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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ – UNIVALI

CENTRO DE CIÊNCIAS DA TERRA E DO MAR – Cttmar

Curso de Oceanografia

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE LINHAGENS SIMILARES À Bacillus stratosphericus ISOLADAS DE AMBIENTES MARINHOS PROFUNDOS

Etieli Amiel Cortez

ORIENTADOR: Msc. Marcus Adonai Castro da Silva

Modalidade: Pesquisa

Área de conhecimento: Oceanografia Biológica

ITAJAÍ

NOV/2012

http://lattes.cnpq.br/1194705917531306

ii

ETIELI AMIEL CORTEZ

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE LINHAGENS SIMILARES À Bacillus stratosphericus ISOLADAS DE AMBIENTES MARINHOS PROFUNDOS

Monografia apresentada como requisito parcial para a obtenção do titulo de oceanógrafo na Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar.

ORIENTADOR: Msc. Marcus Adonai Castro da Silva

ITAJAÍ

NOV/2012

http://lattes.cnpq.br/1194705917531306

iii

DEDICATÓRIA

DEDICO A TODOS QUE ME APOIARAM NESSA

ETAPA DA MINHA VIDA, PRINCIPALMENTE

AOS MEUS PAIS E FAMILIARES.

iv

“Ser feliz é sentir o sabor da água, a brisa no rosto, o cheiro de terra molhada,

É extrair das pequenas coisas, grandes emoções

É encontrar motivos para sorrir, mesmo quando não existam grandes fatos

É rir de suas própria tolices. É não desistir de quem se ama, é ter amigos

É agradecer,a cada dia, pelo milagre que é viver!”

Augusto Cury

v

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos os professores que contribuíram para a minha formação

dentro desse curso.

Ao meu orientador Marcos Adonai Castro da Silva pela oportunidade de

desenvolver esse trabalho. Pelo apoio e confiança que depositou em mim, afim de

realizar um trabalho importante dentro do LAMA em tão pouco tempo.

Agradeço a equipe do Laboratório de Microbiologia aplicada e do Laboratório

Genética Molecular da UNIVALI pela ajuda na realização dos experimentos .

Ao meu namorado Marcos Dulor, por ser uma pessoa compreensiva,

paciente, por me apoiar e me ajudar nos momentos mais difíceis e acima de tudo por

me aguentar nos momentos de stress e compreender que tudo era por um bem maior

e necessário. Agradeço também pelo simples fato de estar presente na minha vida

sempre cuidando de mim com muito carinho e atenção.

A minha irmã de alma Tássia que já é formada em oceano e já fez

intercambio sem sair de Uruguayork. Obrigada mesmo pelas noites de conversa,

conselhos e as ajudas que me destes durante esse tempo. Tenho certeza de que

amigos são uma família que podemos escolher, e nos escolher por vários motivos.

A todos os amigos, que por muitas vezes foram incansáveis e nunca me

deixaram desistir, logo acabaram por viver todas as conquistas e os fracassos junto

comigo.

Agradeço também as meninas do LAMA pelas tardes engraçadas, pelas

conversas, conselhos e ajuda,

Aos meus pais pelo apoio integral desde o momento em que escolhi minha

futura profissão sem ter a certeza de que era a certa, pela força e por serem os

responsáveis pela minha formação, educação e caráter. Devo a eles tudo que sou

hoje e sem eles eu não seria nada.

De um modo mais geral agradeço a toda a minha família pela compreensão e

apoio nesses anos de estudo, pela ajuda e apoio.

vi

RESUMO

Bacillus stratosphericus é uma espécie de bactéria descrita originalmente em amostras

de ar de grandes altitudes. Recentemente nosso grupo de pesquisa realizou o

isolamento de seis linhagens filogeneticamente similares a esta espécie, a partir de

amostras de sedimentos marinhos de grandes profundidades (em torno de 5000m), o

que nos levou ao questionamento sobre a posição taxonômica destas linhagens

marinhas. Neste contexto, o objetivo principal foi caracterizar fenotipicamente as seis

linhagens isoladas da espécie em questão de ambientes marinhos. As características

analisadas incluem caracteres morfológicos como forma da célula e motilidade,

fisiológicos como crescimento em diferentes temperaturas, bioquímicos como

utilização de açucares, e resistência a antibióticos. Estes resultados permitem,

juntamente com os estudos que já vem sendo realizados nos Laboratórios de

Microbiologia Aplicada e Genética Molecular da UNIVALI, comprovar que estas

linhagens de B. stratosphericus são organismos similares/idênticos ou apenas

adaptados ao ambiente de onde foram coletadas, quando comparadas com a

descrição da linhagem encontrada na estratosfera. Com a realização dos testes

citados anteriormente pode-se verificar que nos testes morfológicos as linhagens

estudadas foram semelhantes a linhagem tipo. Já nos testes fisiológicos e bioquimicos

as linhagens originadas de sedimentos marinhos profundos, de um modo geral,

apresentaram algumas diferenças quando comparadas a linhagem tipo, descrita por

Shivajii et al(2006). O amplo espectro de temperaturas de crescimento e as

concentrações de salinidade apresentados pelas seis linhagens do estudo, o fato de

não ter a capacidade de realizar a hidrolise da ureia, gelatina e amido, a não utilização

de acido a partir da maltose e a não produção de acetoina foram as principais

diferenças observadas, fazendo com que exista uma restrição de locais, onde seria

possível a presença destes micro-organismos. Outros resultados importantes dizem

respeito a maior sensibilidade a antibióticos apresentados pelas linhagens utilizadas

neste trabalho. Com bases nesses resultados e utilizando análises estatísticas foi

possível verificar uma diferença entre as linhagens originadas de sedimentos

profundos e da Bacillus stratosphericus LAMA 736, que é pelágica. Podemos concluir

que as espécies isoladas de ambientes marinhos profundos eram mais similares

dentre si do que com a linhagem tipo, que possivelmente trata-se de um micro-

organismo terrestre e de uma espécie diferente da descrita por Shivajii et al (2006).

