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Nutrição

Bioquímica

APOSTILA

DE

AULAS-PRÁTICAS

PROFESSORES: Antonio Celso S. R. Filho /

Fernanda Drummond

FAM

2

Sumário

1. Cronograma das aulas --------------------------------- pág. 2

2. Normas de segurança ---------------------------------- pág.4

3. Aula-prática 1: Potencial energético dos

alimentos ------------------------------------------------ pág.7

4. Aula-prática 2: Caracterização de carboidratos

pelo método de Benedict (açúcares redutores)--- pág.11

5. Aula-prática 3: Propriedades químicas dos

lipídios ------------------------------------------------------ pág.17

6. Aula-prática 4: Caracterização de proteínas pelo

método do Biureto -------------------------------------- pág.24

7. Aula-prática 5: Avaliação da atividade amilásica

da saliva ---------------------------------------------------- pág.29

3

CRONOGRAMA AULAS-PRÁTICAS

AULA DATA Horário TÍTULO DA AULA

1 14/08/2015 20h40 - 22h10 Potencial energético dos alimentos

2 28/08/2015 20h40 - 22h10 Caracterização de carboidratos pelo método

de Benedict(açúcares redutores).

3 02/10/2015 20h40 - 22h10 Propriedades dos lipídios

4 16/10/2015 20h40 - 22h10 Caracterização de proteínas pelo método de

Biureto

5 30/10/2015 20h40 - 22h10 Avaliação da atividade amilásica da saliva.

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NORMAS DE SEGURANÇA E CUIDADOS ESPECIAIS PARA TRABALHO LABORATÓRIOS DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

I - INTRODUÇÃO

Acidentes em laboratórios ocorrem frequentemente em virtude da

pressa excessiva na obtenção de resultados. Todo aquele que trabalha em

laboratório deve ter responsabilidade no seu trabalho e evitar atitudes ou

pressa que possam acarretar acidentes e possíveis danos para si e para os

demais. Deve prestar atenção a sua volta e se prevenir contra perigos que

possam surgir do trabalho de outros, assim como do seu próprio.

O usuário de laboratório deve, portanto, adotar sempre uma atitude

atenciosa, cuidadosa e metódica no que faz. Deve, particularmente,

concentrar-se no seu trabalho e não permitir qualquer distração durante o

processo. Da mesma forma não deve distrair os demais enquanto

desenvolvem trabalhos no laboratório.

A seguir estão relacionadas algumas regras de segurança que você

deverá colocar em prática para sua segurança e de seus colegas.

II - UTILIZAÇÃO

As normas de segurança, abaixo relacionadas, devem ser

rigorosamente observadas pelos profissionais técnicos que trabalham nos

Laboratórios de Química e Bioquímica, bem como pelos usuários, a fim de

que possibilite a maior segurança possível aos funcionários e aos seus

próprios colegas.

III - REGRAS PRÁTICAS PARA O TRABALHO

1. Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é

potencialmente perigoso. Portanto, tenha o máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento, evitando conversas e

brincadeiras que dispersem a concentração; 2. Existe uma regra geral que deve ser seguida neste ambiente: toda

substância desconhecida é potencialmente perigosa até que se prove

o contrário; 3. Siga rigorosamente as instruções específicas do professor. Consulte-o

quando tiver dúvidas e avise-o de qualquer acidente que ocorra, por menor que pareça;

4. Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar

ordenadamente, com consciência da seqüência a ser realizada. Leia atentamente o procedimento experimental certificando-se de que

todos os materiais e reagentes necessários estão disponíveis. Anote os resultados obtidos, relacionado-os à teoria da prática;

5. Em caso de acidentes, mantenha a calma e chame o professor ou

técnico responsável; 6. Evite trabalhar sozinho, e fora das horas de trabalho convencionais;

7. Localize os extintores de incêndio e familiarize-se com seu uso, ou seja, aprenda a utilizá-lo antes que o incêndio aconteça;

5

8. Certifique-se do bom funcionamento dos chuveiros e lava-olhos de

emergência; 9. Antes de usar qualquer equipamento elétrico, verifique a voltagem

correta e no caso de dúvida, consulte o professor ou o técnico de laboratório;

10. É obrigatório o uso de avental apropriado, ou seja, de algodão (se

possível) e de mangas compridas, na altura dos joelhos e fechado; 11. Use sapato fechado, de salto baixo, ou tênis durante as aulas

práticas; 12. Óculos protetores de segurança são requeridos durante todo o

período de trabalho no laboratório;

13. Brincadeiras são absolutamente proibidas nos laboratórios; 14. É proibido fumar no laboratório ou em qualquer outro lugar que

possa por em risco a segurança ou saúde das pessoas; 15. Não coma ou beba dentro do laboratório; 16. Nunca use material de laboratório para beber ou comer;

17. Não prove ou engula drogas ou reagentes do laboratório; 18. Caminhe com atenção e nunca corra no laboratório;

19. Lentes de contato não devem ser usadas em laboratórios, pois podem absorver produtos químicos e causar lesões nos olhos;

