joÃo guilherme werner brum -...

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE BIOLOGIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PARASITOLOGIA VETERINÁRIA

INFECÇÃO EM TELEÓGINAS DE Boophilus microplus (ACARI: IXODI-

DAE) POR Cedecea lapagei GRIMONT et al., 1981: ETIOPATOGENIA

E SAZONALIDADE.

JOÃO GUILHERME WERNER BRUM

SOB A ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR

JOÃO LUIZ HORÁCIO FACCINI

Tese, submetida como requisito

parcial para a obtenção do

grau de Doutor em Medicina

Veterinária - Parasitologia Ve-

terinária.

Itaguaí, Rio de Janeiro.

Dezembro, 1988.

INFECÇÃO EM TELEÓGINAS DE Boophilus microplus (ACARI: IXODI-

DAE) POR Cedecea lapagei GRIMONT et al., 1981: ETIOPATOGENIA

E SAZONALIDADE

JOÃO GUILHERME VERNER BRUM

APROVADO EM: 22/DEZEMBRO/1988

JOÃO LUIZ HORÁCIO FACCINI

CLAUDETE ARAÚJO MASSARD

OSAMU KIMURA

NICOLAU MAUÉS DA SERRA FREIRE

CARLOS LUIZ MASSARD

AGRADECIMENTOS

à Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

(UFRRJ) e à Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) pela opor-

tunidade de realizar o Curso;

- ao Professor JOÃO LUIZ HORÁCIO FACCINI pela amizade

e correta orientação;

- aos Professores GONZALO EFRAIN MOYA BORJA e CARLOS

WILSON GOMES LOPES pelo apoio e constantes sugestões;

- ao Professor NICOLAU MAUÉS DA SERRA FREIRE, Coorde-

nador do Curso de Pós-Graduação em Parasitologia Veterinária,

por sua dedicação ao Curso;

- ao Professor MILTON MASCARENHAS DO AMARAL pela a-

juda nos cortes histológicos;

- à Professora MARTHA DE OLIVEIRA TEIXEIRA e ao Dou-

tor LEONIR BIRCK pelo auxílio nos trabalhos de Microbiologia;

ao Professor JOÃO CARLOS GONZALES da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) pela nossa iniciação à

pesquisa com Boophilus microplus;

- aos laboratoristas JOSÉ ZUFFO NETO e CARMEM LÚCIA

FONSECA MARTINS pelo auxílio no trabalho laboratorial;

- ao Médico-Veterinário SÉRGIO SILVA DA SILVA e à

Professora MARIA DA GRAÇA ROTH pela ajuda nas fotografias e

iv

slides;

- ao secretário FERNANDO LUIZ LEON DE MELLO pelo ser-

viço datilográfico;

- aos demais professores, funcionários e colegas do

Curso de Parasitologia Veterinária da UFRRJ e do Departamento

de Microbiologia e Parasitologia da UFPEL pelo apoio;

- à todos que de uma maneira ou de outra tornaram

possível realizar este trabalho.

BIOGRAFIA

JOÃO GUILHERME WERNER BRUM, filho de Alfredo Almeida

Brum e de Enilda Werner Brum, nasceu no dia 29 de outubro de

1950 em Pelotas, RS, tendo realizado o Curso Primário no Gru-

po Escolar Bernardino Ângelo em Dom Pedrito, RS e o secundá-

rio no Colégio Agrícola Visconde da Graça em Pelotas, RS.

Ingressou na Faculdade de Veterinária da UFPEL em

1970, concluindo o Curso em 1973, tendo sido bolsista de ini-

ciação científica do extinto DNPeA nos dois últimos anos.

Em 1974 foi contratado pela EMBRAPA como pesquisador

em Campo Grande, MS, onde permaneceu até 1975.

Em 1976 foi contratado pela Universidade Federal de

Pelotas como Auxiliar de Ensino no Departamento de Microbio-

logia e Parasitologia e Curso de Pós Graduação em Sanidade A-

nimal onde permanece como Professor Adjunto.

Em 1977, como bolsista do Programa Institucional de

Capacitação Docente (PICD) da CAPES, iniciou o Curso de Pós-

Graduação a nível de Mestrado em Doenças Parasitárias, na Fa-

culdade de Veterinária da UFRGS, concluindo-o em setembro de

1979 com a aprovação da tese "Postura e eclosão de Boophilus

microplus (Can., 1887) em diferentes localizações geográficas

do Rio Grande do Sul", tendo sido agraciado na época, com Láu-

vi

rea Acadêmica da mesma Universidade.

No período 1975-1985 publicou 29 trabalhos científi-

cos e orientou duas teses na área de Parasitologia Veteriná-

ria.

Em março de 1984, como bolsista do PICD/CAPES, ini-

ciou Curso de Doutorado em Medicina Veterinária, Parasitolo-

gia Veterinária, na Universidade Federal Rural do Rio de Ja-

neiro.

SUMÁ RI O

INTRODUÇÃO

REVISÃO DA LITERATURA

1. Patologia de carrapatos

2. Anatomia e histologia da porção final do aparelho geni-

tal feminino

MATERIAL E MÉTODOS

1. Identificação da bactéria

2. Histopatologia da infecção bacteriana

3. Ação da bactéria sobre teleóginas

3.1. Teste de inoculação por método de imersão

3.2. Teste de inoculação por método de injeção

4. Infecção natural

4.1. Descrição do local

4.2. Exposição das teleóginas

RESULTADOS E DISCUSSÃO







1

3

3

6

10

10

11

12

12

13

14

14

15

16

16

18

25

25

28

34

vii i

CONCLUSÕES 39

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40

LISTA DE TABELAS

Peso da massa de ovos, eclodibilidade e morta-

lidade de Boophilus microplus de acordo com os

tratamentos

Frequência mensal de aparecimento de doença cau-

sada por Cedecea lapagei em teleóginas de

Boophilus microplus naturalmente expostas a cam-

po na UFPEL; de acordo com a temperatura meso-

climática mínima

30

37

TABELA I -

TABELA II -

LISTA DE GRÁFICOS

Mortalidade e/ou doença em teleóginas imersas

em suspensão bacteriana de Cedecea lapagei

(ISB) e salina glicerinada (ISG)