Palavras Chave: Bacillus stratosphericus; ambiente marinho profundo; fenótipo

vii

Lista de figuras

Figura 1: Mapa de localização dos pontos de coleta ..................................................... 8

Figura 2: Ilustração de resultados de resistência a antibióticos ................................... 13

Figura 3: Dendograma dos dados da caracterização das linhagens ........................... 14

viii

Lista de tabelas

Tabela 1: Micro-organismos utilizados neste trabalho ................................................... 7

Tabela 2: Caracterização morfologia dos micro-organismos ....................................... 10

Tabela 3: Caracterização fisiológica dos micro-organismos ........................................ 11

Tabela 4: Caracterização bioquímica dos micro-organismos ...................................... 12

Tabela 5: Resistência à antibióticos ............................................................................ 13

ix

SUMÁRIO

Resumo ...................................................................................................................... vi

Lista de figuras ......................................................................................................... vii

Lista de tabelas ........................................................................................................ viii

1 Introdução ................................................................................................................ 1

2 Objetivos .................................................................................................................. 3

2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 3

2.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 3

3 Fundamentação teórica ........................................................................................... 4

3.1.Métodos de taxonomia bacteriana ....................................................................... 4

3.2.Biologia da espécie Bacillus stratosphericus ....................................................... 5

4 Metodologia .............................................................................................................. 7

4.1 Micro-organismos utilizados no estudo ................................................................ 7

4.2 Caracterização morfológica ................................................................................. 8

4.3 Caracterização bioquímica e fisiológica ............................................................... 7

4.4 Avaliação da resistência a antibióticos ................................................................ 9

4.5 Analise estatística ............................................................................................... 9

6 Resultados ............................................................................................................. 10

6.1 Características morfológicas ............................................................................. 10

6.2 Características fisiológicas ................................................................................ 10

6.3 Características bioquímicas ............................................................................... 11

6.4 Resistência a antibióticos .................................................................................. 12

6.5 Análise estatística ............................................................................................. 13

7 Discussão ............................................................................................................... 15

8 Conclusão .............................................................................................................. 19

9 Referencias ............................................................................................................ 20

10 Anexos .................................................................................................................. 24

1

1.Introdução

A microbiologia tem como definição clássica a área da ciência que se dedica ao

estudo de organismos que somente podem ser visualizados ao microscópio. Tendo

esse conceito como base, a microbiologia aborda um vasto e diverso grupo de

organismos, que podem ser encontrados como células isoladas ou agrupadas em

diferentes arranjos. Assim, a microbiologia envolve o estudo de organismos

procarióticos (bactérias, archaeas), eucarióticos (algas, protozoários, fungos) e

também seres acelulares (vírus) (ALTERTHUM, 2008).

Pode-se dizer que uma das principais áreas da microbiologia é a classificação

(taxonomia) microbiana; essa permite que os cientistas observem as relações entre os

organismos e torna possível a determinação de uma linha evolutiva. Na taxonomia

bacteriana, várias características são analisadas e em seguida utilizadas para reunir

os organismos em uma escala taxonômica, de espécie a domínio. Aspectos

morfológicos, nutricionais, fisiológicos e de habitat são exemplos de características de

importância taxonômica e amplamente utilizados (MADIGAN et al, 2004).

Os ecossistemas marinhos, especialmente os mares profundos, abrigam uma

grande diversidade filogenética de micro-organismos. Estes podem ter grande

importância ecológica e biotecnológica. Sua capacidade de sobreviver e manter suas

atividades mesmo sob condições de baixa temperatura e alta pressão despertaram o

interesse da comunidade cientifica sobre os micro-organismos de mares profundos.

No entanto, as dificuldades de acesso a esses locais e a manutenção desses

organismos em laboratório, tornaram seu entendimento bastante complexo.

Em termos topográficos, os mares profundos se iniciam na quebra da

plataforma, que geralmente ocorre a 200m de profundidade. Além disso, podem-se

definir os mares profundos em termos hidrográficos como as regiões localizadas

abaixo da termoclina permanente, o que normalmente ocorre abaixo dos 800m de

profundidade (GAGE; TYLER, 1996).

Como o organismo alvo deste estudo foi encontrado em amostras de ar de

grandes altitudes é bom lembrar que estudos realizados na troposfera e estratosfera

(10-85 km de altitude), são importantes para determinar a existência de micro-

organismos no espaço (HOYLE; WICKRAMASINGHE, 1986, 1993, 1999). No entanto,

hoje já é bem reconhecido que os mesmos podem sobreviver às duras condições da

atmosfera superior e os rigores do espaço exterior (revisado por BRUCH, 1967), mas

existem poucos estudos publicados sobre a quantidade e a natureza desses

2

organismos (BRUCH, 1967; GREENE et al, 1964;. LYSENKO, 1979; ROGERS;

MEIER, 1936).

A espécie utilizada neste trabalho é Bacillus stratosphericus. A sua escolha se

deve às diferenças existentes entre os ambientes onde essa bactéria foi encontrada.

Harris et al. (2001) detectou, a partir de amostras coletadas à 41 km de altitude,

usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e técnicas de epifluorescência, a

existência de bactérias. Wainwright et al. (2003), utilizando as mesmas amostras,

descreveram a existência de duas espécies bacterinas (Bacillus simplex e

Staphylococcus pasteurii) e um fungo (Engyotontium). Além de ser encontrada em

altas altitudes, B. stratosphericus também foi detectado em sedimentos estuarinos no

recente trabalho de Zhang e colaboradores (2012). O presente trabalho visa servir

como complemento dos estudos que são realizados no Laboratório de Microbiologia

Aplicada em linhagens desta espécie, obtidas de amostras de sedimentos marinhos de

profundidade. A união deste trabalho fornecerá dados de extrema relevância para o

processo de identificação destes micro-organismos, tornando a mesma mais completa

e segura.

