiente para lidar com este problema.

2.1.1 Tipos de Eletroforese

As separações por eletroforese são feitas atualmente em dois formatos bastante

diferentes: um é chamado eletroforese em placa e a outra eletroforese capilar. O primeiro é

um método clássico que foi usado por muitos anos para separar espécies complexas, de alta

massa molecular e de interesse bioquímico e biológico. As separações em placa são feitas

sobre uma fina camada plana ou placa de gel poroso semi-sólido que contém uma solução-

tampão aquosa nos seus poros. Essa placa geralmente tem dimensões de uns poucos

centímetros de lado, como uma placa para cromatografia de camada delgada, e é capaz de

separar várias amostras simultaneamente. As amostras são introduzidas como manchas ou

faixas sobre a placa e um potencial de corrente contínua é aplicado através da placa por um

certo tempo.

A eletroforese em placa é, atualmente, a ferramenta de separação mais usada por

biólogos e bioquímicos. Monografias, livros-texto e revistas sobre ciências da vida

usualmente contêm centenas de fotografias de placas de eletroforese. A eletroforese capilar,

que é uma versão instrumental da eletroforese, foi desenvolvida e usada apenas a partir dos

anos 1980 e tornou-se um importante método de separação usado por químicos e profissionais

de ciências da vida. Em muitos casos, este novo método parece ser um substituto satisfatório

da eletroforese em placa, com algumas vantagens importantes que serão descritas a seguir.

2.2 ELETROFORESE CAPILAR

Mesmo sendo tão útil quanto a eletroforese convencional em placa tem sido e continua a

ser, este tipo de separação por eletroforese é tipicamente lenta, trabalhosa, difícil de ser

automatizada e não produz informação quantitativa muito precisa. Durante meados e final dos

anos 1980, houve um crescimento explosivo da pesquisa e da aplicação de eletroforese feita

em tubos capilares e também do aparecimento de numerosos equipamentos comerciais. A

eletroforese capilar (em inglês, CE – capillary electrophoresis) faz separações com alta

resolução e alta velocidade, em volumes de amostra excepcionalmente pequenos (0,1 a 10nL,

ao contrário da eletroforese em placa que requer amostras na faixa de µL). Adicionalmente,

na saída do capilar, as espécies separadas são eluidas, de modo que detectores, como os de

HPLC, podem ser usados, em vez da pouco eficiente técnica de manchas da eletroforese em

placa.

2.2.1 Instrumentação para Eletroforese Capilar

Como mostrado na Figura 10, a instrumentação para eletroforese capilar é simples. Um

capilar de sílica fundida preenchido com solução-tampão, tipicamente com 10 a 100 µm de

diâmetro interno e 40 a 100 cm de comprimento, estende-se entre dois reservatórios de

solução-tampão que também contêm dois eletrodos de platina. A introdução da amostra é feita

em uma extremidade e a detecção na outra. A polaridade da alta tensão pode ser como está

indicada ou invertida para permitir a separação de ânions.

Figura 10 – Esquema de um sistema para eletroforese capilar por zona.

Embora a instrumentação seja conceitualmente simples, há grandes dificuldades

experimentais na introdução da amostra e na detecção, devido aos volumes muito pequenos

envolvidos. Uma vez que o volume de um capilar normal é da ordem de 4 a 5µL, os volumes

de injeção e detecção devem ser da ordem de alguns nanolitros ou menor.

2.3 APLICAÇÕES DE ELETROFORESE CAPILAR

Separações por eletroforese capilar são feitas de várias formas chamadas modos. Deve-

se salientar que esses modos foram empregados primeiramente em eletroforese em placa e,

depois, adaptados para separações por eletroforese capilar. Estes modos incluem eletroforese

capilar por zona (CZE), eletroforese capilar em gel (CGE), focalização isoelétrica capilar

(CIEF) e isotacoforese capilar (CITP). As seções que se seguem ilustram aplicações típicas

de cada uma dessas técnicas.

2.3.1 Eletroforese Capilar por Zona (CZE)

Na eletroforese capilar por zona, a composição do tampão é constante na região da

separação. O potencial aplicado faz com que os diferentes componentes iônicos da mistrua

migrem de acordo com a sua própria mobilidade e se separem emm zonas que podem ser

completamente resolvidas ou apresentar superposição parcial.

