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XVII MET - ENCONTRO NACIONALSOBRE METODOLOGIAS E GESTÃO DE

LABORATÓRIOS DA EMBRAPA

IV Simpósio sobre procedimentos Analíticos e a Rastreabilidade dos Resultados na Agropecuária

Edição 2012

Pirassununga – SP2012

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XVII MET - ENCONTRO NACIONALSOBRE METODOLOGIAS E GESTÃO DE

LABORATÓRIOS DA EMBRAPA

Edição 2012

Organizadores

FZEAArlindo Saran Netto

Catarina Abdala Gomide Fernando de Lima Caneppele

Giovana Krempel Fonseca MerigheMarcos Roberto Ferraz

Pedro Henrique de Cerqueira LuzRafael Vieira de Sousa Roberta Ariboni Brandi

Roice Eliana Rosim Roseli Sengling Lacerda

EMBRAPAAna Rita de Araujo Nogueira

Cristiane Vieira Peres FragalleFlavia Aline Bressani Donatoni

Gilberto Batista de Souza

IV Simpósio sobre Procedimentos Analíticos e aRastreabilidade dos Resultados na Agropecuária

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ISBN: 978-85-60014-13-2Edição 2011

Os organizadores autorizam a reprodução total ou parcial deste trabalho, para qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

O conteúdo e revisão ortográfica são de inteira responsabilidade de seus autores.

Edição Editora 5DRua Siqueira Campos, 2.090 - 1º andar Pirassununga - SP - CEP: 13630-010Tel.: 19 3562-1514Email: contato@5dpublicidade.com.brwww.5dpublicidade.com.br

Editoração EletrônicaAlexandre RaisPaula Bertanha Izepom

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

XVII MET- Encontro Nacional sobre Metodologia e Gestão de Laboratórios da Embrapa e IV Simpósio sobre procedimentos Analíticos e a Rastreabilidade dos Resultados na Agropecuária (2012 : Pirassununga, SP) E56 Anais / XVII Encontro Nacional sobre Metodologia e Gestão de Laboratórios da Embrapa e IV Simpósio sobre procedimentos Analíticos e a Rastreabilidade dos Resultados na Agropecuária ; ed. Arlindo Saran Netto, Roberta Ariboni Brandi.-- Pirassununga : Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos/ Embrapa Pecuaria Sudeste, 2012. 84p

Evento realizado nos dias 22 a 26 de Outubro de 2012

1. Gestão de laboratório- congressos 2. Rastreabilidade analítica- congressos 3. biotecnologia animal 4. nutrição animal 5. Solos. I. Saran Netto, Arlindo. II. Brandi, Roberta Ariboni. III. Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos IV. Embrapa Pecuaria Sudeste.

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SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO

CAPÍTULO I 008 Histórico do MET – Impactos na gestão de laboratórios e metodologias analíticas na pesquisa agropecuária

CAPÍTULO II 019 Fertilizantes e corretivos: aspectos relevantes no controle de qualidade de resultados analíticos

CAPÍTULO III 031Qualidade analítica e a rastreabilidade dos resultados para fertilidade do solo

CAPÍTULO IV 043 Ações do PNCRC/MAPA na área de contaminantes inorgânicos

CAPÍTULO V 055 Controle de qualidade na análise de minerais com ênfase em nutrição animal

CAPÍTULO VI 068Biotecnologia animal: avanços de metodologias na área

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APRESENTAÇÃO

Esta publicação é fruto do 1° evento realizado em parceria entre a Embrapa e a Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos FZEA/USP. O grupo envolvido entende que é de suma importância a aproximação das Universidades a Embrapa e com isso, pensou-se em realizar um evento em parceria que pudesse contemplar o objetivo principal do evento que é na qualificação de pesquisadores, profissionais, técnicos e estudantes que desenvolvam ou tenham interesse em técnicas analíticas de laboratórios de pesquisa, mediante a exposição de conteúdos técnicos apresentados na forma de palestras e mesas redondas. O evento deste ano preconiza a discussão de procedimentos analíticos e rastreabilidade de resultados, área de grande importância e poucos estudos divulgados, proporcionando aos participantes do evento, a reunião em anais, de material de consulta para o desenvolvimento de suas atividades. Os anais tem a participação dos mais renomados pesquisadores de instituições de destaque (Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos FZEA/USP, Faculdade de Engenharia de Alimentos UNICAMP, Instituto Agronômico de Campinas IAC, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ESALQ/USP, Ministério da Agricultura, Pecuária e abastecimento MAPA, Embrapa, Centro de energia nuclear na agricultura CENA/USP) nas áreas de Segurança alimentar, controle de qualidade na análise de minerais, biotecnologia animal, análise de solos, que abrilhantaram esta publicação com seu conhecimento. Espera-se que os assuntos abordados possam promover a discussão entre os técnicos e pesquisadores da Embrapa e também a comunidade acadêmica. Visa-se também fornecer conhecimento para a utilização dos laboratórios de forma sustentável e com máximo aproveitamento sem causar prejuízos ao meio ambiente. Estamos certos de que o conteúdo deste material será de grande valia e desejamos a todos os leitores bom aproveitamento deste e que nele encontrem o conhecimento necessário para aprimoramento em todos os níveis, sendo eles, acadêmicos, técnicos ou práticos.

OS EDITORES

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CAPÍTULO I

HISTÓRICO DO MET – IMPACTOS NA GESTÃO DE LABORATÓRIOS E METODOLOGIAS ANALÍTICAS NA PESQUISA

AGROPECUÁRIA

Ana Rita de Araujo Nogueira1; Gilberto Batista de Souza1

1 Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos SP e-mail: anarita@cppse.embrapa.br; gilberto@cppse.embrapa.br

RESUMO Este texto traz um resumo do desenvolvimento do MET, encontro que ocorre anualmente entre os representantes dos laboratórios da Embrapa. A primeira edição ocorreu em 1995 na Embrapa Pecuária Sudeste, localizada em São Carlos, SP. Neste primeiro encontro participaram apenas as unidades localizadas na região Sudeste, sendo que desde então houve um aumento constante na participação e importância do evento, com vários desdobramentos para a Empresa, os quais serão aqui apresentados e discutidos.

O INÍCIOO primeiro MET – denominado inicialmente “I MET - Workshop de

Metodologias dos Laboratórios da Embrapa – Sudeste” ocorreu de 6 a 8 de dezembro de 1995 na Embrapa Pecuária Sudeste e contou com a participação de 24 representantes das 8 Unidades localizadas na região Sudeste: Embrapa Instrumentação, Embrapa Solos, Embrapa Milho e Sorgo, Embrapa Gado de Leite, Embrapa Meio Ambiente, Embrapa Agrobiologia e Embrapa Agroindústria de Alimentos além de 1 representante da Embrapa Gado de Corte.

Na memória final do primeiro evento ficou patente a oportunidade deste tipo de reunião e a grande carência existente, tanto na edição de manuais e protocolos de metodologias analíticas quanto na grande diversidade de análises laboratoriais existente na Embrapa. Portanto, haveria necessidade de se estabelecer um padrão para ser comparado com os outros métodos. Foram sugeridos diversos caminhos, entre os quais a colocação de metodologias padrão na Internet, após a definição dos métodos que fossem consenso e a redação de manual em diferentes formatos. Pela primeira vez na Embrapa, naquela ocasião, foram reunidas pessoas com interesses e competências afins para discutir metodologias de análises laboratoriais, tendo sido proposta, ao final deste primeiro evento, a ampliação do evento, com a participação das unidades da Embrapa localizadas no centro oeste e a elaboração de um “Manual

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de Métodos de Análises Laboratoriais da Embrapa”. Também foi criada a lista através do correio eletrônico, para dar continuidade às discussões pertinentes aos assuntos tratados durante a reunião. Foi ainda elaborado questionário para definição dos assuntos a serem tratados durante o II MET e a forma como seria elaborado o Manual. As palestras convidadas proferidas durante o evento foram publicadas em forma de anais (NOGUEIRA, 1995). De maneira geral, ficou clara a necessidade de maior intercâmbio entre profissionais que trabalham em laboratório, o que se refletiu no entusiasmo dos participantes e na demanda por manuais técnicos de uso comum. O “II MET - Workshop de Metodologias dos Laboratórios da Embrapa - Sudeste e Centro-Oeste” foi realizado na Embrapa Pecuária Sudeste em São Carlos SP, de 27 a 30 de agosto de 1996. Contou com a participação de profissionais das unidades da Embrapa localizadas nas regiões Sudeste e Centro-Oeste e de outras 9 instituições de pesquisa e ensino. No II MET foram priorizadas discussões sobre a coleta e o preparo de amostras. Além das unidades da Embrapa da região Sudeste, também participaram representantes da região Centro-Oeste: Embrapa Pantanal, Embrapa Gado de Corte, Embrapa Agropecuária Oeste, Embrapa Cerrados e Embrapa Recursos Genéticos.

Durante o período que transcorreu entre o primeiro e o segundo encontro, houve o amadurecimento e a consolidação dos grupos de trabalho já definidos durante o I MET, sendo que os trabalhos se apresentaram bastante produtivos. Os três grupos de trabalho - Solos, Plantas e Nutrição Animal assumiram a responsabilidade pela elaboração da primeira versão do documento “Coleta e Preparo de Amostras para Análises Laboratoriais”. Foram feitas discussões internas para definir a formatação e o escopo do documento, sendo definido o cronograma de envio das informações para a elaboração do documento, inicialmente previsto para novembro de 1996. Questões referentes ao cronograma, título, conteúdo e formato foram abordadas durante as reuniões, sendo definido o cronograma e o título do documento: “Orientações sobre Coleta e Preparação de Amostras para Análises Laboratoriais na Embrapa - Sudeste e Centro-Oeste”, com conteúdo geral naquele momento, e que o mesmo fosse publicado na série Documentos, preferencialmente pelo Serviço de Produção de Informação (SPI) da Embrapa.

Outro fato sempre abordado durante as primeiras reuniões era quanto à institucionalização do MET, ao Comprometimento da Embrapa e à sensibilização da Empresa e das Chefias sobre a participação continuada do pessoal envolvido em análises laboratoriais nas Unidades nos próximos Workshops, em consequência da evolução natural do processo que foi iniciado em 1995.

Durante o II MET foi definido que haveria um rodízio entre as Unidades e que o objetivo final dos Workshops seria a elaboração e posteriores

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atualizações de um Manual de Análises Laboratoriais da Embrapa – objetivo este que foi ampliado nos demais encontros. Os participantes concordaram com as colocações de que deveria haver rodízio entre as Unidades para realização do Workshop, porém o III MET e IV MET ainda seriam realizados em São Carlos na Embrapa Pecuária Sudeste.

O “III MET - Workshop de Metodologias dos Laboratórios da Embrapa” foi realizado na Embrapa Pecuária Sudeste de 23 a 26 de setembro de 1997. Participaram 40 representantes de 22 Unidades da Embrapa, além de palestrantes de universidades, empresas e centros de pesquisa. Foi finalizado o primeiro documento e definido o cronograma para a redação da segunda parte do Manual, referente às determinações realizadas nos laboratórios de solos, plantas e nutrição animal e alimentos. Nesta ocasião foi também proposta a modificação do título do Evento, para: “MET - Encontro Nacional de Metodologias dos Laboratórios da Embrapa”, procurando-se adaptá-lo à língua portuguesa.

Como resultado, foi proposta a publicação de um Manual de análises laboratoriais da Embrapa, sendo a primeira parte, envolvendo coleta e preparo de amostras, tema da reunião de 1996, foi finalizado e publicado. Durante o III MET ficou estabelecido cronograma para a continuidade do Manual, que deveria inicialmente ser publicado em forma de fichário, em virtude da dinâmica e progresso científico relacionados à essa área. A ideia seria adequá-lo e atualizá-lo à medida que novas pesquisas e métodos fossem desenvolvidos e validados. Cada grupo de trabalho seria responsável pela definição das metodologias para compor o manual, sendo estas compatibilizadas e revisadas entre os membros dos grupos de trabalho. Foi enviada correspondência a todas as Unidades da Embrapa para que participem na elaboração do documento e enviassem representantes nas próximas reuniões, cujos resultados pretendem ser orientadores com relação aos procedimentos laboratoriais na Embrapa, além de ter como objetivo estreitar o relacionamento entre as pessoas.

Outro aspecto levantado foi a importância da participação em programas interlaboratoriais, visando estabelecer procedimentos a serem observados nas análises em todo o seu processo, desde a fase de amostragem no campo, às determinações analíticas e, se for o caso, introdução de novas metodologias e/ou técnicas. Assim, já durante o III MET foi consolidada a criação pelo grupo de nutrição animal o “Programa Colaborativo Interlaboratorial - PCI”. O grupo estabeleceu cronograma para envio de amostras e subcoordenadores em cada tipo de análise, dada à ampla gama de análises envolvidas. A ideia principal para a criação do Programa foi englobar análises não contempladas por outros programas já existentes, com o objetivo de auxiliar no controle de qualidade de dados analíticos gerados pelos laboratórios na área de nutrição animal.

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No primeiro ano do PCI, com a participação de quatorze laboratórios, foram previstas as seguintes análises: digestibilidade “in vitro” na matéria seca, fibra bruta, fibra em detergente ácido, fibra em detergente neutro e extrato etéreo. O programa foi realizado em três quadrimestres, sendo analisadas três amostras de forrageiras por quadrimestre.

Desde que foi criado em 1997, o “Programa Colaborativo Interlaboratorial” apresentou uma importância cada vez maior dentro do MET e para os laboratórios participantes e merecerá uma discussão especial nesta revisão. Fator importante foi o envolvimento e a participação sempre crescente de laboratórios no Programa, sendo que e a detecção de problemas observados com o controle interlaboratorial possibilita a realização de treinamentos, que podem ser realizados pelos próprios representantes de outras Unidades, uma vez que alguns laboratórios estão mais capacitados em algumas análises.

O “IV MET - Encontro Nacional Sobre Metodologias de Laboratórios da Embrapa” foi realizado na Embrapa Pecuária Sudeste de 22 a 25 de setembro de 1998. Durante a apresentação dos relatórios dos Grupos de Trabalho, na assembleia final, foram apresentados e discutidos os resultados das reuniões dos três Grupos de Trabalho - Solos, Plantas, Nutrição Animal e Alimentos - criados durante o II MET (1996), com o objetivo de elaborar manuais técnicos de uso comum. A primeira versão do documento sobre Coleta e Preparo de Amostras para Análises Laboratoriais foi distribuída aos participantes durante o evento (NOGUEIRA et al., 1998). A continuidade da redação do manual foi priorizada nos grupos de discussão.

O grupo de trabalho em Nutrição Animal e Alimentos fez uma avaliação do primeiro ano de funcionamento do Programa Colaborativo Interlaboratorial (PCI), que contou com a participação de 14 laboratórios. Foi observada crescente diminuição entre os resultados fornecidos pelos laboratórios. Já a partir de 1999 o PCI contaria com a participação de 20 laboratórios, sendo 15 de unidades da Embrapa e 05 de outros órgãos estaduais de pesquisa (USP Pirassununga, Instituto de Zootecnia (IZ), Coordenadoria de Assistência Técnica Integrada (CATI), Fundação Pinhalense e Universidade Federal de Lavras). Além disso, foram discutidos assuntos referentes à coordenação, locais de preparo das amostras, cronograma de entrega de resultados, etc. Sendo que o consenso entre os participantes foi: o cronograma de analises passaria a ser trimestral; distribuição de 12 amostras durante o ano, sendo três por trimestre; para envio dos dados, os participantes que tivessem acesso à Internet, deveriam enviar os resultados via e-mail (arquivo anexo) e também, via correio; os formulários para envio de resultados foram padronizados; ficou definido que haveria a repetição de uma amostra, aleatoriamente, durante o ano; foi aceito pelos participantes do grupo de nutrição a inclusão de mais seis laboratórios no PCI e, como norma, a exclusão de laboratórios que

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não enviassem resultados de duas rodadas consecutivas sem justificativa; e ampliação do escopo de ensaios incluindo as análises de matéria seca, proteína bruta, lignina, cinzas, cálcio e fósforo. Além do grupo de Nutrição e Alimentos, os Grupos de Tecidos Vegetais e Solos também apresentaram suas avaliações. O Grupo de Solos constatou que os trabalhos de harmonização das sugestões e posterior envio para publicação necessitavam ser acelerados devido aos prazos para a publicação juntamente com o grupo Tecidos Vegetais e a estrutura e os tópicos a serem incluídos no Manual.