3

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

Caracterizar fenotipicamente seis linhagens de Bacillus stratosphericus

isoladas de amostras de sedimentos de ambientes marinhos profundos da porção

leste do Oceano Atlântico Sul

2.2. Objetivos específicos

Caracterizar morfologicamente as seis linhagens estudadas de B.

stratosphericus;

Caracterizar em termos fisiológicos e bioquímicos as seis linhagens estudadas

de B. stratosphericus;

Avaliar a resistência das seis linhagens estudadas a diferentes antibióticos:

ampicilina, penicilina, canamicina, norfloxacina, ácido nalidíxico e cloranfenicol.

Resumir as características avaliadas, visando analisar a similaridade entre os

organismos isolados.

4

3. Fundamentação teórica

3.1.Métodos de taxonomia bacteriana

A taxonomia é a ciência da classificação e é composta por duas etapas

principais: identificação e nomenclatura. A taxonomia bacteriana tradicionalmente

empregou análises fenotípicas (levando em conta a aparência e o metabolismo dos

organismos, por exemplo) como base para a classificação. Devido ao seu tamanho, as

bactérias nos fornecem poucas pistas das suas raízes evolutivas, a análise genotípica

surgiu para auxiliar os microbiologistas a identificarem com maior precisão os micro-

organismos (TORTORA, 2005)

Dentre as técnicas desenvolvidas para a identificação das bactérias estão às

baseadas nas características fenotípicas e a quimiotaxonomia, que se baseia na

análise molecular de biomoléculas presentes na célula. Existem algumas

características fenotípicas que apresentam importância taxonômica, tais como,

morfologia (forma, tamanho e a reação de Gram), motilidade (por flagelos,

deslizamento, por vesícula de gás ou imóveis), nutrição e fisiologia (mecanismos de

conservação de energia – fototrofia), quimiorganotrofia, quimiolitotrofia; relação com o

oxigênio, exigência/tolerância a temperaturas, pH e sal), e outros fatores (pigmentos,

inclusões celulares ou camadas superficiais, patogenicidade e sensibilidade a

antibióticos). Já no que se trata de taxonomia molecular podemos citar a composição

do DNA base, hibridização do DNA:DNA, ribotipagem (rRNA 16S) e análise de ácidos

graxos: MEAG (de metil éster de ácido graxo) (TRÜPER, 2006).

Hansen et al (1991) escreveram sobre a metodologia para a caracterização

fenotípica de bactérias, dizem que tais características são determinadas

essencialmente por métodos convencionais. Muitas vezes esses não são os métodos

mais adequados para a caracterização de bactérias ambientais isoladas, assim como

as marinhas; isso devido os kits utilizados terem sido projetados para uso clínico, logo,

bactérias comuns, muitas vezes de origem humana.

As bactérias marinhas em geral, são de crescimento mais lento e

bioquimicamente versáteis, muitos delas não são capazes de crescer, ou apenas

apresentam um leve crescimento nos métodos convencionais. Além disso, muitas

apresentam alguns fatores fundamentais, como a presença de vários sais e fatores

que influenciam no crescimento que não são satisfeitas pela adição de compostos

simples (por exemplo, NaCl). Em muitos casos, essas exigências podem ser

satisfeitas usando água do mar. A temperatura também é um fator importante, a

5

temperatura dos testes convencionais é 37ºC enquanto a das bactérias marinha sita-

se no intervalo de 12-20ºC, o tempo de incubação das bactérias marinhas tambem é

diferenciado do utilizado nos kits disponiveis, geralmente um tempo curto não é o

suficiente para as bactérias marinhas expressarem seu fenótipo num grau observável.

3.2. Biologia da espécie Bacillus stratosphericus

Em um trabalho recente, Shivaji et al, (2006) realizaram um estudo taxonômico

de cepas bacterianas isoladas a partir de tubos criogênicos utilizados para coleta de

amostras de ar em grandes altitudes. Como resultado estes autores descreveram

quatro novas bactérias do gênero Bacillus, dentre as quais B. stratosphericus, utilizada

nesse trabalho.

As características de B. stratosphericus incluem a produção de colônias de

coloração branca, crescimento entre 8 e 37ºC, entre pH 6 e 10, com tolerância de até

17,4% de NaCl. São resistentes a radiação UV, e apresenta crescimento em peptona.

Os principais ácidos graxos são iso-C17:0, anteiso-C15:0, iso-C15:0, C16:111cis e

C16:0. Os lipídios são fosfatidil etanolamina, fosfatidil glicerol, difosfodiacilglicerol e

dois fosfolipídios desconhecidos (SHIVAJI et al., 2006).

Zhang e colaboradores (2012) publicaram um artigo no qual eles descrevem

um ambiente estuarino, onde foi também foi encontrada a bactéria alvo desde

trabalho. Neste trabalho os autores discutem a possibilidade desta bactéria de produzir

energia. Cooper et al. (2010) realizaram um experimento para testar as respostas

biológicas de Bacillus stratosphericus às descargas dielétricas. Os autores obtiveram

fenômenos semelhantes às demais bactérias, como perda e desintegração da

membrana, e danos ao DNA com o tratamento com plasma de ar seco. Além disso,

quando tratadas no estado líquido, as espécies reativas de oxigenio são capazes de

inativar as bactérias testadas através de danos letais e subletais.

