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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

XANA RAQUEL ORTOLAN

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DE CHALCONAS

Itajaí

2013

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

XANA RAQUEL ORTOLAN


Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Fátima de Campos Buzzi Co-orientador: Rogério Corrêa

Itajaí, Dezembro de 2013

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DEDICATÓRIA

Ao amigo professor Telmo José Mezadri,

Estivemos lado a lado por todos esses anos. Ensinou-me a aprender, a

refletir, a pesquisar, a decidir e a interrogar... Mostrou-me um caminho

que não tem fim. Presenteou-me com o que ninguém jamais poderá me

roubar: o conhecimento.

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AGRADECIMENTOS

A minha orientadora, Fátima de Campos Buzzi, por ser uma grande guia, responsável pela

missão que agora se cumpre. As indicações, dicas e correções compõem uma somatória

fundamental não só para a construção do pensamento, mas como para a maturidade de toda

uma vida a seguir.

Aos professores da banca, Rogério Corrêa, Sérgio Faloni de Andrade, Clóvis Antonio Rodrigues

e Ricardo José Nunes, sempre disponíveis e dispostos a ajudar.

Ao professor David Rivero Tames. Aquele que, quando simplesmente deveria ser professor, foi

mestre, transmitindo seus conhecimentos e experiências. E que, quando mestre, foi amigo,

apoiando, compreendendo, inspirando, provocando e incentivando-me a trilhar outros caminhos.

As minhas amigas, dentro e fora dos laboratórios, Maria, Bia, Vanessa, Bruna e Jú, pelos

momentos que dividimos juntas, tornando minha caminhada mais leve.

Aos meus irmãos, Katiane Ortolan e Matheus Grigol Ortolan que com muita sabedoria,

discernimento, bom senso e dedicação estiveram sempre ao meu lado, encorajando nas horas

difíceis e aplaudindo nos momentos de glória. Obrigada por serem pessoas corretas e

competentes, fontes de inspiração, apoio e ensino diário.

Aos meus pais, Arildo Jorge Ortolan e Ivanete Grigol Ortolan, que me deram a vida e me

ensinaram a vivê-la com dignidade. Que iluminaram meus caminhos com afeto e dedicação para

que os trilhasse sem medo e cheia de esperanças. Que se entregaram por inteiro e renunciaram

aos seus sonhos, para que, muitas vezes, eu pudesse realizar os meus. Por serem exemplos de

integridade e serenidade.

À Willian Braz Hannecker, não tenho palavras para agradecer. Procuro arduamente uma forma

verbal de exprimir uma emoção ímpar. Uma emoção que jamais seria traduzida por palavras.

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Xana Raquel Ortolan Dezembro/2013

Orientador: Fátima de Campos-Buzzi, Doutora em Química (UFSC)

Co-Orientador: Rogério Corrêa, Doutor em Química Orgânica (UFSC)

Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas

Número de Páginas: 82

Introdução. As chalconas são compostos da via de biossíntese dos flavonóides e

apresentam atividades biológicas e farmacológicas como: anti-inflamatórias, antioxidantes e moduladoras de vias de sinalização celular. Muitas investigações com substâncias encontradas em plantas têm sido relatadas quanto à atividades de reparo em tecidos não mineralizados, entretanto ainda são incipientes os estudos sobre a utilização de moléculas bioativas na estimulação do reparo ósseo. Objetivos. Avaliar o

potencial osteogênico de chalconas, analisando a relação estrutura-atividade, o comportamento celular, a qualidade do tecido ósseo formado em microscopia de luz e o grau de fechamento das feridas provocadas. Métodos. As chalconas foram sintetizadas

seguindo a condensação aldólica de Claisen-Schmidt a partir da acetofenona variando-se os benzaldeídos substituídos (H; 4-CH3; 4-OCH3; 4-Cl; 3,4-Cl2); conforme o princípio de Topliss verificando-se uma possível relação estrutura-atividade. Para os testes in vivo foram utilizados 170 ratos Wistar, fêmeas com 45 dias de idade, divididos em 17

grupos (n=10). O primeiro grupo não recebeu tratamento (controle); o segundo foi tratado somente com veículo (vaselina); em outros 5 grupos aplicou-se as moléculas de chalcona na concentração de 1%. Outros 5 grupos receberam aplicação das mesmas moléculas na dose de 5%; e os demais 5 grupos foram tratados da mesma forma na concentração de 10%. No procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados e tricotomizados na linha média da calota craniana, seguindo-se a incisão dos tecidos moles. Com uma trefina cirúrgica de 5 mm de diâmetro, removeu-se um disco de tecido ósseo, correspondendo a ferida crítica, local de aplicação do tratamento. Após 30 dias da cirurgia, os animais foram eutanasiados, removendo-se para análise a área da ferida crítica e o tecido adjacente. Após descalcificação das amostras com EDTA, realizaram-se fotografias para mensurar a área remanescente das feridas com ajuda do programa Image J. Os dados quantitativos foram tratados estatisticamente através do método de ANOVA seguido pelo teste Student - Newman - Keuls e as lâminas analisadas qualitativamente em microscopia de luz transmitida. O projeto pesquisa recebeu aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais da UNIVALI, sob parecer 040-2011. Resultados. Os dados mostram que os grupos controle e veículo apresentaram

neoformação óssea limitada, sem resultados significativos entre si quanto ao fechamento da ferida óssea. As superfícies de reparo apresentaram-se revestidas por células inativas, demonstrando baixa atividade em relação à osteogênese. Ainda, no grupo veículo notou-se a presença de infiltrado inflamatório. Nos grupos tratados com as moléculas de chalcona a 1%, as células presentes nas bordas ósseas mostram-se com características de atividade, indicando continuidade do reparo. Nessa concentração, somente os grupos tratados com as moléculas C3, C4 e C5 apresentaram resultados significativos quanto ao fechamento da ferida quando comparadas ao grupo controle. A 5%, as moléculas C3, C4 e C5 mostraram resultados estatisticamente significativos quanto a área das feridas remanescentes em relação aos grupos controle e veículo, embora o resultado de todas as moléculas mostraram

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osteoblastos ativos nas superfícies ósseas, indicativo de atividade secretora dessas células. A concentração de 10% foi a mais efetiva para todas as moléculas analisadas. Nessa dose, todas mostraram resultados significativos em relação aos grupos controle, veiculo e ao grupo tratado a 1%, demonstrando uma relação dose-dependente em todas as moléculas. A análise histológica mostrou osteoblastos ativos nas bordas do defeito crítico em todos os grupos tratados nessa concentração, sendo que, os grupos C4 e C5 mostraram características de osso secundário. Não houve diferenças significativas entre as moléculas em uma mesma concentração. A molécula não substituída mostrou-se mais efetiva quanto a osteogênese, demonstrando que o efeito estéreo é mais significativo que os efeitos hidrofóbicos e eletrônicos de acordo com a relação proposta por Topliss. Conclusão. As chalconas estudadas apresentam potencial osteogênico,

algumas, entretanto, mostram que o reparo ósseo acontece mais rapidamente. Dessa maneira, estas moléculas podem representar uma perspectiva farmacológica na aceleração do processo de osteogênese. Palavras-Chave: Chalconas, Osteogênese, Síntese Orgânica.

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EVALUATION OF THE OSTEOGENIC POTENTIAL OF CHALCONES

Xana Raquel Ortolan

December/2013 Supervisor: Fatima Campos Buzzi, PhD in Chemistry (UFSC) Co-Supervisor: Rogério Correa, PhD in Organic Chemistry (UFSC) Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of Pages: 82 Introduction. Chalcones are compounds of the flavonoid biosynthetic pathway and

exhibit biological and pharmacological activities such as anti-inflammatory and antioxidant activities and modulation of the cell signaling pathways. Many investigations have been reported using substances found in plants, in terms of the activities of non-mineralized tissue repair’ However studies on the use of bioactive molecules in the stimulation of bone repair are still in their infancy. Objectives. To evaluate the osteogenic potential of chalcones, analyzing the structure-activity relationships, cell behavior, and quality of bone tissue by light microscopy and the degree of closure of wounds. Material and Methods. The chalcones were synthesized by Claisen-Schmidt

aldol condensation from acetophenone, varying the substituted benzaldehydes (H, 4-CH3, 4 -OCH3, 4-Cl, 3,4-Cl2), according to the Topliss principle, to verify a possible structure-activity relationship. For the in vivo tests, 170 female Wistar rats were used, 45 days old, divided into 17 groups (n = 10). The first group received no treatment (control), the second group was treated only with vehicle (Vaseline), and five other groups received the chalcone molecules at a concentration of 1%. Another group received the same 5 molecules at a dose of 5%, and the remaining 5 groups were treated in the same manner, at a concentration of 10%. During the surgical procedure, the animals were anesthetized and shaved on the midline of the skull, followed by an incision of the soft tissue. Using a surgical trephine 5 mm in diameter, a disc of hard bone tissue was removed corresponding to a critical wound at the site of application of the treatment. Thirty days after surgery, the animals were euthanized, removing for analysis the critical wound area and surrounding tissue. After decalcification of the samples with EDTA, photographs were taken to measure the remaining area of the wounds, using the software program Image J. Quantitative data were statistically analyzed by the ANOVA test followed by the Student-Newman-Keuls test, and the slides were qualitatively analyzed under transmitted light microscopy. The research project was approved by the Ethics Committee on the Use of Animals of UNIVALI, under opinion no. 040-2011. Results. The data show that the control and vehicle groups showed limited formation of

new bone, without significant differences between them as to the closure of the bone wound. The repair surfaces presented inactive cells, showing low activity in terms of osteogenesis. Furthermore, in the vehicle group, the presence of inflammatory infiltrate was noted. In the groups treated with the 1% chalcone molecules, the cells present at the bone borders showed features of activity, indicating continuity of the repair. At this concentration, only the groups treated with molecules C3, C4 and C5 showed significant results in relation to wound closure, compared with the control group. At 5%, molecules C3, C4 and C5 showed statistically significant results in relation to the remaining wound area, compared with the control and vehicle groups, although all the molecules showed active osteoblasts on the bone surfaces, indicative of secretory activity of these cells. The 10% concentration was the most effective for all the analyzed molecules. At this dose, all the molecules showed significant results compared with the control and vehicle

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groups and the group treated at 1%, demonstrating a dose-dependent relationship in all the molecules. Histological analysis showed active osteoblasts at the borders of the critical defect in all the treated groups at this concentration, whereas the C4 and C5 groups showed characteristics of secondary bone. There were no significant differences between the molecules at the same concentration. The unsubstituted molecule was more effective in regard to osteogenesis, demonstrating that the stereo effect is more significant than the hydrophobic and electronic effects, according to the relationship proposed by Topliss. Conclusion. The chalcones studied showed osteogenic potential,

however, some showed faster bone healing. These molecules may, therefore, represent a pharmacological prospect for accelerating the process of osteogenesis. Keywords: Chalcones, Osteogenesis, Organic Synthesis

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrura geral das chalconas. .............................................................. 16

Figura 2. Mecanismo de reação de Claisen-Schmidt ........................................ 17

Figura 3. Síntese das chalconas ....................................................................... 32

Figura 4. Incisão dos tecidos moles. ................................................................. 36

Figura 5. Anatomia de calota craniana de uma amostra de um crânio de rato

Wistar indicando a região de confecção da ferida crítica. .................................. 37

Figura 6. Realização da ferida crítica com uma broca trefina sob irrigação com

soro fisiológico. ................................................................................................... 37

Figura 7. Remoção do fragmento ósseo de 5mm compreendendo a ferida

crítica. ................................................................................................................. 37

Figura 8. Aplicação dos tratamentos com uma espátula. .................................. 38

Figura 9. Programa Image J utilizado para mensuração da área da ferida na

calota craniana do animal................................................................................... 39

Figura 10. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a

molécula C1 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do

tratamento.. 44



tratamento. ......................................................................................................... 45



tratamento. ......................................................................................................... 46



tratamento.. ........................................................................................................ 47



tratamento. ......................................................................................................... 48

Figura 15. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as

moléculas na concentração de 1%. .................................................................... 49

8


moléculas na concentração de 5%. .................................................................... 49


moléculas na concentração de 10%. .................................................................. 50