20. Objetos pessoais como bolsas, blusas, etc, devem ser guardados em armários de preferência em áreas externas aos laboratórios;

21. Aventais de laboratório, luvas, óculos de proteção ou outras

vestimentas não devem ser usados fora do laboratório; 22. Não use relógios, pulseiras, anéis ou qualquer ornamento durante o

trabalho no laboratório; 23. Alunos que possuam cabelos longos devem trabalhar com os

mesmos presos durante as aulas de laboratório;

24.Observe a limpeza dos materiais antes de utilizá-los; 25. Não trabalhe com material defeituoso, principalmente o de vidro;

26. Vidrarias trincadas, lascadas ou quebradas devem ser descartadas pelo técnico ou professor Portanto, detectando problemas desta natureza chame-os;

27. Nunca jogue no lixo restos de reações; 28. As substâncias químicas, principalmente os solventes, são

normalmente, voláteis, corrosivos e combustíveis. Desta forma, o uso de chama deve ser evitado, quando utilizado, deve-se cercar de todas as precauções;

29. Trabalhando com reações perigosas, explosivas, tóxicas ou que envolvam a liberação de gases e/ou vapores tóxicos devem ser

realizadas na câmara de exaustão (capela); 30. Quando utilizar soluções e reagentes, certifique-se que o rótulo

esteja voltado para cima, evitando que se estrague;

31. Feche adequadamente os frascos das soluções e regentes, principalmente os que forem voláteis e inflamáveis;

32. Não jogue resíduos de solventes nas pias. Resíduos de reações devem ser antes inativados, depois armazenados em frascos adequados;

33. Não gaste reagentes e soluções inutilmente, utilize somente o necessário para o experimento;

34. Os reagentes e soluções devem ser claramente identificados e as soluções apresentar data de preparo, validade e o nome do analista que a preparou;

35. Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou frasco correto;

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36. Nunca retorne um reagente líquido ou sólido, não utilizado, para o

vidro de reagente estoque; 37. Evite contato com qualquer substância com a pele. Seja

particularmente cuidadoso quando manusear substâncias corrosivas como ácidos e bases concentrados;

38. Não jogue nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos, ainda

que seja ligeiramente solúvel; 39. Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta,

use banho-maria; 40. Nunca pipete com a boca, utilize pêras de borracha; 41. Ao aquecer um tubo de ensaio contendo qualquer substância, não

volte a extremidade aberta do mesmo para si ou para uma pessoa próxima;

42. Sempre que proceder a diluição de um ácido concentrado, adicione-o lentamente, sob agitação sobre a água e NUNCA o contrário;

43. Antes de manipular qualquer reagente deve-se ter conhecimento de

suas características com relação à toxicidade, inflamabilidade e explosividade;

44. Certifique-se que vidros que foram aquecidos estejam frios antes de tocá-los. Não se esqueça, tubos e materiais de vidro, frios ou

quentes, têm a mesma aparência; 45. Ao introduzir rolhas em tubos de vidro, umedeça-os

convenientemente e enrole a peça de vidro numa toalha ou em um

papel para proteger as mãos; 46. Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite

aquecimento prolongado ou que desenvolva grande quantidade de energia (calor);

47. Deve-se tomar cuidados especiais quando manipular substâncias

com potencial carcinogênico; 48. Todas as substâncias são tóxicas, dependendo de sua concentração.

Nunca confie no aspecto de uma droga, deve-se conhecer suas propriedades para manipulá-la;

49. Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança; use

béquer, vidro de relógio ou papel manteiga; 50. Todo acidente com reagentes deve ser limpo imediatamente

protegendo-se se necessário. No caso de ácidos e bases devem ser neutralizados antes da limpeza;

51. Ao final de cada aula, as vidrarias utilizadas durante o trabalho de

laboratório devem ser esvaziadas nos frascos de descarte e enxaguadas com água antes de serem enviadas para limpeza;

52. Ao se retirar do laboratório verifique se não há torneiras (água ou gás) abertas. Desligue todos os aparelhos, deixe todo o equipamento e vidrarias limpas e lave as mãos;

53. Receber visitas apenas fora do laboratório, pois elas não conhecem as normas de segurança e não estão adequadamente vestidas.

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AULA PRÁTICA 1

POTENCIAL ENERGÉTICO DOS ALIMENTOS

1) Introdução:

Inicialmente, definiremos provisoriamente calor, como uma quantidade

de energia que se transfere de um corpo a outro por efeito exclusivo de uma

diferença de temperatura entre ambos. A quantidade de calor recebida por um

sistema simples, sob pressão constante (por exemplo, a pressão atmosférica

local), é proporcional ao acréscimo de temperatura produzido, isto é:

Q = C(T2-T1)

Onde C é um fator de proporcionalidade, chamado capacidade calorífica, que

depende da natureza da substância, da massa considerada, e que varia

também, sensivelmente com o intervalo de temperatura (T2-T1).