Odisi et al (2012) realizaram a caracterização da bactéria Bacillus

stratosphericus LAMA 585 nos seguintes quesitos: i) localização das enzimas (extra ou

intracelular), ii) temperatura otima de β -glucosidase, exoglucanase, endoxilanase,

esterase e lipase, e iii) crescimento específico e a produção de enzimas. De acordo

com eles a bacteria apresentava atividade extracelular, dessas enzimas integrada à

membrana, mais elevada que a intracelular, essa caracteristica pode ser associada

com o ambiente onde foram encontradas; a baixa temperatura pode causar

desnaturação das enzimas, devido às enzimas intracelulares apresentarem proteção à

desnaturação no frio, podendo ter sido viavel devido à produção e acumuação de

solutos compatives, como glutamato de postassio. A temperatura ótima foi estimada

6

em: 50ºC para β–glucosidase e exoglucanase, 40ºC para endoxilanase e lipases, 20ºC

para esterase. Por ultimo foi realizado o crescimento isolado em meio Luria Bertani e

Meio Mineral, avaliando em conjunto a produção de enzimas; respectivamente os

crescimentos específicos foram 0,388h-1 1e 0,253h-1, uma concentração mais elevada

de células tambem foi obtido em meio LB. A produção de celulases e lipases seguiram

basicamente o mesmo padrão, o que nos mostra que as enzimas são produzidas

constitutivamente e não necessitam de um indutor para a sua produção, que está

intimamente ligada com o crescimento.

Silva et al. (comunicação pessoal) realizaram o isolamento e o estudo

taxonomico e identificação de quatro das seis linhagens bacterianas utilizadas neste

trabalho, sendo elas LAMA 713, LAMA 762, LAMA 781 e LAMA 892. De acordo com o

estudo essas linhagens contêm genes 16S similares ao do micro-organismo estudado

por Lima et al. (comunicação pessoal). Todas estas seis linhagens foram provenientes

de amostras de sedimentos marinhos de profundidade, da porção leste do Oceano

Atlântico Sul, algo inesperado, considerando a espécie identificada e o habitat no qual

foi originalmente descrita.

1 h

-1, unidade usada pra expressar duplicação dos organismos por hora.

7

4. Metodologia

4.1. Micro-organismos utilizados no presente estudo

Neste trabalho foram utilizados os organismos LAMA 585, LAMA 713, LAMA

762, LAMA 781, LAMA 736 e LAMA 892, isolados previamente de sedimentos

marinhos profundos e pertencentes à espécie B. stratosphericus (Tabela 1). O

isolamento foi realizado por Castro-Silva (em preparo) e Odisi et al., (2012) como parte

do programa Programa MAR – ECO Atlântico Sul “Patterns and Processes of the

Ecosystems of the Southern Mid-Atlantic” – Census of Marine Life (CoML), sob

coordenação do prof. Dr. Angel Alvarez Perez. Durante o trabalho os organismos

foram mantidos no laboratório de Microbiologia Aplicada em placas de Petri contendo

o meio Agar Marinho, sendo repicadas mensalmente.

Tabela 1. Micro-organismos utilizados neste trabalho, local de origem, profundidade e

data de coleta.

Micro-organismo Local Data Profundidade

B. stratosphericus LAMA 585 Super Estação 2 3/11/2009 902

B. stratosphericus LAMA 713 Geológica 3, 70cm 24/11/2009 5200

B. stratosphericus LAMA 736 Planície Abissal da

Argentina 15/11/2009 1800

B. stratosphericus LAMA 762 Super Estação 10 23/11/2009 4400

B. stratosphericus LAMA 781 Geológica 3, 10cm 24/11/2009 5200

B. stratosphericus LAMA 892 Planície Abissal do

Cabo 25/11/2009 1107

8

Figura 1: Mapa com a localização dos pontos de coleta dos organismos: LAMA 585 marcador azul, LAMA

713 (70cm) e LAMA 781 (10cm) marcador amarelo, LAMA 736 marcador vermelho, LAMA 762 marcador verde e LAMA 892 marcador roxo

4.2. Caracterização morfológica dos micro-organismos

Os micro-organismos selecionados foram caracterizados em relação a sua

morfologia. As características morfológicas determinadas foram: morfologia e arranjo

celular, presença de inclusões e vacúolos, motilidade, produção dos endósporos

(cultura em crescimento exponencial e fase estacionária por microscopia de contraste

de fases) e tipo de parede celular, pelo método da lise do KOH (BUCK, 1982).

4.3. Caracterização bioquímica e fisiológica dos micro-organismos

Os micro-organismos também foram estudados em relação com suas

características fisiológicas e bioquímicas. Os testes fisiológicos realizados foram:

crescimento em anaerobiose (meio O/F com glicose), crescimento em diferentes

temperaturas (5, 8, 37 e 40ºC), feito em Agar marinho e crescimento a 0 e 17,4% de

NaCl utilizando caldo nutriente. Os valores escolhidos de concentração salina e de

temperatura baseiam-se na descrição original da espécie. Os testes bioquímicos

utilizados foram: teste de metabolismo oxidativo e/ou fermentativo (meio O/F), hidrólise

de amido, da gelatina, da caseína e da ureia (caldo ureia), redução de nitrato (caldo

nitrato), produção de acetoína (teste de Vorges-Proskauer), utilização de citrato,

9

acidificação do meio a partir de açucares como: manitol, lactose, glicose, xilose,

arabinose, maltose e frutose, produção de catalase e citocromo oxidase, e produção

de indol e H2S (meio sim). Os testes bioquímicos e fisiológicos foram realizados de

acordo com os métodos propostos por Claus e Berkeley (1986), Smibert e Krieg

(1994) e Hansen et al (1991), em meio contendo NaCl a 2%, exceto nos testes de

tolerância a salinidade.

Os testes realizados, só foram repetidos quanto a resposta não era conclusiva.