Figura 18. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal

do grupo controle, 30 dias após o experimento. ................................................. 51


do grupo veículo, 30 dias após o experimento. .................................................. 52


do grupo veiculo, 30 dias após o experimento. .................................................. 52


tratado com a molécula C1 a 1% 30 dias após o experimento........................... 53




tratado com a molécula C1 a 10% 30 dias após o experimento. ........................ 54



















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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores dos parâmetros físico-químicos π e e ambos

relacionados. ...................................................................................................... 21

Tabela 2. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-quimicos

proposta por Topliss ........................................................................................... 22

Tabela 3. Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em

função dos prováveis parâmetros mais ativos. ................................................... 23

Tabela 4. Tratamentos aplicados em cada um dos grupos experimentais. ....... 35

Tabela 5. Mostra a média±erro padrão das áreas das feridas 30 dias após

os tratamentos. ................................................................................................... 43

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LISTA DE ABREVIATURAS

UNIVALI Universidade do Vale do Itajaí

BMPs Proteína(s) morfogenética(s) óssea(a)

rhBMP-2 Proteína morfogenética óssea recombinante humana

FGF Fator de crescimento de fibroblastos

HE Hematoxina e Eosina

PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas

SF Solução fisiológica

TGF Fator de transformação do crescimento

TGF-β Fator de crescimento de transformação beta

QSAR Formulação quantitativa da relação estrutura atividade

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

OCC Osteocalcina

OPN Osteopontina

OCN Osteonectina

ALP Fosfatase alcalina

pH Potencial de Hidrogênio

CCD Cromatografia de coluna delgada

UV Ultravioleta

KBr Brometo de potássio

Hz Hertz

MHz Megahertz

TMS Tetrametilsilano

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 13

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................... 16

2.1 Chalconas ................................................................................................. 16

2.2 Relação estrutura-atividade ...................................................................... 19

2.3 Reparo ósseo ........................................................................................... 24

3 OBJETIVOS .................................................................................................... 31

3.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 31

3.2 Objetivos Específicos ................................................................................ 31

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 32

4.1 Síntese de Chalconas (1,3-difenilprop-2-em-1-onas) ............................... 32

4.1.1. Caracterização estrutural dos compostos ......................................... 33

4.2 Animais ..................................................................................................... 35

4.3 Procedimento cirúrgico e tratamento das feridas críticas ......................... 36

4.4 Procedimento macroscópico e técnica histológica.................................... 38

4.5 Análise macro e microscópica e tratamento estatístico ............................ 39

5 RESULTADOS ................................................................................................ 40

5.1 Chalconas ................................................................................................. 40

5.2 Análise macroscópica ............................................................................... 42

5.3 Análise Microscópica ................................................................................ 51

5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 63

6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 71

ANEXO ............................................................................................................... 79

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1 INTRODUÇÃO

Os ossos são estruturas resistentes e rígidas que apesar do aspecto

inerte, crescem, remodelam-se e mantêm-se ativos durante toda a vida do

organismo. Quando lesados, como ocorre nas fraturas, são capazes de

reparação, fenômeno que demonstra sua permanente vitalidade. Em condições

normais a maioria das fraturas não apresenta problemas de consolidação, porém

existem situações em que o processo de reparo pode ser acelerado,

assegurando rápido retorno da função músculo-esquelética (RISO et al., 2010).

Doenças como a osteoporose, injúrias traumáticas, cirurgias ortopédicas,

ressecção de tumores primários, podem formar defeitos ósseos, constituindo-se

em uma ferida crítica quando não ocorre reparo espontâneo, necessitando de

materiais substitutos para preencher o tecido lesado.

Diante da perspectiva de acelerar o reparo ósseo, várias intervenções têm

sido estudadas com a finalidade de estimular o reparo de fraturas, acelerando a

osteindução, osteocondução e a osteointegração.

Alguns mecanismos utilizados no tratamento músculo-esqueletais

correspondem ao transplante autólogo, alogênico ou xenotransplantes,

entretanto esses métodos exigem controle rigoroso relacionado com a

transmissão de agentes infecciosos (PUTZIER et al., 2009; ZWITSER et al.,

2012).

Por outro lado, a engenharia tecidual tem proposto o uso de matrizes

extracelulares como suporte de órgãos possibilitando a função celular de

proliferação, migração e diferenciação no processo de regeneração óssea e

também o desenvolvimento de uma matriz inteligente, ou seja, sem adição de

moléculas componentes da superfamília TGF-β, que possa iniciar a cascata de

diferenciação celular para produzir tecido ósseo (RIPAMONTI, 2010).

Atualmente os principais medicamentos utilizados na prática clínica,

quando se trata de tecido ósseo, tem seu mecanismo de ação baseada na

reabsorção óssea ou na reposição de minerais que compõe o osso. Entretanto,

ainda não existe, um medicamento eficaz que promova a indução da formação

óssea (DIMITRIOU et al., 2011). Desta maneira, a síntese orgânica através do

desenvolvimento de moléculas bioativas mostra-se necessária para atender uma

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demanda cada vez maior de desordens ósseas. Muitas classes de compostos

orgânicos tem apresentado efeitos biológicos promissores e a literatura cientifica

relata um crescimento significativo de novas moléculas com potencial similar ou

superior àquele de um fármaco (CECHINEL FILHO, et al. 2003).

Nesse sentido, as chalconas representam um grupo de compostos

intermediários ou produtos finais na biossíntese de flavonóides e são

extensivamente investigadas em virtude da alta aplicabilidade já encontrada.

Estudos farmacológicos de várias chalconas sintéticas, mostram potencial

antioxidante, antiinflamatório, citotóxico e quimiopreventivo em relação à células

cancerosas, antibacteriano, antifúngico antiviral, antiparasitário, analgésico e

osteogênico (BATOVSKA; TODOROVA, 2010; HAN; et al., 2010; VOGEL; et al.,

2010; ORTOLAN et al., 2013).

Diversos tipos de biomateriais e suas associações experimentais com

diversas substâncias vêm sendo estudados no processo de cicatrização. Um dos

modelos mais utilizados para estudar o potencial indutor de reparo ósseo é o da

ferida crítica que consiste em promover uma ferida cujas dimensões não

permitem seu reparo espontâneo e completo, assim, o modelo permite estudar,

com relativa segurança, a capacidade de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas

de induzir o reparo ósseo quando implantadas dentro delas.

Muitas investigações com substancias isoladas de plantas tem sido

relatadas quanto à atividades de reparo em tecidos não mineralizados

(SASIDHARAN et al., 2011; MEZADRI et al., 2012; MANOJ, MURUGAN, 2012 ),

entretanto pouco se conhece sobre o uso no reparo de feridas ósseas.

Recentemente, Kim et al (2012), ao avaliar o potencial osteogênico da

licochalcona A demonstraram, em estudos in vitro e in vivo, que essa chalcona

apresenta atividade quanto a osteogênese, aumentando os níveis de fosfatase

alcalina e cálcio e interferindo na diferenciação celular, com uma possível

indução dos níveis da expressão de BMPs (Proteínas Morfogenéticas Ósseas).

Já, Tames et al. (2010) sugeriram indução de reparo ósseo da chalcona

1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona no modelo de ferida crítica em calota

craniana de ratos, uma vez que as feridas tratadas com essa molécula

apresentaram uma cicatrização significativamente maior do que as feridas

controle (sem tratamento).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Manoj%20GS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23016492

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Manoj%20GS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23016492

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Em continuidade aos estudos de Tames et al. (2010), este estudo

objetivou sintetizar e avaliar o potencial osteogênico de chalconas em modelo “ in

vivo”, analisando o grau de fechamento das feridas, a morfologia celular,

qualidade do tecido recém formado e a possível relação estrutura-atividade.

16

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Chalconas

As chalconas são substâncias químicas abundantemente encontradas em

plantas, tendo por característica a pigmentação amarela. Possuem importante

papel em sistemas ecológicos em função das cores que produzem nos vegetais,

auxiliando na polinização como atraentes de insetos e/ou pássaros (ZUANAZZI,

2001).

A estrutura química (Figura 1) das chalconas (1,3 difenil-2-propen-1-onas)

consiste de uma porção olefínica e a carbonila conjugadas, ligadas á

grupamentos aromáticos. Esses anéis são identificados como anel A (advindo da

cetona) e anel B (advindo do aldeído).

Quimicamente são conhecidas como cetonas α-β-insaturadas e

contrariamente à maioria outros flavonóides, o núcleo A das chalconas é

numerado com números ordinários seguidos de uma linha ( ‘ ) e o núcleo B

somente com números ordinários (CHIARADIA, 2008; RAHMAN, 2011).

Figura 1. Estrura geral das chalconas.

Teoricamente, essas moléculas podem existir nas conformações Z e E.

Entretanto, estudos demonstraram que em extratos vegetais, o produto

majoritário isolado é o isômero trans, uma vez que estes são considerados mais

estáveis termodinamicamente (CAMPOS-BUZZI et al., 2007; CORRÊA et al.,

2001).

As chalconas podem também, facilmente, ser obtidas de forma sintética

através da síntese orgânica, pela condensação de cetonas e aldeídos

17

aromáticos num processo conhecido como Claisen-Schmidt (EDDARIR et al.,

2003; LI et al., 2002).

A reação de condensação aldólica é uma reação geral para todas as

cetonas e aldeídos com átomos de hidrogênio alfa (α). A reação ocorre quando

uma base remove um hidrogênio alfa ácido de uma molécula de aldeído ou

cetona para formar o enolato, que se estabiliza por ressonância. O enolato ataca

uma outra molécula de aldeído ou cetona (na posição alfa ao grupo carbonila

eletrofílico) por adição nucleofílica e forma um íon alcóxido (intermediário

tetraédrico). A protonação do íon alcóxido gera o produto de condensação e

regenera o catalisador básico. A formação da enona conjugada ocorre por

desidratação, que pode ser catalisada por base ou por ácido. Em condições

básicas, um hidrogênio ácido é abstraído da posição α para dar um íon enolato

que elimina o grupo de saída –OH. Em condições ácidas, forma-se o enol, o

grupo –OH é protonado e a água, eliminada (Figura 2).

Figura 2. Mecanismo de reação de Claisen-Schmidt

Conforme Avila (2008), substâncias, muitas vezes de difícil produção

sintética, podem servir como protótipos para o desenvolvimento de novas

biomoléculas possibilitando a análise da relação estrutura atividade, assim como

permitem modificações em seu esqueleto com o intuito de torná-los mais

eficazes.

18

Desta maneira, as chalconas mostram-se uma fonte riquíssima e

interessante para a obtenção de novos princípios ativos, uma vez que além de

apresentar um amplo espectro de atividades biológicas possuem vantagens

sobre outros compostos naturais como a versatilidade sintética.

Campos-Buzzi et al. (2007) verificaram que a introdução de diferentes

grupos substituintes nos anéis aromáticos da chalcona causam drásticas

mudanças nas atividades biológicas.

Chiaradia et al (2008) descrevem que reações de substituição no anel A

e B de um hidrogênio por qualquer outro substituinte pode resultar em

compostos com propriedades farmacológicas totalmente distintas, é por isso que

o alvo principal dos pesquisadores está na variedade de substituintes que se

pode adicionar a estes anéis.

Diversos estudos tem revelado que algumas chalconas sintéticas simples

incluindo aquelas derivadas de produtos naturais, como a xantoxilina exibiram

um pronunciado efeito antinociceptivo em camundongos no teste de contrações

abdominais (BOECK et al., 2006). Ainda, Corrêa et al., (2008) investigando a

ação de três séries de chalconas, usando diferentes aldeídos e acetofenonas

substituídas, mostraram no mesmo modelo, um significativo efeito

antinociceptivo quando comparado aos fármacos não esteroidais como aspirina,

paracetamol e diclofenaco.

Outro estudo conduzido por Lin et al. (2001) avaliou uma série de

flavonóides, chalconas e derivados em sua ação inibitória contra Mycobacterium

tuberculosis H37RV. Seis substâncias, nas séries sintetizadas, apresentaram

inibição do crescimento bacteriano maior que 90%. A presença de um

substituinte hidrofóbico em um dos anéis aromáticos e um grupo doador/aceptor

de hidrogênio no outro anel resultou no aumento da atividade antituberculose

das chalconas e derivados.