A unidade utilizada para a energia no Sistema Internacional de Unidades

é o joule, J. Porém, a unidade caloria (1 cal = 4,184 J), continua sendo utilizada

na indústria alimentícia, e uma caloria nutricional é igual a 1000 calorias

químicas (1kcal). Atualmente, os rótulos dos alimentos devem conter as

informações em calorias químicas. A capacidade calorífica em calorias por grau

e a capacidade calorífica específica em calorias por grau e por grama

(cal/g.°C).

Calorimetria é a determinação da quantidade de calor liberada ou

absorvida como decorrência de uma transformação química ou física. Esta

determinação baseia-se na aplicação da 1ª Lei da Termodinâmica: “para

qualquer sistema, existe uma propriedade denominada energia, que é

conservada e que pode ser transferida para outro sistema por interações de

calor ou de trabalho”. Medidas calorimétricas são feitas para determinar a

capacidade calorífica de materiais, bem como os ganhos ou perdas de energia

decorrente de transformações físicas (vaporização, fusão, etc.) ou químicas

(reações de combustão e neutralização). A parte da calorimetria que trata

especificamente das variações de temperatura causadas por reações químicas

é conhecida como Termoquímica.

Medidas calorimétricas mais precisas são feitas em calorímetros,

aparelhos que permitem isolar termicamente do meio o sistema a ser estudado.

Deste modo pode-se trabalhar adiabaticamente. Um calorímetro consiste

usualmente de uma câmara de reação, a qual contém um termômetro e um

agitador.

Quando uma transformação qualquer é realizada em calorímetro, uma

fração do calor liberado ou absorvido é gasta para aquecer ou resfriar os

diversos componentes do próprio calorímetro. Consequentemente, antes de

utilizar um calorímetro é necessário conhecer a sua capacidade calorífica, Ccal.

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Nas experiências termoquímicas realizadas em laboratórios,

basicamente, o que se faz é medir a variação de temperatura dos calorímetros

e seu conteúdo, decorrente da reação química. Pode-se então calcular o calor

absorvido ou cedido no frasco, denominado calor medido qmed. Como as

variações térmicas que ocorrem em um calorímetro adiabático são causadas

só pela ocorrência de reação química, um aumento na temperatura do frasco

(qmed > 0) implica que a reação é exotérmica (ΔH < 0), e uma diminuição

(qmed < 0) implica que a reação é endotérmica (ΔH > 0). Pode-se dizer que a

relação entre o calor medido e a variação de entalpia da reação é:

∆H = - qmed

A determinação da variação de temperatura que acompanha a

ocorrência de uma transformação química ou física exige paciência e

meticulosidade. Tanto antes (estado inicial) como após (estado final) à

ocorrência de um processo, faz-se necessário acompanhar a evolução da

temperatura com o tempo.

Nesta atividade, vamos calcular a quantidade de energia (em calorias)

que um grão de amendoim, uma porção de pão e uma porção de bolacha

podem fornecer ao corpo. Para isso, vamos queimar os alimentos, e usar o

calor produzido nesse processo para aquecer uma quantidade conhecida de

água. Isso irá provocar um aumento na temperatura da água e, com esse dado,

será possível calcular a energia fornecida pelos alimentos utilizando a seguinte

fórmula:

qmed = (Mágua . Cágua . ΔT + Mvidro . Cvidro . ΔT)

como

qliberado = -qmed

obteremos o valor da quantidade de energia liberada pela queima dos

alimentos analisados.

2) Objetivos:

Medir o potencial energético de alguns alimentos.

3) Procedimento experimental

• Preparação Prévia

Os alimentos devem ser desidratados em estufa (37°C).

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A montagem do calorímetro consiste em retirar a parte de baixo de uma

embalagem longa vida a qual deve ser fixada em uma base firme. Na parte

superior da embalagem recorte um orifício pouco menor que o diâmetro de um

tudo de ensaio,encaixe um tubo de ensaio nesse orifício.

• Procedimento:

1°) Pese as amostras que devem ter em torno de 0,5g;

2°) Pese os tubos de ensaio;

3°) Adicione água destilada (10 mL).

4°) Leia a temperatura da água neste instante (temperatura ambiente).

5°) Coloque o tubo de ensaio no sistema montado como na figura 1.

6°) Fixe as amostras em hastes metálicas. Inflame o alimento com um fósforo

ou bico de gás e coloque-o rapidamente dento do cilindro para que a chama

atinja diretamente o tubo de ensaio.

7°) Quando a combustão terminar meça a temperatura da água;

8°) Repita o procedimento com outros alimentos para comparação.

9°) Todas as medidas realizadas no experimento devem ser realizadas em

duplicata.

4) Análise de dados e discussão.

• Deve se calcular o calor medido (Qmed) em cal, kcal, j e kj;

• Calcular o potencial energético (μq) em Kj/g e Kcal/g;

• Considerar densidade da água como 1 g/cm3;

• Considerar como calor específico do vidro 0,2cal/g;

• Discuta sobre a viabilidade do experimento;

• Discussão sobre possíveis fontes de erro;

• Correlacionar os valores obtidos com valores reais.