4.4. Avaliação da resistência a antimicrobianos

A resistência a antibióticos foi avaliada através de antibiogramas (BENSON,

2002). Para a sua realização, a partir de culturas líquidas em Caldo Infusão de

Cérebro e Coração contendo NaCl a 2% (24 horas de cultivo a 30ºC), foram

inoculadas placas de Petri contendo Agar Muller Hinton (NaCl a 2%) de maneira a

obter crescimento por toda a superfície. Posteriormente discos de antibiótico com

concentrações padronizadas foram colocados sobre a superfície do meio de cultura e

as placas forão incubadas a 30ºC por 24 horas. Transcorrido o tempo de incubação, o

diâmetro das zonas de inibição do crescimento foram medidos com o auxílio de um

paquímetro e os organismos foram classificados em resistentes ou suscetíveis ao

antibiótico, segundo uma tabela padrão de antibiograma. Foram testados os seguintes

antibióticos: ampicilina, penicilina, canamicina, norfloxacina, ácido nalidíxico e

cloranfenicol. Estes foram realizados apenas uma vez. A escolha destes se baseia nos

padrões de resistência observados na linhagem utilizada para a descrição da espécie.

4.5. Análise estatística

Para a analise dos dados foi utilizado o método estatístico de análise de

agrupamentos, também conhecida como análise de cluster ou de conglomerados, uma

técnica estatística multivariada que tenta sintetizar ou simplificar a estrutura de

variabilidade dos dados. Para isso os dados foram inicialmente codificados de forma

binária, sendo 0 = negativo e 1 = positivo, para cada um dos testes. Em seguida foram

calculados índices de similaridades de Jaccard entre os organismos e estes foram

agrupados pelo Método de Associação Média (UPGMA, Unweighted Pair Group

Method using Arithmetic Averages) e representados graficamente através de um

dendograma. Esta análise foi realizada utilizando-se o software Multivariate Statistical

Package (MVSP).

10

6. Resultados

6.1 Caracterização Morfológica

Após avaliação das características morfológicas das seis linhagens estudadas

foi possível verificar que todas apresentaram os mesmos resultados para os

caracteres morfológicos (Tabela 2) e não diferiram dos resultados relatados para a

linhagem tipo. Entretanto os autores que descreveram a espécie não realizam a

caracterização dos endósporos produzidos.

Tabela 2: Caracterização morfológica das seis linhagens estudadas e da linhagem

tipo, descrita por Shivaji et al (2006).

Organismo Morfologia Motilidade Endósporo

Forma Posição Distenção

Shivaji (41KF2aT)

Bastonete + NR* NR NR

LAMA 585 Bastonete + Elíptico Subterminal -






*NR, não relatado.

6.2 Caracterização Fisiológica

Depois da realização dos testes e análise dos resultados, comparando-os com

os obtidos por Shivajii et al (2006), constatou-se que as seis linhagens do trabalho

apresentaram características fisiológicas similares (Tabela 3), mas em algumas

características ocorreu uma variação em relação aos dados originais, são elas: a

linhagem tipo não cresce a 40ºC e cresce com 17,4% de NaCl enquanto as linhagens

estudadas crescem a 40ºC e não crescem com NaCl à 17,4%

11

Tabela 3: dados fisiológicos das seis linhagens utilizadas no trabalho e as

características da linhagem tipo, retiradas do trabalho onde a espécie, B.

stratosphericus, foi descrita inicialmente.

Característica Shivaji

(41KF2aT) LAMA 585

LAMA 713

LAMA 762

LAMA 781

LAMA 892

LAMA 736

Anaerobiose - - - - - - -

5ºC - - - - - - -

8ºC + - - - - - -

37ºC + + + + + + +

40ºC - + + + + + +

0% NaCl + + + + + + +

17,4% NaCl + - - - - - -

6.3 Caracterização Bioquímica

No que se refere à caracterização bioquímica foi possível constatar que as seis

linhagens utilizadas no estudo apresentaram diferenças em algumas características

entre si e ao confrontarmos com os dados de Shivajii et al (2006) também

apresentaram discrepâncias (Tabela 4). Na descrição da espécie original consta que

ela tem a capacidade de produção da catalase, assim como de realizar a hidrólise do

amido, gelatina e uréia, também produz ácido a partir da maltose e produz acetoína.

Já as linhagens utilizadas neste trabalho não apresentam estas características, com

algumas exceções que serão descritas a seguir. O organismo B. stratosphericus

LAMA 713 apresentou resultados inversos para a produção de ácido a partir da frutose

e arabinose, e utilização do citrato. Já as linhagens B. stratosphericus LAMA762,

LAMA892 e LAMA781 os resultados foram diferentes para a produção de acido a partir

da xilose, a B. stratosphericus LAMA781, também apresentou resultado diferenciado

para hidrólise da ureia e a B. stratosphericus 736 não produz acido a partir da glicose

e da lactose. Os dados da hidrólise da caseína não foram relatados pelos autores na

descrição da espécie.

12

Tabela 4: Caracterização bioquímica das seis linhagens utilizadas no presente

trabalho e os dados bioquímicos relatados por Shivaji et al (2006) na descrição original

da linhagem tipo.

