UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCOCURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

Relatório apresentado à disciplina Microbiologia Básica do curso de Farmácia da Professora Drª Andréa Vieira Colombo por JÉSSICA AMARAL.

PETROLINA-PE2014

1. AULA PRÁTICA 01

NORMAS DE CONDUTA E BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

“Biossegurança é a condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal e vegetal e o meio ambiente.” (Comissão de Biossegurança em Saúde, 2002).

Acidentes nos laboratórios de Microbiologia podem acarretar em contração de doenças infecciosas por microrganismos patológicos, é um risco não só para o indivíduo que está em contato direto com o patógeno, mas para todos que tenham acesso ao local. Por isso devem ser tomadas algumas precauções como: pessoas com cabelos longos devem prendê-los; limpar a bancada com álcool etílico a 70% (v/v) antes e depois de cada aula prática; lavar as mãos com detergente e álcool etílico a 70% (v/v) ao entrar e sair do laboratório; sempre usar o jaleco; usar calça comprida e sapato fechado; trabalhar sempre próximo ao bico de Bunsen; evitar o uso de materiais pessoais que possam ser contaminados durante as aulas (cadernos, anéis, colares, pulseiras, livros, mochilas); utilizar luvas e óculos de proteção sempre que necessários (evitar o contato direto do material contaminado com o indivíduo); o tampão de algodão de tubos e frascos deve ser manuseado com o dedo mínimo, nunca pode tocar na bancada.

EQUIPAMENTOS E MATERIAIS

Meios de cultura são necessários para o cultivo dos microrganismos, eles atuam como “alimentos” para esses seres. Eles podem ser distribuídos em placas de Petri, Erlenmeyers, balões ou tubos, com tampas de alumínio, algodão ou rosca.

Algumas vidrarias utilizadas são: béqueres, pipetas, provetas, bastões, swabs, alça de Drigalsky, autoclave, bico de Bunsen, lâminas e lamínulas, entre outros.

CONCEITOS BÁSICOS DA MICROBIOLOGIA

A microbiologia é definida como a ciência que estuda os microrganismos (protozoários, algas, fungos, vírus e bactérias). Suas formas, estruturas, reprodução, identificação; suas relações com a natureza, entre si e com outros seres vivos; além das alterações químicas e físicas produzidas por eles em seus habitats, que podem ser prejudiciais ou benéficas aos seres humanos.

Algumas características dos microrganismos os tornam ideais para investigação de fenômenos biológicos, como: podem ser cultivados facilmente em recipientes pequenos, como tubos (diferente de plantas e animais);

crescem e se reproduzem em um ritmo elevado (algumas chegam a se reproduzir milhões de vezes em 24 horas).

Eles são encontrados em praticamente todos os ambientes, sendo mais frequentes em locais em que encontram condições favoráveis para o seu desenvolvimento (úmidos, com temperatura ideal e presença de substâncias nutritivas).

Os microrganismos, atualmente, classificam-se de acordo com os reinos: Monera (bactérias, cianobactérias e arqueobactérias) e Protistas (algas, protozoários e fungos).

2. AULA PRÁTICA 02

TÉCNICAS LABORATORIAIS DE MICROBIOLOGIA: COLETA, TRANSPORTE E MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura são uma mistura de substâncias nutritivas que dependem das exigências nutricionais de cada espécie de microrganismos, decorrentes do seu maior ou menor poder de síntese. Esses meios podem ser compostos por soluções de sais inorgânicos, extratos de tecidos ou órgãos animais, tecidos vivos...

Eles podem ser classificados a partir de diversos grupos: procedência, consistência, composição e finalidade. Essas divisões estão mostradas nas tabelas abaixo:

O ágar é o solidificante utilizado para obter a variação na consistência dos meios de cultura, ele é extraído de algas marinhas.

As amostras coletadas para análise podem ser de dois tipos: clínica ou ambiental. A primeira é retirada do organismo do indivíduo (secreção, urina, fezes, sangue); já a segunda é retirada do ambiente (água, solo).