10

5) Referências Bibliográficas

• ATKINS, P.W. Físico-química, 6ª edição, vol 1, Rio de Janeiro, LTC,1999,

p.37-45.

• ATKINS, P; JONES, L.Princípios de Química: questionando a vida moderna e

o meio

ambiente, 3ªedição, Porto Alegre, Bookman, 2006, p.304-311.

• GOMES, Márcio Augusto de Oliveira. Determinação da energia contida em

alguns

alimentos. Curitiba, 1999.26f. Monografia (Especialização em Ensino de

Química

Experimenal para o 2o. Grau) - Setor de Ciências Exatas, Departamento de

Química,

Universidade Federal do Paraná, p.112-124.

• CROCKFORD, H.D; KNIGHT, S.B. Fundamentos de Físico-química, LTC, Rio

de Janeiro,

1977, p.53.

11

AULA PRÁTICA 2

Caracterização de carboidratos pelo método de Benedict

I. INTRODUÇÃO TEÓRICA

Os carboidratos, ou sacarídeos, são classificados como

poliidroxialdeídos ou cetonas. Possuem a fórmula empírica [CH2O]n, que

originalmente sugere “hidratos” de carbono. Os monossacarídeos, também

chamados de açúcares simples, consistem numa só unidade poliidroxialdeídica

ou cetônica. O esqueleto de carbono dos monossacarídeos comuns é não-

ramificado e cada átomo de carbono possui um grupo hidroxílico no átomo de

carbono, EXCETO o carbono carbonílico. Quando o grupo carbonílico estiver

na extremidade da cadeia, o monossacarídeo é um aldeído derivado,

denominado aldose; se estiver em qualquer outra posição, o monossacarídeo

é uma cetona derivada, denominada cetose. (figura 1).

Figura 1. Exemplos de aldose (D-glucose) e cetose (D-frutose) com seis átomos de carbono, mostradas

em fórmulas estruturais de cadeia aberta.

A partir de várias considerações químicas, deduziu-se que os

monossacarídeos (aldoses e cetoses) com cinco ou mais átomos de carbono

não são estruturas de cadeia aberta, mas estruturas cíclicas. No caso da D-

glicose, formam-se estruturas cíclicas de seis elementos, pela reação do grupo

hidroxílico alcoólico do átomo de carbono 5 com o átomo de carbono aldeídico

1, conforme ilustrado na figura 2. As formas isoméricas dos monossacarídeos

(dextrógira,D, e levógira,L), diferem entre si apenas na configuração ao redor

do átomo denominado de carbono anomérico.

O monossacarídeo mais abundante é o açúcar de seis carbonos D-

glicose, de onde muitos outros são derivados. A D-glicose é o principal

combustível para a maioria dos organismos, e faz parte da composição de

12

dissacarídeos comuns, como maltose, lactose e sacarose, e de polissacarídeos

abundantes na natureza, tais como o amido e a celulose.

As unidades de monossacarídeos são unidas por ligações glicosídicas,

as quais são formadas pela reação do carbono anomérico de um

monossacarídeo com um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo

(figura 3). Dessa forma, os dissacarídeos consistem em dois monossacarídeos

unidos por uma ligação glicosídica, e os oligossacarídeos e polissacarídeos

são cadeias de monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas.

Figura 2. Reação de ciclização da molécula de glicose (glucose), produzindo as formas anoméricas α e β.

A reação envolve o grupo hidroxila ligado ao carbono 5 e o átomo de carbono carbonílico 1, formando

moléculas cíclicas com 6 átomos de carbono.

13

Figura 3. Exemplo da formação de uma ligação glicosídica entre duas moléculas de glicose, produzindo

maltose. A ligação glicosídica é formada pela reação do carbono anomérico de um monossacarídeo com

um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo.

II. PRÍNCIPIO DA REAÇÃO PARA PESQUISA DE SACARÍDEOS

REDUTORES

Os sacarídeos cujo grupo hidroxila ligado ao carbono anomérico está

livre (ou seja, não está envolvido em ligações químicas), possuem a

capacidade de reduzir íons metálicos, tais com: Cu2+, Ag+ ou ferricianeto, em

meio alcalino. Os açúcares capazes de reduzir tais agentes são denominados

açúcares redutores. De modo geral, os monossacarídeos são açúcares

redutores, enquanto que os sacarídeos de cadeia maior nem sempre

apresentam essa propriedade. O dissacarídeo lactose é encontrado no leite,

não tendo outra ocorrência na natureza e sua hidrólise produz galactose e

glicose. A lactose é um dissacarídeo redutor, uma vez que possui um carbono

anomérico livre na unidade de glicose.

A sacarose, ou açúcar de cana, é um dissacarídeo de glicose e frutose,

sendo extremamente abundante no reino vegetal e é conhecida como açúcar

de mesa. Em contraste com a maioria dos dissacarídeos e oligossacarídeos, a

sacarose não possui átomos de carbono anomérico livres, uma vez que os

átomos de carbono anoméricos de ambos os monossacarídeos estão ligados

entre si e não podem sofrer oxidação. Por esta razão, a sacarose não age

como açúcar redutor.