Foi sugerida a formalização e realização de “cursos de treinamento” pelas Unidades com boa estrutura em técnicas laboratoriais comuns.

O “V Encontro Nacional Sobre Metodologias dos Laboratórios da Embrapa” foi realizado na Embrapa Gado de Leite em Juiz de Fora, MG, de 26 a 29 de outubro de 1999. Desde então, o encontro foi realizado anualmente, em diferentes Unidades, confirmando o que já havia sido definido anteriormente “o MET seria itinerante” e encerrando-se um ciclo de consolidação. A partir daí, o MET foi organizado pelas seguintes unidades:

VI MET – Embrapa Solos; VII MET – Embrapa Florestas (destaque: o MET foi realizado num hotel e não no âmbito da unidade da Embrapa como era de costume); VIII MET – Embrapa Meio Ambiente (destaque: pela primeira vez a comissão organizadora contrataria uma empresa para realizar e conduzir todas as atividades do evento); IX MET – Embrapa Agrobiologia (destaque: envio de projeto de capacitação para o Departamento de Gestão de Pessoas – DGP). A Embrapa Pecuária Sudeste teve o prazer de organizar novamente o X MET, em 2005, ocasião em que foram inseridos os treinamentos.

APÓS 10 ANOSO X MET – “Encontro Nacional sobre Metodologias de Laboratórios

da Embrapa” foi realizado entre os dias 21 a 24 de novembro de 2005 pela Embrapa Pecuária Sudeste. Teve como objetivo a troca de informações técnicas entre os profissionais das diversas áreas de laboratórios da Embrapa, de instituições de ensino e pesquisa e de empresas privadas. Participaram 102 pessoas inscritas no evento, provenientes de 32 unidades descentralizadas da Embrapa e de instituições de ensino e pesquisa, 18 palestrantes em mesas redondas (MET, 2005), 9 professores dos minicursos, além de 15 monitores, 17 expositores de empresas de equipamentos de laboratórios, além do envolvimento dos funcionários da Embrapa Pecuária Sudeste.

Como previsto na programação original, ocorreram quatro mesas redondas com temas sugeridos pelos participantes da lista de discussão (laboratóriol@sede.embrapa.br) – 1) Implementação de sistemas de qualidade; 2) Gerenciamento e tratamento de resíduos químicos, 3) Gestão da informação em laboratórios; e 4) Programas intelaboratoriais de controle de qualidade.

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Uma palestra – Programa de Controle de Resíduos (PCR) em carne,leite, mel e pescado do Mistério da Agricultura: Organização, resultados e ações; e sete mini-cursos – 1) Espectrometria de absorção atômica com chama e forno de grafite; 2) Espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado – ICP OES; 3) Gerenciamento e tratamento de resíduos químicos; 4) Técnicas de PCR e NESTED/PCR; 5) Análise de DNA por eletroforese; 6) Análise por injeção em fluxo – FIA; e 7) Segurança em Laboratórios. Embora os participantes devessem optar por apenas um mini-curso, todos receberam o material completo, incluindo as práticas e discussões de todos os mini-cursos oferecidos.

Dentre as atividades também ocorreram reuniões de seis grupos de trabalho: Solos e águas, Nutrição vegetal, Nutrição animal, Biotecnologia, Gerenciamento de resíduos e Qualidade em laboratórios, com discussões de pertinentes voltadas a 4 assuntos envolvendo técnicas laboratoriais de análises químicas e biológicas e de gestão de resíduos e qualidade nos laboratórios da Embrapa, sendo os resultados finais e propostas surgidas nos grupos apresentados no último dia, durante o encerramento do evento.

Paralelamente ocorreu o lançamento da primeira versão do “Manual de laboratórios: Solo, Água, Nutrição Vegetal, Nutrição animal e Alimentos” (NOGUEIRA & SOUZA, 2005), resultado das reuniões anteriores, o lançamento do programa de computador “Sistema de Gerenciamento de Laboratórios – SGL” desenvolvido pela Embrapa Suínos e Aves e a exposição de equipamentos de laboratórios (21 expositores), com a demonstração de vários equipamentos de última geração. Ainda este ano foi realizada a VIII Reunião Anual do Programa Colaborativo Interlaboratorial, o qual passa a ser denominado de Ensaio de Proficiência para Laboratórios de Nutrição Animal – EPLNA. A partir dai o protocolo de funcionamento do EPLNA é adequado às normas ABNT ISO/IEC GUIA 43:1999 (atualmente ISO/IEC 17043:2010) e ao Protocolo Internacional Harmonizado para Ensaio de Proficiência em Laboratórios Analíticos (INMETRO, 2004), sendo que a avaliação de desempenho dos laboratórios participantes é atualizada em função da implantação de um novo modelo de projeto estatístico ao escopo do EPLNA. Com o EPLNA totalmente adequado às normas internacionais, foi possível cadastra-lo na base de dados EPTIS (The European Proficiency Testing Information System - http://www.eptis.bam.de). Na plenária do X MET, os participantes concordaram com a continuidade do rodízio entre as Unidades. Quanto ao local, foi apresentada a proposta da Embrapa Suínos e Aves, que enviou carta da chefia se comprometendo a sediar o próximo XI MET, sendo aprovado por unanimidade e enfatizada a necessidade da continuidade do apoio da diretoria da Embrapa e das chefias das unidades para a continuidade do evento. Foi ressaltado o progresso e a evolução das

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Reuniões, com a participação crescente das Unidades da Embrapa e a criação do “Manual” e do Programa Colaborativo Interlaboratorial, além da troca de experiências e informações entre os laboratórios, com o fortalecimento da lista de discussões criada durante o I MET e a inclusão nas comunidades virtuais (CATIR).

O MET rompe fronteiras, e pela primeira vez extrapola as regiões Sul e Sudeste, sendo o XII MET realizado na região Norte do Brasil, em Rio Brando no Acre, coordenado pela Embrapa Acre.

O XIII MET, também é realizado na região Norte, foi coordenado pela Embrapa Amazônia Oriental e foi o evento, até o momento, com o maior número de participantes (total de 314 participantes), tendo como destaque o estabelecimento de parceria inédita com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA para a organização do evento, contando com a participação de 52 funcionários desse Ministério, incluindo técnicos dos seis Laboratórios Nacionais Agropecuários - Lanagros.

Ainda, no XIII MET, iniciou-se a formação do comitê gestor do MET, o qual seria composto pelos coordenadores dos grupos de discussão e de membros da comissão organizadora do evento atual. Esse comitê gestor tem as seguintes atribuições, de acordo com seu regimento interno: definir as programações dos eventos anuais, quais sejam o MET e simpósios ou congressos paralelos ao evento, quando ocorrerem; realizar consultas e coletar sugestões para locais de realização, temas, grupos de discussão, palestras, minicursos, workshops para os eventos anuais, etc.; definir e dar ampla divulgação ao tema do MET; coordenar a programação e a realização do MET; acompanhar e avaliar as ações realizadas nos eventos anuais; contribuir com a entidade organizadora do evento anual na programação, realização, avaliação do MET e demais eventos relacionados; definir datas para realização das atividades dos grupos de trabalho; e buscar soluções para os problemas de análises/ensaios, visando a melhoria contínua do processo. Também foi sugerido por esse comitê a realização de simpósios em paralelo à realização do MET. O simpósio teria como objetivo estimular a apresentação de trabalhos científicos desenvolvidos nos laboratórios da Embrapa e de outras Instituições participantes.

O XIV MET foi realizado na Embrapa Agroindústria de Alimentos realizado no Centro de Convenções da Federação das Empresas do Rio de Janeiro – FIRJAN, sendo enfatizado o tema “Segurança Alimentar e Alimentos Seguros” e realizado em paralelo ao MET o “I Simpósio sobre Metodologias de Laboratório de Pesquisa Agropecuária”.

O XV MET, realizado na Embrapa Clima Temperado, em Pelotas, RS, teve como tema “A pesquisa agropecuária como instrumento para a competitividade e o desenvolvimento sustentável” e também foi realizado o II Simpósio sobre Metodologias de Laboratório de Pesquisa Agropecuária com

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apresentação de trabalhos científicos. O XVI MET, organizado pela Embrapa Uva e Vinho foi realizado em

Bento Gonçalves, RS, no período entre 17 e 21 de outubro de 2011. Em paralelo ao XVI MET foi realizado o III Simpósio sobre Metodologia de Laboratório de Pesquisa Agropecuária. Participaram da programação cerca de 150 pessoas, entre laboratoristas, enólogos, biólogos, químicos, engenheiros alimentares, agrônomos e pesquisadores de todo País. Nesse evento destacou-se, além da excelente organização, integração de gerações, pois, muitos empregados recém-contratados pela Embrapa participaram, tendo sido o intercâmbio com os mais experientes, muito produtivo e importante para continuidade dos trabalhos desenvolvidos. Os temas abordados no XVI MET foram: agregação de valores aos produtos agropecuários; novidades em métodos de identificação de moléculas componentes de alimentos; biossegurança e qualidade em laboratórios.

Durante o XVI MET foi apresentado pelo Diretor da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, a infraestrutura e a candidatura da instituição para sediar o XVII MET e o IV Simpósio sobre Metodologia de Laboratório de Pesquisa Agropecuária, em parceria com a Embrapa Pecuária Sudeste. A candidatura foi aceita pelo comitê gestor o qual, no período de 28 de fevereiro a 15 de março de 2012, realizou consulta aos integrantes da lista de discussão laboratorio-l@sede.embrapa.br. Com 98% de aceitação, foi aprovada a parceria em questão.

PREOCUPAÇÕES DEMOSTRADAS AO LONGO DA EXISTÊNCIA DO MET

Um dos pontos que podem ser ressaltados é a constante preocupação com assuntos pertinentes à qualidade dos resultados, validação de métodos, meio ambiente e gestão de laboratórios. Por diversas ocasiões o MET foi o fórum onde os empregados da Embrapa que trabalham com laboratórios, direta ou indiretamente, puderam externar suas preocupações quanto à geração de resíduos, gestão da qualidade, dentre outras. Durante o VII MET, organizado pela Embrapa Florestas no ano de 2002, os participantes apresentaram-se preocupados em relação aos resíduos gerados pelos laboratórios da Embrapa, o que originou carta encaminhada à presidência. Essa preocupação foi novamente demonstrada durante o VIII MET, organizado pela Embrapa Meio Ambiente em 2003, ocasião que também foram discutidos os programas de certificação pela ISO Guia 9001:2000; pela ISO/IEC 17.025 e com as Boas Práticas Laboratoriais (BPL’s), em implantação em algumas Unidades da Embrapa, gerando um aumento considerável no controle analítico, na demanda e no número de análises realizadas.

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Carta encaminhada à presidência da Embrapa solicitava a “formulação de uma política institucional que possibilite a implantação de um programa de minimização e descarte dos resíduos químicos e o destino correto dos subprodutos gerados do tratamento como prioridade dentro de um macro processo da Empresa, o que viabilizaria a conscientização de todos os empregados e consequente alocação de recursos, contribuindo para a implantação dos programas de certificação. Essa proposta foi defendida desde a criação do MET e apresenta-se oportuna em função da necessidade da preservação ambiental. Nossa preocupação, como cidadãos e empregados da Embrapa, cuja missão é “viabilizar soluções para o desenvolvimento sustentável do agronegócio brasileiro por meio de geração, adaptação e transferência de conhecimentos e tecnologia em benefício da sociedade”, residia no fato que naquela ocasião não haver políticas claras na Empresa que abordassem essa questão. Na carta foi também salientado que a Lei de Crimes Ambientais expõe a Embrapa a sanções impostas pelos órgãos de fiscalização, o que pode gerar grandes prejuízos à sua imagem perante a sociedade brasileira e à comunidade internacional.”

Lembrando que pouco tempo depois a Embrapa realmente lançou uma ação corporativa visando o gerenciamento de resíduos químicos. Foi possível aos participantes atuarem de forma efetiva, com apresentação de propostas concretas e pertinentes. Diversos documentos e ações a partir das experiências e discussões do grupo e da conscientização da importância da questão foram gerados. Durante o XI MET a Embrapa Suínos e Aves lançou um vídeo descrevendo os principais passos a serem observados dentro de um laboratório de tratamento de resíduos químicos. Outros documentos também foram gerados dentro do escopo da ação corporativa (KUNZ et al., 2004; NOGUEIRA et al., 2006).

Outra ação corporativa recentemente anunciada e que brevemente deverá ser iniciada é a que trata da Gestão da Qualidade, que conta entre os membros do grupo responsável pela implantação participantes do grupo de Gestão da Qualidade do MET e do comitê gestor.

DESENVOLVIMENTOSDe uma forma geral, o que se pode dizer é que o MET extrapolou

em muito suas propostas iniciais, de reuniões de profissionais que atuavam em áreas afins na empresa, para discutir metodologias e elaborar manuais de uso comum. Sem dúvida este objetivo foi atingido, o manual foi redigido, necessitando continuidade. No entanto, outros eventos suplantaram esses objetivos iniciais. A sempre presente preocupação inicial de necessidade de “institucionalizar” o evento ocorreu de certa forma pela demonstração de sua importância, com os resultados concretos que foram surgindo. Sem dúvida

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nenhuma o principal resultado foi a oportunidade das pessoas se conhecerem, que proporcionou todos os outros ganhos, que serão discutidos a seguir.

Melhoria nos resultados analíticos, a partir de diminuição de repetições de analises – isso foi obtido devido à participação no EPLNA – muitos protocolos foram padronizados, discussões de metodologias foram feitas e erros comuns foram dirimidos, discutidos e evitados. Atualmente, o programa conta com a participação de 98 laboratórios, sendo grande parte laboratórios de empresas privadas, além de laboratórios da Embrapa, instituições de pesquisa e universidade, um laboratório do Chile e um laboratório da Colômbia. Artigo publicado por Souza e colaboradores apresenta um detalhamento deste programa e seus procedimentos (SOUZA et al., 2009).

Criação de um programa de gestão de resultados (SOUZA et al., 2007), que possibilita o recebimento dos resultados encaminhados pelos laboratórios durante todo o ano. Esse programa tem sido utilizado não somente pelo EPLNA, mas também por outros ensaios de proficiência para a produção de materiais de referencia ou controle de qualidade analítica de algumas matrizes, como os ensaios criados pelos grupos de solos e de plantas.

Outra vertente interessante e que está sendo possível graças ao MET e ao EPLNA, é a produção de materiais de referência para futura distribuição aos participantes do programa, de amostras nacionais e que sejam utilizadas como padrões nas analises desses laboratórios (SOUZA et at. 2009; NOGUEIRA et al., 2011). Todas essas ações contribuem com diversos projetos de pesquisa em execução na Embrapa.

Os mini-cursos e treinamentos que ocorrem normalmente durante os eventos, são importantes para o balizamento das analises nas diferentes Unidades, sendo uma oportunidade de aproveitar a experiência existente na empresa.

As feiras de equipamentos, oportunidade de se tomar conhecimento do que de mais moderno na área de tecnologia de diferentes fabricantes apresentam no mercado. O conhecimento do equipamento é importante para se conhecer se o equipamento atende exatamente à necessidade pretendida.

A oportunidade de apresentação de trabalhos em forma de painel, ocasião de se compartilhar experiências, conhecimento e discutir alternativas metodológicas. Iniciada durante o XI MET na Embrapa Suínos e Aves, este formato foi consolidado a partir de 2009, com a criação, concomitante ao XIV MET, organizado pela Embrapa Agroindústria de Alimentos, do “I Simpósio sobre Metodologias de Laboratório de Pesquisa Agropecuária”, que terá sua 4ª edição ocorrendo paralelamente ao XVII MET.

Enfim, como já escrito na memoria no II MET de 1997:“A continuidade desse trabalho virá demonstrar mais uma vez a

importância da colaboração entre os técnicos que enfrentam os mesmos

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problemas em seu dia a dia. Não se intenciona esgotar o assunto, mas sim dar o primeiro passo para, a partir dessas Reuniões e da lista eletrônica criada, sejam levantados problemas e definidos critérios dentro dos muitos Laboratórios na Embrapa que trabalham com amostras de solos, água, plantas e materiais relacionados à nutrição. Acreditamos que este seja o melhor caminho para uma melhor racionalização e objetividade nos trabalhos de Laboratório, vindo a se refletir em economia e melhoria nos resultados de pesquisa da Embrapa”.

BIBLIOGRAFIAABNT ISO/IEC GUIA 43-1, 1999, Ensaios de Proficiência por Comparações Interlaboratoriais - Parte 1: Desenvolvimento e Operação de Programas de Ensaios de Proficiência.