Características Shivaji (41KF2aT)

LAMA 585

LAMA 713

LAMA 762

LAMA 781

LAMA 892

LAMA 736

Catalase + - - - - - -

Gram + + + + + + +

Citocromo oxidase + + + + + + +

Amido + - - - - - -

Indol e H2S - - - - - - -

Caseína NR* + + + + + +

Glicose + + + + + + -

Frutose + + - + + + +

Manitol + + + + + + +

Lactose + + + + + + -

Xilose + + + - - - +

Arabinose + + - + + + +

Maltose + - - - - - -

Redução Nitrato + + + + + + +

MR-VP + - - - - - -

Citrato de Simmons - - + - - - -

Gelatinase + - - - - - -

Ureia + - - - + - -

*NR, não relatado

6.4 Avaliação da Resistência a Antibióticos

Após determinar a sensibilidade ou resistência das linhagens utilizadas neste

estudo e posterior comparação com o trabalho de Shivajii et al., (2006) foi possível

estabelecer que assim como nos resultados anteriores, ocorreram algumas

similaridades entre as linhagens estudadas e diferenças com a linhagem tipo (Tabela

5). As seis linhagens apresentaram sensibilidade para os seis antibióticos utilizados,

com exceção de B. stratosphericus LAMA736 que apresentou resistência intermédia

para ampicilina, B. stratosphericus LAMA713 e B. stratosphericus LAMA736 que

apresentaram resistência à Penicilina e a B. stratosphericus LAMA892 que apresentou

sensibilidade intermediária ao Cloranfenicol.

Já ao compararmos os dados obtidos nas linhagens utilizadas neste trabalho

com os dados da descrição original podemos verificar que apenas dois dos antibióticos

apresentaram resultados similares, ambos sensíveis à Ampicilina e o Ácido nalidíxico,

os demais, Penicilina, Canamicina, Norfloxacina e Cloranfenicol os resultados foram

13

opostos, as linhagens do estudo são sensíveis a estes antibióticos enquanto a do

estudo é resistente.

Tabela 5: Resultados obtidos após a realização dos testes de resistência aos

antibióticos das seis linhagens estudadas e apresentação dos dados da linhagem tipo.

Antibiótico Shivaji

(41KF2aT) LAMA 585

LAMA 713

LAMA 762

LAMA 781

LAMA 892

LAMA 736

Ampicilina S S S S S S I

Penicilina R S R S S S R

Canamicina R S S S S S S

Norfloxacina R S S S S S S

Ácido nalidíxico S S S S S S S

Cloranfenicol R S S S S I S

Figura 2: Ilustração dos resultados dos testes de resistência à antibióticos: figura da esquerda:

Ampicilina, Penincilina e Norfloxacina. Fugura da direita Canamicina, Cloranfenicol e Ácido Nalidixico

6.5 Análise de agrupamentos

Pela análise de agrupamentos (Figura 3) verificou-se que as linhagens

originadas de ambientes marinhos profundos são mais similares entre si, em

comparação com a linhagem tipo, que formou um grupo mais separado. A única

linhagem originada de ambiente pelágico, B. stratosphericus LAMA 736, se distinguiu

entre os organismos de origem marinha.

14

Figura 3: Dendograma formada a partir dos dados obtidos da caracterização das linhagens estudadas e

dos dados fornecidos por Shivajii et al (2006) para a linhagem tipo, utilizando o método UPGMA e o índice de sensibilidade de Jaccard. Em azul está destacada a linhagem marinha de ambiente pelágico. Em

verde as linhagems originadas de sedimentos profundos. Em vermelho está destacada a linhagem tipo.

15

7. Discussão

Após a análise dos dados obtidos, foi possível constatar que nos aspectos

morfológicos, no presente trabalho foram obtidos resultados semelhantes aos da

linhagem tipo, conforme relatado por Shivajii et al. (2006), logo todas as linhagens tem

forma de bastonete e são móveis. O trabalho realizou a caracterização do endósporo

da espécie em questão, sendo esta uma contribuição importante para a caracterização

final da espécie, uma vez que na descrição original isto não foi realizado ou não foi

relatado. No que se refere ao formato do endósporo encontrado na B. stratosphericus

pode-se dizer que ele é similar aos demais Bacillus, alguns poucos apresentam

formato circular, mas, na sua grande maioria são elípticos; a posição deste dentro do

organismo é bem variável, não existindo uma posição preferencial, já a distensão não

é algo comum a todos a maior parte não apresenta distensão.

No presente trabalho as linhagens estudadas diferiram em duas características

fisiológicas, no crescimento a 40ºC e a ausência de crescimento a 17,4% de NaCl, em

relação com a linhagem tipo. Estes resultados não são esperados uma vez que o

ambiente de origem destas linhagens se caracteriza como frio, com temperaturas em

torno de 4ºC. Além disso, a linhagem tipo foi originalmente descrita de amostras de ar

da estratosfera e é inesperado o fato dela crescer em concentrações salinas mais

altas do que as linhagens estudadas, originadas de uma ambiente tipicamente

salgado.

Diante dessas características podemos sugerir duas hipóteses para a origem

desse organismo. Primeiramente como se trata de um organismo do filo Firmicutes

formador de endósporo, estrutura que tem como função principal garantir a

sobrevivência das bactérias por períodos de "stress" ambiental (PRIEST, 1993), estes

micro-organismos podem ser de origem terrestre que devido a fatores climáticos e

ambientais foram depositados no fundo do oceano. O endósporo por ser uma estrutura

de resistência, não se pode afirmar o tempo que este continua ativo, ou seja, não se

sabe por quanto tempo mantém suas condições de germinação. Greenblatt et al

(1999) encontraram um endósporos em âmbar datados de 120 milhões de anos, o que

corrobora com a hipótese de ser terreste e ter sido depositado no fundo do oceano

com o passar dos anos.

Como os organismos não têm dependência do sal para o seu crescimento, pois

crescem na ausência de NaCl, e não apresentam crescimento numa temperatura

semelhante a encontrada no fundo do mar, é possível que durante o isolamento estes

micro-organismos se encontravam latentes nas amostras, na forma de endósporos,

16

que germinaram assim que foram colocados nos meios de cultura (SILVA e

WEINGARTNER, 2008). De acordo com Beleneva (2008) a faixa ótima de crescimento

de bactérias marinhas varia entre 5ºC (espécies psicrófilas) e 30ºC (espécies

mesófilas), logo outro fator importante é a faixa de temperatura na qual as linhagens

estudadas crescem. Esta faixa é muito semelhante à encontrada no ambiente

terrestre, outra característica que corrobora a origem não marinha destas linhagens.