14

O amido e a sacarose são açúcares não-redutores, cujas ligações

glicosídicas são hidrolisadas pelo tratamento com ácidos fortes à quente,

produzindo monossacarídeos. Estes produtos, por sua vez, são açúcares

redutores, pois possuem uma hidroxila livre no carbono anomérico. A

comprovação da hidrólise ácida do amido e da sacarose se dá pela

positividade da reação de Benedict.

III. REAÇÃO DE BENEDICT

A ação redutora de açúcares em meio alcalino é bastante utilizada para

a determinação quantitativa e qualitativa de açúcares. Nesta aula, utilizaremos

o Reagente de Benedict, que contém íons Cu2+ ligados a agentes

complexantes, em meio alcalino.

Com o aquecimento do açúcar com grupamento redutor, em presença

dos íons Cu2+ e OH-, o Cu2+ é reduzido a Cu+ e o açúcar é oxidado, e ocorre a

formação de precipitados de Cu2O (óxido cuproso). A cor do precipitado

depende do conteúdo de açúcar redutor.

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Precipitado esverdeado -------- traços

Precipitado amarelado --------- 10 g/L

Precipitado vermelho -----------20 g/L

OH- Cu++ + açúcar redutor → →→ → Cu2O + açúcar oxidado ∆

IV. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

1°ETAPA - Caracterizando os Açúcares

1. Enumere 9 tubos e adicione 1,5mL das seguintes soluções em cada um

deles:

Tubo 1: água destilada

Tubo 2: glicose 0,1mol/L

Tubo 3: frutose 0,1mol/L

Tubo 4: sacarose 0,1mol/L

Tubo 5: amido 1,5%

Tubo 6: maltose 0,1mol/L

Tubo 7: galactose 0,1mol/L

Tubo 8: lactose 0,1mol/L

Tubo 9: alanina 0,1mol/L

Tubo 10: àcido aspártico 0,1mol/L

2. Adicione 1,5mL do reativo de Benedict em cada tubo, agite e anote a

coloração observada.

3. Aqueça os tubos rapidamente no bico de bulsen.

4. Verifique a coloração após o aquecimento.

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5. Quais os açúcares redutores entre os utilizados na atividade? Justifique.

6. Porque algumas solução mudaram de cor quando aquecidas?

7. É possível criar uma escala de poder de redução dos açúcares utilizados

comparando o tubo contendo água (tubo 1) com os demais? Esquematize esta

escala.

2ªETAPA – Explorando açúcares em alimentos


deles:

Tubo1: refrigerante

Tubo 2: mel de abelha

Tubo 3: suco de fruta

Tubo 4: adoçante em gotas

Tubo 5: refrigerante diet (ou zero)

2. Adicione 1,5mL do reativo de Benedict em cada tubo, agite e anote a

coloração observada.

3. Aqueça os tubos rapidamente no bico de bulsen.

4. Verifique a coloração após o aquecimento.

5. Quais os alimentos utilizados que possuem açúcares redutores?

Justifique.

17

AULA PRÁTICA 3

Estudo das propriedades dos lipídios

II. INTRODUÇÃO TEÓRICA

1. Lipídeos

São biomoléculas orgânicas insolúveis na água que podem ser extraídas de

células e tecidos por solventes não polares, como, por exemplo, clorofórmio,

éter ou benzeno. Podem ser de origem animal ou vegetal e possuem

importantes funções biológicas. Eles são componentes estruturais de

membranas, atuam como forma de armazenamento e transporte de

combustível metabólico. São precursores para biossíntese de algumas

vitaminas, hormônios e mediadores inflamatórios, funcionam como isolante

térmico em animais como a foca.

A classificação dos lipídeos pode ser baseada na estrutura de seus

esqueletos. Os lipídeos simples não contêm ácidos graxos (ex: esteróides,

prostaglandinas) enquanto que os lipídeos complexos são constituídos de

ácidos graxos e diferem na estrutura dos esqueletos aos quais esses ácidos

estão covalentemente ligados. Por exemplo:

Triacilgliceróis ou triglicerídeos: ácidos graxos ligados ao glicerol, na

forma de éster.

Fosfolipídeos ou Fosfoglicerídeos: ácidos graxos ligados ao glicerol-

3-fosfato, com diferentes grupos ligados ao grupo fosfato. Os

diferentes tipos de fosfolipídeos são denominados de acordo com o

grupo ligado à sua cabeça polar. Ex: cardiolipina,

fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol.

Ceras: ácidos graxos ligados a álcoois de cadeia longa, na forma de

éster.

Esfingolipídeos: ácidos graxos de cadeia longa ligados a esfingosina

(aminoálcool de cadeia longa). Ex:esfingomielina, cerebrosídeos.