KUNZ, A.; NOGUEIRA, A. R. A. ; BIZZO, H.; SIMEONE, M. L. F.; ENCARNAÇAO, R. Estrategia para Implantaçao de um Programa de Gerenciamento de Residuos Quimicos de Laboratorio na Embrapa. Concordia, SC: Embrapa Suinos e Aves, 2004 (Boletim de Pesquisa).

MET – Encontro Nacional sobre Metodologias de Laboratórios da Embrapa, X., 2005, São Carlos, Resumos...São Carlos, SP. Embrapa Pecuária Sudeste, 2005. 133p.

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CAPÍTULO II

FERTILIZANTES E CORRETIVOS: ASPECTOS RELEVANTES NO CONTROLE DE QUALIDADE DE RESULTADOS ANALÍTICOS

Flavia Consolini¹, Maria de Fátima Martins Pinhel², Eliezer Augusto Baeta de Oliveira³

¹ flavia.consolini@agricultura.gov.br, Responsável pela Unidade de análises físico-químicas de fertilizantes, corretivos, substratos e afins –FET/Lanagro-SP² Coordenadora técnica do Lanagro-SP³ Supervisor da qualidade da Unidade de análises físico-químicas de fertilizantes, corretivos, substratos e afins –FET/Lanagro-SP

RESUMO Os fertilizantes e corretivos são insumos empregados em larga escala na produção de alimentos, bioenergia e matérias primas, como madeira e fibras. Além dos conhecidos benefícios, seu uso também implica potencial impacto ambiental. A comprovação da conformidade desses produtos é atribuição do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento-MAPA, que amostra e analisa, sistematicamente, fertilizantes e corretivos para garantir sua qualidade e inocuidade. As análises para verificar a conformidade e a inocuidade são de responsabilidade da Rede Nacional dos Laboratórios Agropecuários. Os resultados emitidos pela Rede Nacional são utilizados como base para atuação do MAPA junto às empresas detentoras de produtos não conformes. Assim, a garantia de qualidade dos resultados analíticos de fertilizantes e corretivos é importante tanto para os produtores agrícolas que dependem destes insumos para o sucesso de sua atividade, como para dar sustentação aos atos legais do MAPA. Para garantir a qualidade dos resultados analíticos, os laboratórios da Rede Nacional implantaram Sistemas de Gestão da Qualidade segundo a Norma ISO/IEC 17025. Por ser uma norma conhecida, neste texto serão abordados apenas alguns requisitos técnicos que tem maior impacto na garantia dos resultados nas análises de fertilizantes e corretivos, como treinamento de pessoal, métodos de ensaio e validação de métodos, rastreabilidade de medição, amostragem e garantia da qualidade dos resultados de ensaio.

PALAVRAS CHAVE: corretivo, fertilizante, fiscalização, garantia da qualidade.

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REVISÃO DE LITERATURA

1. POR QUE GARANTIR A QUALIDADE DE RESULTADOS ANALÍTICOS DE FERTILIZANTES E CORRETIVOS?

Os fertilizantes e corretivos são fundamentais para a produção agrícola, com relevante participação no custo de produção e efeitos significativos na quantidade e qualidade das colheitas. Assim, são insumos empregados em larga escala na produção de alimentos, bioenergia e matérias primas, como madeira e fibras. Além dos conhecidos benefícios, seu uso também implica potencial impacto ambiental. Entre 2007 e 2009, a quantidade de fertilizantes utilizados no Brasil ficou em torno de 10 milhões de toneladas de nutrientes por ano, isto representa aproximadamente 6% do consumo mundial de fertilizantes (IFA, 2012).

Com o desenvolvimento de pesquisas e o empreendedorismo de alguns produtores, a produção agrícola nacional cresceu significativamente em novas áreas consideradas de baixa produtividade, com sérias limitações de fertilidade, como a região do Cerrado. Esta expansão da fronteira agrícola deveu-se não somente à utilização de fertilizantes, mas também à aplicação de corretivos para adequar acidez do solo, tornando o Brasil um dos principais atores no negócio mundial de grãos e carne.

A importância desses insumos tem sido reconhecida desde muito tempo. O imperador D. Pedro II contratou o químico austríaco Franz Dafert para ser organizador e primeiro diretor do Instituto Agronômico de Campinas, onde criou um laboratório para confirmar a qualidade dos fertilizantes devido ao comércio inescrupuloso que vendia adubos de má qualidade e por preços altos (DIAS, 2005).

Atualmente, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) possui a atribuição legal de fiscalizar a produção, importação e o comércio de fertilizantes e corretivos, conforme disposto na Lei nº 6.894 de 16 de dezembro de 1980 (BRASIL, 1980), regulamentada pelo Decreto nº 4.954, de 14 de janeiro de 2004 (BRASIL, 2004). O MAPA tem a incumbência de garantir a conformidade desses insumos colocados à disposição dos agricultores. Na estrutura do MAPA, esta fiscalização fica a cargo do Departamento de Fiscalização de Insumos Agrícolas (DFIA), que designa aos Serviços de Fiscalização de Insumos Agrícolas (SEFIAs), a de coleta amostras de fertilizantes e corretivos com a finalidade de comprovar a conformidade do produto, ou seja, se os teores de nutrientes e outras características inerentes aos insumos estão de acordo com as garantias declaradas pelos responsáveis (produtores, importadores ou comerciantes) pelo fertilizante ou corretivo. As análises para verificar a conformidade e a inocuidade desses produtos quanto aos limites máximos de metais pesados tóxicos são de responsabilidade

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da Rede Nacional dos Laboratórios Agropecuários.A Rede Nacional é constituída pelos Laboratórios Nacionais

Agropecuários (Lanagros) e por laboratórios credenciados pelo MAPA, de acordo com a Instrução Normativa nº 01 de 2007 (BRASIL, 2007a), que realizam as análises seguindo os métodos oficiais previstos na Instrução Normativa nº 28 do mesmo ano (BRASIL, 2007b). Os resultados analíticos apresentados pelos laboratórios da Rede Nacional são utilizados pelo MAPA para atuar junto às empresas produtoras, importadoras ou que comercializam insumos eventualmente não conformes, infligindo penalidades como multa, suspensão de registro ou, até mesmo, embargo da empresa.

Assim, a garantia de qualidade dos resultados analíticos de fertilizantes e corretivos é importante tanto para os produtores agrícolas que dependem destes insumos para o sucesso de sua atividade, como para dar sustentação aos atos legais do MAPA.

2. COMO CONTROLAR A QUALIDADE DOS RESULTADOS ANALÍTICOS

O sistema de garantia da qualidade dos resultados analíticos é o conjunto de atividades desenvolvidas por um laboratório com objetivo de alcançar um padrão requerido de análise (THOMPSON & WOOD 1995). Este sistema envolve treinamento de pessoal, adequação do ambiente de laboratório, segurança, armazenamento, integridade e identidade das amostras, manutenção de registros, calibração e manutenção de equipamentos, aquisição de insumos adequados e uso de métodos validados. Todavia, somente este sistema não assegura a obtenção de resultados confiáveis a menos que seja feito controle de qualidade interno. Segundo os autores, é a partir do controle interno de qualidade que se estabelece o monitoramento contínuo das operações e dos resultados analíticos, o que permite aos analistas decidirem se os resultados são satisfatoriamente confiáveis para serem emitidos.

Algumas normas foram criadas para que o sistema de garantia da qualidade de um laboratório seja equivalente ao de outro. No Brasil, os laboratórios que analisam fertilizantes e corretivos, em geral, comprovam sua competência implantando um Sistema de Gestão da Qualidade baseado na Norma ABNT ISO/IEC 17025 (ABNT, 2005), sendo tal implantação recomendada para toda a Rede Nacional. Por ser uma norma bastante conhecida, neste texto serão abordados apenas alguns pontos considerados críticos devido à especificidade das matrizes fertilizantes e corretivos. Destacam-se, assim, entre os requisitos técnicos, os itens 5.2, 5.4, 5.6, 5.7 e 5.9, conforme indicado na Figura 1.

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Figura 1: Requisitos da Norma ABNT NBR ISSO/IEC 17025.

3. REQUISITO 5.2 - PESSOAL

TREINAMENTO DE ANALISTAS:Grande parte dos ensaios em fertilizantes e corretivos é realizada por

meio de técnicas clássicas, como gravimetria, volumetria, as quais não utilizam curvas de calibração. Nesses casos, a habilidade do analista é essencial não somente na extração, como na determinação dos analitos, observando-se que a precisão intermediária é a principal causa de incerteza.

Um dos procedimentos adotados na Unidade de Análises Físico-químicas de Fertilizantes, Corretivos, Substratos e Afins do Lanagro/SP - FET é a realização de ensaio de repetitividade e reprodutibilidade para cada analista como parte da avaliação do treinamento realizado antes da emissão da autorização para realizar o ensaio. Devido ao grande número de ensaios realizados pela Unidade, conforme o caso, o treinamento e a análise crítica dos resultados podem ser feitos de acordo com as seguintes opções:

a. uso de dados da carta controle. Neste caso, o desvio padrão dos resultados obtidos pelo analista em treinamento tem que ser menor que o desvio encontrado nos resultados da carta controle;

b. quando não há dados disponíveis por se tratar de um método novo, análise de amostras de ensaio de proficiência de rodadas anteriores. Os resultados obtidos pelo analista devem estar dentro do intervalo dos resultados satisfatórios;

c. quando não há ensaio de proficiência, nem amostra referência, enviando-se a outro laboratório da Rede Nacional, que já realize o ensaio, a mesma amostra utilizada no treinamento e comparando-se os resultados;

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d. quando nenhum outro laboratório da Rede Nacional realiza o ensaio, ou são propostas alterações em ensaios já realizados, é possível realizar um estudo colaborativo entre os laboratórios da Rede.

O treinamento deve ser novamente realizado quando o analista não executar o ensaio por um longo período ou, quando algum problema relativo ao analista for detectado nos controles internos. Os resultados obtidos no treinamento também podem ser úteis ao responsável pelo laboratório para conhecer melhor as habilidades de cada analista e selecionar qual é o melhor, para uma determinada técnica, já que algumas áreas apresentam escopo com técnicas variadas, como é o caso de fertilizantes e corretivos.

4. REQUISITO 5.4 - MéTODOS DE ENSAIO E VALIDAÇÃO DE MéTODOS No Brasil, os métodos oficiais de análises de fertilizantes e corretivos encontram-se publicados na Instrução Normativa nº 28 de 27 de julho de 2007 (BRASIL, 2007b).Por se tratarem de métodos normalizados, não é necessário que se realize sua validação completa. O Lanagro-SP utiliza um procedimento simplificado para validação intralaboratorial, elaborado especificamente para métodos normalizados da área de físico-química, cuja exatidão seja comprovada por participação em ensaios de proficiência, ensaios colaborativos ou material de referência certificado. Basicamente, neste procedimento utilizam-se os parâmetros linearidade, repetitividade e reprodutibilidade, os quais foram selecionados com base em protocolos de validação já estabelecidos (SANCO, 2012; INMETRO, 2011; ICH, 2005). Neste procedimento simplificado são utilizados dados da rotina dos laboratórios, viabilizando a validação e revalidação de métodos para as áreas com grande número de ensaios, como é o caso dos laboratórios que analisam fertilizantes e corretivos. Segundo ÁVILA et al. (2004) para se avaliar a produção de informações laboratoriais há a necessidade da presença de, no mínimo, três contribuições: a ação do operador de laboratório, habilitado para executar a medição; a existência da metodologia referendada que descreva os passos a serem seguidos pelo operador na busca de uma medição e o instrumento, que possibilitará efetuar a medição, segundo a metodologia de posse do operador.

5. REQUISITO 5.6 - RASTREABILIDADE DE MEDIÇÃO Todos os equipamentos utilizados nos ensaios que tenham efeito significativo sobre a exatidão ou validade do resultado são obrigatoriamente calibrados. Os procedimentos operacionais internos devem incluir controle, calibração, instruções de uso e verificação intermediária dos equipamentos.

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O Lanagro-SP estabeleceu um programa de calibração e manutenção preventiva para os equipamentos de medição ou os que tenham impacto sobre a exatidão, como por exemplo, micropipetas, no qual estão definidos por equipamento, os pontos de calibração, os critérios de aceitação para cada ponto e qual a capacidade de medição que o laboratório da Rede Brasileira de Calibração deve ter para ser o fornecedor do serviço de calibração. Os certificados de calibração recebidos devem ser analisados criticamente antes da colocação dos equipamentos em uso. As verificações intermediárias são utilizadas para se verificar se o “status” de calibração está sendo mantido. Essas verificações fornecem ainda, subsídios para que se estabeleça a periodicidade das calibrações.

6. REQUISITO 5.7 -AMOSTRAGEM A amostragem do produto que será analisado muitas vezes é mais importante que a análise em si no que tange à garantia da qualidade dos resultados. No caso dos fertilizantes e corretivos, busca-se sempre que a amostragem possibilite que o objeto da análise no laboratório seja o mais representativo possível do produto que está sob fiscalização. Segundo PATNAIK (2004), a técnica de amostragem varia de acordo com a substância a ser analisada e suas características físicas, pois não há uma teoria de amostragem que possa ser generalizada. Partindo-se de um lote de produto, uma amostra composta relativamente grande é obtida, a qual é quarteada, obtendo-se uma fração para ser encaminhada ao laboratório. No caso dos laboratórios da Rede Nacional, a amostragem é de responsabilidade do SEFIA e é realizada segundo a Portaria. Instrução Normativa MAPA n° 10/2004 (BRASIL, 2004). No caso específico de fertilizantes, um dos problemas encontrados é a grande diversidade de matérias primas que podem ser utilizadas na sua composição. Esta diversidade gera produtos heterogêneos, especialmente, fertilizante mineral produzido com mistura de grânulos. A principal consequência desta realidade é a segregação de alguns elementos, fazendo com que a amostra coletada possa não representar os teores do produto. Para minimizar os problemas causados pela heterogeneidade do produto, não só a coleta, como também o preparo da amostra que consiste em quarteação, moagem e peneiramento devem ser realizadas seguindo-se cuidadosamente o procedimento descrito na IN n° 28/2007 (BRASIL, 2007b). De forma resumida, nas amostras fluidas, o preparo consiste apenas na homogeneização por agitação. Nas amostras sólidas, primeiramente é realizada a quarteação, separando-se uma fração para as análises físicas e outra para as análises químicas. Esta última porção é moída e passada em peneira de 0,3mm para corretivos, 0,5mm para fertilizantes orgânicos e 0,42 e 0,84mm

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para fertilizantes minerais visando uniformizar o tamanho das partículas.

7. REQUISITO 5.9 - GARANTIA DA QUALIDADE DOS RESULTADOS DE ENSAIO Segundo a ABNT NBR ISO/IEC 17025 (ABNT, 2005), o laboratório deve ter procedimentos de controle de qualidade para monitorar a validade dos ensaios. Os dados resultantes devem ser registrados de forma que as tendências sejam detectáveis e, quando praticável, devem ser aplicadas técnicas estatísticas para a análise crítica. Entre as ferramentas empregadas para o monitoramento da qualidade dos resultados, tem-se:a. uso regular de materiais de referência certificados e/ou controle interno da qualidade com materiais de referência secundários; b. participação em programas de comparação interlaboratoriais ou ensaios de proficiência;c. ensaios replicados, utilizando-se os mesmos métodos ou métodos diferentes.

A. MATERIAL DE REFERÊNCIA CERTIFICADO E/OU CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE Como já destacado, mesmo que todos os requisitos do sistema de gestão da qualidade estejam implantados, somente com controle interno da qualidade é que se pode assegurar que os resultados obtidos sejam confiáveis.

O controle interno da qualidade pode ser garantido segundo THOMPSON &WOOD (1995) pela inclusão de materiais de referência, também chamadas de amostras controle, nas “corridas analíticas”. Tais amostras devem, sempre que possível, ter a mesma composição da matriz, incluindo os tipos de analitos e suas concentrações. Por serem tratadas exatamente da mesma maneira que as amostras testadas, elas podem representar o desempenho do laboratório na execução da análise.

O ideal é que essas amostras controle sejam materiais de referência certificados (MRC), que são materiais de referência, acompanhados por um certificado, com um ou mais valores de propriedades, certificados por um procedimento que estabelece sua rastreabilidade (THOMPSON &WOOD, 1993).