Percentagem de teleóginas com infecção por

Cedecea lapagei no meio ambiente e temperaturas

médias mensais em Pelotas, RS

29

38

GRÁFICO 1 -

GRÁFICO 2 -

LISTA DE FIGURAS

Células de Cedecea lapagei coradas pelo método

de Gram, obtida do aparelho genital de teleógi-

nas de Boophilus microplus, 1000 X

Boophilus microplus. Porção terminal do apare-

lho genital de uma teleógina. 40 X

Boophilus microplus. Aspecto da vagina de uma

teleógina do grupo controle, não infectada por

Cedecea lapagei. 40 X

Boophilus microplus. Aspecto anatomopatológico

da vagina de uma teleógina infectada por Cedecea

lapagei. 40 X

Boophilus microplus. Histologia da vagina de uma

teleógina controle, não infectada por Cedecea

lapagei. HE 400 X

Boophilus microplus. Histopatologia da vagina de

uma teleógina infectada por Cedecea lapagei. HE

400 X

Boophilus microplus. Teleógina com secreção ge-

nital. 7 X

Boophilus microplus. Teleógina morta após ter

adquirido infecção genital por Cedecea lapagei. 7 X 32

17

20

21

22

23

24

31

FIGURA 1 -

FIGURA 2 -

FIGURA 3 -

FIGURA 4 -

FIGURA 5 -

FIGURA 6 -

FIGURA 7 -

FIGURA 8 -

xii

FIGURA 9 - Boophilus microplus. "Prolapso de vagina" devido

ao esforço de oviposição. 40 X 33

RESUMO

Identificou-se a bactéria Cedecea lapagei como cau-

sadora de infecção genital e/ou morte em teleóginas de Boophilus

microplus.

Nas fêmeas sadias o epitélio vaginal é constituído

de células colunares com núcleo basal; nas doentes este epi-

télio está destruído.

Teleóginas inoculadas por imersão na suspensão de C.

lapagei apresentaram média de peso de ovos de 1,39 g, as imer-

sas em salina glicerinada 2,36 g e as imersas em água desti-

fada 2,64 g. A injeção de 1,0 µl de suspensão bacteriana ma-

tou 100% das teleóginas em 48 horas; os grupos injetados com

1,0 µl de salina glicerinada e com água destilada apresenta-

ram postura de 2,07 e 2,51 g respectivamente.

Teleóginas sem tratamento expostas ao meio ambiente

durante um ano também apresentaram secreção genital, observando-

se máximo de infecção em 40% das fêmeas no mês de junho e mínimo

de 6,7% nos meses de fevereiro e abril. O coeficiente de cor-

relação entre a percentagem mensal de fêmeas doentes e a tem-

peratura média das mínimas do período foi de r = -0,9074.

ABSTRACT

Cedecea lapagei was identified as the cause of geni-

tal infection and/or death of engorged females of Boophilus

microplus. In healthy females, colummar cells with a basal nu-

cleus form the vaginal epithelium, which is destroyed in the

sick ones. At the inoculation test, the group immersed in a

C. lapagei suspension presented a mean egg weight of 1,39 g;

that immersed in glycerin saline, 2,36 g, and that immersedin

distilled water, 2,64 g. The injection of 1,0 µl of a bacte-

rial suspension killed 100% of the engorged females in 48

hours; groups injected with 1,0 µl of glycerin saline and

distilled water presented an oviposition of 2,07 and 2,51 g

respectively. Untreated engorded females exposed to the envi-

roment during a year also present genital secretion. Infection

peak was 40% of the females in June, and minimal rate was 6,7%

in February and April; correlation coefficient between monthly

percentage of sick females and minimal mean temperatures in

the period was of r = -0,9074.

INTRODUÇÃO

O carrapato comum dos bovinos Boophilus microplus

(Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) é um dos principais ecto-

parasitos destes animais no Brasil e em varias partes do mun-

do. Com o advento dos carrapaticidas a partir da II Guerra

Mundial, começaram a surgir problemas de resistência bem co-

mo houve um certo abandono nas investigações sobre bioecolo-

gia do B. microplus.

No Brasil, a primeira citação de resistência a car-

rapaticida, no caso arsenical, foi de FREIRE (1953) no Rio

Grande do Sul. Posteriormente foram sendo apontados casos de

resistência a organoclorados e organofosforados (GONZALES &

SILVA, 1972; AMARAL et al., 1974). Por outro lado, os traba-

lhos de biologia são raros, se comparados ao número de pesqui-

sas realizadas com acaricidas; os que tratam de microbiologia

e controle biológico praticamente inexistem.

HORN & ARTECHE (1983) informaram que o carrapato, jun-

tamente com a Dermatobia hominis e a Cochliomyia hominivorax

causam, no Brasil, perdas anuais de 727,6 mil toneladas de

carne, 1,6 milhões de litros de leite e que, de 10 milhões de

peças de couro produzidas, apenas 10% são utilizadas pela in-

dústria; por isto, o país tem que importar 25 milhões de dóla-

res em peles para suprir o mercado interno. Além destas perdas

causadas pela ação mecânica e espoliação sanguínea, somam-se

os gastos com carrapaticidas, aliadas à transmissão de riquét-

sias do gênero Anaplasma e protozoários do gênero Babesia.

BRUM & TEIXEIRA (1986) ao realizarem teste de imer-

são em teleóginas com carrapaticida fosforado, verificaram a

presença de secreção purulenta, causando inibição na oviposi-

ção das fêmeas.

Desta secreção RIBEIRO (1986) isolou formas de bas-

tonetes Gram negativos associados à infecção.

Baseado nestas informações, este trabalho teve os se-

guintes objetivos:

- Identificar a bactéria causadora da infecção;

- Estudar possíveis lesões causadas no aparelho geni-

tal das teleóginas;

- Estimar a eficiência da bactéria na inibição da o-

viposição das fêmeas;

- Estimar a frequência mensal de aparecimento de se-

creção em teleóginas colocadas no meio ambiente.

* RIBEIRO, G.A. Comunicação pessoal. Faculdade de Veteriná-

ria - UFPEL. 1986.

REVISÃO DA LITERATURA

1. Patologia de carrapatos

DUNCAN (1926) observou que o conteúdo intestinal

de Cimex lectularis, Argas persicus e Ornithodoros moubata

são consistentemente estéreis.