18

2. Ácidos graxos

Os ácidos graxos possuem uma longa cadeia hidrocarbonada (cauda

apolar) e um grupo carboxílico terminal (cabeça polar) (figura 1). Eles ocorrem

apenas em pequenas quantidades na forma livre; a quase totalidade dos

ácidos graxos encontra-se ligada a diferentes compostos, geralmente na forma

de ésteres, conforme citado acima (figura 2).

A cadeia hidrocarbonada pode ser saturada, isto é, com átomos de

carbono unidos apenas por ligações simples; ou insaturada contendo uma ou

mais ligações duplas ou triplas. Os ácidos graxos diferem um do outro

primariamente no comprimento da cadeia e no número e posição de suas

ligações insaturadas.

Figura 1. Estrutura simplificada de ácidos graxos livres, saturados e insaturados.

Figura 2. Fórmula estrutural e representação simplificada da estrutura de um triacilglicerol.

O número relativo de ligações duplas em uma dada amostra de ácidos

graxos ou lipídeos pode ser determinado empregando-se compostos

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halogenados, como iodo, cloro e bromo. Esses halogênios adicionam-se às

duplas ligações, sendo que a cada lado da dupla ligação se adiciona um átomo

de halogênio. A quantidade de halogênio absorvido é, portanto, proporcional ao

número total de duplas ligações.

Quando se empregam soluções de iodo em clorofórmio, observa-se que

quanto maior o grau de insaturação do lipídeo, mais rápido ocorre o

desaparecimento da cor da solução (figura 3).

Figura 3. Reação de adição de iodo em duplas ligações de ácidos graxos insaturados.

2.1. Propriedades gerais

A. Solubilidade

Os glicerídeos de ácidos graxos inferiores (menores), como o ácido butírico,

são ligeiramente solúveis em água, enquanto os de ácidos graxos superiores

são insolúveis. Todos são solúveis em éter, clorofórmio e benzeno. São pouco

solúveis em etanol a frio, mas a solubilidade aumenta muito em etanol quente.

Os lipídeos, por definição, são moléculas de baixa polaridade, portanto

praticamente insolúveis em solventes polares, como a água. Desse modo, a

ordem de solubilidade esperada para o óleo vegetal é: éter> álcool > água.

B. Saponificação

Os ácidos graxos complexos são também denominados “lipídeos

saponificáveis”, uma vez que produzem sabões, sais de ácidos graxos, sob

hidrólise alcalina.

Os triglicerídeos, ácidos graxos esterificados com glicerol, decompõem-se

facilmente em glicerol e sais de ácido graxo (sabões) por ebulição em bases

fortes como NaOH ou KOH. Como os lipídeos são insolúveis em água, o

processo é facilitado adicionando-se solução alcoólica da base.

Ao acidificar o meio de reação, o sal de ácido graxo, que é solúvel em

água, é convertido em ácido graxo. Este, por sua vez, não é solúvel em água, e

20

separa-se do meio de reação. Além disso, o ácido graxo fica na superfície da

solução, pois é menos denso que a água, e o glicerol permanece dissolvido na

fase aquosa, devido à sua natureza polar.

O ácido graxo separado pode novamente ser convertido em sabão, pela

adição de uma base forte e sob aquecimento. Por esta razão, ao se agitar o

tubo contendo água quente, solução de NaOH 1 mol/L e o ácido graxo

(insolúvel), ocorre formação de espuma, que é indicativa da presença do

sabão.

C. Propriedades dos sabões.

Os sabões de metais alcalinos particularmente de Na e K são solúveis

em água. Os sabões de massa molecular mais alto são menos solúveis. Os de

Ca2+e Mg2+ são muito insolúveis em água e precipitam. Os sais de Pb dos

ácidos graxos saturados possuem solubilidade limitada em água enquanto que

os dos ácidos graxos insaturados são muito mais solúveis (Isto pode servir

para separar ácidos graxos saturados de ácidos graxos insaturados).

Quando acrescentamos solução saturada de cloreto de sódio no sabão,

ocorre precipitação do sabão por sequestrar a água que envolve as moléculas,

de modo semelhante ao fenômeno de precipitação de proteínas por solução

saturada de sulfato de amônio.

21

III. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Propriedades dos ácidos graxos:

1. Separar 3 tubos de ensaio limpos e secos e numerá-los.

Tubo-1: adicione 3 gotas de ácido acético

Tubo-2: adicione 3 gotas de ácido oleico

Tubo-3: adicione pequenos fragmentos de ácido esteárico.

2. Verifique o cheiro e o aspecto físico de cada um, e anotar os resultados

na Tabela-1.

3. Adicione 4mL de H2O(d) a cada tubo, agite bem.

SABÃO

(sais de ácidos graxos)

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4. Retire 1gota de cada tubo e coloque sobre um pedaço de papel azul de

tornassol, previamente umedecido com água destilada. Observe se

ocorre mudança de coloração, e anote os resultados na Tabela1.

5. Aqueça até ebulição cada um dos tubos. Sinta o cheiro, e anote os

resultados na Tabela-1.