Dimmock et al. (1999) demonstraram que algumas chalconas apresentam

ação antimicrobiana, frente a bactérias e fungos. A introdução de grupos metóxi

ou 2-dietilaminoetoxi no anel A produziu substâncias que possuem atividade

bactericida e fungicida.

Ainda, uma variedade de chalconas e seus derivados apresentam

importante atividade citotóxica, com relação a diferentes linhas de células

19

tumorais (DIMMOCK et al., 1998; EDENHARDER et al., 1997 apud DIMMOCK et

al, 1999).

Por conseqüência das diversas atividades biológicas apresentadas pelas

chalconas, as quais variam conforme os diferentes substituintes, estas

moléculas são de grande interesse químico e farmacológico. As chalconas são

referenciados por efeitos analgésico, antiulcerogênico, antioxidante,

imunomodulatório, antileucêmico, anti-inflamatório e osteogênico (KIM et al.,

2012, TAMES et al 2010, HAN et al., 2010; LIN et al., 2001; LUNARDI et al.,

2003; MOHAMAD et al, 2010; RAHMAN, 2011; VIANA; BANDEIRA;MATOS,

2003).

De acordo com a natureza dos substituintes, podemos classificar as

interações estruturais das chalconas quanto aos efeitos estéricos causados por

substituintes volumosos; aos efeitos eletrônicos decorrentes da diferença da

eletronegatividade entre átomos ou grupos subtituintes e aos efeitos hidrofóbicos

(CESARIN-SOBRINHO; NETTO-FERREIRA; BRAZ FILHO, 2001).

2.2 Relação estrutura-atividade

A relação estrutura atividade é o objeto de estudo da química medicinal,

que se configura como uma disciplina baseada na química, também envolvendo

aspectos biológicos, ciência médica e farmacêutica. Essa área de estudo

preocupa-se com a invenção, descobrimento, projeção, identificação e

preparação de novas entidades químicas biologicamente ativas (BARREIRO;

FRAGA, 2008).

Nesse contexto, a multi e a interdisciplinaridade são conceitos

fundamentais em relação a capacidade de produção de novos medicamentos.

Os químicos medicinais, depois de estabelecerem relações qualitativas e

quantitativas entre certas características estruturais (físico-químicas), podem

otimizar a produção de compostos bioativos com características farmacológicas

determinadas (TEUTSH, 1997).

A grande maioria dos fármacos deve sua atividade à sua ligação

específica a uma biomacromolécula ou alvo molecular, geralmente uma enzima

ou um receptor. As interações dos fármacos com estes sistemas biológicos é

20

dependente de fatores relacionados com sua estrutura química e,

consequentemente, de suas propriedades físico-químicas (TAVARES, 2004).

A modificação estrutural é um método muito utilizado para a obtenção de

estruturas farmacologicamente ativas ou para a otimização da ação destas

moléculas. Dependendo da estrutura protótipo, podem ser introduzidas

mudanças como a simplificação da estrutura, a conservação da mesma ou o

aumento desta pela incorporação de novos grupamentos (CECHINEL-FILHO,

YUNES, 2001).

Assim, dois fármacos com estrutura química semelhantes, diferenciando-

se apenas por um átomo ou posição que este ocupa na molécula, podem

apresentar diferenças quanto às suas propriedades físico-químicas e,

conseqüentemente, quanto à atividade biológica (TAVARES, 2004).

Sabe-se que a substituição de um átomo de hidrogênio por um

determinado substituinte (grupo alquila, nitro, metil, metóxi, entre outros) pode

modificar profundamente a potência, duração e ainda o efeito farmacológico de

uma molécula.

Os estudos de correlação estrutura-atividade, fundamentados no efeito do

susbtituinte em um determinado anel aromático, são muito comuns na química

medicinal, uma vez que mais de 50% dos fármacos ou compostos bioativos

possuem esse tipo de anel. As modificações produzidas pela introdução de um

substituinte podem atingir várias propriedades físico-químicas da molécula, tais

como a hidrofobicidade, a densidade eletrônica, a conformação estrutural, as

propriedades farmacocinéticas, entre outros (CECHINEL-FILHO, YUNES, 2001).

Na química medicinal, um bom planejamento de fármacos permite

conseguir um grupo de substâncias-teste importante para realizar um tratamento

quantitativo da relação estrutura-atividade.

A formulação quantitativa da relação estrutura atividade (QSAR) foi

originalmente proposta por Hansch e Fujita em 1960, e desde então, a análise

QSAR evoluiu como ciência devido aos avanços que ocorreram nas últimas

décadas na área molecular (SANTOS-FILHO et al., 2009).

As pesquisas na área de QSAR têm como principal objetivo a construção

de modelos matemáticos que relacionem a estrutura química e a atividade

biológica de uma série de substâncias análogas. A construção dos modelos

requer a elaboração de conjunto ou matriz de dados contendo a medida

21

quantitativa da atividade biológica e os parâmetros físico-químicos e estruturais

capazes de descrever suas propriedades (POLANSKI, 2009).

O estudo de QSAR propõe que a ação de um fármaco pode ser dividido

em dois estágios: o transporte para seu sítio de ação e a ligação ao mesmo.

Assim, a atividade biológica está associada às mudanças de energia livre que

ocorrem nos processos de absorção, distribuição e biotransformação ou à

própria interação fármaco-receptor, sendo esse o paradigma que fundamenta o

estudo de QSAR. Este fenômeno poderia ser explicado por modelos

matemáticos simples ou multiparamétricos, em que a atividade biológica pode

ser determinada por parâmetros que medem a influência de cada uma das

propriedades (LIMA NETO, et al., 2006).

Já Topliss (1977), sugere um método não estatístico baseado no fato de

que alguma correlação quantitativa deve existir entre atividade biológica, a

hidrofobicidade e a descrição molecular eletrônica dos substituintes aromáticos

(YUNES et al., 2002).

O método manual consiste na análise dos resultados da atividade

farmacológica de cinco compostos que possuam anel aromático na sua estrutura

e que estejam presentes os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4 –

OCH3 (CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES, 1993).

A avaliação da atividade biológica está relacionada aos parâmetros

hidrofóbicos (), eletrônicos () e estéricos (Es) conforme demonstrados na

tabela 1.

Tabela 1. Valores dos parâmetros físico-químicos π e e ambos relacionados. Substituinte π σ π - σ 2 π - σ π -2 σ π -3 σ - σ π + σ 2 π - π ²

H 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4-Cl 0.71 0.23 0.48 1.19 0.25 0.02 -0.23 0.94 0.92

3,4-Cl2 1.25 0.52 0.73 1.98 0.21 -0.31 -0.52 1.77 0.94

4-CH3 0.56 -0.17 0.73 1.29 0.90 1.07 0.17 0.39 0.81

4-OCH3 0.02 -0.27 0.25 0.23 0.52 0.79 0.27 -0.29 0.04

3-CF3,4-Cl 1.59 0.66 0.93 2.52 2.91 -0.39 -0.66 2.25 0.65

3-CF3,4-NO2 0.60 1.21 -0.61 -0.01 -1.82 -2.97 -1.21 1.81 0.84

4-CF3 0.88 0.54 0.34 1.22 -0.20 -0.74 -0.54 1.42 0.99

2,4-Cl2 1.42 0.46 0.96 2.38 0.50 0.04 -0.46 1.88 0.82

c-C5H9 2.14 0.02 2.16 4.30 2.18 2.20 0.02 2.12 -0.30

c-C6H11 2.51 -0.22 2.73 5.24 2.95 3.17 0.22 2.29 -1.28

4-CH(CH3)2 1.53 -0.05 1.58 3.11 1.63 1.68 0.05 1.48 0.72

4-C(CH3)3 1.98 -0.20 2.18 4.16 2.38 2.58 0.20 1.78 0.04

3,4-(CH3)2 0.99 -0.30 1.29 2.28 1.59 1.89 0.30 0.69 1.00

22

4-O(CH2)3CH3 1.55 -0.32 1.87 3.42 2.19 5.21 0.32 1.23 0.70

4-N(C3H5)2 1.18 -0.83 2.01 3.19 3.84 4.67 0.83 0.35 0.97

4-N(CH3)2 0.18 -0.83 1.01 1.19 1.84 2.67 0.83 -0.65 0.33

4-NH2 -1.23 -0.66 -0.57 -1.80 0.09 0.75 0.66 -1.89 -3.97

4-NHC4H9 1.45 -0.51 1.96 2.39 2.47 2.98 0.51 0.94 0.80

4-OCH(CH3)2 1.03 -0.45 1.48 2.51 1.93 2.38 0.45 0.58 1.00

3-CH3, 4-OCH3 0.54 -0.26 0.80 1.34 1.06 1.32 0.26 0.28 0.79

4-Br 0.86 0.23 0.57 1.49 0.40 1.55 -0.23 1.09 0.98

4-CF3 0.88 0.43 0.45 1.43 0.02 2.17 -0.43 1.31 0.99

4-C2H5 1.02 -0.15 1.17 2.19 1.32 1.47 0.15 0.87 1.00

4-O(CH2)2CH3 1.05 -0.25 1.30 2.35 1.55 1.80 0.25 0.80 1.00

3-CH3, 4-Cl 1.29 0.17 1.12 2.41 0.95 0.78 -0.17 1.46 0.92

3-Cl 0.71 0.37 0.34 1.05 -0.03 -0.30 -0.37 1.08 0.92

3-CH3 0.56 -0.07 0.63 1.19 0.70 0.77 0.07 0.49 0.81

3-OCH3 -0.02 0.12 0.14 -0.16 -0.26 -0.38 -0.12 0.10 -0.04

3-N(CH3)2 0.18 -0.15 0.33 0.51 0.48 0.63 0.15 0.03 0.33

3,5-Cl2 1.25 0.75 0.50 1.75 -0.25 1.00 -0.75 2.20 0.94

2-Cl 0.71 0.23 0.48 1.19 0.25 0.02 -0.23 0.94 0.92

2-CH3 0.56 -0.17 0.73 1.29 0.90 1.07 0.17 0.39 0.81

2-OCH3 -0.02 -0.27 0.25 0.23 0.52 0.79 0.27 -0.29 -0.04

2-F 0.14 0.06 0.08 0.22 0.02 -0.04 -0.06 0.20 0.28

4-F 0.14 0.06 0.08 0.22 0.02 -0.04 -0.06 0.20 0.28

4-NHCOCH3 -0.97 0.00 -0.97 -1.94 -0.97 -0.97 0.00 -0.97 -2.88

4-NHSO2CH3 -1.18 0.03 -1.21 -2.39 -1.24 -1.27 -0.03 -1.15 -3.75

4-NO2 0.28 0.78 -1.16 -1.34 -1.84 -2.62 -0.78 0.50 -0.64

4-COCH3 -0.55 0.50 -1.5 -1.60 -1.55 -2.05 -0.50 -0.05 -1.40

4-SO2CH3 -1.63 0.72 -2.32 -3.98 -3.07 -3.79 -0.72 -0.72 -5.92

4-CONH2 -1.49 0.36 -1.85 -3.34 -2.21 -2.57 -0.36 -1.13 -5.20

4-SO2NH2 -1.82 0.57 -2.39 -4.21 -3.01 -3.53 -0.57 -1.25 -6.95

A ordem de potência para estes parâmetros relacionados aos 5

substituintes encontra-se na tabela 2. A partir do resultado da atividade biológica

avaliada utiliza-se esta tabela a fim de se encontrar qual parâmetro ou

combinação dos parâmetros estão envolvidos nas moléculas mais ativas

(TOPLISS; 1976).

Tabela 2. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-quimicos proposta por

Topliss

Substituintes Parâmetros físico-quimicos de Topliss

π 2π– π2 π + 2π - π - π - 2π - 3Es

3,4-Cl2 1 1-2 1 1 1 1-2 3-4 5 2-5

4-Cl 2 1-2 2 2 2-3 3 3-4 3-4 2-5

4-CH3 3 3 4 3 2-3 1-2 1 1 2-5

4-OCH3 4-5 4-5 5 5 4 4 2 2 2-5

H 4-5 4-5 3 4 5 5 5 3-4 1

23

A tabela 3 indica a proposta de seleção de novos substituintes que podem

otimizar a atividade farmacológica dos compostos em estudo. Aos parâmetros

relacionados π e σ, baseados nos estudos de correlação de Hansch, Topliss

incluiu também os efeitos estéricos (Es), que muitas vezes exercem influência

dominante.