JENKINS (1964) referiu como bactérias infectan-

tes para carrapatos, Bacillus cereus em Amblyomma americanum,

Pasteurella tularensis em A. americanum, Dermacentor silvarum

e Haemaphysalis concinna, Salmonella enteritides e Serratia

marcescens em D. andersoni; o autor relatou ainda que existem

protozoários e fungos parasitando várias espécies de carrapa-

tos.

GORSHKOVA (1966) estudou a infecção de fêmeas de

Ixodes ricinus com os fungos Beauveria bassiana, Botritis

cinerea e Penicillium insectivorum. Através infecção artifi-

cial, o autor demonstrou que os fungos não afetam a duração

da oviposição, mas interferem consideravelmente na duração do

desenvolvimento do ovo. Cada espécie de fungo investigada in-

fluenciou peculiarmente quanto ao número de ovos e percentagem

de emergência das larvas; quanto a esta última, os menores

índices foram registrados quando as fêmeas de I. ricinus foram

infectadas com B. bassiana.

Segundo STEINHAUS (1967), existem, aproximadamente

250 espécies de bactérias associadas a insetos e carrapatos;

nestes últimos, cerca de 50% dos isolamentos são formas de

cocos. Trabalhando com D. andersoni, o autor encontrou que en-

tre 2016 carrapatos adultos não alimentados, 1,6% albergando

bactérias; de 486 adultos alimentados, no mínimo 9,1% apresen-

taram bactérias. A explicação possível para este fato foi que

os carrapatos podem ingerir bactérias da pele do hospedeiro; o

autor sugeriu ainda que a flora bacteriana de D. andersoni

é casual, consistindo principalmente de organismos adquiridos

acidentalmente de seus hospedeiros.

GONZALES & FERNANDES (1974) observaram em teleó-

ginas colhidas para trabalhos de laboratório, que algumas não

efetuaram oviposição mesmo sem tratamento algum. Nestas, havia

uma secreção genital amarelada e viscosa que submetida a cul-

tivo, apresentou dois tipos de bactérias, as quais porém, não

foram identificadas.

HOOGSTRAAL (1977) relatou que Proteus mirabilis e

S. marcescens são patogênicas para carrapatos, causando ene-

grecimento, inchação e enfraquecimento da cutícula.

HENDRY & RECHAV (1981) reportaram o aparecimento

da doença de enegrecimento (blackening disease) em 5-10% de

teleóginas de B. decoloratus mesmo sem tratamento. Esfregaços

de conteúdo de fêmeas doentes mostraram a existência de cocos

e bacilos, nos esfregaços de teleóginas sadias não foram de-

tectadas bactérias. Os autores identificaram Proteus sp.,

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas sp., Proteus mirabilis e

Staphylococcus sp.; neste estudo a infecção provavelmente o-

correu após a queda das fêmeas, já que as teleóginas que não

foram deixadas cair ao chão após a alimentação não desenvol-

veram a doença. Os autores sugeriram que o aparelho digestivo

do B. decoloratus está isento de bactérias, o sangue do qual se

alimentam é estéril e que a síndrome observada é uma reação não

específica do carrapato à infecção bacteriana. Segundo os au-

tores, a probabilidade do uso em controle biológico é pequena

porque um método efetivo de infectar os carrapatos no campo

não é economicamente acessível, apesar da efetiva ação acari-

c i d a .

Em teleóginas imersas em carrapaticida fosfora-

do, BRUM & TEIXEIRA (1986) verificaram a presença de secreção

genital purulenta, fato este que inibiu a oviposição das te-

leóginas afetadas. Da secreção purulenta antes referida, fo-

ram isoladas formas de bastonetes Gram negativos com cresci-

mento em ágar-sangue, Mac-Conkey e ágar-soja, apresentando

crescimento ótimo à temperatura de 27°C (RIBEIRO, 1986)*. Os

autores realizaram teste piloto com quatro grupos de teleógi-

nas tratadas por imersão nas seguintes soluções 1º) acaricida

fosforado, 2º) acaricida fosforado + suspensão da bactéria,

3º) suspensão da bactér ia e , 4º) tes temunha imerso em água.

Os resul tados variaram de 10 a 60% de teleóginas infectadas,

sendo que o grupo que foi imerso em mistura acaricida + sus-

pensão bacteriana, foi o que apresentou o maior número de fê-

meas com alteração patológica.

Existem poucas ci tações sobre o aparecimento de

* RIBEIRO, G.A. Comunicação pessoal . Faculdade de Veter iná-

ria - UFPEL. 1986.

doenças em carrapatos não tratados. Sabe-se dos trabalhos de

GONZALES & FERNANDES (1974) referindo secreção genital em te-

leóginas de B. microplus e de HENDRY & RECHAV (1981) reportan-

do "blackening disease" em fêmeas de B. decoloratus.

RIBEIRO & WIEGAND (1984)* em Pelotas, RS, obser-

varam que durante os meses de inverno, teleóginas de B.

microplus em condições naturais, apresentaram secreção geni-

tal sem nenhum tipo de tratamento, chegando a 20% de prevalên-

cia nas mesmas.

2. Anatomia e histologia da porção final do aparelho

genital feminino

Em fêmeas de representantes da Família Argasidae

(Argas boueti), ROSHDY (1962) observou duas porções na vagi-

na, a vestibular e a cervical. Esta última é curta, de parede

grossa e parcialmente telescopada para o útero; a porção ves-

tibular e um amplo e longo tubo que se conecta posteroventral-

mente com a porção cervical e abre-se no orifício genital ex-

terno.

Dentro da Família Ixodidae, DOUGLAS (1943) obser-

vou que em D. andersoni, a vagina se divide em duas porções,

anterior ou vestibular e posterior ou cervical. Esta última

tem epitélio colunar com o núcleo basofílico disposto na base

da célula; rodeando esta porção há uma espessa camada muscu-

lar, provavelmente relacionada à extrusão do ovo. A porção ves-

*RIBEIRO, P.B. & WIEGAND, M.M. Comunicação Pessoal-Institu-

to de Biologia - UFPEL. 1984.

tibular da vagina e simples, achatada dorsoventralmente e es-

truturalmente similar à porção cervical, porém sem as dobras

da camada epitelial. A porção posterior da vagina vestibular

projeta-se um pouco para dentro da porção cervical e suas pa-

redes gradualmente confundem-se; neste ponto o oviduto comum

entra na porção ventral.