6. Esfregue sobre o vapor de cada tubo um pedaço de papel azul de

tornassol. Anote os resultados na Tabela-1.

7. Adicione 1 gota de solução de fenoftaleína, a cada tubo.

8. Adicione gota a gota, solução de NaOH 2mol/L, até o aparecimento de

uma coloração rosada.

9. Aqueça. Observe a formação de espuma nos tubos 2 e 3.

10. Complete com água destilada para 10mL, o volume dos 3 tubos.

11. Divida o conteúdo do Tubo 1 em duas porções (numerar 1a e 1b). Repita

o procedimento para o Tubo-2 (2a e 2b) e Tubo-3 (3a e 3b).

12. Nos tubos (1a, 2a, e 3a) adicione 3 gotas de solução de CaCl2 – 0,5%.

Observe e anote os resultados na Tabela-2.

13. Nos tubos (1b,2b,e 3b) adicione 3 gotas de solução de HCl a 2mol/L.

Observe e anote os resultados na Tabela-2.

II. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

1. Por que o ácido acético é solúvel em água?

1. Por que os ácidos oleico e esteárico são insolúveis na água?

2. Por que o ácido acético muda a cor do papel de tornassol e o ácido

oleico e esteárico não mudam a coloração do papel de tornassol?

3. O que é saponificação?

4. Por que a adição de solução de CaCl2, faz com que a espuma

desapareça?

5. Por que, ao adicionar solução de HCl desaparece a coloração rosa da

solução.

23

ANEXOS

Tabela1. Características gerais dos ácidos orgânicos

Ác.

Acétic

o

Ác.

oleíco

Ác.

esteáric

o

Cheiro Papel de

tornassol - I

Cheiro após

aquecimento

Papel de

tornassol - II

Tubo-1 3 gts ------ -------

---

Tubo-2 ------ 3 gts -------

---

Tubo-3 ------ ------ fragme

ntos

Tabela2. Reatibilidade com os íons Ca2+e H+

CaCl2 HCl Observação

Tubo-1a 3gts -------------

Tubo-1b ------------- 3gts

Tubo-2a 3gts -------------

Tubo-2b ------------- 3gts

Tubo-3a 3gts -------------

Tubo-3b ------------- 3gts

24

AULA PRÁTICA 4

Caracterização de proteínas pelo método de biureto


As proteínas são macromoléculas complexas, constituídas por

aminoácidos, e fundamentais para o metabolismo em diferentes organismos

vivos. Seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro

lugar". Os aminoácidos possuem um átomo de carbono assimétrico, ao qual

estão ligados um grupo amino livre, um grupo carboxila livre, um átomo de

hidrogênio e uma cadeia lateral. Esta última é diferente para cada aminoácido.

Figura 1. Fórmula estrutural geral dos aminoácidos.

Nas moléculas protéicas, os resíduos de aminoácidos ligam-se

covalentemente, formando longos polímeros não-ramificados. As ligações

peptídicas, que unem um aminoácido a outro, são formadas pela reação entre

o grupo amino de um aminoácido e o grupo carboxílico do aminoácido

subseqüente, eliminando moléculas de água.

Figura 2. Reação geral da formação de uma ligação peptídica.

25

Figura 3. Exemplo de peptídeo formado por cinco aminoácidos.

II. REAÇÃO PARA IDENFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de

seus grupamentos funcionais, isto é, os grupos carboxílicos, os grupos amino,

e os grupos funcionais presentes nas diversas cadeias laterais. Essas reações

permitem, por exemplo, a identificação de aminoácidos nos hidrolisados

protéicos, identificação da seqüência de aminoácidos de uma proteína,

identificação de aminoácidos essenciais para a atividade de uma enzima.

Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de aminoácidos

em pequenas amostras é a Reação da Ninidrina, devido à sua elevada

sensibilidade.

Princípio da reação da ninidrina: pelo aquecimento, o grupo α-amino

de um aminoácido reage com duas moléculas de ninidrina, produzindo um

complexo de cor azul, denominado “Púrpura de Ruhemann”.

A cor azul é obtida na reação da ninidrina para todos os aminoácidos

que apresentam um grupo α-amino livre. Enquanto que a prolina e a

hidroxiprolina, em que o grupo α-amino está substituído, produzem derivados

com uma cor amarela característica.

26

Figura 4. Reação de ninidrina

III. REAÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Na literatura, podem ser encontrados vários métodos para identificação

e/ou quantificação de proteínas. Eles são baseados em alguma característica

da molécula de proteína, tal como a presença das ligações peptídicas, o

conteúdo de aminoácidos aromáticos ou de grupos R fenólicos.

Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de proteínas é a

Reação do Biureto, devido à sua alta sensibilidade.

Princípio da Reação do Biureto: em meio moderadamente alcalino, os íons

Cu2+ do reagente de Biureto interagem com átomos de nitrogênio das ligações

peptídicas das proteínas, formando complexos de cor violeta. Para a formação

do complexo são necessárias quatro ligações peptídicas para cada íon Cu2+,

conforme ilustrado na figura abaixo.