Entretanto, tais amostras são caras para uso em rotina e não há disponibilidade no mercado de materiais de referência certificados para todo o escopo, especialmente fertilizantes orgânicos e organo-minerais. Além disso, os materiais de referência certificados tem sua composição descrita a partir de métodos que não necessariamente correspondem à fração determinada nos fertilizantes analisados no Brasil. Por exemplo, pela legislação brasileira, o teor “total” dos micronutrientes Zn, Cu, Fe e Mn é obtido com a extração em HCl e determinação por absorção atômica ou por emissão ótica com plasma

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indutivamente acoplado (ICP/OES). Um MRC utilizado com freqüência nos laboratórios que analisam fertilizantes é o NIST 695, que é um fertilizante com vários nutrientes e metais traço com valores certificados. Neste MRC, teor “total” de Zn foi determinado por fluorescência de raio X e por ativação neutrônica.

Para tornar possível a utilização de amostras controle em cada “corrida analítica”, podem ser utilizadas amostras de fertilizantes ou corretivos que já foram analisadas e apresentam homogeneidade. Uma das particularidades dos fertilizantes e corretivos é que em geral são produtos estáveis e que podem ser armazenados por longos períodos.

Essas amostras selecionadas podem ser analisadas junto com o material de referência certificado, para estabelecer o valor do mensurando. Outra opção é analisar o material candidato à amostra controle, junto com os ensaios de proficiência.

A partir do estabelecimento da amostra controle, incluir tal amostra em cada corrida e analisar o resultado criticamente. Caso o resultado saia dos limites estabelecidos na carta controle, todas as determinações obtidas na corrida devem ser descartadas e deve ser realizada uma análise crítica para verificar a causa do erro.

A inserção das amostras controle na rotina permite avaliar continuamente o desempenho dos analistas, metodologias e equipamentos em relação à exatidão e à precisão (repetitividade/reprodutibilidade); indica falhas e fontes contínuas de problemas (erro sistemático); auxilia na detecção da necessidade de treinamento, tornando-se ferramenta essencial na garantia da qualidade laboratorial.

B. ENSAIO DE PROFICIÊNCIAA participação do laboratório num ensaio de proficiência é importante

para que se verifique a consistência das atividades desenvolvidas, possibilitando avaliar seu desempenho por meio de comparações interlaboratoriais.

De acordo com THOMPSON et al (2006), em princípio, a validação do método e o controle interno de qualidade seriam suficientes para garantir a exatidão. Entretanto, o ensaio de proficiência é que garante se esses dois controles realizados internamente estão funcionando satisfatoriamente. Na validação de métodos, influências desconhecidas podem interferir no processo de medição e, como já comentado, os materiais de referência certificados não abrangem todos os ensaios. Laboratórios sem referência externa podem operar por longos períodos com tendência ou erros aleatórios, sendo o ensaio de proficiência uma maneira eficaz de detectar tais problemas.

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Os Programas de Ensaios de Proficiência permitem:- determinar o desempenho individual dos laboratórios para os ensaios propostos;- monitorar continuamente o desempenho dos laboratórios participantes;- proporcionar subsídios aos laboratórios para a identificação e solução de problemas analíticos;- agregar valor ao controle de qualidade dos laboratórios participantes;- estabelecer a efetividade e a comparabilidade de novos métodos de medição;- atribuir valores para materiais de referência e avaliar sua adequação para utilização em ensaios específicos ou procedimentos de medição.

No caso da Rede Nacional, tem-se o Programa de ensaios de proficiência em análises de fertilizantes e corretivos que avalia a maior parte do escopo de fertilizantes minerais e corretivos. Este Programa é organizado pelo MAPA, abrangendo atualmente 13 laboratórios.

O Programa de Ensaio de Proficiência do MAPA foi organizado de maneira que os resultados dos ensaios sejam avaliados por método. Essa especificidade, do Ensaio de Proficiência em avaliar o desempenho dos laboratórios por método, é devida à obrigatoriedade dos Lanagros em realizar análises periciais nos fertilizantes que apresentem resultados fora da garantia declarada pelo produtor nas análises fiscais. Caso a empresa produtora solicite a análise pericial, ela pode escolher o método de análise desde que, o método esteja incluído na IN SDA n°28/2007 (BRASIL, 2007b) e que a empresa comprove que é o método utilizado no seu controle de rotina.

Sendo assim, os laboratórios que realizam as análises periciais executam mais de um método para determinar o mesmo mensurando. Tal fato implica na necessidade de comparações interlaboratoriais que permitam a avaliação dos resultados obtidos por método de ensaio.

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Tabela 1. Escopo do Programa de Ensaios de Proficiência em análises de fertilizantes e corretivos do MAPA

1. IN SDA/MAPA n.º 28/2007 (BRASIL, 2007b).

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Anualmente são realizadas três rodadas do Ensaio de Proficiência do MAPA, cobrindo 36 ensaios, sendo 26 em fertilizantes minerais, 7 em corretivos de acidez e 3 em fertilizantes orgânicos.

C. ENSAIOS REPLICADOS, UTILIZANDO-SE OS MESMOS MéTODOS OU MéTODOS DIFERENTES

No caso de fertilizantes e corretivos, as amostras analisadas apresentam uma larga faixa de concentrações garantidas pelos produtores. O teor de N, por exemplo, pode variar de 0,1% a 45%.

Quando o resultado encontrado indica que o produto está com teores abaixo dos declarados pelo produtor, ou, apresentam valores dentro da garantia, porém, muito acima do declarado, realiza-se o reensaio, que pode ser feito pelo mesmo método, ou pelo mesmo analista, desde que não seja realizado no mesmo dia. No Lanagro/SP, o recomendado é reanalisar a amostra utilizando-se outro método e/ou outro analista.

LITERATURA CITADA

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS (ABNT). ABNT NBR ISO/IEC Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração,. Rio de Janeiro, 2005. 31 p.

ÁVILA, A. K.; ARAÚJO T. O.; COUTO, P.; BORGES, R. M. H. Comparação Interlaboratorial de Constituintes Menores e Traços em Soro Humano: Estimativa da Incerteza de Medição.2004. Revista Analytica. São Paulo,n. 13, Out./Nov, 2004. Disponível em: http://www.revistaanalytica.com.br/ed_anteriores/13/comparacao.pdf. Acesso em: 20 ago 2012.

BRASIL, Lei nº 6.894 de 16 de dezembro de 1980. Dispõe sobre a inspeção e fiscalização da produção e do comércio de fertilizantes, corretivos, inoculantes, estimulantes ou biofertilizantes, destinados à agricultura, e dá outras providências. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 17 dez. 1980. Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/vegetal/fertilizantes/legislacao>. Acesso em: 20 ago. 2012.

BRASIL, Decreto nº 4.954, de 14 de janeiro de 2004, Aprova o Regulamento da Lei no 6.894, de 16 de dezembro de 1980, que dispõe sobre a inspeção e fiscalização da produção e do comércio de fertilizantes, corretivos, inoculantes ou biofertilizantes destinados à agricultura, e dá outras providências. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 15 jan. 2004. Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/vegetal/fertilizantes/legislacao> . Acesso em: 20 ago. 2012.

BRASIL, Instrução Normativa Mapa nº 10, de 6 de maio de 2004, Aprova as disposições sobre a classificação e os registros de estabelecimentos e produtos, as exigências e critérios para embalagem, rotulagem, propaganda e para prestação de serviço, bem como os procedimentos a serem adotados na inspeção e fiscalização da produção, importação, exportação e comércio de fertilizantes, corretivos, inoculantes e biofertilizantes, destinados à agricultura. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 12 mai. 2004. Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/vegetal/fertilizantes/legislacao> . Acesso em: 20 ago. 2012.

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BRASIL, Instrução Normativa nº 1, de 16 de janeiro de 2007. Estabelecer os critérios para credenciamento, reconhecimento, extensão de escopo e monitoramento de laboratórios no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, de forma a integrarem a Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária, constantes do Anexo à presente Instrução Normativa. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 17 jan. 2007. Disponível em: <http://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.do?method=abreLegislacaoFederal&chave=50674&tipoLegis=A> . Acesso em: 20 ago. 2012.

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CAPÍTULO III

QUALIDADE ANALÍTICA E A RASTREABILIDADE DOS RESULTADOS PARA FERTILIDADE DO SOLO

Heitor Cantarella1

1Pesquisador Científico. Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Av. Barão de Itapura, 1481, Caixa Postal 28, 13020-902 Campinas, SP. E-mail: cantarella@iac.sp.gov.br

RESUMO As análises de solo para fertilidade estão entre as mais largamente empregadas na agricultura. Centenas de laboratórios públicos e privados prestam esse serviço no Brasil. Ensaios de proficiência (EP) como o do IAC e de outras instituições brasileiras têm colaborado para a melhoria da qualidade dos serviços. A maior parte dos laboratórios que operam na região Centro-Sul do Brasil é privada. Os preços praticados no mercado são relativamente baixos e normalmente comprometem investimentos em equipamentos e mão-de-obra. Há grande discrepância na qualidade dos resultados analíticos apresentados por laboratórios, mas, a maior parte oferece serviços de valor para o agricultor.

PARTICIPAÇÃO EM ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA, QUALIDADE ANALÍTICA E RASTREABILIDADE As análises de solo para fins de fertilidade são amplamente utilizadas por agricultores do mundo todo para orientar a calagem e a adubação de solos agrícolas. São as determinações químicas realizadas em maior número na agricultura. Uma amostragem parcial de até 80 laboratórios (Tabela 1) que participaram do Ensaio de Proficiência IAC (EP) em 2011 indicou que mais de 1 milhão de amostras foram realizadas para as determinações básicas (pH, H+Al, Ca, K, P, matéria orgânica). A maioria das amostras foi processada em laboratórios paulistas, refletindo o fato de que 70% dos laboratórios que participam desse EP são do Estado de São Paulo. É provável que no Brasil mais de 2 milhões de amostras sejam analisadas anualmente. Recentemente, tem havido grande interesse também para a análise de solo para fins ambientais, ou seja, para as determinações de elementos poluentes, o que aumenta as preocupações com a qualidade dos resultados.

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Tabela 1. Número de amostras de solo analisadas por laboratórios participantes do Ensaio de Proficiência IAC em 2011.

PERFIL DOS LABORATÓRIOS DE ANÁLISE DE SOLO Existem cinco ensaios de proficiência em funcionamento no Brasil: ROLAS no Rio Grande do Sul e Santa Catarina, CELA no Paraná, PROFERT em Minas Gerais, PAQLF, que congrega os laboratórios da Embrapa e laboratórios que utilizam a extração de P com Mehlich em todo o Brasil, e o Ensaio de Proficiência IAC, para laboratórios que utilizam os métodos baseados na resina de troca iônica (Cantarella et al., 2001b). Esse texto fará referência principalmente aos dados gerados no EP do IAC pois não há dados recentes publicados dos outros programas. Atualmente há 116 laboratórios participando do EP do IAC (Figura 2), 80% dos quais privados. No passado, a maior parte dos laboratórios de análise do solo era ligada a instituições públicas devido ao alto custo de implantação dos laboratórios e às políticas de incentivo ao uso da análise do solo para modernizar a agricultura. Esse cenário mudou bastante e hoje, a porcentagem de laboratórios privados no EP do IAC é, provavelmente, maior do que aquela dos outros programas interlaboratoriais. No entanto, a tendência de maior participação do setor privado nessa atividade é clara em todo o Brasil.

Figura 1. Número e tipo de laboratório de análise de solos participantes do Ensaio de Proficiência IAC em 2011.

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Há uma variedade de perfis de instituições que controlam laboratórios de análise de solo. No EP do IAC, o maior grupo é de laboratórios independentes – 37% do total, que são geralmente pequenas empresas cuja principal atividade gira em torno da análise de solo e/ou outras análises para fins agrícolas; laboratórios ligados a empresas representam 22%; outras constituições incluem associações de produtores, cooperativas e laboratórios ligados a instituições de ensino e pesquisa (Figura 2). Atualmente, a maior parte dos laboratórios (54%) oferece análises completas (básica, micronutrientes e granulometria), evidenciando a demanda por agricultores de informações mais detalhadas (Figura 3). O quadro de prestação de serviços de análise de solo no Brasil, a julgar que os dados do EP do IAC sejam representativos do resto do País, indica uma crescente profissionalização do setor e a busca por oferecer análises diversificadas. Uma constante reclamação dos laboratórios, no entanto, é com os preços cobrados pelas análises de solo, considerados muito baratos. Uma análise básica, que compreende sete ou oito determinações independentes, custa, para o cliente, em torno de R$20,00. Esse valor dificilmente remunera adequadamente um laboratório que conte com equipamentos modernos e pessoal bem treinado e pago. Embora o mercado seja livre, há dificuldade em atualizar preços. Os preços de análises de solo têm sido tradicionalmente baixos desde os tempos em que a maior parte dos laboratórios era do setor público e havia subsídio para incentivar os agricultores a usar o serviço. O mercado se acostumou com o baixo preço e há dificuldade em mudar a situação. Além disso, ainda há muitos laboratórios públicos e ou ligados a cooperativas, os quais nem sempre contabilizam todos os custos no preço das análises. Por fim, existe grande concorrência no setor.

Figura 2. Perfil dos laboratórios participantes do Ensaio de Proficiência IAC em 2011.

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Figura 3. Tipo de análise realizada pelos laboratórios que participaram do Ensaio de Proficiência IAC em 2011.

Um ponto importante é que a baixa remuneração inibe investimentos em equipamentos sofisticados e mão de obra mais qualificada, o que, indiretamente, pode afetar a qualidade dos resultados, especialmente para pequenos laboratórios privados. Não há solução fácil para a questão dos preços, embora pareça haver espaço para uma melhor remuneração do serviço. A análise de solo é usada principalmente para auxiliar na definição da adubação e da calagem, as quais representam cerca de 20 a 30% do custo de uma lavoura. Assim, o investimento na análise é muito pequeno em relação aos benefícios.

QUALIDADE ANALÍTICA Os atributos químicos avaliados na análise de solo são, em sua maioria, frações dos teores totais, dependentes dos procedimentos adotados. Por exemplo, a oxidação do C do solo não é completa nos procedimentos para a determinação do teor de matéria orgânica (ou carbono orgânico); um fator de correção é necessário. Os teores trocáveis de Ca, K, Mg, Al, Na representam frações do total desses elementos, adsorvidas por troca iônica aos colóides do solo; para o P, determina-se uma fração “disponível” para as plantas, estreitamente ligada com o processo de extração (Raij et al., 2001, Silva et al., 2009). Com isso, os resultados analíticos são mais sujeitos a variações pois não há, em geral, um valor único a que se deve chegar (por exemplo, o teor total). São escassas as amostras de referência para os atributos químicos medidos em solos para fins de fertilidade. Nesse contexto, os procedimentos visando padronização e qualidade ganham importância.Além das boas práticas laboratoriais - não discutidas nesse texto; vide Klesta e Bartz (1996) - a participação em ensaios de proficiência é uma importante

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medida visando a qualidade analítica. O EP do IAC distribui 12 diferentes amostras por ano ao laboratórios participantes, quatro com três repetições e oito que são analisadas apenas uma vez (total 20 amostras por ano). Com isso é possível estimar índices de exatidão e de precisão para cada laboratório. Bimensalmente os laboratórios entregam resultados de quatro amostras e recebem relatórios que lhes possibilitam comparar seus resultados com aqueles dos demais laboratórios e seus posicionamentos dentro de um intervalo de confiança calculado com base em valor mais provável obtido com base no conjunto de resultados. Os métodos estatísticos usados estão descritos em Quaggio et al. (1994). Avaliações globais dos laboratórios, por meio de um índice de excelência, são realizadas com base nos resultados do ano todo. Essas são feitas com base em grande número de observações. Por exemplo, em 2011, cerca de 100 laboratórios analisaram 20 amostras nas quais foram feitas nove determinações independentes. As estatísticas para a avaliação dos laboratórios são calculadas, portanto, com cerca de 1800 observações (Quaggio et al., 1994).