ARTHUR (1953) citou que em I. hexagonus, a vagina

é dividida em uma porção posterior ou cervical, provida deu ma

grossa camada muscular e revestida por epicuticula; há uma cur-

ta região vestibular, sem músculos circulares mas revestida

por uma epicutícula acentuadamente enrugada e delgada camada

de endocutícula.

Segundo ARTHUR (1960), em Dermacentor spp. a vagi-

na é dividida em uma porção em formato de barril que é poste-

rior e chamada parte cervical e uma anterior ou vestibular que

vai dar no orifício genital externo. O epitélio e colunar e

rodeado por fibras musculares, indubidavelmente relacionados

à extrusão do ovo.

CHINERY (1965) descreveu o aparelho genital femi-

nino de Haemaphysalis spinigera com a seguinte constituição:

um ovário tubular simples, um par de ovidutos que se prendem

num oviduto comum, a vagina, um par de glândulas tubulares a-

cessórias que desembocam dorsalmente na porção distal da va-

gina, o receptáculo seminal e um tubo de conexão que junta o

receptáculo à vagina. O autor relatou que, histologicamente,

com o engurgitamento, as células epiteliais cúbicas do ovidu-

to proliferam e aumentam de tamanho; elas aparecem como peque-

nas células colunares com o núcleo situado na metade basal das

células. O citoplasma e fortemente fibrilar, principalmente na

porção basal e com grânulos finos uniformemente distribuídos.

Em fêmeas em oviposição as células mostram extremo achatamen-

to, podendo assemelhar-se a células epiteliais de pavimenta-

ção. A linha cuticular rugosa da região proximal do oviduto

comum torna-se plana devido ao estiramento e as células epi-

teliais, assim como as células musculares, tornam-se hipertro-

fiadas.

BALASHOV (1972) também dividiu a vagina de Ixodidae

em duas partes, cervical e vestibular. O vestíbulo é um tubo

achatado que se estende da abertura genital externa ate a par-

te cervical. Quando os ixodídeos se alimentam, a epiderme do

vestíbulo separa-se da línha cuticular e se expande grande-

mente, de modo a formar umaglândula tubular acessória. A par-

te cervical serve como receptáculo seminal; é oval, posterior-

mente alargada, paralela à linha longitudinal do corpo e co-

nectada ao útero por um curto tubo.

BRINTON et al. (1974) trabalhando com D. andersoni,

realizaram cortes histológicos de aparelho genital corados por

Hematoxilina-eosina. Os autores relataram que os ovidutos são

pregueados, com paredes formadas de epitélio cubóide a colu-

nar, rodeado perifericamente por tecido conjuntivo (membrana

basal) com o qual as fibras musculares estão associadas. Os

núcleos são de formato ovóide ou arredondado e geralmente o-

cupam posição central, exibindo muito material cromatínico.

NUDEZ et al. (1982) reportaram que o aparelho ge-

nital feminino de B. microplus apresenta um ovário alongado

que se estende para frente em ambos os lados do idiossoma pa-

ra continuar-se em um par de ovidutos. A vagina se divide em

duas porções: a cervical, onde desembocam os ovidutos e a ves-

tibular, que se continua até a abertura genital externa.

EL SHOURA et al. (1984) trabalhando com Nuttalliella

namaqua observaram também duas porções na vagina, a vestibu-

lar e a cervical. Histológicamente, a parede da parte anterior

tubular do vestíbulo e constituída de uma camada de células

pouco definidas, espalhadas e com núcleo oval; a parte poste-

rior do vestíbulo consiste de células epiteliais cubóides ou

achatadas. A porção cervical da vagina consiste de células e-

piteliais colunares revestidas por uma delgada camada cuticu-

lar que se estende desde a parte vestibular e é rodeada por

uma camada muscular bem desenvolvida; uma válvula ventral es-

tá presente na estreita junção entre as partes vestibular e

cervical.

MATERIAL E MÉTODOS

I. Identificação da bactéria

A partir de secreção genital de teleóginas de B.

microplus naturalmente infectadas, com cultivo em meio de Mac

Conkey e incubado a 27°C por 24 horas, obteve-se três tipos de

bactérias as quais foram reisoladas em cultura pura. Para a

identificação específica utilizou-se baterias Bac-Tray I e II

para Enterobactérias1. Estes "kits" constam de 10 provas bio-

químicas em cada bateria e que são os seguintes: ONPG (O-ni-

trofenol-β-d-galacto-piranoside), ornitina descarboxilase, Vo-

ges Proskauer, citrato de Simmons, adonitol, inositol, argi-

nina dehidrolase, gás sulfídrico, fenilalanina desaminação,

malonato, salicina, sorbitol, rafinose, lisina descarboxilase,

uréia, indol, ramnose, arabinose e sacarose. A identificação

bacteriana está baseada na obtenção de algarismos, derivados

dos códigos das combinações bioquímicas obtidas.

Para verificar a presença da bactéria na cutícula

dos carrapatos, foram retiradas com pinça esterilizada dire-

tamente do corpo do bovino, 30 teleóginas e colocadas em fras-

1 - Marca Difco.

11

cos também previamente esterilizados. O material foi levadoao

laboratório e cada teleógina, individualmente, foi colocada em

tubo de ensaio contendo 10 ml de água destilada estéril, so-

frendo agitação por 5 minutos (STEINHAUS, 1967). Este lavado

foi semeado em ágar- soja2 pela técnica do esgotamento para ve-

rificação das colônias e incubado a 27°C por 24 horas. Para a

identificação específica procedeu-se do mesmo modo que a iden-

tificação a partir da secreção genital, tal como descrito an-

teriormente.


As teleóginas utilizadas na dissecação foram ob-

tidas de queda natural sendo selecionadas as sadias e em boas

condições. Para a verificação de lesões macroscópicas utili-

zaram-se teleóginas doentes, com 8 a 12 dias após o apareci-

mento de secreção genital. A dissecação foi feita sobre placa

de Petri parafinada, em microscópio estereoscópico binocular3

onde era separada a porção final do aparelho genital. Para co-

rar esta peça utilizou-se a técnica de coloração pelos carmins

(PINTO, 1945) empregada para Cestóides e modificada da seguin-

te maneira: passagem no ácido acético puro por 30 segundos,

lavagem em água corrente, desidratação em álcool 70°GL por 2

minutos, imersão no carmim clorídrico 20 minutos, lavagem em

água corrente e passagem nos álcoois, 70, 90 e 96°GL por 5 mi-

nutos em cada, creosoto de Faia por 2 horas e posteriormente

2 - Marca Biobrás.