A Reação do Biureto pode ser empregada também para determinar a

concentração de proteínas em uma amostra, pois a intensidade da cor é

diretamente proporcional à concentração de proteínas.

27

Figura 5. Esquema da reação do Biureto.

IV. METODOLOGIA EXPERIMENTAL


deles:

Tubo 1: água destilada

Tubo2: glicose 0,1mol/L

Tubo 3: solução de clara de ovo

Tubo 4: solução de gelatina 2%

Tubo 5: amido 1,5%

Tubo 6: leite desnatado

Tubo 7: leite integral

Tubo 8: água com sal

2. Adicione em cada tubo 3mL do reativo de biureto e agite.

3. Observe o que ocorre.

4. Adicione 4mL de H2O(d) a cada tubo, agite bem.

5. Aqueça até ebulição cada um dos tubos.


7. Repita os procedimentos 1 e 2

8. Adicione em cada tubo 3 gotas de HCl 1mol/L

28


V. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES.

1. Em quais soluções é possível afirmar que há ligações peptídicas?

2. Se a intensidade da cor resultante da reação com biureto é proporcional à

concentração proteica da solução, faça uma sequencia do meio mais proteico

para o menos proteico

3. Por que o aquecimento e a adição de HCl modificaram a coloração da

solução?

29

AULA PRÁTICA 5

Avaliação da atividade amilásica da saliva


Enzima é uma classe especial de proteínas que atuam como

catalisadores em todas as células de todos os seres vivos. Elas aumentam a

velocidade das reações químicas sem alterar o equilíbrio das reações por elas

catalisadas. Sob condições brandas de pH e temperatura, existentes nas

células, muitas reações bioquímicas não ocorreriam em velocidade compatível

coma vida, não fossem as enzimas. As enzimas diferem dos catalisadores em

três importantes aspectos: (1) elas são específicas para a reação que

catalisam, em geral cada enzima catalisando uma reação diferente. (2) as

condições de pH e temperatura requeridas para o seu funcionamento são

compatíveis com as fisiológicas. (3) sua ação catalítica pode ser regulada para

adequar a velocidade de formação dos produtos às necessidades celulares.

Vários fatores afetam a velocidade das reações catalisadas por enzimas dentre

eles a temperatura, o pH, a concentração do substrato e a própria

concentração de enzima (Cisternas et al., 2011). .

O amido é encontrado na forma de grãos nas sementes, caules, e raízes

de várias plantas como trigo, mandioca, arroz, milho, feijão, batata, entre

outros. No processo de digestão as enzimas α e β- amilase rompem as

ligações glicosídicas do amido originando maltose, amilopectina, e glicose.

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

1. Preparação das enzimas

Amilase salivar: coletar aproximadamente 3mL de saliva filtrada em gaze e

fazer uma diluição com solução salina (NaCl 0,9%) na proporção de 1:10.

Invertase: misturar 50g de levedura seca (fermento de padaria com 150 mL de

NaHCO3 0,1M em um erlerlemmeyer de 1L). Fechar o frasco com algodão e

colocá-lo em banho-maria entre 40-45°C. Deixar a preparação autolisar durante

24horas. Centrifugar a 15000 rpm por 15minutos. Decantar. Manter o

sobrenadante em banho de gelo entre 0-4°C durante todo o tempo de uso.

Tripsina: solução estoque 5mg/mL em HCl 1mM. Diluir com tampão de modo a

obter uma solução de uso contendo 0,025 mg/mL de tampão TRIS-HCl 0,05M

com CaCl2 5 mM pH8,0.

2. Especificidade enzimática

30

2.1.Enumere 4 tubos e adicione 2,0 mL das seguintes soluções em cada um

deles:

Tubo 1: água

Tubo 2: amilase

Tubo 3: tripsina

Tubo 4: invertase

2.2. Adicione 2,0 mL de amido em cada tubo.

2.3. Incubar todos os tubos durante 15 min em banho-maria a 37°C.

2.4 Verificar a presença de amido adicionando ao meio uma gota de lugol em cada tubo.

3. Influência da concentração na atividade amilásica

3.1 Enumere 4 tubos e adicione 2,0 mL das seguintes soluções em cada um

deles:

Tubo 1: água

Tubo 2: amido 0,2%

Tubo 3: amido 1%

Tubo 4: amido 2%

3.2. Adicione 2,0 mL de solução amilásica



4. Influência do pH na atividade amilásica

4.1 Enumere 4 tubos e adicione 2,0 mL das seguintes soluções em cada um

deles:

Tubo 1: água

Tubo 2: solução pH 4,0



4.2. Adicione 2,0 mL de amido em cada tubo.


31


III. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES.

1. Qual foi a enzima mais efetiva em digerir o amido? Justifique.

2 O que aconteceu com a atividade enzimática quando a concentração de amido foi aumentada e diminuida? O tempo poderia interferir nesses resultados? Justifique.

3. Qual o melhor pH para favorecer a atividade da amilase salivar?

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