2.3.1.1 Separação de Íons Pequenos

Na maioria das separações de íons pequenos por eletroforese, verificou-se que, para

diminuir o tempo, o melhor é deslocar os íons do analito na mesma direção, do fluxo

eletroosmótico. Assim, em separações de cátions, as paredes do capilar não são tratadas e o

fluxo eletroosmótico e o movimento dos cátions vão em direção ao cátodo. Em separação de

ânions, por outro lado, o fluxo eletroosmótico é usualmente invertido, tratando-se as paredes

do capilar com um sal de alquilamônio, como brometo de cetil-trimetilamônio. Os íons de

amônio positivamente carregados ligam-se à superfície carregada negativamente da sílica e,

por sua vez, criam uma dupla camada de solução carregada negativamente, que é atraída para

o ânodo, revertendo assim o fluxo eletroosmótico.

Várias razões importantes para a adoção de métodos de eletroforese foram identificadas:

baixo custo dos equipamentos, menores tamanhos de amostras, velocidade muito maior e

melhor resolução.

Os tamanhos de amostras para eletroforese estão no intervalo de nanolitros enquanto

que amostras de microlitros ou maiores usualmente são necessárias em outros tipos de análise

de íons pequenos. Assim, os métodos de eletroforese são mais sensíveis que os outros

métodos baseados em massa (mas comumente não-baseados em concentração).

A Figura 11 ilustra a rapidez e a resolução insuperáveis das separações por eletroforese

para ânions pequenos. Neste caso, 30 ânions foram separados em exatos 3 minutos.

Tipicamente, uma separação por troca iônica de apenas três ou quatro ânions seria feita neste

mesmo breve tempo. A Figura 30-11 ainda ilustra a velocidade na qual as separações podem

ser feitas. Neste caso, 19 cátions foram separados em menos de dois minutos.

Figura 11 – Eletrograma mostrando a separação de 30 ânions. Diâmetro interno do capilar: 50micrômetros(sílica fundida). Detecção: UV indireta, 254 nm.

2.3.1.2 Separação de Espécies Moleculares

Muitos herbicidas, pesticidas e fármacos sintéticos pequenos que são iônicos ou cujos

derivados podem ser iônicos, podem ser separados e analisados por CZE. Proteínas,

aminoácidos e carboidratos são separados em tempos mínimos por CZE. No caso de

carboidratos neutros, as separações são precedidas pela formação de complexos de borato

carregados negativamente. Esses complexos são formados se um tampão de borato for usado

como meio de separação.

2.3.2 Eletroforese Capilar em Gel (CGE)

A eletroforese capilar em gel é comumente realizada em uma matriz polimérica porosa

de gel, cujos poros contêm uma mistura tamponada na qual a separação é feita. Nos primeiros

estudos de eletroforese em placa(veja Figura 12), a finalidade primária do meio polimérico

era reduzir a dispersão do analito por convecção e difusão e propiciar um meio que pudesse

ser usado convenientemente para detecção e varredura.

Figura 12 – Aparelho de eletroforese capilar em gel(CGE).

Verificou-se depois que esse tipo de meio gera uma ação de peneira molecular que

retarda a migração das espécies em diferentes graus, dependendo do tamanho do poro do

polímero e do tamanho dos íons do analito. Esse tipo de ação de peneira é particularmente útil

na separação de macromoléculas, como proteínas, fragmentos de DNA e oligonucleotídeos

que têm substancialmente a mesma carga, mas diferem no tamanho. Atualmente, a maioria

das separações por eletroforese em macroescala é feita em placa de gel. Algumas separações

por eletroforese capilar de espécies que diferem em tamanho também são feitas em géis

contidos em tubos capilares.

O tipo mais comum de gel usado em eletroforese é um polímetro de poliacrilamida

formado pela polimerização de acrilamida (CH2═CH─CO─NH2) na presença de um agente

de cruzamento. O tamanho de poro do polímetro depende da relação entre o monômero e o

agente de cruzamento (agente de ligações cruzadas). Quanto maior a quantidade de agente de

cruzamento, menor o tamanho do poro. Outros géis usados são: agarose, um polissacarídeo

extraído de uma alga marinha, metilcelulose e polietileno-glicol.

2.3.3 Isotacoforese Capilar (CITP)

Em isotacoforese capilar, todas as bandas de analito migram na mesma velocidade. Daí

o nome isso para igual e taco para velocidade. Em uma aplicação particular, tanto cátions

como ânions podem ser separados, mas não ambos ao mesmo tempo. Em uma separação, a

amostra é injetada entre duas soluções-tampão: a primeira contendo íons de maior mobilidade

do que qualquer dos íons presentes no analito e a final com íons de mobilidade mais baixa do

que a dos íons da amostra. Por exemplo, na separação de ânions os íons cloreto que se movem

muito rapidamente devem estar contidos na primeira solução-tampão e os íons heptanoato que

se movem lentamente devem estar no tampão final. Para uma separação de ânions, a primeira

solução de eletrólito está conectada ao ânodo e a outra, final, ao cátodo.