3 - Marca Micronal.

12

montagem em lâmina escavada com líquido de Hoyer. Para reali-

zar os cortes histológicos, a peça era fixada em líquido de

Bouin durante 24 horas, inclusa em blocos de parafina, reali-

zando cortes de 6 µm de espessura e corados pela Hematoxili-

na-eosina.

3. Ação da bactéria sobre as teleóginas

Foi realizado teste piloto com as três bactérias

isoladas para verificar o grau de virulência às fêmeas de B.

microplus, a partir daí, trabalhou-se apenas com a espécie que

apresentou, através de inoculação por imersão, maior eficácia

na produção de doença nas fêmeas.

As teleóginas utilizadas no teste foram obtidas de

queda natural e selecionadas as que apresentassem bom aspecto

e motilidade. Após foram separadas em 180 grupos de 5g (± 0,05)

de teleóginas cada um (± 15 fêmeas por grupo), pesados em ba-

lança digital analítica 4 e divididos da seguinte maneira: 30

grupos para o teste de imersão em suspensão bacteriana, 30

grupos para imersão em salina glicerinada, 30 grupos para i-

mersão em água, 30 grupos para injeção de suspensão bacteria-

na, 30 grupos para injeção de salina glicerinada estéril e 30

grupos para injeção de água destilada estéril.


Para preparar a suspensão bacteriana, utili-

4 - Marca Mettler, mod. PC 2000.

13

zou-se solução salina glicerinada feita com os seguintes com-

ponentes: cloreto de sodio, 4,2 g; fosfato dipotássico anidro,

3,1 g; fosfato monopotássico anidro, 1,0 g; glicerol, 300 ml e

água destilada, 700 ml. Após este procedimento a solução foi

autoclavada por 15 minutos a 116°C; posteriormente foi estoca-

da em geladeira. A bactéria foi cultivada em ágar-soja a 27°C

por 24 horas e as placas colocadas em geladeira 24 horas an-

tes de ser feita a suspensão; esta foi misturada no momento do

teste de imersão. A concentração bacteriana foi aferida atra-

vés de contagem de células viáveis por método de diluição se-

riada em placas de Petri (± 20 x 108 cél./ml). Os 30 grupos de

5 g de teleóginas foram imersos nesta suspensão durante 5 mi-

nutos (GONZALES, 1975), à semelhança dos testes "in vitro" com

carrapaticidas químicos, secas em papel absorvente e levadas

à estufa a 27°C e umidade relativa do ar superior a 80%. Nos

60 grupos testemunhas utilizou-se a mesma metodologia só que

ao invés de suspensão bacteriana, em 30 foi feita imersão em

salina glicerinada e nos outros 30, imersão em água destila-

da. As massas de ovos de todos os grupos foram recolhidas, pe-

sadas, identificadas e colocadas na estufa a 27°C e umidade

relativa do ar superior a 80%, para estimativa do período de

incubação e percentagem de eclosão.


Os restantes 90 grupos de 5 g de teleóginas

foram utilizadas da seguinte maneira: em 30 injetou-se 1 µ 1

da suspensão de bactérias referida no item anterior utilizan-

14

do-se uma seringa5 com capacidade de 1 µl. As teleóginas fo-

ram imobilizadas pela face ventral através fixação em fita go-

ada e a inoculação da suspensão foi feita dorsalmente ao la-

do do escudo. Nos outros 60 grupos utilizou-se a mesma meto-

dologia porém em 30 foi injetado solução salina glicerinada

estéril e nos restantes foi inoculada água destilada estéril.

Após o tratamento os grupos foram levados à estufa à 27°C e

umidade relativa do ar superior a 80%; foi feita inspeção diá-

mia para verificação da mortalidade. As massas de ovos que

houvessem eram recolhidas, pesadas, identificadas e colocadas

em tubos de ensaio e levadas à estufa nas mesmas condições a-

cima citadas, para ser estimado o período de incubação e a

percentagem de eclosão.

4- Infecção natural

4.1. Descrição do local

O Campus da Universidade Federal de Pelotas

(UFPEL) está localizado à 15 km da cidade de Pelotas, no mu-

nicípio do Capão do Leão, RS, localizado a 31° 47' L.S. e 52º

25' L.W., com uma altitude de 11,783 m, assentando-se na re-

gião fisiográfica denominada encosta do sudeste. O clima e

sub-tropical úmido, sem estação seca, com inverno fresco e ve-

rão suave e apresenta acentuada influência marítima, manifes-

tada na elevada umidade atmosférica (U.R. 80%) e na amenização

da temperatura, amplitude térmica anual de 10,6°C, uma média

5 - Marca Hamilton.

15

mínima de 13,4°C e média máxima de 22,90C. Segundo a classi-

f icação cl imát ica de Köeppen, o c l ima é denominado de tempera-

do (ROSA, 1985).

4.2. Exposição das teleóginas

Mensalmente e durante um ano, dois grupos de

30 teleóginas cada, obtidas de queda natural, com bom aspecto

e motilidade, foram colocados em placas de Petri e postos sob

abrigo de madeira de modo que permitisse aeração e ao mesmo

tempo protegesse as teleóginas dos raios solares diretos e

precipi tações atmosféricas. De dois em dois dias era fei ta

inspeção nas fêmeas para verificar o aparecimento de doença;

os dados meteorológicos referentes à temperatura do período

foram obtidos na Estação Agroclimatológica do Campus da Uni-

versidade Federal de Pelotas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO


As três bactérias isoladas foram identificadas pe-

la passagem nas baterias Bac-Tray I e II como sendo Escherichia

coli, Enterobacter agglomerans e Cedecea lapagei (Fig. 1),

tendo se trabalhado com esta última por ter sido, no teste

piloto realizado, mais virulenta às fêmeas de B. microplus.