A transferência de um microrganismo para um meio de cultura é chamada de repique, semeadura ou inoculação. Para que esse transporte seja realizado em condições de assepsia (não contaminação da amostra), recomenda-se trabalhar próximo ao bico de Bunsen, em câmaras assépticas (esterilizadas por raios UV) ou em câmaras de fluxo laminar, que além de esterilização UV, possuem filtros de ar, que evitam a presença de partículas de ar no seu interior, mantendo o meio estéril.

Após a semeadura, incuba-se o microrganismo para que haja a formação de colônias (massa visível que cresce no meio de cultura). Essa incubação pode ser realizada em banhos de água, incubadoras, quartos-estufa, jarras de anaerobiose.

A preservação de microrganismos por períodos curtos é feita geralmente em refrigeradores à temperatura de ~4ºC. Para períodos mais longos utilizam-se freezers com temperaturas entre -20ºC e -70ºC ou em câmaras de nitrogênio líquido, além de liofilização (método caro).

UBIQUIDADE BACTERIANA: COLETA DO MATERIAL CLÍNICO E

AMBIENTAL E SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO

Objetivos: Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos

de uso mais frequente no laboratório de microbiologia; Desenvolver habilidade de manipulação dos meios de cultura, em

condições de assepsia; Executar semeadura em meios sólidos e líquidos.

Prática

A turma foi subdividida em grupos e cada um ficou responsável pela coleta de um material ambiental ou clínico (este já presente no laboratório).

O meu grupo ficou responsável pela coleta ambiental e optamos por analisar os microrganismos presentes na pia do banheiro da Universidade Federal do Vale do São Francisco – Univasf, localizado no primeiro andar do bloco de Laboratórios.

A coleta do material foi feita pelo contato do dedo polegar, previamente lavado com água e detergente, com a pia. Após a coleta, o dedo foi pressionado em placa de Petri (meio sólido) contendo ágar.

Os materiais coletados foram corretamente identificados com pincel e submetidos à incubação e preservação para análise na aula posterior.

3. AULA PRÁTICA 03

LEITURA E INTERPRETAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Houve a formação de uma massa densa, com pouca diferenciação, de cor esbranquiçada. Notou-se também a presença de odor característico.

ISOLAMENTO MICROBIANO – SEMEADURA POR ESGOTAMENTO

Introdução

Nos ambientes naturais, os microrganismos se encontram, quase sempre, sob a forma de populações mistas e, para estudar as espécies que compõem essas misturas, é preciso isolá-las em culturas puras. O isolamento mais comum é feito em placas de Petri.

A semeadura por esgotamento é caracterizada pela formação de estrias superficiais lado a lado com a placa. É preciso ocupar toda a superfície da placa, não pode passar duas vezes no mesmo lugar e as estrias devem manter uma distância razoável entre si.

Pode-se também fazer as estrias por quadrantes, flambando o swab antes de cada quadrante.

As colônias isoladas e de tamanho característico serão observadas mais ao final da semeadura, pois tanto no meio, quanto no ponto de esgotamento e nas primeiras estrias, ainda não é possível esse isolamento.

Inicialmente o crescimento é exponencial em relação ao tempo. Logo após, entretanto, a ordem de crescimento se torna muito complexa, devido à proximidade das células acumuladas. Esta proximidade cria uma situação que pode ser chamada “aglomeração fisiológica” na qual as células competem entre si pelos nutrientes disponíveis e afetam-se mutuamente pelo acúmulo de produtos residuais.

Objetivos Treinar a técnica de esgotamento; Semear o material em estudo para obter o isolamento da bactéria em

cultura pura, cujas propriedades servirão para caracterização e posterior identificação.

Prática

Utilizando a placa da aula prática anterior, foi coletada uma amostra de característica aparentemente uniforme e semeada a partir da técnica de esgotamento. Essa placa foi novamente levada para incubação e armazenamento adequado, para análise na aula posterior.