Quando o potencial é aplicado em uma separação isotacoforética, os íons do analito

migram como em eletroforese por zona, cada íon com sua velocidade única, dada pelo

produto µeE.

2.3.4 Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)

A focalização isoelétrica capilar é usada para separar espécies anfipróticas, como

aminoácidos e proteínas, que contêm um grupo carboxílico fraco e um grupo amina que é

uma base fraca.

2.3.4.1 Propriedades de Compostos Anfipróticos

Um composto anfiprótico é uma espécie que, em solução, é capaz de doar e receber

prótons.

2.4 ELETROCROMATOGRAFIA CAPILAR (CEC)

A eletrocromatografia capilar (em inglês, CEC – capillary electrochromatography) é

um híbrido da eletroforese capilar com HPLC e oferece algumas das melhores características

de cada uma das duas técnicas.

A eletrocromatografia capilar (CEC) parece oferecer várias vantagens sobre as técnicas

que a originaram. Primeiro, assim como a HPLC, pode ser aplicada na separação de espécies

não-carregadas. Segundo, como a eletroforese capilar, permite separações altamente eficientes

de microvolumes de solução de amostra sem a necessidade de sistema de bombeamento a alta

pressão. Na eletrocromatografia, uma fase móvel é transportada através de uma fase

estacionária pelo bombeamento eletrosmótico do fluxo em vez de bombeamento mecânico,

simplificando de modo significativo o sistema.

2.4.1 Eletrocromatografia em Coluna Empacotada

A eletrocromatografia baseada em colunas empacotadas é a menos amadurecida entre as

várias técnicas de eletrosseparação. Neste método, um solvente polar é dirigido pelo fluxo

eletrosmótico através de um capilar empacotado com uma fase estacionária do tipo HPLC em

fase reversa. As separações dependem da distribuição das espécies do analito entre a fase

móvel e a fase estacionária líquida mantida no empacotamento.

3. LIMITE DE DETECÇÃO

A definição qualitativa mais aceita de limite de detecção é da concentração ou da

massa mínima de analito que pode ser detectada em um nível conhecido confiável. Este limite

depende da razão entre a magnitude do sinal do analítico e o tamanho das flutuações

estatísticas no sinal do branco. Insto é, a menos que o sinal analítico seja maior do que branco

por um fator múltiplo de k da variação no branco devido aos erros aleatórios, é impossível

detectar o sinal analítico com certeza. Então, assim que o limite de detecção for atingido, o

sinal do branco e de seu desvio-padrão. O sinal analítico mínimo distinguível é então tomado

como a soma do sinal médio do branco mais um múltiplo de k do desvio-padrão do branco.

4. CALIBRAÇÃO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Com duas exceções, todos os métodos analíticos requerem calibração, um processo

que relaciona o sinal analítico medido com a concentração do analito. Os três tipos mais

comuns de calibração incluem a preparação e o uso de uma curva de calibração, o método de

adição de padrão e o método todo de padrão interno.

4.1 Curvas de Calibração

Para o uso da técnica de curva de calibração, vários padrões que contêm concentrações

do analito conhecidas exatamente são introduzidas no instrumento, e a resposta instrumental é

registrada. Normalmente, essa resposta é corrigida para o valor obtido com o branco no

instrumento. Idealmente, o branco contém todos os componentes da amostra original exceto o

analito. Os dados resultantes são então colocados em um gráfico com a resposta do

instrumento corrigida versus à concentração do analito, como mostra a Figura 13.

Figura 13 – Gráfico de calibração linear para método de adição de padrão. A concentração da solução desconhecida pode ser calculada a partir da inclinação m e o intercepto b.

Na Figura 13, é mostrada uma curva de calibração típica. Gráficos, tais como este, que

são lineares em um intervalo de concentração significativo(a faixa dinâmica) geralmente são

obtidos e almejados porque estão menos sujeitos a erros do que curvas não-lineares.

Entretanto, de modo não raro são observados gráficos não-lineares que requerem um grande

número de dados de calibração para estabelecer grande número de dados de calibração para

estabelecer exatamente a relação entre a resposta do instrumento e a concentração.