Das provas bioquímicas contidas na Bac-Tray I e II, C. lapagei

foi positiva para ONPG, arginina dehidrolase, citrato de Sim-

mons, malonato e manitol, sendo a única espécie do gênero

Cedecea que não desdobra sacarose.

Estes resultados coincidem com os citados por

GRIMONT et al. (1981) na descrição original do gênero e das

espécies de Cedecea. Neste trabalho os autores isolaram C.

lapagei da saliva e garganta de pessoas nos Estados Unidos e

Canadá e afirmaram que o significado clínico desta bacteria e

desconhecido.

No cultivo em ágar-soja, as colônias de C. lapagei

são lisas, brilhantes e de coloração amarelada apresentando a

27°C, um crescimento rápido nas primeiras 16 horas de incuba-

ção, ficando praticamente do mesmo tamanho até completar 24

17

FIGURA 1 - Células de Cedecea lapagei coradas pelo método

de Gram, obtida do aparelho genital de teleó-

ginas de Boophilus microplus, 1000 X.

18

horas.

Também da cutícula de fêmeas antes da queda, foi

possível identificar C. lapagei pela passagem nas Bac-Tray I

e II, comprovando-se assim, que as teleóginas de B. microplus

adquirem C. lapagei antes de cair ao solo.


A porção final do aparelho genital de teleóginas de

B. microplus consta de vagina, um tubo de conexão que liga es-

ta ao receptáculo seminal, o próprio receptáculo e um oviduto

comum, formado pela junção de um par de ovidutos (Fig. 2), à

semelhança do aparelho genital de D. andersoni (DOUGLAS, 1943)

e H. spinigera (CHINERY, 1965). A divisão da vagina em por-

ções vestibular e cervical (DOUGLAS, 1943; ARTHUR, 1953; AR-

THUR, 1960; BALASHOV, 1972; NUDEZ, 1982; EL SHOURA, 1984) pa-

rece ser uma divisão puramente nomenclatorial, já que ao mi-

croscópio não é possível visualizar qualquer diferença entre

as porções anterior e posterior da vagina. Dos autores consul-

tados, apenas ARTHUR (1960) citou alguma diferença morfológi-

ca entre as duas porções, como sendo a cervical em forma de

barril em Dermacentor spp; apesar disto, DOUGLAS (1943) e

BRINTON et al. (1974) não citam este tipo de diferença em D.

andersoni. Estes autores, bem como CHINERY (1965), NUDEZ et

al. (1982) e EL SHOURA (1984), consideraram a porção cervical

como sendo onde desemboca o oviduto comum, porém não citaram

qualquer diferença morfológica entre as duas porções.

Nas teleóginas sadias e observadas ao microscópio

estereoscópico, a vagina apresenta-se como um tubo claro, es-

19

branquiçado e quase translúcido (Fig. 3), ao passo que nas doen-

tes, observou-se que algumas tiveram uma formação nodular ao

redor da vagina (Fig. 4), outras apresentaram infecção no re-

ceptáculo seminal e em algumas não era possível identificar

nenhum tipo de lesão, simplesmente havia secreção externa e

não havia oviposição, porém sem lesão aparente.

Das teleóginas que ficaram doentes, algumas mor-

riam escuras à semelhança do "blackening disease" em B.

decoloratus referido por HENDRY & RECHAV (1981) ou se observava

secreção genital; no caso de morte foi possível reisolar

C. lapagei do conteúdo das teleóginas mortas. Nas teleóginas

vivas também isolou-se C. lapagei, pois estas não efetuavam

oviposição, havendo casos de teleóginas que permaneceram vivas

por 31 dias após a queda natural. Ao exame microscópico, era

possível verificar no interior das mesmas, ovos formados e em-

brionados, porém sem condições de serem expulsos devido a in-

fecção; estes ovos apesar de embrionados, se colocados em con-

dições ótimas para evolução, não completavam o desenvolvimen-

to.

Histologicamente, observou-se na vagina de B.

microplus um epitélio colunar, com os núcleos situados na base

da célula (Fig. 5), à semelhança de D. andersoni (DOUGLAS, 1943;

BRINTON et al., 1974), Dermacentor spp. (ARTHUR, 1960),

H. spinigera (CHINERY, 1965) e N. namaqua (EL SHOURA, 1984),

parecendo ser este o padrão de tipo de epitélio vaginal da Fa-

mília Ixodidae e também da Família Nuttalliellidae. Nas teleó-

ginas com secreção e sem lesão genital aparente, os cortes

histológicos revelaram que havia uma destruição do epitélio

vaginal (Fig. 6), sendo esta a provável razão pela qual as te-

20

FIGURA 2 - Boophilus microplus. Porção terminal do aparelho

genital de uma teleógina, va - vagina, eg - ovo.

ov - oviduto comum, od - oviduto, rs - receptá-

culo seminal, tc - tubo de conexão. 40 X.

21

FIGURA 3 - Boophilus microplus. Aspecto da vagina de uma te-

leógina do grupo controle, não infectada por Cedecea

lapagei, va - vagina, es - escudo, cx - inserção

da coxa I. 40 X.

22

FIGURA 4 - Boophilus microplus. Aspecto anatomopatológico da

vagina de uma teleógina infectada por Cedecea

lapagei, gr - formação nodular, es - escudo. 40X.

23

FIGURA 5 - Boophilus microplus. Histologia da vagina de uma

teleógina controle, não infectada por Cedecea

lapagei. ep - epitélio, ms - músculo. lz - luz

da vagina. HE. 400 X.

24

FIGURA 6 - Boophilus microplus. Histopatologia da vagina de

uma teleógina infectada por Cedecea lapagei, ed -

epitélio destruído, ms - músculo. lz - luz da va-

gina. HE. 400 X.

25

leóginas doentes não conseguiam realizar a postura.



As médias dos pesos das posturas nas 90 re-

petições feitas foram respectivamente de 1,39, 2,36 e 2,64 g

(Tab. 1) para os grupos imersos em suspensão bacteriana, sa-

lina glicerinada e agua destilada, médias estas estatística-

mente diferentes a nível de 0,01. A média de peso dos o-

vos dos grupos imersos em suspensão de C. lapagei (1,39), re-

presentou 58,9% do peso da postura do grupo salina glicerina-

da (2,36) e 52,6% da postura do imerso em água destilada (2,64),

havendo portanto, uma redução na quantidade de ovos postos de,

41,1 e 47,4% respectivamente.