O fato das linhagens estudadas diferirem na tolerância à salinidade, em relação

com a linhagem tipo, pode ser explicado pela capacidade de sintetize e acúmulo de

compostos de massa molecular pequena, como açucares álcoois, prolina e glicina

betaína (HELLEBUST, 1976; YANCEY et al., 1982), os quais são denominados de

osmólitos, osmoprotetores ou solutos compatíveis. A função exata desses compostos

está relacionada à proteção contra estresses abióticos, funcionando como uma

ferramenta para o ajustamento osmótico celular (HELLEBUST,

1976,FLOWERS,2004). Além dessa função principal no ajuste osmótico, os solutos

compatíveis podem contribuir para a estabilização de macromoléculas

(osmoprotetores) e proteção contra danos oxidativos sob condições adversas (YEO,

1998). A linhagem tipo deve apresentar uma maior capacidade de síntese e

acumulação de solutos compatíveis, em relação com as linhagens estudadas, o que

explicaria sua maior tolerância à salinidade.

Os microrganismos estudados neste trabalho em geral aparentam possuir

menor versatilidade bioquímica que a linhagem tipo, uma vez que apresentaram

resultados negativos para vários testes. Em particular as linhagens estudadas não

produziram enzimas hidrolíticas (amilase, gelatinase e urease), não utilizam a maltose

como fonte de carbono e energia, não produzem acetoína e catalase. Com base nos

resultados bioquímicos citados acima pode-se inferir que as linhagens estudadas

seriam mais restritas em relação com os ambientes passíveis de serem colonizados

por elas. Isso é corroborado novamente pelos dados fisiológicos obtidos para estas

linhagens.

A não produção de acetoína é condizente com o fato destes microrganismos só

crescerem na presença de oxigênio, uma vez que essa molécula indica a realização

de uma via fermentativa chamada de fermentação de ácidos mistos, caracterizada

pela liberação de diversos produtos ácidos (WHITE et al., 2011). Por outro lado, era

esperado que estes organismos produzissem catalase, uma vez que crescem em

ambientes aeróbios. A catalase atua na decomposição do peróxido de hidrogênio em

oxigênio e água (2 H2O2 → 2 H2O + O2 ). Uma hipótese que foi observada em outras

bactérias, é que estes organismos produzam outras enzimas que atuariam de forma

similar. Uma delas é a peroxidase que tem o papel de desintoxicação celular ao

http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

17

eliminar o peróxido de hidrogênio em espécies reativas de oxigênio (MADIGAN et al,

2007).

Em relação com a resistência a antibióticos, foram obtidos resultados diferentes

dos apresentados para a linhagem tipo, a explicação para esse fato deve-se a uma

possível exposição prévia dos organismos testados por Shivajii et al (2006), fazendo

com que estes apresentassem uma resistência notável aos antibióticos testados

(MADIGAN et al, 2007). Essa resistência estaria ligada a produção de uma enzima

conhecida como β-lactamase.

De acordo com o estudos genéticos feitos por Lima et al (comunicação pessoal)

que sequenciaram o genoma da linhagem B. stratosphericus LAMA 585, foram

detectados genes que codificam a enzima de resistencia a antibióticos β-lactâmicos, a

β-lactamase. Esta enzima constitui um importante mecanismo de resistência a

antibióticos β-lactâmicos, hidrolisando o anel β-lactâmico pela quebra da ligação

amida, perdendo assim, a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana

(WILLIAMS, 1999). Esta enzima tornaria esse micro-organismo resistente a

penincilina, o que não foi observado. Isto poderia ser explicado pela ausência de

expressão do gene da β-lactamase. Como os antibióticos agem fora das células, a não

expressão do gene citado acima pode estar relacionada com a ausência de um

mecanismo de percepção dos antibióticos pelas linhagens sensíveis de B.

Stratosphericus. Isso faria com que a enzima responsável pela quebra de antibióticos

β-lactâmicos não tivesse sua produção estimulada, tornando assim o micro-organismo

sensível a presença de antibióticos β-lactâmicos.

Entre os micro-organismos estudados a linhagem B. stratosphericus LAMA 736

diferiu das demais, conforme observado na análise de agrupamentos (figura 3). Isto

pode estar relacionado com a origem deste micro-organismo, o único proveniente de

ambiente pelágico. Algo similar foi descrito para cianobactérias da espécie

Prochlorococcus marinus, cujas linhagens diferem entre si, sendo umas adaptadas a

locais com alta luminosidade, o que faz com que elas habitem águas próximas à

superfície, e outras adaptadas a ambientes com menos luminosidade, fazendo com

que viva em camadas mais profundas (KIRCHMAN, 2008 cap 3). As adaptações que

permitiriam que os microrganismos estudados moldar-se a uma vida pelágica em vez

de sedimentar, uma vez que os testes realizados não foram direcionados para este

fim, mas sugere-se que isto seja alvo de um próximo trabalho.

Através da análise dos dados fisiológicos, bioquímicos e os de resistência a

antibióticos, pôde-se perceber uma distinção entre as linhagens de origem marinha e a

linhagem tipo. Duas hipóteses foram formuladas para explicar isso: a primeira delas é

que estaríamos lidando com uma espécie nova, com algumas características

18

semelhantes com a descrita por Shivajji et al (2006) e a segunda é que as linhagens

do estudo seriam na verdade uma subespécie de Bacillus stratosphericus. Para

finalizar esse estudo foi realizada uma análise de agrupamentos para tornar a

visualização das similaridades mais fácil (Figura 3). A partir dessa analise foi possível

verificar que as seis linhagens utilizadas no estudo eram mais semelhantes entre si do

que com a descrita por Shivajii et al (2006), e por isso é provável que as linhagens

estudadas pertençam na verdade a uma nova espécie.