Tabela 2. Porcentagem das amostras do conjunto analítico básico analisadas durante o ano de 2011 (20 amostras por ano) que ficaram fora do intervalo de confiança (IC) estabelecido (receberam pelo menos 1 asterisco). Os resultados estão estratificados de acordo com os conceitos recebidos pelos laboratórios

Tabela 3. Porcentagem das amostras do conjunto analítico de micronutrientes analisadas durante o ano de 2011 (20 amostras por ano) que ficaram fora do intervalo de confiança (IC) estabelecido (receberam pelo menos 1 asterisco). Os resultados estão estratificados de acordo com os conceitos recebidos pelos laboratórios

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O desempenho dos laboratórios participantes do EP é bastante variável, como pode ser observado pelo exame da porcentagem de amostras analisadas pelos laboratórios que ficam fora do intervalo de confiança (IC), proxi para resultado correto (Tabela 2 e Tabela 3). Na média de todos os laboratórios, 8% das determinações ficam fora do IC, mas, esse número é muito maior - 16% - para a determinação do S-SO4

2-. Por outro lado, os melhores laboratório (com conceito A) têm apenas 3% fora do IC e os piores (conceito C e D) têm cerca de 20% fora do IC (Tabela 2). O mesmo se aplica às determinações de micronutrientes (Tabela 3) De modo geral, laboratórios que têm desempenho satisfatório em um conjunto analítico também o têm nos demais. Por exemplo, 55% do laboratórios que conseguiram conceito A nas análises básicas também o conseguiram nas determinações de micronutrientes; nenhum laboratório com conceito A ou B nas análises básicas ficou com conceito C ou D em micronutrientes (Figura 4). Estatísticas semelhantes têm sido calculadas todos os anos no EP IAC, com resultados semelhantes. A participação em um EP traz benefícios individuais para o laboratório, por permitir identificar falhas e, eventualmente corrigi-las, mas, também permite que a população de laboratórios melhore com o tempo. Houve uma sensível melhora nos resultados médios dos laboratórios que analisam granulometria entre os anos 2000 e 2011 (Figura 5). Em 2000 teve início a avaliação de granulometria (argila, silte e areia total) no EP IAC. No primeiro ano apenas 15% dos laboratórios conseguiram conceito A; por outro lado, 24% ficaram com o conceito D. Onze anos depois, 46% dos laboratórios conseguiram atingir o conceito A e 14% ficaram com nota D (Figura 5). A Tabela 4 mostra o desempenho anual de dois laboratórios, comparado-o com a média de toda a população de laboratórios e com os melhores. O laboratório 39 teve 5% das determinações de P e 45% das determinações de matéria orgânica fora do IC, mas, teve resultados muito satisfatórios em todos os outros atributos analisados na rotina básica, ou seja, esse laboratório teve um problema de qualidade localizado (em matéria orgânica). Fica claro para qual determinação o responsável pelo laboratório deve dirigir sua atenção. Por outro lado, o laboratório 58 teve altos índices de resultados insatisfatórios em MO, pH, H+Al e S (mas não teve problemas em P, uma determinação em que os erros costumam ser mais elevados do que nas demais). A correção de problemas no laboratório 58 deverá envolver múltiplas determinações.

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Figura 4. Comparação entre porcentagem de laboratórios com conceitos A, B, C e D (A e B são mais bem classificados) para análises básicas e para granulometria.

Figura 5. Evolução dos conceitos obtidos pelos laboratórios de análise de solo participantes do Ensaio de Proficiência IAC entre 2000 e 2011 para as determinações de granulometria.

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Tabela 4. Desempenho de dois laboratórios participantes do Ensaio de Proficiência IAC com a média de todos e com a média dos melhores laboratórios. Valores se referem à porcentagem de amostras analisadas durante o ano no Ensaio de Proficiência que ficaram fora do intervalo de confiança (IC) estabelecido para cada determinação.

Os laboratórios com conceitos A e B, de acordo com as normas do EP, recebem um selo no ano seguinte, válido por um ano. Os selos foram introduzidos no EP em 1989, por demanda dos laboratórios participantes, que desejavam ser identificados junto aos clientes com tendo um diferencial por sua preocupação com qualidade. Os selos de EP ou programas interlaboratoriais não substituem credenciamentos ou acreditações por órgãos oficiais; porém, na época em que os selos foram criados, nenhum entidade fornecia acreditação no Brasil para laboratórios de análise de solo para fins agrícolas. A participação em EPs é geralmente uma das condições para a obtenção da acreditação oficial, mas, os selos provavelmente deixarão de ter sua função atual à medida que os laboratórios se qualifiquem em processo de acreditação.

AFERIÇÃO DA QUALIDADE NO DIA-A-DIA Os EPs são importantes ferramentas para a melhoria e a manutenção da qualidade de laboratórios, mas, a frequência com que amostras interlaboratoriais são analisadas é baixa e os resultados, que permitem correções de rumo, são recebidos em intervalos de tempo às vezes longos. Portanto, atividades de aferição diárias de qualidade são necessárias. Cuidados especiais devem ser tomados com a qualidade dos reagentes empregados. Nem sempre a caracterização trazida na embalagem é fidedigna. Além disso, contaminantes presentes em pequenas quantidades em alguns reagentes podem ser importantes para algumas determinações, mas, insignificantes para outras (Cantarella et al., 1981; Cantarella et al., 2001a). Há pouca disponibilidade de amostras de referência para as determinações analíticas ligadas à fertilidade do solo. Quando disponíveis, são caras. O EP IAC disponibiliza amostras com resultados conhecidos, oriundas de avaliações no próprio programa interlaboratorial, que podem substituir em parte

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amostras de referência para a checagem periódica do desempenho analítico. Tais amostras devem ser incluídas entre as amostras desconhecidas toda vez que essas foram analisadas. Uma maneira de acompanhar o desempenho do laboratório é por meio de uso de cartas controle com as amostras de referência (Figura 6). O exame da série da dados obtidos ao longo do tempo permite não só detectar erros pontuais mas, também, tendências e erros sistemáticos. O ideal é que o laboratório tenha várias amostras com valores conhecidos sendo analisadas diariamente. Para isso, o laboratório pode preparar suas próprias amostras-controle, escolhendo amostras de solos com diferentes características químicas (para garantir variabilidade nos resultados analítico). A determinação dos valores mais prováveis e do intervalo de erro aceitável deve ser feita com base em grande número de determinações, em dias diferentes, e acompanhadas de amostras com valores conhecidos (amostras de referência ou amostras provenientes de EPs). Sugestões de como preparar tais amostras são apresentadas por Cantarella et al. (2001a) e Cantarella e Quaggio (2009).

Figura 6. Exemplo de carta-controle para os resultados da determinação, por cerca de um mês, de Mg em uma amostra-controle. Dois intervalos de confiança são definidos: (a) faixa ideal, entre os limites de precaução superior e inferior e (b) faixa de aceitação dos resultados, entre os limites de rejeição superior e inferior. Os limites de precaução e de rejeição foram definidos como (média ± 1s) e (média ± 2s) respectivamente (Fonte: Cantarella et al., 2001a).

ERROS PERCEBIDOS, ERROS REAIS E EFEITO SOBRE RECOMENDAÇÕES DE ADUBAÇÃO A maior fonte de variação em análise de solo ocorre na etapa de amostragem no campo. O solo é um material heterogêneo por natureza e a obtenção de amostra e representativa é sempre um desafio. Desse modo, comparações de resultados entre amostras retiradas em períodos diferentes devem sempre ser feitas com cuidado. O erro ou variabilidade de resultados

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no laboratório também não é desprezível. Uma matriz complexa como o solo, somado a determinações de índices cujos valores numéricos dependem fortemente dos extratores e das condições analíticas, contribuem para que os resultados apresentam variação maior do que quando se analisam materiais homogêneos. Muitas vezes, a variabilidade de resultados em uma mesma amostra analisada em laboratórios distintos gera inseguranças e dúvidas quanto à qualidade e à utilidade da análise. Com alguma frequência esse autor recebe reclamações de que amostras enviadas para diferentes laboratórios (com selos do EP) produziram resultados discrepantes. Em alguns casos, a variabilidade é decorrente de erros reais ou de falta de qualidade. Nesses casos, as interpretações dos resultados, e, por consequência as recomendações de calagem e adubação delas derivadas são muito diferentes, com riscos de prejuízos ao cliente. Suspeita-se que alguns laboratórios ajam com mais cuidado com as amostras do programa interlaboratorial do que com as de clientes. Tal tratamento especial às amostras do EP é indevida e faz com que a avaliação recebida não reflita a qualidade percebida pelo cliente. A pressão para a obtenção e manutenção do selo do EP pode também levar alguns responsáveis por laboratórios a ações fora das normas do EP. Nem sempre é possível detectá-las. A preocupação com a representatividade do EP fez com que um teste paralelo fosse executado. Realizou-se um teste cego no qual os laboratórios não sabiam a origem das amostras e não poderiam identificá-las como sendo de um programa interlaboratorial. Cinco amostras foram enviadas para 50 laboratórios participantes do EP, em nome de terceiros, e pagas. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos pelos 50 laboratórios no EP. O estudo (Agbenin e Cantarella, 2011) indicou que mais de 90% dos laboratórios obtiveram resultados satisfatórios pelo índice Z-score (um método diferente daquele usado no EP) em todos os atributos químicos comparados, atestando uma capacidade analítica razoavelmente alta, exceto por dois ou três laboratórios, o que é compatível com os resultados do EP. No entanto, alguns laboratórios parecem ter menor cuidado com as amostras do teste cego em comparação com as do EP, que determinam a obtenção ou não do selo (Abgenin e Cantarella, 2011). Em alguns casos os usuários da análise de solo não têm a correta percepção da variabilidade natural dos resultados e reclamam de valores diferentes mas que estão, na realidade, dentro da faixa de variação normal. Por exemplo, um resultado de P-resina pode ser o dobro de outro (3 e 6 mg/dm3), mas, mesmo assim, ambos podem estar na mesma faixa de interpretação, nesse caso, valores “muito baixos” para fins de recomendação de adubação fosfatada. Cantarella et al. (2006), utilizando 20 amostras analisadas por 84 laboratórios comerciais, estimaram as discrepâncias entre laboratórios

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e simularam as implicações dessas para a recomendação de fertilizantes. Em 74% dos casos, a recomendação de calagem calculada com os resultados analíticos dos 84 laboratórios atingiu o objetivo de elevar a saturação por bases para 70±8%. Em cerca de 90% dos casos as recomendações de adubação com P e K foram próximas dos resultados esperados. Em apenas 5% dos casos as doses de P e K calculadas a partir de resultados com erros laboratoriais afetariam a produtividade e o retorno econômico para a cultura do milho. Todos os esforços devem ser feitos, tanto pelos responsáveis pelos laboratórios quando pelos coordenadores de EPs, para reduzir erros e garantir a qualidade analítica dos laboratórios de análise de solo. Há laboratórios operando com qualidade duvidosa, o que não atende as necessidades de seus clientes. Porém, alguns dos resultados aqui mostrados indicam que há uma preocupação com a melhoria da qualidade e que a maior dos laboratórios oferece serviços de grande valor para o agricultor.

REFERÊNCIAS

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CANTARELLA, H.; DECHEN, A.R.; RAIJ, B. van. Influência da origem do cloreto de potássio utilizado em extrações de amostras de solos nos resultados de alumínio trocável. Bragantia,10:189-192, 1981.

CANTARELLA, H.; QUAGGIO, J.A.; ANDRADE, J.C. Controle de qualidade dos resultados analíticos. pp. 142-163. In: RAIJ, B. van; ANDRADE, J.C.; CANTARELLA, H.; QUAGGIO, J.A. (Eds) Análise Química para Avaliação da Fertilidade de Solos Tropicais. Campinas: Instituto Agronômico, 2001(a). 285p

CANTARELLA, H.; QUAGGIO, J.A.; RAIJ, B. van; ABREU, M.F. Variability of soil analysis in commercial laboratories: implications for lime and fertilizer recommendations. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 37:2213-2225, 2006.

CANTARELLA, H.; WIETHÖLTER, S.; BERNARDI, A.C.C.; VITTI, G.C.; CANTARUTTI, R. B.; MUNIZ, A.S.. Programas de avaliação de qualidade das análises de solo e de planta no Brasil. Viçosa: Boletim Informativo da Sociedade Brasileira de Ciência do Solo. 26(1):20-24, SBCS, 2001(b).

KLESTA, E.J.; BARTZ, J.K. Quality assurance and quality control. pp. 19-48. In: BARTELS, J.M.; BIGHAM, J.M. (Eds.). Methods of Soil Analysis. Part 3. Chemical Methods. Madison: Soil Science Society of America, 1996.

QUAGGIO, J.A.; CANTARELLA, H. & RAIJ, B. van. Evolution of the analytical quality of soil testing laboratories integrated in a sample exchange program. Commun. Soil Sci. Plant Anal., New York, 25(7&8): 1007-1014, 1994

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RAIJ, B. van; ANDRADE, J.C.; CANTARELLA, H.; QUAGGIO, J.A. Análise Química para Avaliação da Fertilidade de Solos Tropicais. Campinas: Instituto Agronômico, 2001. 285p.

SILVA, F.C., ABREU, M.F. de, PEREZ, D.V., EIRA, P.A., ABREU, C. A., RAIJ, B. van, GIANELLO, C., COELHO, A.M., QUAGGIO, J.A., TEDESCO, M.J., SILVA, C.A., CANTARELLA, H., BARRETO, W.O. Métodos de análises químicas para avaliação da fertilidade do solo. pp. 107-189. In: SILVA, F.C. (Ed) Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. 2a. Edição Revista e Ampliada. Brasília: Embrapa, 2009.

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CAPÍTULO IV

AÇÕES DO PNCRC/MAPA NA ÁREA DE CONTAMINANTES INORGÂNICOS

Helena Müller Queiroz1

1 Laboratório Nacional Agropecuário – Lanagro-SP, Rua Raul Ferrari, s/n , 13100-105 Campinas - SP, Brasil (helena.queiroz@agricultura.gov.br)

RESUMO Para garantir o alimento seguro os governos precisam considerar dois aspectos estratégicos: saúde pública nacional e competitividade no comércio internacional. Um componente fundamental de qualquer programa que visa garantir a segurança do alimento é o controle e monitoramento de resíduos e contaminantes na produção de alimentos. Atualmente, os Lanagros (Laboratórios Nacionais Agropecuários) realizam as análises oficiais relativas aos programas de investigação e monitoramento e na pesquisa e desenvolvimento de métodos analíticos, provendo recomendações técnicas na elaboração de guias e normativas, negociações internacionais e na avaliação de outros laboratórios. Os Lanagros trabalham com sistema de gestão da qualidade em conformidade com a ISO/IEC 17025 e já possuem grande parte do escopo acreditado. Uma das áreas de relevância no Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (PNCRC/MAPA) é a área de contaminantes inorgânicos. Muitas ações vêm sendo tomadas nos últimos anos para preparar os Lanagros na resposta às crises relacionadas à presença de resíduos e contaminantes em alimentos, com a velocidade e confiabilidade requeridas em situações emergenciais. Esse texto relata tais ações, pesquisas e tendências adotadas no âmbito da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários, com ênfase na área de contaminantes inorgânicos, na busca da concretização da missão do MAPA “Prover o desenvolvimento sustentável e a competitividade do agronegócio em benefício da sociedade brasileira”.

PALAVRAS CHAVES: contaminantes inorgânicos, equivalência, ISO/IEC 17025, Lanagro, PNCRC.

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REVISÃO DA LITERATURA A segurança do alimento abrange dois aspectos estratégicos: saúde pública nacional e competitividade no comércio internacional.

Atualmente o mercado interno consome cerca de dois terços da produção dos diversos produtos do agronegócio (Contini, 2012), o que ressalta a necessidade de adoção de medidas que assegurem a segurança do alimento ofertado ao consumo.

Contudo, nas últimas duas décadas, as exportações do agronegócio têm exercido um papel de destaque na economia brasileira. O saldo do comércio internacional do agronegócio expandiu de US$ 11 bilhões em 1989 para US$ 77,5 bilhões em 2011 (615 %) o que consolidou a posição ocupada pelo agronegócio como principal setor responsável pelo bom desempenho do saldo da balança comercial brasileira.

Outro fator de grande importância em relação ao crescimento das exportações do agronegócio brasileiro é a diversificação do mercado de destino. Em 2000, o agronegócio brasileiro exportou para 186 destinos; já em 2011, foram 214 (Contini, 2012). Dessa forma, o Brasil, na posição de maior produtor e fornecedor de algumas commodities para muitas regiões do mundo, tem como dever garantir que os produtos comercializados estejam de acordo com os critérios de segurança e qualidade exigidos pelos consumidores (Mauricio, 2009).

Paralelamente aos recentes avanços tecnológicos e ao aumento nos volumes de produção e consumo de alimentos, há uma crescente demanda relativa ao desempenho dos laboratórios oficiais, principalmente, no sentido de que os mesmos sejam completamente capazes de manter sua evolução tecnológica e analítica em consonância com as legislações relativas à segurança do alimento elaboradas pelos governos de todo o mundo. Isso também requer uma nova abordagem do controle oficial, no qual a atividade laboratorial é integrada e fundamental nas operações de fiscalização. Dessa forma, os laboratórios passam a atuar diretamente na verificação e validação das etapas dos sistemas de processamento e produção de alimentos, sendo responsáveis por fornecer avaliações científicas, no lugar de simplesmente fornecer relatórios de ensaio (Mauricio, 2012).