4. AULA PRÁTICA 04

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE COLÔNIAS

Utilizando as placas da aula anterior, pôde-se observar a formação de Unidades Formadoras de Colônias - UFC (provável presença de apenas uma bactéria). A partir da observação macroscópica, foi possível visualizar as colônias isoladas.

COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM E MICROSCOPIA DE

BACTÉRIAS

Introdução

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes: cristal violeta (corante principal), responsável pela cor; lugol (mordente), reforça a ação do corante principal; álcool-acetona (diferenciador), descora seletivamente as bactérias; e fucsina (corante secundário), cora o que foi descorado pelo diferenciador e tem que contrastar com o principal.

Cristal Violeta Lugol Álcool-Acetona Fucsina Fenicada

Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas (violetas) e Gram-negativas (rosas), e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. Essa técnica tem grande importância clínica, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. Muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos, daí a frequente utilização desse método.

As bactérias podem ser classificadas de acordo com a sua forma e disposição como: cocos (arredondadas), bacilos (cilíndricas/bastonetes) e vibriões (espiraladas). E elas podem se agrupar, formando os seguintes grupamentos:

Objetivos Preparar lâminas; Aprender o método de coloração de gram; Visualização das lâminas preparadas; Verificação da morfologia celular.

Prática

Utilizando a placa analisada na primeira parte da aula, extraiu-se uma das UFC’s para preparo da lâmina e posterior coloração. Esse método é realizado nas etapas apresentadas a seguir:

I. Realização do esfregaço com amostra coletada;

II. Fixação a quente no bico de Bunsen;

III. Coloração

IV. Secagem a temperatura ambiente

Após a secagem, houve a observação da lâmina no microscópio, obtendo o seguinte resultado:

Fungos (contaminação da amostra)

Bacilos Gram-negativos

Bacilo Gram-positivo

Coco Gram-positivo

5. AULA PRÁTICA 05: TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES E ANTISSÉPTICOS

Introdução

A escolha de um agente químico depende da finalidade do uso. Não existe uma substância ideal capaz de agir em todos os casos. Alguns são muito ativos, mas tóxicos para os tecidos vivos, portanto usados apenas em objetos inanimados. Outros apresentam instabilidade quando em solução. Alguns são rapidamente inativados em contato com matéria orgânica.Desinfetantes são compostos químicos que podem matar ou inibir o crescimento dos microrganismos, usados em superfícies e objetos. Os antissépticos são utilizados em tecidos vivos, para uso tópico.

Os desinfetantes e antissépticos (e suas ações) utilizados na aula estão descritos a seguir:

Além destes também foi usado um desinfetante comercial.

Clorexidina Formaldeído Álcool Hipoclorito Desinfetante 0,12% 10% Etílico 70% de Sódio Comercial

Objetivo

Verificar a eficácia de desinfetantes e antissépticos contra os microrganismos.

Prática

Foram utilizadas placas de Petri com culturas de bactérias utilizadas no controle de qualidade.

Utilizando a pinça, foram mergulhados nas soluções desinfetantes e antissépticas, pequenos discos de papel estéreis. Depois, esses discos foram depositados na placa com espaçamentos semelhantes e razoáveis entre si e entre a borda da placa.

Por último, essas placas foram incubadas e armazenadas para análise na aula posterior.

6. AULA PRÁTICA 06 LEITURA E INTERPRETAÇÃO DO TESTE DE ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES E ANTISSÉPTICOS

O resultado obtido na aula prática anterior está mostrado a seguir:

O “anel” formado ao redor do disco é chamado de Halo de Inibição. Halos com diâmetro superior a 15 mm apresentam poder inibitório contra os microrganismos presentes no meio, valores menores significam que não há inibição satisfatória.

Legenda:

Fo – Formaldeído

A – Álcool Etílico

D – Desinfetante

Clo – Clorexidina

Hip – Hipoclorito de Sódio

C - Controle

Das substâncias testadas, apenas o formaldeído apresentou halo com diâmetro superior a 15 mm (30 mm), todos os demais apresentaram valores inferiores. Isso significa que o único capaz de inibir o crescimento da cultura de bactérias eficazmente presente no meio de cultura , foi o Formaldeído.