De acordo com a definição de espécie bacteriana, um grupo de linhagens com

mais que 70% de similaridade em seu material genético e suficiente divergência

fenotípica em relação com organismos geneticamente próximos, pertencem a uma

mesma espécie bacteriana (MADIGAN et al 2007). Portanto, para confirmar a hipótese

de que as linhagens marinhas estudadas constituem uma espécie distinta é

necessário o estudo destes micro-organismos pela técnica de hibridização do

DNA:DNA, uma técnica que determina o grau de semelhança genética entre linhagens

de micro-organismos, geralmente usada para determinar a distância genética entre

duas espécies.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Dist%C3%A2ncia_gen%C3%A9tica

http://pt.wikipedia.org/wiki/Esp%C3%A9cies

19

8. Conclusão

Com todos os dados analisados e todas a hipóteses estudas podemos dizer que a

partir desse trabalho é possível concluir:

Possivelmente é uma bactéria de origem terrestre, mas de uma localidade

diferente da linhagem tipo.

Após as analises estatísticas é possível dizer que trata-se de uma espécie

nova, com características semelhantes a descrita por Shivajii et al(2006)

20

9. Referências

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24

10. Anexos

Anexo 1: Ilustração dos resultados do Teste da

hidrolise da caseína

Anexo 2: Ilustração dos resultados do Teste da

hidrolise do amido

Anexo 3: Ilustração dos resultados do teste da

utilização do Citrato de Simmons. Verde (negativo) e Azul (positivo)

Anexo 4: Ilustração dos resultados da hidrólise

da gelatina

Anexo 5: Ilustração do resultado da redução do

nitrato. Depois da adição do α-nafitil e sulfanilamida Rosa(positivo) e Incolor (negativo).

Traço de zinco incolor (positivo)

Anexo 6: Ilustração do resultado da produção

de acetoina (MR-VP). Depois da adição do α-naftol e KOH

Vermelho(positivo) e Amarelo (negativo)

25

Anexo 7: Ilustração dos resultados de Indol

Reativo de Kovacs rosa(positivo) e amarelo (negativo), produção de H2S, preto(positivo,

amarelo(negativo)

Anexo 8: Ilustração dos resultados da

produção de ácido a partir: do manitol, da xilose, lactose arabinose, maltose e frutose.

Amarelo (positivo) e Rosa (negativo)

Anexo 9: Ilustração dos resultados obtidos no

Teste da hidrólise da ureia. Laranja (negativo) e Rosa (positivo)

Anexo 10: Ilustração dos resultados obtidos na

produção de acido a partir da glicose e do crescimento em aerobiose.

Amarelo (positivo) e Rosa (negativo)

Anexo 11: Ilustração da ausência de

crescimento à 5ºC

Anexo 12: Ilustração da ausência de

crescimento à 8ºC

26

Anexo 13: Ilustração do crescimento à 37ºC Anexo 14: Ilustração do crescimento à 40ºC

Anexo 15: Ilustração da ausência de crescimento em anaerobiose

Anexo 16: alo de inibição dos micro-organismos em milímetros, a partir desde foi possível determinar o

nível de resistência com base nos dados de BENSON (2002)

Antibiótico LAMA 585 LAMA 713 LAMA 762 LAMA 781 LAMA 892 LAMA 736

Ampicilina 32 18 30 29 35 25

Penicilina 35 15 31 32 37 20

Canamicina 18 19 19 20 19 15

Norfloxacina 34 36 32 34 36 20

Ácido nalidíxico 20 20 20 19 20 33

Cloranfenicol 22 22 18 20 17 21

Anexo 17: formulação do meio Agar marinho para 1L

Componentes Quantidade

Peptona 5g

Extrato de Levedura 1g

Citráto Férrico (após autoclavação) 10ml

Agua do mar 740ml

Agua destilada 250ml

Agar 15g

27

Anexo 18: formulação do meio para teste da hidrólise do amido


Amido 5g

Agar marinho 1000ml

Anexo 19: formulação do meio para teste de produção do Indol e H2S


Meio Sim 30g


NaCl 20g

Anexo 19: formulação do meio para teste da hidrólise da caseína


Agar marinho com concentração dobrada Só com água do mar

500ml

Leite desnatado 500ml

Anexo 20: formulação do meio para teste de redução do nitrato


Caldo Nitrato 9g

NaCl 20g


Anexo 21: formulação do meio para teste MR-VP


Caldo MR-VP 17g

NaCl 20g


Anexo 22: formulação do meio para teste de utilização do citrato


Citrato Simmos 22,5g

NaCl 20g


28

Anexo 23: formulação do meio para teste da Gelatinase


Gelatinase 120g

Peptona 5g

Extrato de carne 3g

NaCl 20g


Anexo 24: formulação do meio para teste da hidrólise da Uréia


Caldo Ureia 38,7g

NaCl 20g


Anexo 25: formulação do meio para teste do crescimento em 17,4% de NaCl


Caldo Nutriente 8g

NaCl 174 g


Anexo 26: formulação do meio para teste de produção de ácido


Caldo Marinho Sem ágar

940ml

Tris 4,7g

Ágar 3g

Solução Vermelho de fenol 10ml

Açucar 50ml

Anexo 27: formulação de cada uma das soluções dos açucares para 100ml


Glucose 20g

Manitol 20g

Lactose 20g

Xilose 20g

Arabinose 20g

Maltose 20g

Frutose 20g

29

Anexo 28: formulação do caldo infusão de cérebro e coração


Caldo BHI 37g

NaCl 20g


Anexo 29: formulação do meio para teste de resistência a antibióticos


Agar Muller Hinton 34g

NaCl 20g


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