Essas pressões fizeram com que o governo brasileiro reorganizasse o Sistema Laboratorial do MAPA, com o objetivo de atualizar e aprimorar as atividades analíticas e de fiscalização relacionadas à saúde e defesa animal e vegetal. Ainda, a rede nacional de laboratórios foi estabelecida com a responsabilidade de conduzir estudos e ensaios no sentido de avaliar a conformidade das etapas da cadeia produtiva de alimentos nacional e compreende os laboratórios oficiais e laboratórios credenciados (Mauricio, 2012).

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Atualmente a rede compreende seis Laboratórios Nacionais Agropecuários, formalmente criados, em 2005, por meio do Decreto n. 5351 e designados como laboratórios oficiais do MAPA pelo Decreto Presidencial n. 5741, em 2006.

As atividades dos Lanagros incluem:• Análises oficiais;• Ensaios para inspeção e monitoramentos para outros

propósitos legais;• Auditoria em Laboratórios;• Pesquisa e desenvolvimento de métodos analíticos;• Elaboração de revisão da legislação e guias técnicos;• Participação em negociações internacionais.

Além disso, foram introduzidos nos Lanagros os estudos exploratórios relativos à antecipação de riscos emergentes numa abordagem proativa focada na resposta rápida e preparo ao atendimento de situações de emergência (Mauricio, 2012).

Um componente fundamental de qualquer programa que visa garantir a segurança do alimento é o controle e monitoramento de resíduos e contaminantes. Assim, uma importante ferramenta para monitorar de perto e garantir a adequação dos produtos brasileiros aos padrões internacionais é o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes – PNCRC/MAPA (Mauricio, 2009). O Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes – PNCRC é um programa federal de inspeção e fiscalização de alimentos, baseado em análise de risco, que verifica a presença de substâncias químicas potencialmente nocivas à saúde do consumidor, como resíduos de medicamentos veterinários, de agrotóxicos ou afins, de contaminantes ambientais (ex: aflatoxinas) e de contaminantes inorgânicos. Os objetivos principais do PNCRC são: a. verificar e avaliar as boas práticas agropecuárias (BPA), as boas práticas de fabricação (BPF) e os autocontroles ao longo das etapas das cadeias agroalimentares; b. verificar os fatores de qualidade e de segurança higiênico-sanitária dos produtos de origem animal e vegetal, seus subprodutos e derivados de valor econômico e dos produtos importados; c. fornecer garantias de um sistema que provê alimentos seguros e inócuos aos consumidores, além disso, que esse sistema seja equivalente aos requisitos sanitários internacionais estabelecidos pelo MERCOSUL, CODEX, OMC, e órgãos auxiliares (FAO, OIE, WHO) (MAPA, 1999).

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A Equivalência de Sistemas é uma forma de prover o reconhecimento e garantia mútuos entre os países facilitando as relações comerciais. Ela é demonstrada pelo atendimento aos preceitos do Acordo de Medidas Sanitárias e Fitossanitárias – SPS e a conformidade aos parâmetros do Codex Alimentarius, no caso de alimentos.

O Acordo SPS é um conjunto de medidas que estabelecem as regras básicas dos padrões para garantir a segurança dos alimentos e saúde animal e vegetal. O acordo não impede que os países tenham seus próprios padrões, desde que eles tenham fundamentação científica e não sejam utilizados como forma de discriminar países com condições idênticas ou similares. Ele ainda estimula a harmonização de critérios pela adoção dos guias, recomendações e padrões internacionais (FAO, Codex Alimentarius, OMC, OIE, OMS etc.), uma vez que os mesmos são resultado de exames detalhados realizados por especialistas e são revisados freqüentemente à luz da evolução científica.

A União Européia (EU) reconheceu a equivalência do Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC/Animal) do Brasil para os programas setoriais: bovinos, aves, eqüinos, pescado e mel, por meio da Decisão de Execução da Comissão, n. 21, de junho de 2012. A equivalência é publicada anualmente como resultado das diversas avaliações documentais e auditorias realizadas pelo Food and Veterinary Office – FVO (Comissão Européia, 2012). Os procedimentos de avaliação de equivalência são executados por todos os países com os quais o Brasil possui relações comerciais. No ano passado, considerando apenas os Lanagros, foram recebidas mais de cinco auditorias externas para a área de Resíduos e Contaminantes (FSIS/USA e DG/SANCO/EU) e, em 2012, já foram recebidas ao menos três (FSIS/USA, DG/SANCO/EU e Federação Russa).

As recomendações do Codex Alimentarius para o planejamento e implementação de Programas Oficiais Nacionais para Garantir a Segurança dos Alimentos estão descritas no documento CAC/GL 71-2009 (Codex, 2009). No caso de laboratórios envolvidos no controle oficial de alimentos, as recomendações do Codex Alimentarius são: adequação à ISO/IEC 17025, participação em ensaios de proficiência, validação de métodos em consonância com as orientações da Comissão do Codex e o uso dos procedimentos de controle de qualidade interno descritos no Guia harmonizado para controle de qualidade interno em laboratórios de química analítica (Codex Alimentarius, 1997 e IUPAC, 1995).

Atualmente, todos os Lanagros possuem escopos acreditados na ISO/IEC 17025:2005 pelo organismo de acreditação nacional, INMETRO. Em 2011, foram 40 métodos acreditados, sendo que 38% dos mesmos foram relativos aos métodos para a determinação de contaminantes inorgânicos em alimentos e alimentos para animais.

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Os métodos analíticos utilizados na área de resíduos e contaminantes seguem rígidos protocolos de validação e controle de qualidade interno. No final de 2011, foi publicado o Manual de Garantia da Qualidade Analítica (MAPA, 2011 b) que reuniu conceitos, procedimentos e critérios de aceitação tecnicamente e metrologicamente fundamentados e em consonância com os requisitos internacionais. Este guia trata de forma harmonizada os assuntos: validação de métodos, cálculo de incerteza e garantia da qualidade analítica. E ainda, quando necessário, esse documento particulariza os tratamentos a serem aplicados a ensaios específicos como resíduos de drogas veterinárias, resíduos de pesticidas, contaminantes inorgânicos e micotoxinas, respeitando as características individuais de cada técnica.

A manutenção da proficiência nos métodos validados e acreditados é comprovada pela participação dos laboratórios da rede oficial em ensaios de proficiência. Entre 2011 e 2012, considerando os seis Lanagros responsáveis pelas determinações de contaminantes inorgânicos, foram 11 participações, com 16 resultados satisfatórios (100% dos resultados).

Em relação aos ensaios de proficiência dois pontos importantes devem ser ressaltados: a publicação do Guia orientativo para importação de insumos para a Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (MAPA, 2010) e o PRIMAR (Programas Interlaboratoriais e Materiais de Proficiência).

O Guia orientativo supracitado (MAPA, 2010) sistematizou os procedimentos necessários para a importação dos ensaios de proficiência e foi resultado de vários ajustes entre os órgãos anuentes (Receita Federal, MAPA e ANVISA). Por se tratar de um assunto interinstitucional, muitas etapas e ajustes ainda deverão ser realizados, mas a iniciativa do MAPA promovida pela área de Resíduos e Contaminantes em Alimentos da Coordenação Geral de Apoio Laboratorial (RCA/CGAL) facilitou os trâmites e aumentou sensivelmente o número de ensaios realizados na Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. A área de contaminantes inorgânicos foi responsável por cerca de 20% das solicitações de importação, para internalização de ensaios de proficiência realizadas pela RCA no período de 2011 a 2012.

O PRIMAR foi criado pela CGAL como uma ferramenta para realizar o controle de qualidade dos resultados obtidos a partir dos métodos utilizados pelos Lanagros. Sua coordenação é realizada pela RCA e pelo Lanagro-MG, que também é responsável pela execução operacional do programa. Atualmente, o PRIMAR é um dos programas interlaboratoriais inscritos na Rede Interamericana de Laboratórios de Análises de Alimentos – RILAA e tem expressão internacional. Na última rodada realizada em 2011 o provedor ofereceu os seguintes ensaios: sulfonamidas (sulfametazina) em fígado de suíno, avermectinas (ivermectinas) em músculo bovino, contaminantes inorgânicos (cádmio e chumbo) em rim suíno e micotoxinas (Aflatoxinas B1+B2+G1+G2)

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em castanha do Brasil. Apenas para os ensaios de determinação de cádmio e chumbo em rim suíno participaram 33 laboratórios dos seguintes países: Belize, Bolívia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Cuba, Equador, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Paraguai, Peru, República Dominicana, Uruguai e Venezuela. Nos últimos anos foi empreendido também um grande esforço na construção do conhecimento científico dos Lanagros. Para tanto, foram estabelecidas cooperações técnicas com centros de referência do mundo todo nas áreas relativas ao PNCRC. Essas iniciativas propiciaram uma inestimável experiência para o intercâmbio de técnicas avançadas aliadas ao desenvolvimento e inovação com foco na melhoria contínua e na rápida resposta a riscos emergentes na produção e consumo de alimentos (Mauricio, 2012). Exemplos dessas cooperações são os projetos EU/Mercosur/SPS ALA 2005/17887, que teve como objetivo a cooperação para a harmonização dos padrões e procedimentos fitossanitários, veterinários e de segurança do alimento e o Projeto EU/Brasil ALA/2004/006-189 que visava à internacionalização de empresas brasileiras, bem como cooperação bilateral com centros de referência internacionais como o CFIA no Canadá, Wageningen-UR e o RIKILT na Holanda (Projeto LNV-BOCI 2010), SARAF/LABERCA na França e a Agência de Cooperação Internacional do Japão (JICA). Outros projetos incluem iniciativas de pesquisa dentre as quais o Projeto MycoRed - Centro para química analítica IFA-Tulln, Áustria e FSA – RRD 31 Aflatoxinas em Castanha do Brasil e suas Cascas (Mauricio, 2012).

Na área de contaminantes inorgânicos dois projetos merecem destaque: a colaboração com o EURL para Contaminantes Inorgânicos localizado na Itália e o Projeto ARCAL RLA 5060, com a Agência Internacional de Energia Atômica – AIEA. Em Roma (2008), durante a visita ao Istituto Superiore di Sanità foram treinados quatro dos seis Lanagros em validação de métodos, técnicas analíticas para determinação de contaminantes inorgânicos e preparo de material de referência e organização de ensaio de proficiência. Depois de quatro anos, no Projeto de Cooperação Técnica ARCAL RLA 5060 - “Harmonização e Validação de Métodos Analíticos para Monitorar o Risco de Resíduos e Contaminantes em Alimentos para Saúde Humana”, iniciado em 2012 e promovido pela IAEA (Agência Internacional de Energia Atômica), o Brasil atua como centro divulgador de tecnologia promovendo treinamentos nas diversas áreas do PNCRC. O primeiro foi o “Curso teórico práctico en validación, incertidumbre y metodología específica en contaminantes inorgánicos” que ocorreu no período de 6 a 17 de agosto de 2012. O Lanagro-SP, recebeu participantes de Cuba, Panamá, México, Venezuela, Peru, Uruguai, Costa Rica e Brasil.

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Outra ação relevante nos últimos anos ocorreu entre o MAPA e o Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT), esse projeto vem promovendo a alocação de especialistas com mestrado e doutorado especificamente nas áreas de resíduos e contaminantes dos Lanagros. Essas contratações são realizadas via Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq por meio da disponibilização de bolsas classificadas como Desenvolvimento Tecnológico e Inovação (DTI), EV (Especialista Visitante) e EXP (Extensão no País). Os especialistas e cientistas têm os seguintes objetivos: a execução de projetos de pesquisa aplicada, execução de projetos de desenvolvimento tecnológico e atividades de inovação e transferência de tecnologia. Desde 2008, mais de 109 bolsistas com mestrado e doutorado em química analítica, engenharia, farmácia, veterinária, agronomia, matemática, estatística, biologia, gestão da qualidade, arquitetura, administração etc. foram contratados. Em última análise, o projeto visa estabelecer os Lanagros como instituições de orientação científica de alto nível, capazes de fornecer soluções tecnológicas avançadas e respeitadas pela comunidade científica e com credibilidade perante a sociedade (Mauricio, 2012). Também foram alocadas bolsas ATP (Apoio Técnico em Extensão no País) para auxílio às atividades de rotina e de validação. As ações voltadas ao desenvolvimento científico dos Lanagros ampliaram o número de publicações de resumos em congressos e artigos em periódicos oriundas dos Lanagros e culminaram na publicação, em abril de 2012, da edição especial (volume 29, número 4) da Revista Foods Additives & Contaminants – Part A – “Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil – Laboratórios Nacionais Agropecuários: Methods of analysis for residues and contaminants in the food chain.

ANÁLISES DO PNCRC: ATUALIDADES E PROJEÇÕES FUTURAS O PNCRC atualmente compreende um total de quase 20.000 amostras coletadas anualmente em todos os estados do país. São determinados atualmente 362 analitos. As amostras são distribuídas em programas setoriais, sendo cinco deles para produtos de origem animal e quadro para produtos de origem vegetal: carne (bovino, eqüino, suíno, avestruz, aves), pescado (peixes de captura e cultivo e crustáceos), leite, mel, ovos, frutas e hortaliças; grãos, sementes, nozes e cereais; plantas aromáticas e especiarias e produtos processados (MAPA, 2011 a). A maior parte das amostras é proveniente das regiões sul e sudeste, principalmente de estabelecimentos produtores de aves e suínos que correspondem a quase 50% das amostras do PNCRC (Lins, 2012). Utilizando a correlação entre a vocação agropecuária de cada estado e a capacidade instalada dos Lanagros, a RCA/CGAL elaborou uma matriz estratégica dos

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Lanagros, estabelecendo prioridades a serem cumpridas em relação aos métodos a serem desenvolvidos e validados, bem como disponibilizados entre os laboratórios da rede, minimizando custos de implementação e agilizando o processo de otimização e início da rotina nos diferentes laboratórios. Na área de contaminantes inorgânicos, por exemplo, a matriz leite é prioritária para o Lanagro-MG, enquanto vegetais e carne são prioridades no Lanagro-SP. Das 19.267 amostras analisadas em 2011, 98,6% das amostras, nas quais foram determinados os contaminantes inorgânicos, foram consideradas conformes em relação aos teores máximos de contaminantes (TMC) estabelecidos na legislação (MAPA, 2012 a). A determinação dos TMCs é uma atribuição do Ministério da Saúde e todos os anos o PNCRC publica os TMCs que serão adotados, bem como o número de amostras a serem analisadas para a condução do PNCRC do ano de exercício (MAPA, 2012 b). Para a realização das análises a equipe de contaminantes inorgânicos conta com 47 pessoas distribuídas nos seis Lanagros, uma vez que não há laboratório credenciado e com autorização válida para esse fim atualmente na rede. As técnicas utilizadas e os equipamentos disponíveis para essa finalidade são:

• Lanagro-RS: espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GF AAS), AAnalyst 600, marca PerkinElmer; espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos (HG AAS), AAnalyst 200 com FIAS 100, marca PerkinElmer; espectrometria por vapor frio (CV AAS), FIMS 400 Mercury Analysis System, marca PerkinElmer.

• Lanagro-PE: GF AAS, AAnalyst 600, marca PerkinElmer; HG AAS, AAnalyst 100 com FIAS 400, marca PerkinElmer, CV AAS, Quick Trace M-6100, marca CETAC, espectrometria de massas com plasma de acoplamento indutivo (ICP MS), NexIon, marca PerkinElmer (em instalação).

• Lanagro-GO: GF AAS, AAnalyst 600, marca PerkinElmer; HG AAS, FIAS 100, marca PerkinElmer, CV AAS, Quick Trace M-6100, marca CETAC.

• Lanagro-SP: GF AAS, AAnalyst 600 e AAnalyst 800, marca PerkinElmer; HG AAS, FIAS 400, marca PerkinElmer, espectrometria de absorção atômica com decomposição térmica e amalgamação (SS TDA AAS), DMA-80, marca Milestone, HPLC-ICP MS, 7700, marca Agilent (em instalação).

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• Lanagro-PA: GF AAS, AAnalyst 800, marca PerkinElmer; HG AAS, FIAS 400, marca PerkinElmer, CV AAS, Quick Trace M-6100, marca CETAC, SS TDA AAS, DMA-80, marca Milestone.