TESTE DE SENSIBILIDADE MICROBIANA AOS ANTIBIÓTICOS

Introdução

Antibiograma ou Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) é utilizado para alguns grupos de bactérias, principalmente as que adquirem resistência facilmente.

Os testes para a detecção de resistência são realizados em bactérias isoladas de amostras representativas de um processo infeccioso, no qual a sensibilidade aos antimicrobianos não é previsível ou quando existem problemas de resistência a antibióticos. Não é indicada a realização do TSA em microrganismos da microbiota normal, devido à possibilidade de mutação, podendo se desenvolver para um microrganismo patogênico e resistente ao antibiótico.

O meio que deve ser utilizado é o ágar Mueller-Hinton por possuir propriedades que permitem o crescimento da maioria dos microrganismos.

Para a realização do TSA, necessariamente a bactéria em questão, primeiramente deve ter sido isolada e realizado os testes de gram, catalase, DNAse e coagulase, a fim de fazer uma previa identificação da bactéria para a escolha dos discos de antibióticos adequados.

O Método de Kirby-Bauer é considerado o método-padrão para a realização de antibiogramas. Utiliza pequenos discos de papel com a Concentração Inibitória Mínima (CIM) do antibiótico, ou seja, a menor concentração de antibiótico capaz de inibir o crescimento da bactéria.

Objetivo

Verificar a ação de substâncias antimicrobianas no crescimento de bactérias, utilizando o método de Kirby-Bauer.

Prática

Com o auxílio de uma pinça, os discos são colocados na placa de petris contendo a cultura previamente identificada, com distâncias semelhantes entre si. Os antibióticos utilizados foram: Penicilina G - PEN (10 µg/mL), Piperacilina+tazobactam – PPT (110 µg/mL), Eritromicina - ERI (15 µg/mL) e Imipenem - IPM (10 µg/mL).

Logo após, as placas foram incubadas e armazenadas para a análise na aula posterior.

7. LEITURA E INTERPRETAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA

Com o auxílio de uma régua foi medido o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco, com posterior consulta a uma tabela apropriada com valores padrão, para determinar se a bactéria em análise é sensível ou não aos antibióticos testados.

Os resultados podem ser observados na tabela a seguir:

Valores de Referência (mm)

Substância

Diâmetro do Halo

(mm)

Resistente (≤)

Intermediária

Sensível(≥)

Resultado

IPM 21 13 14-15 16 Sensível

PEN 09 28 - 29 Resistente

PPT 19 17 - 18 Sensível

ERI 0 - - - Resistente

Segundo este método, as bactérias podem ser classificadas como Sensíveis, Resistentes ou Intermediárias (I).

A categoria sensível implica que a infecção causada pela bactéria isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infecção e o agente infeccioso.

A categoria intermediária permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas.

A categoria resistente inclui isolados que não são inibidos pelas concentrações usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando um específico mecanismo de resistência é expresso.

REFERÊNCIAS

Microbiologia Industrial. Disponível em: <http://www.fat.uerj.br/intranet/disciplinas/Microbiologia%20Industrial/APOSTILA%20PR%C1TICA%20DE%20MICROBIOLOGIA%20INDUSTRIAL.pdf>. Acesso em: 08/12/14.

Monteiro, C. L. B.; Cogo L. L.; Galarda, I.; Filho, F. C. B. Manual Teórico-Prático De Procedimentos Básicos Em Microbiologia Médica. 3ª ed. Curitiba, 2010.

Teste De Sensibilidade Aos Antimicrobianos (TSA). Disponível em <http://users.med.up.pt/cc04-10/micropratica/micro_p_5.doc> Acesso em: 08/12/14.

TRABULSI, L. R., Alterthum, F.; Microbiologia. 5ª ed.. São Paulo: Atheneu, 2008.

Vermelho, A. B.; Pereira, A. F.; Coelho, R. R. R.; Souto-Padrón, T. C. B. S. S. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.