UPCII M MicrobiologiaTeórica 23-24

2º Ano

2013/2014

Sumário

T 23-24 MJC 2

E. Patologia Oral de Etiologia Microbiana Capítulo XIX. Cárie

Etiologia Bacteriana da cárie Modelos animais Imunologia da cárie e vacinas Aplicação de técnicas moleculares ao estudo da cárie Implicações para terapêutica

20-11-2013

Cárie – O que é?

20-11-20133 T 23-24 MJC

SALIVA

Progressão da carie

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Tipos de carie Da superfície do dente Das fissuras ou zonas interproximais Radicular Recidiva Rampante Carie de biberão

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Etiologia Bacteriana Streptococci:

mutans sanguinis gordonii sobrinus salivarius mitis anginosus ....

S. mutans: a S. cricetus b S. ratti (us) c S. mutans d S. sobrinus e S. mutans f S. mutans g S. sobrinus

20-11-20136 T 23-24 MJC

Grupo IV

Grupo II

Grupo I

Grupo III

ADESINAS PECS

Além dos streptococci …. Lactobacilli (dificuldade em colonizar

superfícies lisas) Actinomyces

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Bifidobacterium, Propionobacterium, Veillonella, AttopobiumAtopobium, Olsenella, Pseudoramibacter, Propionibacterium e Selenomonas

Rothia, Propionibacterium

CÁRIE TEM MICROBIOLOGIA COMPLEXA

Factores de Virulência de Streptococci

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Factores de virulência de streptococci

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Glucanos e Frutanos

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Glucanos e Frutanos

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20-11-2013

Metabolismo da sacarose por S.mutans

Glucosiltransferase

Glucanos alfa(1,3) e alfa(1,6)

+

Frutose

Fructanos beta(2,1) e beta(2,6)

+

Glicose

GlicoseDextranase

Fructanase

PSI

Fructosiltransferase

T 23-24 MJC T09-1012

Factores de virulência de S. mutansFactor Função Localização

SpaP (AgB, AgI/II), PI Aderência (saliva, aglutinina gp340) Superficie da célula

Proteinas de ligação ao glucano (GbpA-C)

Aderência aos glucanos (dentes e biofilme) Superfície da célula

Glucosyl transferases (GtfB-D) Produção de polímeros de glicose apartir da sacarose (glucanos)

Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Fructosyl transferase (Ftf) Produção de polímeros de fructose apartir da sacarose (fructanos – reservas extracelulares de glicose)

Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Fructanase Hidrólise dos fructanos. Aumenta e preserva a acidificação

Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Dextranase Hidrólise de glucanos Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Polissacarideos intracelulares Polímero intracelular de glicose Intracelular

Fosfoenolpiruvato:fosfotransferase (PTS)

Cataliza internalização de vários açucares em baixas concentrações extracelulares

Membrana/citoplasma

ATPases (F1F0 ATPase ou H+ATPase)

Complexo enzimático que bombeia H+ para fora da célula. Importância?

F0 membranar F1 citoplasmático

Tolerância ao ácido Vantagem competitiva em pH baixo Global e multifactorial

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Biofilme e controlo do QS Os CSP

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Factores envolvidos

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Factores envolvidos

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Mais factores

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Fluor na prevenção da cárie

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Prevenção da carie

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Estudo das caries – Modelos animais

Rat (ratazana) Tamanho Desenvolvem cárie

segundo dieta (4 semanas)

Modelos gnotobióticos e pathogen free

16-21 dias todos os molares infecção

MI Alterações do esmalte

Cães, gatos, cavalos, porcos. Primatas.

20-11-2013 20T 23-24 MJC

Técnicas de BM usadas1. Clonagem de genes / Sequenciação2. Mutações no cromossoma de S.mutans. Em

que genes?3. Produção de potenciais proteínas de puras

para estudos bioquímicos. Quais? 4. Expressão de genes de virulência.5. Expressão de genes em heterólogos.6. Utilização de bactérias com moléculas

repórter para a expressão de determinados genes.