Este método visa uma síntese mais racional e objetiva, visto que, fazendo

primeiramente a análise e comparação dos resultados da atividade biológica

com a estrutura química dos compostos pode-se determinar futuras

modificações estruturais com o objetivo de obter um composto ainda mais

potente que os iniciais.

Tabela 3. Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos.

Prováveis parâmetros mais ativos Seleção de novos substituintes

π, π + , 3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2; 4-C-C5H9

π, 2π – , π – 4-CH(CH3)2; 4-C(CH3)3; 3,4(CH3)2; 4-O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2

π - 2, π – 3, 4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9; 4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3

2π – π2

4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3- CH3; 3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl

Na aplicação de estratégias de planejamento de fármacos, os estudos dos

processos evolutivos de reconhecimento molecular em sistemas biológicos

assumem grande importância, pois constituem as bases fundamentais para o

entendimento de propriedades como potência, afinidade e seletividade. Diante

desse complexo paradigma, as ferramentas biotecnológicas associadas aos

métodos de química medicinal ganham papel destacado no desenvolvimento de

novas moléculas com atividade biológica (GUIDO; ANDRICOPULO, OLIVA,

2010).

Esse processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos é muitas

vezes complexo, longo e de alto custo, tendo suas raízes profundamente ligadas

às inovações científicas e tecnológicas. Os avanços expressivos da ciência

24

tornaram possível a descoberta de inovações terapêuticas notáveis,

proporcionando melhorias significativas na qualidade de vida das diversas

populações no mundo (GUIDO et al., 2008).

2.3 Reparo ósseo

O sistema esquelético é tão essencial à vida quanto qualquer outro

sistema orgânico, pois desempenha papel fundamental na homeostase mineral.

O tecido ósseo serve de suporte para os tecidos não mineralizados e protege

órgãos vitais, como os contidos nas caixas craniana e torácica. Aloja e protege a

medula óssea, formadora das células sanguíneas, proporciona apoio aos

músculos esqueléticos, transformando suas contrações em movimentos úteis, e

constitui um sistema de alavancas que amplia as forças geradas na contração

muscular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

O tecido ósseo compreende um tecido conjuntivo altamente rígido e

resistente. Suas propriedades dependem das características da matriz

extracelular, composta por porção orgânica (formada por proteínas colagenosas

– das quais 90% são representadas por colágeno tipo I e aproximadamente 10%

por proteoglicanos, e proteínas não colagenosas como osteocalcina (OCC),

osteopontina (OPN), osteonectina (OCN) e fosfatase alcalina (ALP) sintetizadas

por osteoblastos com propriedades específicas na mineralização do tecido

ósseo. O componente protéico da matriz é responsável pela resistência a fratura,

compressão e tensão, conferindo certa maleabilidade ao tecido sem que o

mesmo perca morfologicamente sua dureza (KLEIN et al., 2003; MOTA et al.,

2008).

Os componentes inorgânicos, responsáveis pela resistência à

deformação, apresentam fosfato de cálcio organizados em forma de cristais de

hidroxiapatita, além de magnésio, bicarbonato, sódio e potássio, em menor

quantidade. Estes se associam a proteínas estruturais e se encontram distribu-

ídos entre as fibras de colágeno formando, assim, feixes impregnados por

partículas iônicas (MOTA et al., 2008).

25

Apesar do aspecto aparentemente inerte, o tecido ósseo é um tecido

metabolicamente ativo que sofre remodelação contínua ao longo da vida. Tal

remodelação envolve a remoção de osso mineralizado pelos osteoclastos,

seguida pela formação da matriz óssea pelos osteoblastos, que posteriormente

se torna mineralizada (HADJIDAKIS; ANDROULAKIS, 2006).

Quando lesados, como em fraturas, são capazes de reparação, fenômeno

que demonstra sua permanente vitalidade. No entanto, esta capacidade

regenerativa tem limites e pode falhar em certas condições. As condições que

influenciam para que o reparo ósseo se consolide são a presença de uma

adequada vascularização e de um arcabouço tridimensional (GONDIM, 2007;

SALGADO, 2002) além do tamanho e local do sítio lesionado, a preservação ou

não do periósteo, a interposição de tecido mole ou a presença de osso necrótico

entre os fragmentos ósseos, a infecção local e a inadequada imobilização do

material implantado com o seu consequente deslocamento (BARRIAS et al.,

2005).

Quando se trata de reparo ósseo, pode se designar tal processo como o

restabelecimento da continuidade de tecidos defeituosos por outros tecidos que

não tem capacidade de substituir funcionalmente e estruturalmente o tecido

lesado, enquanto a regeneração óssea pode ser definida como um processo

biológico complexo, de renovação da arquitetura e função do tecido ósseo

perdido (COSTA, 2009; MELCHER, 1969).

A regeneração óssea guiada, por sua vez, é definida como uma

renovação óssea controlada em áreas onde existe um defeito ósseo, através da

osteoindução ou osteocondução restabelecendo as características funcionais e

estruturais dos tecidos lesado (BOSCH; MELSEN; VARGERVIK, 1998; FRANCO

et al., 2001; GAROFALO, 2007).

A osteoindução estimula a osteogênese, ou seja, é o processo pelo qual

substâncias induzem a diferenciação de células progenitoras do leito receptor

em osteoblastos, com posterior formação do tecido ósseo (LINDHE; KARRING;

LANG, 2005). O termo refere-se ao processo pelo qual as células tronco

mesenquimais, presentes no tecido circunjacente ao local da aplicação da

substância, são induzidas à diferenciação em células de linhagem osteogênica

(ALEXANDER, 1987). Na osteoindução, as células mesenquimais são

estimuladas a se transformarem em osteoblastos que produzem a matriz óssea

26

mineralizada. A osteoindução é ativa e representa a propriedade do material em

estimular a produção óssea pelo tecido receptor.

A osteocondução ocorre quando uma matriz física serve de arcabouço

para formação de um novo osso através da proliferação e migração de células

progenitoras do leito receptor, que se diferenciam em osteoblastos (TEIXEIRA,

2009). A osteocondução é passiva, sendo representada pela capacidade do

enxerto em permitir a invasão vascular e celular proveniente da área receptora.

A osteocondução é o processo tridimensional de intracrescimento de capilares

em processo de brotamento do tecido perivascular e de células

osteoprogenitoras do leito recipiente em direção a estrutura de um implante ou

enxerto (BAUER; MUSCHLER, 2000; CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004;

STEVENSON, 1998).

Apesar do alto potencial de regeneração do tecido ósseo, esta função

pode não se desencadear em defeitos de grandes dimensões, uma vez que a

regeneração óssea é um processo complexo e contínuo que objetiva uma

restauração anatômica e funcional.

Lee; Shin (2009) descrevem que a formação de osso é um processo que

envolve um grande número de hormônios, citocinas e fatores de crescimento.

Durante o estágio embrionário do desenvolvimento ósseo e no processo de

regeneração, vários eventos biológicos são regulados por essas moléculas

bioativas em um determinado espaço de tempo.

Atualmente o desenvolvimento de biomateriais para a substituição do

tecido ósseo é uma grande área da ciência. Funcionalmente os biomateriais

podem ser divididos em dois grandes grupos: aqueles para substituir funções

puramente mecânicas (próteses metálicas) e aqueles destinados ao

preenchimento de cavidades ósseas com o intuito de reconstrução e

estimulação da neoformação de tecido mineralizado (PAGAN, 2003).

O biomaterial é definido como uma substância ou combinação de duas ou

mais substâncias, sintéticas ou naturais, que pode ser utilizado por um período

de tempo para melhorar, aumentar ou substituir, parcial ou inteiramente um

tecido ou órgão (PAGAN, 2003); provocando resposta biológica específica na

interface do material com o tecido. Sabe-se que nenhum material implantado em

tecido vivo é inerte, todos provocam alguma resposta tecidual (CARLO et al.,

2007; ELBATAL et al., 2003).

27

Inúmeros eventos ocorrem quando um determinado biomaterial entra em

contato com o ambiente biológico; interações moleculares e celulares

influenciam as características teciduais ao redor dos biomateriais. Na presença

destes, fatores de crescimento são adsorvidos ou umedecem a superfície dos

substitutos ósseos, promovendo uma adequada integração com o osso do

hospedeiro. A função dos biomateriais é promover rápida formação óssea, assim

quando se estabelece uma total integração, ocorrerá uma gradual substituição

por novo osso (GAROFALO, 2007).

As propriedades físico-químicas de cada biomaterial, somadas ao

ambiente fisiológico, influenciam diretamente na neoformação óssea e como

e quando ocorrerá de forma equilibrada a sua biodegradação. As

propriedades físicas dos biomateriais são específicas à área de superfície

ou formato (bloco, partícula) a porosidade (denso, macro ou microporoso) e a

cristalinidade (cristalino ou amorfo) (KARAGEORGIU, KAPLAN, 2005; MISCH,

2000; YANG, DENNISON, ONG, 2005).

O principal objetivo da pesquisa com substitutos ósseos tem sido o

desenvolvimento de materiais para implantação que favoreçam um reparo ósseo

rápido e controlado e que resulte em regeneração tecidual (BRUNSKI; PULEO;

NANCI, 2000). Por estar em íntimo contato com tecidos biológicos no sítio de

implantação, a superfície do material se constitui em fator crítico na

determinação de sua biocompatibilidade e no processo de integração (NANCI et

al., 1998; NETO 2006)

Desta forma, espera-se que o material seja o mais parecido possível com

o tecido vivo, além de ser capaz de interagir sem ativar o sistema de defesa do

hospedeiro e que não apresente toxicidade, não causando destruição de células

e não liberando radicais nocivos que possam afetar o tecido (HOLLINGER;

LEONG, 1996; PRETEL, 2005) .

Por outro lado, a engenharia tecidual oferece perspectivas promissoras

para tratar defeitos ósseos causados por trauma, neoplasias, malformações

congênitas, infecções e resultantes do tratamento cirúrgico. Essa área de estudo

utiliza células, carreadores e fatores de indução para criar um novo tecido, sendo

as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), os fatores mais utilizados para a

regeneração óssea, devido sua atividade osteoindutiva da matriz óssea

orgânica.

28

Há muitos anos, as BPMs vem sendo isoladas, clonadas e identificadas

como membros da família das TGF-β (fator de crescimento de transformação

beta). Acredita-se que as BMPs são glicoproteínas responsáveis pelo

recrutamento de células osteoprogenitoras para os locais de formação óssea.

Aparentemente, através da quimiotaxia promovem a migração de células

mesenquimais indiferenciadas e monócitos para o local da lesão, atuando na

proliferação celular, maturação, mineralização e remodelação da matriz óssea

com consequente neoformação de osso (SCHMIDT, 2006).

O uso de BMPs na regeneração óssea é considerado um potente

substituto aos enxertos ósseos autógenos e aloimplantes, diminuindo o risco de

complicações associadas a cirurgias e limitações do doador. Atualmente mais de

20 tipos de BPMs foram identificadas, sendo responsáveis pela formação de

cartilagem e osso e por exercerem papel na formação de outros órgãos. A BPM-

2 nativa, por exemplo, esta presente na cortical óssea e induz a ossificação

endocondral localizada e a formação óssea intermembranosa, possuindo grande

eficácia na formação de osso (SCHMIDT, 2006).

As BMPs podem ser obtidas através de diferentes espécies de animais,

uma vez que apresentam uma homologia estrutural e funcional. Entretanto, para

se obter essa proteína é necessário cerca de um quilograma de osso para

poucos microgramas de BPM, restringindo o uso em quantidade dessa proteína

(SCHMIDT, 2006).