• Lanagro-MG: GF AAS, AAnalyst 600, marca PerkinElmer; HG AAS, FIAS 400, marca PerkinElmer, SS TDA AAS, DMA-80, marca Milestone, ICP MS, 820-MS, marca Varian.

Atualmente, a determinação de contaminantes inorgânicos é voltada para a quantificação total destes analitos na matriz analisada. São determinados As, Cd, Pb e Hg nas matrizes do Programa Setorial de Carnes, Pescado e Mel (exceto mercúrio) (MAPA, 2012 b). Os TMCs para os analitos nessas matrizes estão em consonância com os padrões internacionais (Codex, 2010; European Commission, 2006; European Commission, 2008 e MERCOSUL, 2011). A observação de casos como arsênio (As) em pescados, responsável pela porcentagem de 1,4% dos resultados acima do TMC relativos apenas à área de contaminantes inorgânicos, principalmente em músculo de peixe de captura (MAPA, 2012 a), fez com que essa abordagem de determinar a quantidade total do elemento na matriz fosse substituída pela introdução de uma visão toxicológica dos contaminantes inorgânicos. Essa também é uma tendência global nessa área.

Assim, quando necessário, sob o ponto de vista toxicológico, os métodos passariam a identificar e quantificar as espécies individuais dos elementos químicos nos alimentos, de acordo com as formas químicas presentes de elementos como arsênio, mercúrio e estanho, por exemplo. Tal tipo de análise é chamado de “especiação” e diversas iniciativas contemplando essa nova abordagem estão em andamento, sobretudo na Europa, haja vista a perspectiva da Comunidade em estabelecer limites legais para espécies ou frações de elementos específicos em alimentos. Projetos temáticos, redes de trabalho e até um instituto virtual (EVISA - European Virtual Institute for Speciation Analysis) foram criados para atender à demanda pela evolução das técnicas de especiação (Sloth, 2009; Harrington, 2009 e Welz, 1999). Atualmente o Lanagro-SP trabalha em uma estratégia dividida em duas partes voltada a atender a demanda da Coordenação Controle de Resíduos e Contaminantes (CRC), gestora do PNCRC, por métodos que discriminem as espécies de As em pescados: a. implementar a área de especiação química (longo prazo), b. desenvolver, otimizar e validar o método para a quantificação do arsênio total e das frações orgânica e inorgânica de arsênio em pescado (médio prazo). O fracionamento permite a utilização do parque de equipamentos instalados atualmente no Lanagro-SP, viabilizando uma resposta mais ágil e econômica e satisfatória, pois a informação fornecida (fração inorgânica com

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maior toxicidade presente na amostra) é suficiente para iniciar a gestão do risco atribuído ao alimento.

É importante ressaltar que ainda não existem limites máximos para as espécies de As disponíveis na legislação internacional (CE, MERCOSUL e Codex Alimentarius), embora já existam muitos projetos em andamento na CE para o desenvolvimento e validação de métodos para a determinação das mesmas. Assim, o método estará disponível para o monitoramento no PNCRC brasileiro antes de estar previsto na legislação internacional. Outra tendência é a aplicação de métodos rápidos, com preparo de amostras reduzido em termo de reagentes e tempo e, preferencialmente, com a detecção simultânea de vários analitos. Os assim chamados métodos multielementares possuem vantajosa relação entre custo e benefício quando utilizados como ferramenta para realizar a prospecção de cenários (Moauro, 2009).

Mais um aspecto importante na manutenção da segurança do alimento é a investigação da origem de possíveis contaminações, permitindo a rastreabilidade do contaminante na cadeia produtiva de alimentos (Brereton, 2009; Cannavan, 2009 e Nakashita, 2008).

CONSIDERAÇÕES FINAISConsiderando todos os argumentos apresentados e a perspectiva

crescente das projeções do agronegócio brasileiro, o PNCRC deve continuar o aprimoramento em todas as áreas. Em relação aos contaminantes inorgânicos, a associação de diversas abordagens analíticas, contemplando a determinação de espécies químicas individuais, a detecção de elementos emergentes ou inesperados por análises multielementares e a possibilidade de identificar a procedência dos contaminantes, por meio de métodos e instrumentação ágeis e eficientes, tornará os Lanagros e as equipes responsáveis pela determinação de contaminantes inorgânicos preparados para o gerenciamento de emergências. E, dessa forma, possibilitando o cumprimento dos objetivos estratégicos estabelecidos pela CGAL para os Lanagros: desenvolver, validar e divulgar métodos, ampliar acreditação na ISO/IEC 17025, harmonizar procedimentos na Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários e fortalecer a integração com centros de referência nacionais e internacionais. E, principalmente, tornar possível a realização da missão do MAPA de “Prover o desenvolvimento sustentável e a competitividade do agronegócio em benefício da sociedade brasileira”.

AGRADECIMENTOS O autor agradece ao MAPA e à agência CNPq que fornecem suporte aos trabalhos de pesquisa e rotina desenvolvidos no Lanagro-SP.

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DECISÃO DE EXECUÇÃO DA COMISSÃO, N. 21. Altera a Decisão 2011/163/UE relativa à aprovação dos planos apresentados por países terceiros, em conformidade com o artigo 29 da Diretiva 96/23/CE do Conselho. Comissão Européia, Junho de 2012.

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INSTRUÇÃO NORMATIVA N.11. Publica os Subprogramas de Monitoramento em Carne (Bovina, Suína, Aves e Eqüina), em Leite, Pescado, Mel, Ovos e Avestruz para o exercício de 2012, referentes ao Plano Nacional de Resíduos Biológicos, em Produtos de Origem Animal - PNCRB. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Maio de 2012.

INSTRUÇÃO NORMATIVA N.42. Define os requisitos e critérios específicos para o funcionamento dos laboratórios de Análises de resíduos e Contaminantes em Alimentos integrantes da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Dezembro de 1999.

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WELZ, B., SPERLING M. Atomic Absorption Spectrometry, Cap. 7, p. 323-334, Ed. WILEY-VCH, 1999.

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CAPÍTULO V

CONTROLE DE QUALIDADE NA ANÁLISE DE MINERAIS COM ÊNFASE EM NUTRIÇÃO ANIMAL

Marcus Antonio Zanetti

Prof. Titular da FZEA-USP

RESUMO A análise de minerais na área de nutrição animal tem como limitantes os baixos níveis de minerais nos tecidos e as pequenas quantidades de amostra, em virtude disso, a maior preocupação com qualidade é evitar a contaminação, que pode ocorrer em praticamente todas as fases da análise. Uma das dificuldades do estudo de mineral nos animais são as interações que podem ocorrer entre eles, desde o alimento até a utilização pelos tecidos, isto faz com que seja necessária a análise de vários elementos. Um dos pontos chaves na qualidade é a coleta e preparo da amostra, que se não forem adequados comprometem todo o restante do processo. A rotina de trabalho no laboratório também é de extrema importância, há uma série de cuidados indispensáveis para assegurar a qualidade. Atualmente há vários equipamentos e métodos para análise de minerais, sendo que com o avanço da eletrônica e das técnicas computacionais, o custo dos equipamentos tem diminuído sensivelmente ao longo do tempo, facilitando sua aquisição. A escolha do método adequado é indispensável e com tantos equipamentos e técnicas disponíveis a análise ficou muito mais fácil e precisa. Há uma série de recomendações indispensáveis para garantir a qualidade da análise de mineral, mas, a principal delas é a utilização de material de referência certificado e de organismo independe.

INTRODUÇÃO Apesar da análise de minerais não variar muito entre os diferentes materiais, geralmente quando trabalhamos com tecido animal, há que se alguns cuidados especiais principalmente com contaminação, sendo um fator de complicação os baixos níveis nos tecidos e a pequena quantidade de amostras. Na nutrição animal há um grupo de elementos considerados essenciais para os animais e outro grupo tóxico, como podemos ver na Tab. 1. Os minerais são ainda classificados como macro elementos (ocorrem em concentrações superiores a 100 mg/kg) ou como micro elementos (abaixo de 100 mg/kg).

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Tab. 1 – Macro e micro elementos minerais essenciais e micros essenciais em situações especiais*

*Ewing & Charlton, 2005. Além destes elementos, há ainda um grupo considerado tóxico, constituído por cádmio (Cd), chumbo (Pb) e mercúrio (Hg). No grupo “essenciais especiais”, apesar de já ter sido comprovada a sua essencialidade, foi em quantidades tão baixas que normalmente não se suplementa. Atualmente não é raro encontrar apenas o níquel sendo suplementado. Por outro lado, os elementos deste grupo são mais estudados como minerais tóxicos aos animais (F, As, V).

Apesar de as funções dos minerais nos animais serem inúmeras, elas podem ser divididas em três funções gerais segundo Od´ell & Sunde (1997): I) Estrutural; II) Catalítica e III) Transdução de sinais. Como estrutural, temos principalmente o cálcio e fósforo como constituintes dos ossos e dentes e o fósforo e o enxofre como constituintes das proteínas. A maioria dos minerais participa dos processos catalíticos e como transdução de sinais o principal mineral é o cálcio, mas o magnésio também participa. O estudo dos minerais nos animais é um tanto quanto complexo, principalmente devido às inúmeras interações que os mesmos possuem e que podem ser sinérgicas ou antagônicas. Na figura 1 podemos ver as principais interações propostas em 1982 por Georgievskii. Desde aquela época até agora, o número de relações aumentou bastante, mas a figura já dá uma boa idéia do problema que enfrentam os

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nutricionistas. Analisar apenas um elemento geralmente fornece pouca ou nenhuma informação, uma vez que na maioria das vezes ele pode estar relacionado negativamente ou positivamente com outro.

Figura 1: Interações sinérgicas e antagônicas entre os elementos minerais (GEORGIEVSKII, 1982).

ANÁLISES DE MINERAIS EM NUTRIÇÃO ANIMAL

COLETA E PREPARO DE AMOSTRA Como as amostras de tecidos animais geralmente possuem baixos níveis de minerais (com exceção dos dentes e ossos), deve haver uma preocupação muito grande com possíveis fontes de contaminação durante a amostragem, preparação, armazenamento, manuseio no laboratório e durante a análise propriamente dita. A primeira preocupação para realizar uma análise confiável é a coleta do material, é importante ressaltar que por mais perfeito que seja o método de análise ele não conseguirá corrigir um erro de amostragem. Em primeiro lugar, a amostra deve ser representativa, isto normalmente é um problema em amostras de alimentos, principalmente em se tratando de alimentos grosseiros (fenos, capins, silagens etc.) e que geralmente estão distribuídos em áreas extensas. Mesmo em se tratando de alimentos concentrados em grande quantidade, a amostragem é difícil. Em todos estes casos se faz necessária a redução das amostras e este processo é um dos que mais contribuem para a introdução de erros nas análises (SILVA E QUEIROZ, 2005).

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Outra preocupação não menos importante na amostragem é o tipo de material que será utilizado na coleta, deve ser dada preferência a material de aço inoxidável. O uso de aço não oxidável , a exposição ao ar e o uso de recipientes contaminados (cuidado com a reutilização de embalagens!) são as principais fontes de contaminação de tecidos animais, enquanto que para amostras de forragem, as principais fontes de contaminação são o solo, poeira atmosférica e os procedimentos de coleta e de moagem. Segundo McDowell (1992), mesmo utilizando moinhos com lâminas de aço inoxidável há possibilidade de contaminação principalmente com Cr, mas ainda pode haver contaminação por Ni, Co, Mn e Fe. Amostras de sangue podem ser contaminadas com o anticoagulante utilizado, ou mesmo com a agulha de coleta, o ideal é utilizar agulha de aço inoxidável. As tampas de borracha utilizadas em tubos tipo “vacutainer” para sangue já foram importantes fontes de contaminação de zinco. O uso de luvas plásticas para lidar com amostras de tecidos é indispensável. Mesmo para amostras de alimentos pode haver contaminação quando não se usa luva de borracha ( infelizmente o talco usado em algumas luvas pode ser uma grande fonte de contaminação!). Para coletar as amostras, é importante utilizar material de polietileno (sacos e frascos). Sacos de panos e de papel podem conter nas cinzas até 2000 mg/kg de Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn e até 100 mg/kg de Ag, Be, Co, Ga, Mo, Sn, Sr, V, Y e Zr. Armazenagem de líquidos em vidros pode causar perda de Mn, Mo, Ni, Ti e V. Armazenamento de material em vidro de boro silicato de sódio pode contaminar as amostras com Na e B (MILES et al., 2001). Na maioria das vezes a preocupação é apenas com a contaminação da amostra, o que leva a valores superiores ao esperado, mas pode haver o inverso, ou seja, o recipiente adsorver o elemento mineral, fazendo com que o resultado seja inferior ao esperado, isto também é chamado de contaminação negativa (MERTZ, 1986). Vários trabalhos já demonstraram que determinados plásticos podem adsorver o selênio. Atualmente é comum a utilização de geladeiras e freezers “frost-free” para conservar amostras, neste caso há desidratação e a consequente concentração da amostra, aumentando os níveis dos minerais. Além de todos os cuidados acima descritos para com as amostras, tem um ponto que geralmente não merece atenção e que tem causado grandes perdas em resultados: a identificação inadequada das amostras. Não só erros básicos como identificação do grupo e não das amostras individuais, numeração repetida ou até mesmo ausente, mas também identificação com marcadores não resistentes à água, umidade, congelamento etc. Também não é raro a amostra estar devidamente identificada com códigos que se perdem após a obtenção dos resultados.

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CUIDADOS NO LABORATÓRIO No laboratório é importante que a preparação da amostra seja feita em local diferente da análise e que, principalmente a água seja além de destilada (ou bidestilada), deionizada e armazenada com recipientes adequados (polietileno). No destilador a água não pode entrar em contato com partes de metal (principalmente resistência). Vidro e Pirex podem contaminar soluções ácidas com Al, B, Ca, Fe, Pb, Li, Mg, Mn, Na, Si e Sc (Miles et al., 2001). Uma das fontes mais comuns de contaminação no laboratório são os reagentes, mesmo os reagentes “das melhores marcas” podem apresentar níveis elevados de contaminantes, principalmente no caso do selênio. É importante checar os níveis de garantia antes da utilização e sempre utilizar na análise o “branco”. A poeira e a fumaça são fontes importantes de contaminação e podem ser trazidas também pelo aparelho ar condicionado. Os vapores de ácido comuns nos laboratórios podem liberar uma série de elementos (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn etc.) existentes nas partes de metal, como as maçanetas das portas, canaletas, canos, cadeiras etc. É importante manter todo ácido em capela. A limpeza do material utilizado na análise de minerais é de grande importância, principalmente do material que é reutilizado, como os cadinhos, vidraria e pipetas etc., o esquema para limpeza de material proposto por Miles et al., (2001) é o que segue:

a) Cadinhos: depois de limpos devem permanecer uma noite em recipiente plástico contendo 50% de HCl ou 50% de HNO3 (de preferência o mesmo ácido utilizado para solubilizar a amostra) e depois ser lavado três vezes em água deionizada. Terminada a lavagem, colocar o cadinho em bandeja de fibra de vidro revestida com gaze, secar em estufa e guardar em saco plástico;

b) Vidraria e material plástico: Deixar o material por uma noite em uma solução de detergente não fosfatado. Lavar três vezes em agua deionizada e deixar por uma noite em recipiente de nalgene contendo solução de HNO3 10%, depois lavar novamente três vezes com água deionizada. Todo material deve ficar submerso na solução ácida e não flutuando. Secar em estufa em bandeja de fibra de vidro forrada com gaze e guardar em saco plástico ou vedado com parafilme. A secagem em estufa deve ser feita a baixa temperatura e nunca ultrapassar 90º. C para vidraria calibrada. Material contaminado com LaCl3 ou sangue deve ser lavado em água morna antes do contato com detergente para evitar precipitação. Não utilizar material contaminado com produtos químicos ou sabão que secou sem antes tratar com ácido dicromato-sulfúrico ou HNO3 quente.