20-11-201321 T 23-24 MJC

1. Clonagem de genes Genes codificantes de proteínas

extracelulares envolvidas na formação de polímeros de açucar.

O que se sabia? Gtf e Ftf glucosiltransferase e

fructosiltransferase O que não se sabia?

Como eram regulados? Quantos genes existiam? Como é que as proteínas contribuiam para a

virulência?

20-11-201322 T 23-24 MJC

1. Clonagem de genes Quantos genes existiam?

Existem 3 genes gtf diferentes em cada estirpe Existe 1 gene ftf

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2. Mutação dos genes de S. mutans Como é que as proteínas contribuem para a

virulência? Fazendo mutação dirigida Com os genes gtf e ftf mutados a capacidade de

provocar patologia é bastante diminuida.

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3. Produção de potenciais proteínas de puras para estudos bioquímicos

Cada uma das enzimas têm domínios conservados Há dois domínios

Um enzimático para a síntese do glucano Um de reconhecimento e ligação ao glucano

(específico de mutans)

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4. Expressão de genes de virulência

Quando são os genes gtf activados? Quando há baixo pH

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Outras questões além de gtf

Síntese de polisacarídeos intracelulares de armazenamento

Internalização dos vários açucares Proteínas de superfícies (AgI/II) Biofilmes

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Caracterização das respostas ao stress

Identificação dos genes Criação de mutantes Criar quimeras genéticas para observar o

efeito das mutações. Para quê saber as respostas ao stress?

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Respostas ao pH

+ 100 proteínas diferentes são expressas a pH 5.0

61 são bombas de protões ATPase Algumas são enzimas para produzir amónia

intracelularmente. Como pode ser amonia produzida

intracelularmente? Produção de S.mutans com urease do

S.salivarius

20-11-201329 T 23-24 MJC

PCR “Isolamento” de genes de função

desconhecida. Cerca de 1/3 do genoma de S. mutans codifica

proteínas de função desconhecida. Estudos de expressão por microarrays.

20-11-201330 T 23-24 MJC

Microarrays Não servem para estudar proteínas cujo

controlo é feito pós transcrição. Qual é a solução?

20-11-201331 T 23-24 MJC

Vacinas contra cáries Produção sistémica de anticorpos memória

S.mutans (superfícies sólidas) sIgA

Resposta de curta duração Reforços

Especificidade Etiologia Factores de virulência

Adesão Formas de vacinação

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Antigénios e modos de imunização Comprimidos de S. mutans inactivado Proteínas secretadas ou expressas por

S.mutans Gtfs, Gbps, ag (I/II) e SpaP

Disponibilização dos antigénio o máximo de tempo Tecido linfóide na associação da mucosa nasal e oral Peyer’s patches intestino

Moléculas inteiras combinadas com partículas de alumínio, incluídas em esferas de poli-L-lactose.

Actualmente partes das moléculas: Mais eficazes Mais fáceis de recombinar (junção da parte

antigénica com toxinas aumenta longevidade da resposta)

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Antigénios e modos de imunização Bactérias vivas (Salmonella enterica)

Recombinante c/ agI/II + subunidade beta da toxina da colera.

Administrado na mucosa nasal e no intestino

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Segurança das vacinas Ensaios em humanos

Soro de ratos imunizados com Strep. mutans reagia com tecido cardíaco.

O material a ser utilizado como imunogénico tem de estar livre de material que possa ser prejudicial ao hospedeiro.

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Resumo das estratégias de imunização

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Novas perspectivas Cárie tem etiologia microbiana mas...

Polimicrobiana Há outros factores...

Relação com o pH (bem estabelecida) mas poucas terapêuticas exploram este factor.

Remineralização diminuída Conhecem-se alguns dos mecanismos associados à

recuperação da dentina. Concentração dos iões necessários à reminenalização

Terapêuticas inovadoras com Células estaminais Substituição de microrganismos não acidogénicos

no biofilme oral20-11-2013T 23-24 MJC 37

Bibliografia

T 23-24 MJC 38 20-11-2013

Capítulo 11

Capítulo 32

Capítulo 16-19