Comercialmente, as proteínas morfogenéticas ósseas recombinante

humanas (rhBMP-2) estão disponíveis apresentando boa capacidade

osteoindutiva. Estudos in vivo e in vitro encontraram que a rhBMP-2 rapidamente

se difunde do sitio de aplicação, diminuindo o efeito osteocondutivo. Ainda,

outros autores descrevem que a aplicação de grandes quantidades de rhBMP-2

diretamente nos tecidos não é efetivo para a indução de osteogênese porque

acelera o metabolismo de proteínas, sustentando que quantidades menores

parecem produzir melhores resultados (ISSA et al., 2010).

Existe um longo caminho entre o desenvolvimento de um novo biomaterial

ou técnica até a utilização em seres humanos. Para utilização na clínica, é

necessário que os materiais e técnicas sejam testados in vitro e in vivo (LUIZ;

COSTA; NADANOVSKY, 2005).

29

Dessa forma, nos últimos anos, uma grande variedade de biomateriais

tem sido avaliada in vivo em diferentes modelos animais, como ratos coelhos,

cães e macacos (ACCORSI MENDONÇA et al, 2008, SILVA et al., 2005;

SCHLEGEL et al., 2003, THALLER, 1994).

A escolha do modelo animal para avaliar o reparo de defeitos ósseos

utilizando biomateriais geralmente envolve animais jovens com alto potencial

para osteogênese (SCHIMITZ, HOLLINGER, 1986).

Vários modelos animais de defeitos ósseos têm sido estudados para

avaliar o potencial de materiais e candidatos biológicos para promoção de

regeneração do tecido ósseo. Esses modelos tem ajudado a elucidar os

mecanismos de integração endósseos (fenômeno de osteocondução), bem

como os mecanismos de remodelação óssea (fenômeno de osteindução)

(COSTA, 2009; MANKANI, et al., 2006).

No estudo do processo de regeneração de defeitos ósseos criados em

modelos animais, um fator importante a ser considerado é o tamanho do defeito.

Se este for muito amplo, o reparo resultará, em parte, em um tecido conjuntivo

muito fibroso, ao invés de tecido ósseo. Assim, existe o conceito de tamanho

crítico, que é o menor tamanho do defeito que não irá regenerar

espontaneamente. Além disso, existe um tamanho crítico do defeito para cada

modelo animal e também para cada tipo de osso em particular. Esses defeitos

críticos em animais são usados como padrão na análise experimental de

diversas substâncias que possam aumentar a regeneração do tecido ósseo

(HOLLINGER; KLEINSCHMIDT, 1990).

Atualmente, para o estudo de regeneração óssea in vivo, o modelo mais

utilizado de acordo com a literatura é a reconstrução de defeitos críticos criados

na calota craniana de ratos e esses defeitos são considerados críticos, uma vez

que não se regeneram espontaneamente durante a vida do animal.

Kneser et al. (2006) estudaram feridas críticas de calota craniana de ratos

tratadas com enxerto de discos de osso esponjoso bovino e recobertos com gel

de fibrina contendo osteoblastos, um segundo grupo sem osteoblastos e um

terceiro com controle negativo. Os espécimes obtidos no dia 0, 2 e 4 meses de

período experimental, analisados histológica e morfometricamente, mostraram

em um mês, neoformação óssea limitada a pequenas áreas periféricas de todas

as feridas tratadas. Dois a 4 meses depois, nessas feridas, ocorreu uma

30

neoformação óssea significativa, áreas de reabsorção do enxerto, bem como a

integração a osso neoformado e nas feridas controle não houve formação

significante de osso.

Nyan et al. (2007) mostraram a ação de moléculas bioativas e

biomateriais na melhora do reparo ósseo, utilizando 45 ratos com feridas críticas

de 8mm de diâmetro, observando radiografias e tomografias computadorizadas,

2, 4 e 8 semanas após as cirurgias, verificaram que a sinvastatina em

combinação com o sulfato de cálcio, promove uma inflamação intensa nos

períodos iniciais do reparo e osteogênese mais acentuada nos períodos tardios.

Kramer et al. (2008) trataram defeitos críticos na calota de quatro

carneiros com distração bifocal, colocando segmentos transportadores

osteogênicos constituídos de osso autógeno ou de biomaterial de tecido ósseo

esponjoso bovino desproteinizado. Após um período de latência de 5 dias a

distração (1mm/dia) foi realizada durante 28 dias. Através de exames

radiográficos e microscópico, observaram que em ambos os grupos, o transporte

osteogênico resultou em formação óssea; indicando que o biomaterial pode

contribuir para a regeneração óssea no transporte bifocal osteogênico, evitando-

se uma segunda intervenção para obter osso autólogo.

Kim et al. (2012) ao estudarem o potencial osteogênico da licochalcona A

em modelos in vitro demonstraram que em baixas concentrações, essa

molécula estimulou a diferenciação celular e induziu a expressão de BMPs. Em

testes in vivo, a licochalcona A acelerou o desenvolvimento do esqueleto no

método de zebrafish e melhorou consideravelmente a formação do tecido ósseo

no modelo de ferida crítica, podendo ser benéfica no tratamento de desordens

ósseas.

Assim, a avaliação de diferentes chalconas no modelo de calota craniana

em ratos possibilitou avaliar o potencial osteogênico destas moléculas em um

modelo in vivo.

31

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral:

Sintetizar e avaliar o potencial osteogênico de chalconas em modelo “in vivo”.

3.2 Objetivos Específicos:

- Sintetizar e caracterizar uma série de chalconas segundo as substituições

propostas por Topliss;

- Mensurar macroscopicamente o fechamento das feridas ósseas através do

programa Image J;

- Verificar a atividade de osteoblastos na formação de matriz óssea;

- Comparar a matriz óssea entre os grupos;

- Analisar a relação estrutura-atividade da série de chalconas sintetizadas.

32

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Síntese de Chalconas (1,3-difenilprop-2-em-1-onas)

As 1,3-difenilprop-2-en-1-onas (C1 á C5) foram obtidas pelo método de

Claisen Schmidt (CORREA et al., 2008).

O método consistiu em dissolver uma mistura equimolar de benzaldeído

substituído (0,05 mol) e acetofenona (0,05 mol), em 25 mL de etanol, em meio

básico (5g de hidróxido de sódio) (Figura 3). A solução permaneceu sob

agitação magnética a temperatura ambiente por 24 horas, ou até o ponto que a

agitação não fosse mais possível (devido à formação de precipitados). A fim de

confirmar o término da reação, a formação do produto reacional foi

acompanhada por cromatografia de camada delgada em silicagel, utilizando

como eluentes gradientes hexano/acetato de etila. Os produtos reacionais foram

filtrados à pressão reduzida e vertidas em gelo e água gelada, filtrada e lavada

sucessivas vezes com água gelada, até que as águas de lavagens se

apresentassem neutras ao teste com papel de tornassol. O produto foi então

lavado com 20 mL de etanol gelado e submetido à secagem em dessecador na

presença de pentóxido de fósforo.

Para a purificação dos compostos, a recristalização foi realizada sob

aquecimento, utilizando-se etanol e carvão ativo. Após, os compostos foram

novamente filtrados e secos, obtendo-se o produto puro.

Figura 3. Síntese das chalconas

CH3

O

+

O

HR

O

R

R= H, 4-CH3, 4-OCH

3, 4-Cl, 3,4-Cl

2

EtOH

NaOH

33

4.1.1. Caracterização estrutural dos compostos

O andamento das reações durante os procedimentos reacionais, bem

como a pureza preliminar dos compostos utilizando-se como comparação os

padrões dos reagentes, foram monitorados por cromatografia de camada

delgada. Os procedimentos de purificação foram os usuais, por recristalização

com etanol. A caracterização de todos os compostos sintetizados foi realizada

através de ponto de fusão, espectroscopia no infravermelho e espectroscopia de

ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (NIQFAR/UNIVALI).

Na técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas

placas pré-revestidas de sílica gel com indicador de fluorescência - F254, em

folhas com base de alumínio, Merck. Em todos os procedimentos

cromatográficos foram utilizados gradientes do sistema de solventes

hexano/acetato de etila. Os solventes utilizados foram adquiridos

comercialmente das marcas Aldrich e Merck. Os compostos foram visualizados

como manchas (spots) através de luz UV de ondas curtas. Para a recristalização

dos compostos foram utilizados diferentes solventes.

Os pontos de fusão, dos compostos obtidos, foram determinados de

forma direta, com o equipamento Microquímica APF-301, não necessitando

correção por curva de calibração.

As análises espectrométricas no infravermelho foram realizadas em

espectrômetro interfotométrico por transformada de Fourier, SHIMADZU,

Prestige – 21, pelo método de reflectância difusa – DRIFTS. Os espectros foram

obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e foram

corrigidos pelo algoritmo Kubelka Munk.

Os espectros de RMN1H e RMN13C foram obtidos em espectrômetro de

ressonância magnética nuclear Bruker Advance DPX – 300, a 300MHz e 75

MHz, respectivamente. Os deslocamentos químicos foram expressos em valores

adimensionais (δ = ppm) em relação a um padrão de referência de

tetrametilsilano (TMS). Foram utilizados os solventes dimetilsulfóxido-

hexadeuterado, acetona deuterada e clorofórmio deuterado adquiridos

comercialmente. As constantes de acoplamento (J) foram expressas em Hertz

(Hz). As multiplicidades dos sinais foram indicadas como segue: s=simpleto,

34

d=dupleto, dd=duplo dupleto, t=tripleto e m=multipleto. A visualização foi

realizada no programa ACDSpec Manager 10.08 (licença no: 41159) e Bruker

TopSpin 5.0.

(2E) 1-fenil-3-(3,4-diclorofenil)-2-propen-1-ona – C1

Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e 3,4-clorobenzaldeído (8,75g/

0,05mol) na presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) sendo

a reação acompanhada por CCD.

(2E)-1-fenil-3-(4-clorofenil)- 2-propen-1-ona – C2

Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e 4-clorobenzaldeído (7,03g/

0,05mol) na presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) e a

reação foi acompanhada por CCD.

(2E)-1-fenil-3-(4-metilfenil) 2-propen-1-ona – C3

Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e tolualdeído (6,08mL/ 0,05mol) na

presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL). O produto

reacional foi acompanhado por CCD.

(2E)-1-fenil-3-(4-metoxifenil)-2-propen-1-ona – C4

Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e anisaldeído (5mL/ 0,05mol) na

presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) e a reação foi

acompanhada por CCD.

(2E) 1,3-difenil-2-propen-1-ona – C5

Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e benzaldeído (5,10mL/ 0,05mol) na

presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) sendo a reação

acompanhada por CCD.

35

4.2 Animais

Foram utilizados 170 ratos Wistar, fêmeas (45 dias de idade) provenientes

do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí, com peso

aproximadamente de 200g, os quais foram alimentados com ração granulada

Nuvital® na quantidade de 10 a 20 g/animal/dia e água a vontade, mantidos em

ambiente com ciclo claro/escuro de 12/12 horas à temperatura de 22°C ±2. Este

trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UNIVALI

(processo 40/2011). O trabalho foi desenvolvido conforme o modelo

experimental apresentado na tabela a seguir:

Tabela 4. Tratamentos aplicados em cada um dos grupos experimentais. GRUPOS TRATAMENTO/DOSES NÚMERO DE ANIMAIS

Controle Sem tratamento 10

Veículo Veículo 10

C1 (2E) 1-fenil-3-(3,4-diclorofenil)-2-propen-1-ona

1%

5%

10%

10

10

10

C2 (2E) 1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona

1%

5%

10%

10

10

10

C3 (2E) 1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-1-ona

1%

5%

10%

10

10

10

C4 (2E) 1-fenil-3-(-4metoxilfenil)-2-propen-1-ona

1%

5%

10%

10

10

10

C5 (2E) 1,3-difenil-2-propen-1-ona

1%

5%

10%

10

10

10

36

4.3 Procedimento cirúrgico e tratamento das feridas críticas

Os animais, sob condições estéreis do campo cirúrgico foram

anestesiados com solução de 3,75ml de cloridrato de cetamina (10%), 2,5ml de

xilazina (2%) e 3,35ml de água destilada; aplicando-se 0,1ml/kg/im e

tricotomizados manualmente na região da linha média da calota craniana, onde

se procedeu a incisão dos tecidos moles (Figura 4).

Figura 4. Incisão dos tecidos moles.