UMAÑA (1976) referiu que» do peso inicial das

teleóginas, 56,24% é transformado em ovos, o que daria das 5 g

utilizadas neste trabalho, 2,81 g de peso de postura, isto em

condições de laboratório. Trabalho semelhante porém sob con-

dições de meio ambiente, foi realizado por OLIVEIRA (1979) no

Rio de Janeiro, onde o autor referiu que a maior percentagem de

conversão foi de 56,90% em janeiro e a menor de 47,78% em a-

gosto e novembro, que calculados em relação à 5 g de teleógi-

nas serão respectivamente, 2,85 e 2,39 g de ovos. Em trabalho

anterior, OLIVEIRA et al. (1974) referiram que o mínimo total

de ovos depositados pela fêmea independem das condições cli-

máticas, podendo-se admitir então, a faixa de 47,78 a 56,90%

como normal. A relação peso da postura X peso das teleóginas nos

26

grupos tratados com suspensão bacteriana, foi de 27,80%, bem

menor que os resultados de UMAÑA (1975) e OLIVEIRA (1979), de-

monstrando que houve ação da C. lapagei na eficiência de ovi-

posição das fêmeas de B. microplus. Nos grupos testemunhas,

imersos em salina e água, a conversão foi de 47,20 e 52,80%

respectivamente, percentagens estas menores que a encontrada

por UMAÑA (1976) e praticamente dentro da mínima e da máxima

encontradas por OLIVEIRA (1979). Se for comparado o peso da

postura do grupo imerso em suspensão bacteriana com as obti-

das por outros, nota-se que foi 50,9% menos que a postura ob-

tida por UMAÑA (1976) e 41,84 e 51,23% menos que a mínima e a

máxima referidas por OLIVEIRA (1979); a confrontação do resul-

tado deste trabalho como de UMAÑA (1976) torna-se mais impor-

tante por terem si do ambos executados com a mesma metodolo-

gia.

A diminuição no peso da postura do grupo tra-

tado com suspensão de C. lapagei, deveu-se ao aparecimento de

teleóginas com secreção genital (Fig. 7), as quais não reali-

zaram postura; outras morriam (Fig: 8) e algumas vivas, porém

estes, faziam grande esforço para ovipositar, provocando

desta forma o que poderia se chamar de "prolapso de vagina"

(Fig. 9).

0bservou-se que a menor quantidade de ovos

postos nos grupos imersos em suspensão de bactéria e salina

glicerinada, deveu-se ao fato de que nestes grupos, a secreção

e/ou mortalidade de teleóginas até o 10º dia, que é o período

de maior postura e de maior fertilidade, (UMAÑA, 1976) foi de

39,1 e 8,9% respectivamente; no grupo imerso em água, as mor-

tes foram esporádicas, sem obedecer a nenhum padrão. Ao exame

27

do Gráf. 1, observa-se que ao se fazer registros de dois em

em dois dias do número de teleóginas doentes e/ou mortas nos

dois primeiros grupos, o imerso em suspensão apresentou um pi-

que de morte e/ou doença no 8º dia após a queda (16,3%) e o

grupo imerso em salina glicerinada teve um pique no 4º dia,

com 3,7%. Apesar disto, o Gráf. 1 mostra claramente que as

curvas de morte e/ou doença de ambos os grupos são praticamen-

te iguais, sugerindo que, neste caso, há um modelo padrão de

mortalidade e/ou doença em determinado intervalo de tempo.

Além da infecção de carrapatos por fungos

(GORSHKOVA, 1966) e bactérias (JENKINS, 1964; GONZALES & FER-

NANDES, 1974; HENDRY & RECHAV, 1981; BRUM & TEIXEIRA, 1986),

existem também riquétsias (Rickettsia prowazeki em D. marginatus

e D. pictus; REHACEK, 1965); além destes, B. bigemina e B.

bovis (= argentina) podem causar a morte de teleóginas de B.

microplus quando o sangue ingerido tiver uma parasitemia de 5%

ou mais (RIEK, 1964 e 1966). No caso deste trabalho, a hipóte-

se de mortalidade por Babesia spp. esta afastada devido a di-

ferença significativa entre os grupos tratado e os testemu-

nhas.

Como a postura do grupo imerso em salina gli-

cerinada foi intermediária em relação aos pesos dos outros

dois grupos, isto poderia ser devido à persistência da salina

junto ao corpo das teleóginas e algumas já contaminadas com

C. lapagei, desenvolveriam a doença e consequentemente, teriam

assim, comprometido a quantidade de ovos postos pelo grupo.

Com relação à eclodibilidade, apesar de ser

um dado não exato, verificou-se que o grupo tratado com C.

lapagei apresentou percentagem de eclosão menor que os dois

28

testemunhas; enquanto nestes a percentagem foi de 90-100%, no

grupo imerso em suspensão bacteriana ficou em torno de 60-70%

(Tab. 1). Se for considerado o peso da postura e a percenta-

gem de eclosão juntos, verifica-se que a redução da postura

fértil do grupo tratado com C. lapagei foi de 59,70% em rela-

ção ao imerso em salina e 63,98% em relação ao imerso em água.

Como rodas as repetições foram feitas sob as mesmas condições

e temperatura e umidade relativa do ar, há evidência de que

a C. lapagei, alem da efetiva ação sobre a teleógina, também

tem ação sobre o ovo, não tendo sido possível identificar po-

rém, a maneira pela qual isto ocorre.


A ação da inoculação de C. lapagei sobre as

teleóginas de B. microplus está descrito na Tab. 1. Ao exame

desta, verifica-se que o grupo no qual foi injetado 1,0 µ 1

da suspensão bacteriana, não efetuou postura, havendo morta-

lidade de 100%; deste total, 98,85% morreram em 24 horas e as

restantes 1,15% morreram antes de completar 48 horas.

O grupo que foi injetado salina glicerinada

estéril, apresentou mortalidade de 13,9% até o décimo dia e

peso de postura 2,07 g; o testemunha que foi injetado água

destilada estéril apresentou mortalidade de 1,2% e peso de

postura 2,51 g (Tab. 1). Essa quantidade de ovos pode ser con-

siderada normal, enquanto a postura do grupo injetado com sa-

lina glicerinada foi bem menor, demonstrando que esta tem al-

gum tipo de ação letal sobre as teleóginas, que poderia ser da

própria glicerina ou então da combinação de sais existentes

29

GRÁFICO 1 - Mortalidade e/ou doença em teleóginas

imersas em suspensão bacteriana de

Cedecea lapagei (ISB) e salina glice-

finada (ISG).