Usualmente, a equação é ajustada à curva de calibração pela técnica de mínimos quadrados de

forma que as concentrações da amostra possam ser calculadas diretamente.

O sucesso do método da curva de calibração é muito dependente da exatidão com que

são conhecidas as concentrações dos padrões e quão próxima a matriz dos padrões está da

matriz das amostras a serem analisadas. Infelizmente, estabelecer esta similaridade de matriz

entre amostras complexas e padrões geralmente é difícil ou impossível de ser feita, e os

efeitos da matriz levam a erros de interferência. Para minimizar os efeitos da matriz,

normalmente é necessário separar analito do interference antes de obter a resposta medida do

instrumento.

4.2 Métodos de adição de Padrão

Os métodos de adição de padrão são particularmente úteis na análise de amostrar

complexas, nas quais a probabilidade de efeitos de matriz é alta. Um método de adição de

padrões pode ser implementado de diversas formas. Uma das mais comuns envolve a adição

de um ou mais incrementos de uma solução-padrão a alíquota da amostra de mesmo volume.

Esse processo é freqüentemente denominado de spiking. Deve ser observado que, quando a

quantidade de amostra é limitada, as adições podem ser feitas por sucessivas introduções de

incrementos do padrão a um único volume medido da amostra. As medidas são realizadas

com a amostra original e depois com a amostra mais o padrão, após cada adição. Na maioria

das versões do método de adição de padrão, a matriz da amostra permanece quase inalterada

após cada adição, a única diferença é a concentração do analito ou, em casos que envolvem a

adição de um excesso de um reagente analítico, a concentração do reagente. Todos os outros

constituintes da mistura reacional deveriam ser idênticos porque os padrões preparados em

alíquotas da amostra.

4.3 Método de Padrão Interno

Um padrão interno é uma substancia que é adicionada em quantidade constante a todas

as amostras, aos brancos e os padrões de calibração em uma análise. Alternativamente, pode

ser um componente principal das amostras e padrões que está presente em uma quantidade

suficientemente grande de modo geral que sua concentração pode ser considerada constante

para todos os casos. A calibração envolve, então colocar em m gráfico a razão entre o sinal do

analito e o sinal do padrão interno em função da concentração do analito para obter as

concentrações de analito a partir da curva de calibração.

Uma grande dificuldade da aplicação do método do padrão interno é a de encontrar

uma substancia adequada para servir como padrão interno e introduzir essa substancia tanto

na amostra como nos padrões de modo reprodutível. O padrão do analito em vários aspectos,

mas suficientemente diferente para ser facilmente distinguível pelo instrumento. O padrão

interno deve estar ausente da matriz da amostra de forma que a única fonte de padrão seja a

quantidade adicionada. Por exemplo, o lítio é um bom interno para a determinação de sódio

ou potássio em soro sanguíneo porque o comportamento químico do lítio é similar a ambos os

analitos, mas não ocorre naturalmente no sangue.

Como exemplo, o método do padrão interno é freqüentemente usado na determinação

de traços de elementos em metais por espectroscopia de emissão. Assim, em determinações de

partes por milhão de antimônio e estanho em chumbo para ser usado por fabricantes de

baterias, a intensidade relativa de uma linha forte de cada um dos componentes minoritários

pode ser comparada cm a intensidade de uma linha fraca para o chumbo.

Para que tal procedimento seja bem-sucedido, muito tempo e esforço são necessários

na preparação de um conjunto de amostras de chumbo puro que contenham concentrações de

antimônio e estanho exatamente conhecidas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

SKOOG, D.A. et. al. Princípios de análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. p. 27-31, p. 567-595, p. 687-702.

UNIVERSIDADE PARANAENSE – UNIPAR

RECONHECIDA PELA PORTARIA – MEC N° 1580, DE 09/11/93 – DOU 10/11/93. MANTENEDORA ASSOCIAÇÃO PARANAENSE DE ENSINO E CULTURA – APEC

Introdução, Fundamentação e Aplicação de Métodos Analíticos:

1. Voltametria;

2. Eletroforese;

3. Conceitos de Limites de Detecção; e

4. Calibração de Métodos Instrumentais.

Curso: Química – 4° Ano.Disciplina: Análise Instrumental.

Acadêmicas: José Luiz Banhara Júnior RA: 33875.Regiane da Silva Gomes RA: 33890.Alaine de Moura Lino RA: 34229.

Professor: José Gaspar Ferrarezi.

NOVEMBRO - 2007