Os planos cutâneo (pele e hipoderme) e periosteal foram rebatidos e entre

as suturas interparietal e interocipital ao lado direito (Figura 5), com uma trefina

cirúrgica de 5 mm de diâmetro (Figura 6), adaptada em peça de mão de baixa

rotação e sob constante irrigação com soro fisiológico, removeu-se um disco de

tecido contendo as corticais ósseas e o osso esponjoso subjacente até a

exposição da dura-máter (Figura 7).

37

Figura 5. Anatomia de calota craniana de uma amostra de um crânio de rato Wistar indicando a região de

confecção da ferida crítica.

Figura 6. Realização da ferida crítica com uma broca trefina sob irrigação com soro fisiológico.

Figura 7. Remoção do fragmento ósseo de 5mm

compreendendo a ferida crítica.

38

Nos animais controle, as feridas foram lavadas somente com soro

fisiológico; nos animais experimentais, após esta irrigação, foram aplicados os

tratamentos (aplicação única) com vaselina (grupo veículo) e as moléculas com

veículo carreador: (2E) 1-fenil-3-(3,4-diclorofenil)-2-propen-1-ona – C1, (2E),

(2E) 1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona – C2, 1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-

1-ona – C3, (2E) 1-fenil-3-(-4metoxilfenil)-2-propen-1-ona – C3, (2E) 1,3-difenil-

2-propen-1-ona – C5 nas concentrações de 1%, 5% e 10% (Figura 8).

Em seguida, o periósteo foi reposicionado e suturado, utilizando-se fio

absorvível Catgut 5-0 simples (Polysuture®), seguindo-se a síntese dos tecidos

moles com fio não absorvível 6-0 (Polysuture®). Para analgesia, aplicou-se por

via subcutânea, cetoprofeno 1% (0,25ml/100g) nas primeiras 72 horas, conforme

as diretrizes da SBCAL (princípio do bem estar animal).

Figura 8. Aplicação dos tratamentos com uma

espátula.

4.4 Procedimento macroscópico e técnica histológica

Após 30 dias da intervenção cirúrgica, os animais foram eutanasiados

com sobredose anestésica seguida de perfusão intracardíaca de

paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, removendo-se as

calotas cranianas e mantendo as amostras na mesma solução fixadora utilizada

para a perfusão intracardíaca durante 7 dias. Após este período, foram obtidas

39

fotografias das feridas para análise quantitativa, calculando-se as áreas das

feridas remanescentes (em mm2) através do programa Image J. Em

continuidade da técnica histológica, as amostras foram desmineralizadas em

solução de EDTA a 7% em tampão fosfato, desidratadas em álcoois de

concentrações crescentes (70, 90 e 100%), clareadas em xilol e incluídas em

parafina. Cinco cortes semisseriados (1:10) obtidos em micrótomo rotatório, com

espessura de 7µm, corados com Hematoxilina e Eosina, foram utilizados para

observação, em microscopia de luz transmitida.

4.5 Análise macro e microscópica e tratamento estatístico

O programa Image J (Figura 9) foi utilizado para mensurar as áreas das

feridas críticas, com a finalidade de comparação com os demais resultados. Os

dados quantitativos foram tratados estatisticamente através da análise de

variância do método de ANOVA seguido pelo teste de múltiplas comparações

Student - Newman - Keuls, utilizando o programa GraphPad Instat e as lâminas

analisadas qualitativamente em microscopia de luz transmitida, avaliando-se

tipos celulares e teciduais na área de reparo das feridas. Os exemplares

padronizados das áreas de reparo foram documentados com fotomicroscópio

(BX50, Olympus, Tokio, Japão).

Figura 9. Programa Image J utilizado para mensuração da área da ferida na calota craniana do animal

40

5 RESULTADOS

5.1 Chalconas

(2E)-1- fenil-3-(3,4-diclorofenil)- 2-propen-1-ona – C1

O

Cl

Cl

O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 68 % e

tempo reacional: 3,5 horas.

Características físico-químicas: p. f.: 114-115 ºC (lit. p.f.: 114-115 segundo

CORRÊA et al., 2001), Rf : 0,72.

Fórmula Molecular: C15H10Cl2O (279,0 g/mol).

IV max/cm-1 pastilhas de KBr: 1661 (C=O); 1605 (C=C).

RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 7,27 (d, 1H, J: 15,70 Hz, Hα); 7,39 (d,

1H, J: 15,70 Hz, Hβ); 7,50-7,93 (m, 8H, Ar).

NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 121,3, 133,3, 132,6, 137,9, 134,7,

127,8, 130,1, 128,5, 127,1, 129,2, 134,5, 189,7, 145,1.

(2E)-1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona - C2

O

Cl

O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 74 %.

Tempo recional: 4 horas.

41

Características físico-químicas: p. f.:113-115 ºC (lit. p.f.: 114,4-117,1 segundo

CABRERA et al., 2007), Rf : 0,68.

Fórmula Molecular C15H11ClO (244,5 g/mol).



1H, J: 15,71 Hz, Hβ); 7,25-7,76 (m, 9H, Ar).

NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 122,32, 128,48, 129,13 129,54,

132,79, 133,43, 136,65, 137,98, 143,09, 189,76.

(2E)-1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-1-ona – C3

O

CH3

O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 90 %;

tempo reacional: 12 horas; p. f.: 95 - 99 ºC (lit. p.f.: 98 - 100 ºC segundo LOPEZ

et al., 2001), Rf : 0,67.

Fórmula Molecular: C16H14O (224,0 g/mol).

IV max/cm-1 pastilhas de KBr 1660 (C=O); 1603 (C=C).

RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 2,32 (s, 3H, Me); 7,54 (d, 1H, J: 15,50

Hz, Hα); 7,60 (d, 1H, J: 15,50 Hz, Hβ); 7,26-8,17 (m, 9H, Ar).

NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 121,3, 137,9, 132,2 137,6, 128,5,

128,9, 129,2, 134,5, 189,7, 145,1, 21,3.


O

OCH3

42

O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 95 %;

tempo reacional: 10horas; p. f.: 116-118 ºC (lit. p.f.: 114-116 ºC segundo IWATA

et al., 1995), Rf : 0,52.

Fórmula Molecular: C16H14O2 (240,0 g/mol).

IV max/cm-1 pastilhas de KBr 1659 (C=O); 1598 (C=C).

RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 3,39 (s, 3H, OMe); 7,54 (d, 1H, J: 16,00

Hz, Hα); 7,62 (d, 1H, J: 16,00 Hz, Hβ); 7,00-8,16 (m, 9H, Ar).

NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 122,00, 128,40, 128,47, 128,89,

130,45, 132,67, 134,80, 138,17, 144,64, 190,29.

NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm):121,3, 159,8, 137,9, 127,5, 114,2,

128,5, 130,2, 130,2, 129,2, 134,5, 189,7, 55,8, 145,1.


O

O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 77 %

com tempo reacional de 6 horas.

Características físico-químicas: p. f.:119-122 ºC (lit. p.f.: 118-120 segundo

ADEWUNMI et al.,1987), Rf : 0,67.

Fórmula Molecular: C15H12O (210,0 g/mol).



1H, J: 15,81 Hz, Hβ); 7,46-8,17 (m, 10H, Ar).

NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 122,00, 128,40, 128,47, 128,89,

130,45, 132,67, 134,80, 138,17, 144,64, 190,29.

5.2 Análise macroscópica

A Tabela 5 mostra, 30 dias após o tratamento, os valores das médias das

áreas remanescentes das feridas experimentais tendo como parâmetro a área

43

da ferida crítica inicial (5mm – 19,635mm2). Os dados foram avaliados

quantitativamente em cada um dos grupos e doses testadas, utilizando a Análise

de Variância (ANOVA) seguido do Teste de múltiplas comparações Student-

Newman-Keuls.

Tabela 5. Mostra a média±erro padrão das áreas remanescentes das feridas 30 dias após o tratamento.

Grupos Média±erro padrão

Controle 16,28±0,48

Veículo 14,97±1,20

Concentrações

Moléculas 1% 5% 10%

C1 13,83±0,53 12,24±0,63 9,11±1,19

C2 14,06±0,61 11,96±0,91 7,93±1,05

C3 12,36±0,60 9,53±0,62 7,34±1,05

C4 11,59±0,95 9,18±0,64 6,25±1,05

C5 11,78±0,61 8,58±0,53 5,94±0,72

Grupo Controle

Após um mês de cirurgia, constatou-se pelo método estatístico que no

grupo controle, a média das áreas remanescentes nas feridas desse grupo

apresentou-se em 16,28mm2; mostrando pouca capacidade de reparo

espontâneo, estatisticamente não significativo em relação à área da ferida inicial.

Grupo Veículo

Quando somente o veículo, utilizado para carrear a molécula de chalcona,

foi avaliado, os resultados mostraram uma média das áreas da ferida

semelhante ao grupo controle com valor de 14,97mm2, mostrando formação

óssea limitada não significativa em relação ao grupo controle e a área da ferida

inicial.

44

(2E)-1- fenil-3-(3,4-diclorofenil)- 2-propen-1-ona – C1

Os resultados obtidos na mensuração das áreas de tecido ósseo

neoformado evidenciaram que no tratamento com concentração de 1% e 5%,

esta molécula apresentou uma média da área das feridas ósseas

remanescentes de 13,82mm2 e 12,24mm2 respectivamente. Na dose de 10%, o

grupo tratado apresentou uma média de 9,11mm2 da área da ferida.

Em relação a esta molécula, os valores das médias de área de reparo

ósseo ao utilizar a concentração de 1% mostraram associação estatística

significativa somente em relação ao grupo tratado com a concentração de 10%

(p<0,01). Quanto ao uso da dose de 5% os valores apresentaram-se

significativos quando comparados ao grupo controle (p<0,01). Já a concentração

de 10% mostrou associação significativa (p<0,001) em relação aos grupos

controle e veículo (Figura 10).

Observou-se ainda, que o grau de reparo envolvido na osteogênese

apresentou uma relação dose-resposta, ou seja, a concentração à 10% mostra-

se mais efetiva em relação as demais.

Figura 10. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a molécula C1 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do tratamento. Os dados são apresentados como média±erro padrão. [**] = p<0,01; [***] = p<0,001. ANOVA seguido do teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.

45

(2E)-1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona - C2

Quantitativamente, na concentração de 1%, aos 30 dias de experimento,

esta molécula apresentou uma média de 14,06mm2 em relação a áreas das

feridas remanescentes. Já nas concentrações de 5% e 10%, as feridas críticas

mostraram uma média de 11,96mm2 e 7,93mm2 respectivamente.

Comparando-se os dados obtidos, a concentração de 1% mostrou

diferenças significativas em relação ao grupo tratado com a dose de 10%

(p<0,01). A concentração de 5% mostrou associação significativa somente ao

grupo controle (p<0,01). A de 10% apresentou valores significativos quando se

compara aos grupos controle e veículo (p<0,001).

Nota-se ainda, que o uso dessa molécula mostrou maior neoformação

óssea na concentração de 10%, mostrando uma relação dose-dependente

(Figura 11).


46

(2E)-1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-1-ona – C3

Em relação a esse o composto na concentração de 1% observou-se uma

média de feridas remanescentes de 12,36mm2. À 5% a média apresentada pelo

grupo foi de 9,53mm2. À 10%, quanto ao reparo ósseo, o composto exibiu média

de 7,34mm2.

Estatisticamente, observou-se na concentração de 1% maior grau de

fechamento da ferida em relação ao grupo controle (p<0,01) e ao grupo tratado

com a molécula na dose de 10% (p<0,001). A concentração de 5% mostrou

diferenças estatísticas somente em relação aos grupos controle e veículo

(p<0,001).

Já o grupo tratado com a concentração de 10% mostrou maior atividade

de reparo em relação aos grupos controle; veículo (p<0,001) e ao grupo tratado

à 1% (p<0,01), apresentando uma relação dose-resposta (Figura 12).


47


Após 4 semanas, o composto na concentração de 1% e 5% exibiu uma

média de área de ferida de 11,59mm2 e 9,18mm2.

Na concentração de 10%a média de área das feridas foi de 6,25mm2.