30

TABELA 1 - Peso da massa de ovos, eclodibilidade e mortalidade

de B. microplus de acordo com os tratamentos.

ISB = Imersão em suspensão bacteriana de Cedecea lapagei.

ISG = Imersão em salina glicerinada estéril.

ISA = Imersão em água destilada.

IB = Injeção de suspensão bacteriana de Cedecea lapagei.

IS = Injeção de salina glicerinada estéril.

IA = Injeção de água destilada estéril.

31

FIGURA 7 - Boophilus microplus. Teleógina com secreção geni-

tal. sc - secreção. 7X.

32

FIGURA 8 - Boophilus microplus. Teleógina morta após ter ad-

quirido infecção genital por Cedecea lapagei, sc -

secreção. 7 X.

33

FIGURA 9 - Boophilus microplus. "Prolapso de vagina" devido ao

esforço de oviposição, pr - vagina prolapsada, pt -

pata I. 40X.

As percentagens mensais de aparecimento de infec-


tor traumatismo pela agulha no momento da inoculação.

na saliva, descartando-se a possibilidade de haver ação do fa-

ção em teleóginas expostas ao meio ambiente estão no Gráf. 2.

Ao exame deste, observa-se que em quatro meses do ano não hou-

ve aparecimento da doença e nos oito restantes houveram teleó-

ginas doentes, com máximo de 40% em junho e mínimo de 6,7% em

fevereiro e abril. A análise de correlação entre as tempera-

turas medias das máximas, das medias e das mínimas apresentou

coeficientes de correlação respectivos de r = -0,8199, -0,8808

e -0,9074 os quais, submetidos ao teste de Student (t), foram

significativos a nível de 0,01 Esta correlação-negativa

muito forte, demonstra que à medida que a temperatura dimi-

nui, aumenta a percentagem de casos de doença nas fêmeas, sen-

do portanto, inversamente proporcionais. Examinando a Tab. II,

observa-se que dos oito meses em que apareceu infecção geni-

tal em teleóginas de B. microplus, sete tiveram temperatura

media das mínimas abaixo de sugerindo que em torno des-

te valor deve estar o limiar térmico para o aparecimento de

doença na natureza, sem descartar, contudo, a possibilidade de

teleóginas adoecerem sob temperaturas superiores, fato que o-

correu em um mês. Considerando-se os oito meses como 100% das

vezes em que ocorreu infecção, observa-se que 87,5% acontece-

ram sob temperaturas inferiores a 15°C, o que reforça a suges-

tão deste como o possível limiar térmico para aparecimento de

doença. Isto poderia ser explicado pela afirmativa de STEINHAUS

35

(1967) de que sob temperaturas baixas (18-15°C) há retardo no

início da fagocitose e abaixo de 10°C não há reação em muitos

nsetos. O aumento do número de teleóginas doentes no inverno,

quando a temperatura está em declínio, sugere que deve acon-

tecer o fenômeno descrito por STEINHAUS (1967) em insetos, já

que parece existir uma "baixa de resistência" nas teleóginas,

que poderia ser a diminuição da fagocitose e que favorece a

instalação da doença.

Das teleóginas que foram coletadas diretamente do

corpo do bovino para vidros esterilizados, comprovou-se que as

mesmas adquirem C. lapagei da pele do animal já que algumas a-

presentaram doença.

A incidência de 40% de fêmeas doentes em junho foi

maior que os 20% reportados por RIBEIRO & WIEGAND (1984),

sendo possível que esta diferença seja devida à temperatura,

já que foram observações feitas em anos diferentes ou talvez

à cepa de carrapatos utilizada.

Pelos resultados obtidos neste trabalho, há evidên-

cia de que, alem dos predadores naturais do B. microplus no Rio

Grande do Sul como formigas e aranhas (GONZALES, 1975), a per-

diz, Nothura maculosa (MENEGHETI & ARIGONY, 1982), a garça-va-

queira, Egretta ibis (BRANCO et al., 1983), o passáro "vira-

bosta", Molotrus bonariensis (VIEIRA et al., 1986), o chiman-

go, Milvago chimango (BRANCO & PINHEIRO, 1987) o quero-quero,

* RIBEIRO, P.B. & WIEGAND, M.M. Comunicação pessoal. Insti-

tuto de Biologia. UFPEL. 1984.

Elcy

36

Vanellus chilensis (BRANCO, 1988)*, e a própria temperatura

como agente físico na inibição da postura e/ou eclosão nos me-

ses frios (BRUM et al., 1985), a C. lapagei desempenha papel

importante no controle biológico do B. microplus nesta região.

*BRANCO, F.P.J.A. Comunicação Pessoal. CNPO, EMBRAPA, Ba-

gé, RS. 1988.

Elcy

37

TABELA II - Frequência mensal de aparecimento de doença causa-

da por Cedecea lapagei em teleóginas de Boophilus

microplus naturalmente expostas a campo na Univer-

sidade Federal de Pelotas, de acordo com a tempe-

ratura mesoclimática mínima.

38

GRÁFICO 2 - Percentagem de teleóginas com infecção por

Cedecea lapagei no meio ambiente e tempe-

raturas médias mensais em Pelotas, RS.

CONCLUSÕES

- A bactéria Cedecea lapagei foi identificada como

sendo patogênica para teleóginas de B. microplus.

- A morfologia e a histologia da porção final do a-

parelho genital feminino em B. microplus são semelhantes à de

outros ixodídeos;

- As teleóginas infectadas com C. lapagei tem o epi-

télio da vagina destruído;

- Teleóginas imersas em suspensão de C. lapagei tem

sua capacidade de postura reduzida em 47,4% em média;

- A injeção de 1,0 µl de suspensão de C. lapagei ma-

ta 100% das teleóginas em 48 horas.

A infecção de teleóginas por C. lapagei ocorre em

condições ambientais naturais;

- As baixas temperaturas de inverno predispõe ao a-

parecimente de infecção genital em fêmeas de B. microplus.

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