A concentração de 1% mostrou resultados significativos em relação aos

grupos controle (p<0,01) e ao tratado à 10% (p<0,001).

Os grupos tratados com as doses de 5%, e 10% mostraram associação

estatística em relação aos grupos controle e veículo (p<0,001).

Comparando-se os dados, observa-se uma relação dose-efeito (Figura

13).


48


A concentrações de 1% e 5% mostraram valores de médias das áreas

das feridas remanescentes de 11,78mm2 e 8,58mm2 respectivamente. Na

concentração de 10% a média das áreas das feridas ósseas mostrou valor de

5,94mm2.

Em relação a esta molécula, a concentração de 1% mostrou associação

estatística em relação ao grupo veículo (p<0,01) e ao tratado a 10% (p<0,001).

Quanto as doses de 5% e 10% estas mostraram valores significativos em

relação aos grupos controle e veículo (p<0,001) (Figura 14), demonstrando

efeito dose-dependente.


Conforme representado nas figuras 15, 16 e 17, ressalta-se que em

nenhuma das concentrações utilizadas (1%, 5% e 10%) observaram-se

diferenças estatísticas significativas quando se comparam as moléculas

utilizadas.

49

Figura 15. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as moléculas na concentração de 1%. Os dados são apresentados como média±erro padrão. ANOVA seguido do teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.

Figura 16. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as moléculas na concentração de 5%. Os dados são apresentados como média±erro padrão. ANOVA seguido do teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.

50

Figura 17. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as moléculas na

concentração de 10%. Os dados são apresentados como média±erro padrão. ANOVA seguido do teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.

51

5.3 Análise Microscópica

Na análise microscópica, as feridas remanescentes do grupo controle

mostraram na área central do defeito, tecido conjuntivo fibroso, sem sinais de

inflamação. Houve discreta neoformação óssea nas bordas da ferida critica, com

superfícies ósseas revestidas principalmente por células achatadas que

caracterizam osteoblastos inativos ou células ósseas de revestimento e

osteócitos incluídos na matriz óssea recém-formada. A substância osteóide

apresenta-se de forma discreta indicando ausência de atividade secretora

(Figura 18).

Figura 18. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal do grupo

controle, 30 dias após o experimento.

Figura 18. Coloração H.E. Aumento no original 40x. Tecido conjuntivo fibroso (TC); superfície de reparo ósseo revestida por células achatadas ou osteoblastos inativos (setas) e matriz osteóide (O).

Em relação ao grupo veículo, as feridas se mostram semelhantes às do

grupo controle. Entretanto, observa-se na área central do defeito infiltrado

inflamatório, caracterizado por células mononucleares (linfócitos e macrófagos) e

vasos sanguíneos neoformados. As bordas ósseas apresentam reduzida

formação óssea com presença de células de revestimento ósseo ou

osteoblastos inativos (Figura 19 e 20).

52


veículo, 30 dias após o experimento.

Figura 19. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x. Tecido conjuntivo (TC) e infiltrado inflamatório caracterizado por linfócitos (setas), macrófagos (seta dupla) e vasogênese (V).


veiculo, 30 dias após o experimento.

Figura 20. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Osteoblastos inativos (setas) na superfície das feridas.

(2E)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona - C1

Microscopicamente, após 30 dias do experimento, essa molécula na dose

de 1% e 5% mostrou tecido conjuntivo em continuidade com o periósteo

preenchendo toda a extensão do defeito crítico, sem sinais de inflamação. A

53

neoformação mostrou-se restrita as bordas do defeito ósseo, revestidas por

células cúbicas, característica de osteoblastos ativos. O tecido ósseo

neoformado osteócitos incluídos na matriz mineralizada (Figura 21 e 22).

Figura 21. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado

com a molécula C1 a 1% 30 dias após o experimento.

Figura 21. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Bordas ósseas revestidas por células cúbicas ou osteoblastos ativos (setas).

Figura 22. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado com a molécula C1 a 5% 30 dias após o experimento.

Figura 22. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x Bordas ósseas revestidas por células cúbicas ou osteoblastos ativos (setas) e osteócitos na matriz do osso recém-formado (cabeça de seta).

54

Histologicamente, na concentração de 10%, foi observada na região

central do defeito, formação de tecido conjuntivo sem sinais de inflamação. Não

se observou neoformação óssea na região central da ferida, ou seja, a

osteogênese permaneceu restrita às bordas do defeito, revestidas

principalmente por células cúbicas que indicam osteoblastos ativos. A

neoformação óssea mostra características de tecido primário, com distribuição

irregular de osteócitos incluídos na matriz mineralizada (Figura 23).



Figura 23. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x Bordas ósseas revestidas por células cúbicas ou osteoblastos ativos (setas) e osteócitos na matriz do osso recém formado (cabeça de seta).

(2E)-3-(4-clorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona – C2

Na concentração de 1%, este grupo exibiu proliferação celular junto ao

periósteo, sem indícios de inflamação. As feridas mostraram neoformação óssea

limitada, partindo das bordas do defeito crítico, com osteócitos na matriz recém

mineralizada. Os osteoblastos presentes nas superfícies ósseas possuem

morfologia de atividade, indicando continuidade da osteogênese (Figura 24).

55



Figura 24. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (setas) e osteócitos incluídos na matriz (cabeça de seta).

Na dose de 5%, nota-se formação óssea restrita as bordas do defeito

crítico e presença de tecido conjuntivo preenchendo a ferida. As células

adjacentes as bordas do defeito mostram características de atividade. O osso

recém formado apresenta osteócitos incluídos na matriz mineralizada (Figura

25).




56

À 10%, a análise histológica demonstrou que o osso recém-formado

apresenta-se revestido por osteoblastos ativos e osteócitos na matriz óssea

mineralizada. A substância osteóide é mais evidente nessa concentração

indicando maior atividade secretora (Figura 26).



Figura 26. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (setas), osteócito (cabeça de seta) e matriz osteóide (O).

(2E)-3-(4-metilfenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona – C3

Em relação a esse composto na concentração de 1% e 5% observou-se

na análise microscópica, que este grupo demonstrou feridas preenchidas por

tecido conjuntivo fibroso, sem sinais de inflamação, limitada neoformação óssea,

com superfícies revestidas por células ativas (Figura 27 e 28).

57



Figura 27. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (setas) e osteócito (cabeça de seta).

Figura 28. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado com a molécula C3 a 5% 30 dias após o experimento.

Figura 28. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Presença de osteoblastos ativos nas superfícies de reparo (setas).

À 10%, essa molécula mostrou tecido conjuntivo sem sinais de

inflamação; formação óssea restrita as bordas do defeito crítico; com presença

58

de matriz osteóide secretada por osteoblastos ativos dispostos por toda a

extensão da superfície óssea (Figura 29).



Figura 29. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Tecido conjuntivo (TC), superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (setas), osteócitos incluídos na matriz mineralizada (cabeça de seta) e matriz osteóide (O).

(2E)-3-(4-metoxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona – C4

Após 4 semanas, o composto C4 na concentração de 1% mostrou que os

sítios apresentavam osteogênese restrita as bordas do defeito em contato com o

osso basal e mineralização da matriz óssea neoformada, enquanto a região

central apresentava-se preenchida por tecido conjuntivo fibroso em continuidade

com o periósteo sem indícios de inflamação (Figura 30).

59



Figura 30. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Tecido conjuntivo (TC), osteoblastos ativos (setas) na superfície das feridas, osteócitos na matriz mineralizada (cabeça de seta).

Já, na concentração de 5% e 10% as características apresentadas foram

similares. O composto apresentou tecido conjuntivo fibroso, sem indícios de

inflamação. A neoformação óssea apresenta matriz osteóide secretada pelos

osteoblastos ativos nas bordas ósseas. Nota-se, na concentração de 10%

indícios de remodelamento ósseo com áreas características de osso secundário.

(Figura 31 e 32).



Figura 31. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Tecido conjuntivo (TC), superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (setas), osteócitos (cabeça de seta).

60



Figura 32. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x. Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (setas), osteócitos (cabeça de seta) osso primário (OP) e osso secundário (OS).

(2E)-1,3-difenilprop-2-en-1-ona - C5

Nas concentrações de 1% e 5% observa-se tecido conjuntivo na região

central do defeito. A osteogênese parece estar ainda ocorrendo, uma vez que os

osteoblastos nas superfícies ósseas apresentam características de atividade,

com formação de matriz osteóide (Figura 33 e 34).

61



Figura 33. Coloração H.E. Aumento no original 40x. Osteoblastos ativos (setas) na superfície das feridas, osteócitos na matriz mineralizada (cabeça de seta).




Nas feridas tratadas com a molécula á 10% as amostras apresentavam na

área central do defeito a presença de tecido conjuntivo e ausência de infiltrado

inflamatório. Houve neoformação óssea nas bordas do defeito crítico, com

redução significativa do diâmetro do defeito. O tecido ósseo recém-formado

62

apresenta características de remodelamento ósseo, com estruturas

concêntricas, sugerindo maturidade do tecido. Ainda, caracterizando

continuidade da osteogênese, há presença de osteoblastos ativos nas

superfícies ósseas (Figura 35).



Figura 35. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x. Tecido conjuntivo (TC), superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos (seta), osteócitos (cabeça de seta), estruturas concêntricas (seta tracejada), osso primário (OP) e osso secundário (OS)

63

5 DISCUSSÃO

Este trabalho objetivou estudar o potencial osteogênico em defeitos

críticos na calota craniana de ratos de moléculas de chalcona com diferentes

substituintes propostos por Topliss, em diferentes concentrações (1%; 5% e

10%) utilizando como veículo carreador, a vaselina. A calvária desse animal foi

escolhida para simular perdas ósseas porque é composta por osso

membranoso, tem um suprimento sanguíneo relativamente limitado o que lhe

confere pouca capacidade para se regenerar. Além disso, é uma área

anatomicamente livre de estresse mecânico, com uma estabilidade relativa das

estruturas que circundam os defeitos críticos, como margens calvariais intactas,

a base da dura-máter e os músculos temporais e frontais. Essas características

criam uma situação na qual é possível estudar as interações entre o material

implantado e o osso “in situ” (MANKANI et al., 2006; SPICER et al., 2012).

O periósteo foi mantido, pois corresponde um tecido fibroso condensado e

altamente celular e vascularizado, fornecendo aporte sanguíneo, bem como

células osteoprogenitoras, desempenhando importante papel no crescimento

dos ossos e na reparação de fraturas (GONDIN, 2007).

Utilizou-se o período máximo de 30 dias, pois estudos (ORTOLAN et al.,

2013) demonstram que 45 dias pós-tratamento, o uso de uma molécula bioativa

como a chalcona, é capaz de promover um reparo completo da ferida crítica,

limitando o estudo com o objetivo de comparar o crescimento ósseo entre os

grupos experimentais. Dessa maneira, 30 dias de experimento torna-se o

período de escolha para mensurar a reparação óssea, através da medida dos

diâmetros das feridas ósseas remanescentes, sem que ocorra a reparo total do

defeito.

Assim, de acordo com a metodologia utilizada, observou-se que os grupos

controle e veículo apresentaram pequena área de neoformação óssea, sem

diferenças estatísticas entre si, sendo que nenhuma das amostras evoluiu para

regeneração significativa nos 30 dias experimentais desse trabalho,

caracterizando o modelo de ferida crítica.

A análise histológica mostrou, nos grupos controle e veículo, que os

osteoblastos presentes nas bordas das feridas ósseas, caracterizados como

64

células de revestimento ósseo, formam uma camada contínua de células

achatadas que reveste a matriz calcificada, apresentando, em ambos os grupos,

capacidade de síntese reduzida, indicativo de neoformação óssea limitada, como

apresentado pelos resultados quantitativos.

Oliveira et al. (2008) obteve resultados semelhantes ao avaliar o reparo

de feridas críticas, promovido pelo implante de osso bovino desmineralizado,

mostrando que, 21 dias após o experimento, esse biomaterial é substituído por

tecido fibroso e que em períodos posteriores (90 dias) o reparo continua

incompleto.

Na concentração de 1%, os animais tratados com as diferentes

moléculas, demonstraram formação óssea limitada. Nessa concentração,

apenas as moléculas C3, C4 e C5 mostraram diferenças estatísticas em relação

ao grupo controle, embora em todas as amostras encontram-se osteoblastos

ativos nas superfícies do tecido ósseo recém formado.

Já, as feridas tratadas com as 5 chalconas na concentração de 5%

apresentam resultados quantitativos significantes em comparação ao grupo

controle quanto ao fechamento da ferida óssea, confirmado pela análise

histológica, que mostra osteoblastos ativos nas bordas do tecido ósseo,

indicativo de atividade secretora dessas células.

Quanto ao tratamento das feridas com as moléculas a 10%, novamente

todas mostraram-se significativas em relação ao controle e ao veículo, sugerindo

intensa atividade dos osteoblastos nas superfícies ósseas do tecido recém

formado.

Embora, neste estudo, não se observou a cascata de eventos vinculados

à osteogênese, como relata o estudo de Ripamonte e Reddi (1992) em

implantes heterotópicos de matriz óssea desmineralizada, podemos inferir a sua

ocorrência “induzida” pelas moléculas de chalcona utilizadas.

Além disso, neste estudo, as feridas tratadas com veículo mostraram

intensa reação inflamatória, caracterizada pela presença de vasos sanguíneos

ingurgitados e células mononucleares. Issa et al. (2010) mostraram que quando

se usa um carreador como o colágeno, mesmo sendo considerado um material

biocompatível, duas semanas após a sua aplicação, as amostras apresentam na

região central da ferida crítica, um infiltrado inflamatório, com grande quantidade

de células sanguíneas.

65

Entretanto, apesar de primariamente a inflamação representar um dos

mecanismos de defesa do organismo, vale ressaltar que aparentemente o

veículo utilizado neste estudo (vaselina) parece promover uma inflamação

intensa, comprometendo o processo de regeneração óssea, uma vez que em

nosso estudo, mesmo após 30 dias, essa fase do reparo (inflamatória) ainda

permanece bem evidenciada.

Nas feridas tratadas com as moléculas de chalcona, durante o período de

estudo, não se observou sinais de inflamação em nenhuma das amostras

analisadas. Nyan et al (2007) observou em feridas críticas de calota craniana de

ratos, que a sinvastatina em combinação com sulfato de cálcio, durante 2, 4 e 8

semanas, promove uma inflamação intensa nos períodos iniciais seguida de

reparo ósseo acentuado nos períodos tardios.

Aparentemente, as chalconas utilizadas nesse estudo minimizam os

efeitos do processo inflamatório (KIM et al., 2007; BANDGARD et al., 2010),

contribuindo para a melhora do estímulo do reparo ósseo. Estudos de Campos-

Buzzi (2007) mostram que a introdução de substituintes doadores e sacadores

de elétrons sugerem contribuem de forma significativa para a antinocicepção

dessas substâncias, como consequência da diminuição da inflamação

(CAMPOS-BUZZI, 2007).

Ainda, neste estudo, os resultados mostraram que nas feridas tratadas

com as chalconas em todas as concentrações (1%, 5% e 10%) observou-se

predominantemente osteoblastos ativos, que contribuem para a formação de

matriz óssea, indicativo de reparo da ferida em períodos maiores de estudo (45,

60 dias do experimento), como demonstrado em estudos de Ortolan et al.

(2013).

O fato de que os grupos tratados com as moléculas de chalcona, mesmo

após 30 dias de tratamento, ainda apresentarem células ativas permite sugerir

que as chalconas apresentam maior potencial osteogênico quando comparado

ao FGF-1 em estudos de Gomez et al. (2006), o qual mostra que em feridas

críticas de calota craniana de ratos tratadas com essa substância, houve baixa

formação de osso, concluindo que o FGF-1 apresenta poucos benefícios quando

se trata de reparo ósseo.

Sabe-se que, como no processo de reparo ósseo geralmente ocorre o

mesmo tipo de osteogênese que deu origem ao tecido lesado, tudo indica que o

66

reparo induzido pela chalcona ocorreu por mecanismo intramembranoso, que é

responsável pela formação dos ossos de calota craniana (ORTOLAN et al.,

2013).

De acordo com Ortolan et al. (2013), inicialmente, o mecanismo de reparo

do tecido ósseo apresenta uma fase de síntese e maturação de fibras

colágenas, porém, acredita-se que não houve interação das chalconas com as

células ectomesenquimais na diferenciação celular quanto à formação de tecido

conjuntivo fibroso porque de acordo com os resultados desse trabalho, o tecido

fibroso formou-se em todos os grupos, ou seja, tratados e não tratados, sem

sinais de osteogênese na região central das feridas.

Neste estudo, a formação de tecido ósseo a partir das bordas dos defeitos

críticos evoluindo para o fechamento significativo das feridas, principalmente nos

grupos tratados com as chalconas a 10%, sugere que estas substâncias podem

atuar na diferenciação celular da linhagem osteogênica propriamente dita

(células osteoprogenitoras e osteoblastos).

Acredita-se que a estrutura das chalconas utilizadas nessa pesquisa dada

por dois anéis aromáticos e substituintes propostos por Topliss conferem a

essas moléculas certo grau de lipofilicidade (WON et al., 2005; JHA et al., 2007),

podendo, desta maneira, interagir em alguma das fases do reparo junto a

receptores de membrana ou citoplasmáticos de células ósseas, ou através de

fatores de transcrição e secreção de proteínas não colágenas como as BMPs

entre outros, responsáveis pela elaboração de matrizes extracelulares que

mineralizam, estando de acordo com estudo de Kim et al (2012) quanto a

possível indução da Licochalcona A na expressão de BMP, fator importante no

mecanismo de osteogênese.

Assim, o reparo promovido pelas chalconas, é semelhante ao obtido com

rhBMP-2, cuja eficiência já foi demonstrada por Issa et al. (2008) relatando uma

melhoria substancial em qualidade e quantidade do reparo quando comparadas

com reparo espontâneo. Convém ressaltar que é necessário cerca de um

quilograma de osso para se obter poucos microgramas de BPM, dificultando o

uso generalizado desse material (SCHMIDT, 2006) em razão dos custos. Desta

forma, as chalconas tem a vantagem de obtenção simples, economicamente

viável e em quantidade desejada.

67

Atualmente, a proposta da bioengenharia quando se trata de regeneração

óssea é a combinação de células tronco com matrizes artificiais, tridimencionais,

porosas, biodegradáveis que oferecam condições favoráveis para a proliferacao

e diferenciacao celular (TUZLAKOGLU; REIS, 2009).

Kneser et al. (2006) revestiu discos de osso esponjoso bovino com uma

matriz de fibrina contendo osteoblastos e observou que, após 4 meses houve

neoformação óssea significativa e que a presença dos osteoblastos não

modificou o potencial de reparo do disco de osso esponjoso.

Ressalta-se que este estudo, limitou-se a avaliar o potencial de reparo

ósseo das chalconas, sem a elaboração de uma matriz tridimensional nem a sua

combinação com células tronco, em um período de 30 dias acreditando-se,

entretanto, que melhores resultados poderiam ser obtidos em estudos com

intervalos de tempo maiores que 4 semanas, conforme demonstrado por Issa et

al. (2008) ao estudarem o potencial osteogênico das rhBMP-2. Esta proteína

bovina foi capaz de induzir a regeneração óssea tendo sua ação potencializada

quando combinada com elementos carreadores, sendo também, a reparação

óssea dependente do tempo.

Ainda, neste estudo, a osteogênese apresentada pelas 5 moléculas de

chalcona, se mostrou de maneira dose dependente, ou seja, foram observadas

diferenças crescentes de formação óssea quando se utilizou concentrações

maiores.

Estudos de Kim (2012), utilizando a licochalcona A em modelos in vivo e

in vitro, demonstraram que essa molécula não apresenta um bom potencial

osteogênico na dose de 10µM em comparação com as doses menores (2,5 e

5uM), embora a concentração maior não apresente nenhum tipo de

citotoxicidade.

Neste estudo, não se observou, no teste in vivo, alteração celular com

processos de necrose, confirmando a baixa toxicidade destes compostos já

descritos na literatura (Santana 2012). Ao contrário, o uso das moléculas a 10%

representou em todos os grupos, a dose mais efetiva quanto ao estímulo de

osteogênese, mostrando maior neoformação óssea quando comparada as

demais concentrações. Além disso, a qualidade do osso formado parece ser

superior nessa concentração (10%), principalmente nos grupos tratados com as

moléculas C4 e C5, pois apresentaram características de osso secundário.

68

De qualquer maneira, sabe-se que uma dose adequada e que promova

um reparo ósseo adequado, depende da espécie que esta sendo utilizada nos

testes experimentais. Ainda, a dose parece ser dependente do local onde foi

implantada a substância testada, pois, as diferenças encontradas devem-se ao

aporte sanguíneo adequado, presença de células mesenquimais e de linhagem

osteogênica.

Além disso, a dose eficaz varia de acordo com o carreador que esta

sendo utilizado (veículo) o que demonstra a importância das propriedades do

biomaterial transportador na administração de substâncias que possam

promover a osteogênese (BOERCKEL et al., 2011).

Neste estudo, os graus diferentes de reparo ósseo observados pelo

tratamento com as 5 moléculas de chalconas com os substituintes de Topliss

não demonstraram grandes diferenças quando comparadas entre si, sugerindo

que, independente da molécula utilizada, a osteogênese continua ocorrendo

devido a presença de células ativas nas superfícies do tecido ósseo neoformado,

diferente dos grupos controle e veículo que, ao contrário, demonstraram

osteoblastos ativos nas bordas ósseas. Portanto, as 5 moléculas utilizadas

apresentam potencialidades quanto à formação óssea, entretanto as moléculas

C4 e C5 na concentração de 10% apresentaram maior neoformação óssea no

período estudado e melhor qualidade óssea.

Na concentração de 10%, a molécula mais efetiva foi a não substituída

demonstrando que o efeito estéreo é mais significativo que os efeitos

hidrofóbicos e eletrônicos observando-se a relação proposta por Topliss.

O efeito das variações da forma e do tamanho de uma molécula a ser

analisada é de grande importância quando se quer comprovar sua eficácia frente

a uma atividade biológica. Por outro lado, deve-se considerar que ainda

permanece desconhecida a estrutura e o receptor no qual as chalconas estão

atuando. Portanto, há a necessidade de síntese de compostos análogos com

maior variedade de substituintes para que se possa comprovar essa hipótese

através da análise de outros parâmetros físico-químicos que podem também

estar envolvidos nesta atividade biológica.

Neste estudo, de acordo com o método utilizado, levando em conta o

potencial osteogênico apresentado pelas chalconas, estas moléculas podem

representar uma perspectiva farmacológica na aceleração do reparo ósseo,

69

todavia, é importante continuar os estudos avaliando outras moléculas e

carreadores, em outras metodologias, a fim de determinar especificamente a

função das chalconas, considerando o aspecto custo/benefício envolvido no

processo de síntese dessas substâncias.

70

6 CONCLUSÃO

Os resultados desse estudo, de acordo com a metodologia utilizada, permitem

concluir que:

Na concentração à 1%, somente as moléculas C3, C4 e C5 mostraram

diferenças significativas em relação ao grupo controle, embora todas as

amostras apresentam osteoblastos ativos, indicativo de continuidade da

osteogênese;

Nas concentrações de 5% e 10%, em todos os grupos, houve maior

atividade de reparo da ferida óssea, com fechamento ósseo significativo

em relação ao grupo controle; demonstrando maior atividade secretora

dos osteoblastos ativos presentes nas bordas ósseas;

Todas as moléculas apresentaram uma relação dose-resposta;

Não se observou, com os diferentes substituintes propostos por Topliss,

diferenças significativas entre as moléculas, em uma mesma

concentração;

A concentração a 10% foi a mais efetiva em relação a formação óssea em

todas as moléculas analisadas;

A inibição do infiltrado inflamatório observado nas feridas tratadas com a

chalcona pode ser favorável no processo de “indução” de osteogênese;

A molécula mais efetiva foi a não substituída, na concentração de 10%,

apresentando maior potencial osteogênico quanto ao fechamento da

ferida óssea e a qualidade de osso formado.

71

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ANEXO

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