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c) Pipetas: Deixar as pipetas por uma noite em um cesto dentro de recipiente de nalgene em solução de detergente sem fosfato. Transferir o cesto para um lavador sifonado e lavar por três vezes com água deionizada. Deixar as pipetas por uma noite em tanque de nalgene contendo solução de HNO3 10%%, lavar três vezes em lavador sifonado com água deionizada e secar em estufa com temperatura inferior a 90ºC. ANÁLISES

MATéRIA MINERALNão é raro encontramos em uma análise de alimentos o termo “matéria

mineral” ou “cinzas”. Nesta análise o material é queimado a temperatura de 350 a 600º. C visando a destruição de toda a matéria orgânica (Ewling e Charlton, 2005), que é transformada em CO2 e H2 O. Certa quantidade de CO2 pode permanecer nas cinzas formando carbonatos com metais alcalinos, nos produtos de origem terrestre forma-se K2CO3 e nos produtos de origem marítima, ricos em sódio, forma-se Na2CO3 (SILVA e QUEROZ, 2005). Está análise tem pouco significado na nutrição animal, principalmente quanto se trata de plantas. Neste caso, a sílica geralmente está presente em grandes quantidades. Em alguns alimentos como, por exemplo, farinha de carne ou de peixe, a análise de matéria mineral é importante para saber se houve adulteração das mesmas (osso em excesso). Também é importante ressaltar que esta análise não é precisa uma vez que ocorre perda de mineral volátil como o cloro, iodo e o selênio, além de poder possuir carbonatos como já citado e ainda óxidos e sulfatos. Mas o principal ponto negativo é não informar quais os minerais presentes. Em temperatura de 650º. C pode ocorrer perda de I, K, Cu, Zn, PB e Se (MILES et al., 2001).

DIGESTÃO DA AMOSTRA: Há vários métodos de digestão de amostra, sendo os principais os abaixo relacionados:

1) Digestão seca: Neste método a mostra é queimada a 600º. C da mesma maneira descrita acima para a “Matéria Mineral”. Uma das vantagens deste método é não necessitar de supervisão constante, mas tem como principal desvantagem a perda de alguns elementos, como o iodo e o selênio; o tempo necessário e o número pequeno de amostras trabalhadas, já que geralmente as muflas possuem pouco espaço. Para amostras de tecido animal há a necessidade de realizar uma pré-digestão ácida e nunca levar o material direto para a mufla, sob pena de perder grandes quantidades de amostras;

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2) Digestão úmida: A digestão úmida tem como principal vantagem não haver perdas por volatilização, podendo ainda ser realizada em pouco tempo, em compensação possui várias desvantagens: uso de ácidos fortes que necessitam de cuidados especiais, risco de explosão no caso do uso de ácido perclórico, os ácidos se constituem em fonte de contaminação ao ambiente, possibilidade de contaminar o ambiente, custo elevado. É indicada para amostras de tecidos animais.

3) Micro-ondas: Há vários tipos de digestão com micro-ondas, o mais utilizado atualmente é uma digestão ácida (variável) em uma capsula fechada, com alta pressão. Há a necessidade de um bom controle para evitar risco de explosão. Pode ser feita em pouco tempo e um dos inconvenientes é a pequena quantidade de amostra a ser digerida. Há outro método com micro-ondas, onde ocorre a combustão da amostra, este procedimento tem a grande vantagem de poder utilizar quantidades maiores de amostra (BARIN et al., 2012).

PREPARO DA SOLUÇÃO MINERAL:Caso tenha sido feita a digestão seca, há a necessidade de solubilização

dos minerais presentes nas cinzas, o que é feito normalmente com a adição de ácido clorídrico e com aquecimento, neste processo deve-se tomar cuidado com o ácido utilizado, que pode ser fonte de contaminação, sendo imprescindível a utilização de um “branco”. Pode haver contaminação em um primeiro momento quando do aquecimento, que se for muito intenso pode fazer com que a amostra de um cadinho contamine o cadinho vizinho. Caso haja necessidade de interromper o processo antes da filtragem e transferência para o balão, deve-se esperar esfriar e cobrir os cadinhos com um plástico, deixando sempre na capela e nunca no laboratório.

PRINCIPAIS MéTODOS DE ANÁLISES Atualmente há vários métodos confiáveis para realizar a análise de minerais, a escolha depende de vários fatores, segundo Mertz (1986), os principais são: 1) Se a análise será de apenas um elemento ou de vários; 2) Tipo de matriz da amostra biológica e o potencial de interferência; 3) Número de amostra e o tempo requerido por amostra (automatizada ou manual e equipamento); 4) Tamanho da amostra; 5) Disponibilidade, tamanho, custo, facilidade de operação e assistência técnica do equipamento; 6) Habilidade, treinamento e experiência do pessoal disponível e 7) Se a instrumentação será dividida com outros laboratórios ou usada por diferentes pessoas. Os principais métodos de analises de minerais utilizados são: espectrofotometria de absorção atômica (AAS), ativação por nêutrons (NAA), próton induzido por emissão de raios-X (PIXE), diluição isotópica

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por espectrometria de massa (IDMS), fluorescência por raios-X (XRF), espectroscopia de emissão ótica por plasma induzido (ICP-OES), espectroscopia de massa por plasma induzido (ICP-MS e ICP-TOFMS), espectroscopia por refletância infravermelha (NIRS), cromatografia gasosa com espectrometria de massa, fluorimetria, fotometria de chama, eletrodo de íon seletivo etc. (Ewing & Charlton, 2005). Abaixo são apresentados os princípios dos métodos mais utilizados atualmente.

1) Espectrofotometria de absorção atômica: Esta é a técnica que foi mais utilizada para determinar minerais nos últimos tempos, possui poucos interferentes, tem boa sensibilidade e precisão e baixo custo uma vez que nos últimos anos o preço diminuiu muito. Um inconveniente é que tem que trabalhar na faixa linear de calibração, mas o principal inconveniente é que analisa apenas um elemento por vez. Esta limitação esta fazendo com que esta técnica seja substituída por outras, principalmente por ICP. O elemento a ser analisado na absorção atômica sob ação da chama é dissociado em átomos em situação de repouso. Nesta forma, o elemento absorve radiação de comprimento de onda específico, emitida por uma lâmpada do elemento em análise, sendo que a quantidade de luz absorvida quando passa pela chama é proporcional à quantidade do elemento a ser analisado. Além da chama, pode também ser usado para a atomização o forno de grafite (GF-AAS). O forno de grafite aumenta em muito a sensibilidade da absorção atômica, podendo detectar concentração até 1000 vezes menor, e outra grande vantagem é utilizar amostras muito pequenas (McDowell, 1992).

2) Ativação por Nêutrons: Apesar de ser uma técnica que analisa multi-elemetos, é cara e geralmente utilizada principalmente em centros de pesquisa, por trabalhar com técnica de radio química. Nela, a amostra é bombardeada com nêutrons e os elementos emitem radiação específica que é medida, por isso, é bastante sensível (GILL et al., 2004).

3) Espectrometria de Emissão Atômica (ICP-AES ou ICP-OES – Atomic Emission ou Optical Emission): Esta técnica utiliza o plasma induzido de argônio para atomizar a amostra para ser analisada por espectroscopia de emissão. Inicialmente a amostra na forma de aerossol é vaporizada, dissociada e ionizada, com emissão de luz, sendo que cada região do espectro é associada a uma transição eletrônica e as intensidades luminosas são proporcionais à concentração do elemento. O grande diferencial do plasma são as altas temperaturas, podendo chegar a 7000 K, que ionizam a amostras com grande eficiência. Uma grande vantagem deste método é a possibilidade de analisar

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um grande número de elementos ao mesmo tempo (KARACAN & ÇAGRAN 2009).

4) Espectrometria de massa (ICP-MS ou ICP-TOFMS (time of fligth): Além de determinar a concentração do mineral, pode fornecer informação isotópica (McDOWELL, 1992). Os íons produzidos atravessam um campo magnético que altera as trajetórias dependendo da massa de cada elemento. Tanto a massa quanto a carga é medida, identificando deste modo tanto os elementos quanto os isótopos. A sensibilidade deste método é muito alta, geralmente de PPT (parte por trilhão), apesar de esta ser uma grande vantagem, neste nível de detecção, qualquer contaminação, por menor que seja já interfere (recipientes, reagentes etc.). Este método consegue detectar quantidades menores que o ICP-OES (HANÉ et al., 2011; PHAN-THIEN et al., 2012)

5) Forno de grafite: Utilizado para aumentar a sensibilidade de alguns equipamentos (AAS e ICP). No forno de grafite, ao invés da chama, a energia para atomização é fornecida por uma corrente elétrica elevada que passa através de um tubo de grafite contendo a amostra. O tubo “fecha o circuito elétrico” propiciando alta temperatura (até 3000ºC.). A luz do aparelho passa no centro do tubo. Esta técnica tem como vantagem poder analisar elementos em níveis até 1000 vezes mais baixos que na absorção atômica e outra grande vantagem é a utilização de apenas alguns microlitros de amostra. Como desvantagem, é um método lento, mais caro e pode sofrer mais interferência e contaminação.

6) Gerador de hidretos: Utiliza a propriedade que alguns elementos (dos grupos IV, V e VI da tabela periódica), principalmente selênio e mercúrio, têm de formar hidretos covalentes e voláteis com o hidrogênio. Como fonte de hidrogênio geralmente é utilizado o borohidreto de sódio. Com esta técnica, o elemento é separado e concentrado, facilitando a detecção e aumentando em muito o poder de detecção.

IMPORTÂNCIA DO CONTROLE DE QUALIDADE NA ANÁLISE DE MINERAIS Como verificamos até aqui, há uma série de fatores que podem influenciar na qualidade dos resultados das análises de minerais, desde a amostragem, passando pelo preparo da amostra, indo até o método de análise. Infelizmente, somente estes cuidados não bastam para assegurar resultados confiáveis, é importante haver uma preocupação constante com a qualidade e seu controle. O controle de qualidade deve envolver: a) recepção das amostras, b) análises, c) revisão dos resultados e d) haver evidências escritas dos itens

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anteriores. Estes princípios são contemplados pelas Boas Práticas. Para que o controle de qualidade seja efetivo, há a necessidade do engajamento de todos os envolvidos, a começar pela direção do laboratório, até o responsável pela limpeza. O propósito do programa é monitorar o processo analítico e não o pessoal. Além de constituir em uma ferramenta educacional, deve ser estabelecido processo de validação. Os principais objetivos do controle de qualidade é reduzir os erros analíticos a níveis aceitáveis, reduzir o trabalho para obter dados confiáveis e prover uma base de dados para comparação de resultados. O controle de qualidade é necessário para satisfazer o desejo do analista para um trabalho de qualidade, para agir com responsabilidade com relação aos descartes de resíduos e para gerar relatórios e documentação para uso imediato e futuro, no interesse de todos. A motivação para que o controle de qualidade seja eficiente é fundamental, ela é uma ferramenta de marketing muito forte, além da qualidade dos resultados, as pessoas envolvidas tem sua reputação melhorada, além do que os laboratórios sem CQ não sobreviverão! Para implantação de um sistema de qualidade é imprescindível conhecer a natureza dos erros, o sistema de medida e o que fazer para minimizar os erros. No caso dos minerais, os principais pontos que influenciam negativamente nos resultados já foram listados anteriormente, o conhecimento de cada um deles é imprescindível.

DETERMINAÇÃO DO DESEMPENHO ANALÍTICO Precisão x acurácia: Precisão é o grau de reprodutibilidade de um

procedimento analítico no tempo, para ser calculada devem ser eliminados os fatores externos que possam influir nos resultados, deve ser utilizado material de referência para fazer a checagem e inclusive eliminar os efeitos da matriz. A amostra deve ser analisa pelo menos sete vezes em dias diferentes e calculados a média e o desvio padrão para cada dia. Pode ocorrer variação nos resultados de um mesmo dia ou variação de dia para dia. As principais falhas na precisão são: falta de homogeneidade, calibração de equipamento, contaminação e erro do analista. Acurácia é a concordância do valor encontrado com um valor conhecido e verdadeiro para o que está sendo analisado. Os principais fatores que limitam a acurácia são: contaminação da amostra, padrão errado, falha do instrumento, falha no uso dos dados da curva de calibração, não linearidade na curva de calibração e problema entre o padrão e a matriz da amostra. Nas figuras 2 a 5 são apresentadas as diferentes combinações de acurácia e de precisão.

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Fig. 2 - Pobre acurácia e pobre precisão

Figura. 3 – Boa acurácia pobre precisão

Figura 4- Pobre acurácia boa precisão

Figura 5 – Boa acurácia boa precisão

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Uma maneira prática para checar a precisão é analisar duplicada de 5% das amostras e para acurácia analisar 5% das amostras com fortificação ou taxa de recuperação. É desnecessário ressaltar a importância do uso de material de referência para as checagens. Para minerais é bastante utilizado o material de referência (SRM-Standard Reference Materials) do NIST (National Institute of Standards and Technology) do governo americano (http://ts.nist.gov/srm). As amostras certificadas possuem erro desprezível e alta precisão, uma vez que geralmente utilizam espectroscopia de massa ou ativação por nêutrons e ainda geralmente são determinadas por no mínimo dois métodos de análises aceitos, podendo ainda ter sido analisada por mais de um laboratório. Segundo Miles (comunicação pessoal, 19971) para assegurar qualidade na análise de minerais é importante observar os seguintes pontos:

1) Realizar analise em duplicatas; 2) Periodicamente analisar amostras fortificadas; 3) Ressubmeter amostras às cegas;4) Realizar comparações entre laboratórios;5) Utilizar amostras de referência interna (do próprio laboratório);6) Utilizar material certificado (NIST);7) Manter registros:

a) o que foi feito;b) quem fez; c) quando;d) qual o instrumento utilizado;e) qual foi o padrão utilizado e quais os reagentes utilizados; f) o que deu errado. Finalizando, os pontos chaves no controle de qualidade de minerais é a utilização de métodos aprovados de análise, instrumentação analítica adequada ao método; calibração periódica dos equipamentos e utilização de material de referência certificado e de instituição independente.

1MILES, P.H., Curso de análise de minerais, FZEA-USP, 1999.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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KARACAN, M.SZ. ; ÇAGRAN, F. Multielement determination in fruit, soaps, and gummy extract of Pistacia terebinthus L. by ICP OES. Turk J. Biol., v. 33, n. 4, p. 311-318, 2009.

PHAN-THIEN, K.Y., WRIGHT, G.C.; LEE, N.A. Inductively coupled plasma-mas spectrometry (ICP-MS) and optical emission spectroscopy (ICP-OES) for determination of essential minerals in closed acid digestates of peanuts (Arachis hypogaea). Food Chemistry, v. 134, p. 453-460, 2012.McDOWELL, L.R. Minerals in Animal and Human Nutrition, Academic Press, New York, 1992, 524 p.MERTZ, W. Trace elements in human and animal nutrition, 5 ed. Academic Press, Inc. San Diego, 1987, v. 1,480 p.

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SILVA, D.J.; QUEROZ, A.C. de. Análise de Alimentos. Ed. UFV, Viçosa, MG, 233p, 2005.

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CAPÍTULO VI

BIOTECNOLOGIA ANIMAL: AVANÇOS DE METODOLOGIAS NA ÁREA

Wilson Malagó-Jr1*, Adriana Luiza Somavilla2, Luciana Correia de Almeida Regitano1

1 Embrapa pecuária sudeste. 2 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP/FCAV, Campus Jaboticabal.

* E-mail: wilson@cppse.embrapa.br

RESUMO O melhoramento genético animal é fundamentado em análises de

informações obtidas a partir de mensuração de caracteres quantitativos. De fato, as observações fenotípicas constituem o mais importante fator para os programas de melhoramento. Entretanto, nos últimos anos as informações moleculares tem ganhado importância para auxiliar a seleção. Com a evolução dos marcadores moleculares os genomas estudados estão atualmente densamente cobertos e isto está provocando uma mudança no cenário do melhoramento. Deste modo, a seleção assistida por marcadores está sendo substituída pela seleção genômica. Neste contexto, as informações fenotípicas ao serem associadas com os marcadores SNPs densamente distribuídos no genoma, apresentam algumas vantagens em relação ao melhoramento genético tradicional, pautado apenas nas informações oriundas de mensurações fenotípicas. Entre elas destacam-se o aumento da acurácia da predição do valor genético sem comprometimento, e possível redução, do intervalo de gerações, a possibilidade de redução do esforço de mensurações fenotípicas e o mapeamento mais acurado de regiões genômicas envolvidas com os fenótipos de interesse.

Palavras chave: genética quantitativa, marcadores moleculares, melhoramento genético, seleção assistida por marcadores, seleção genômica.

REVISÃO DE LITERATURA

GENéTICA QUANTITATIVAOs principais investimentos em programas de melhoramento animal

estão voltados para mensuração de características, avaliação genética e

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técnicas para aumento dos índices produtivos. A qualidade dos dados de medida fenotípica e registros de pedigree são de fundamental importância em programas de melhoramento genético. Com base nas medidas fenotípicas de características de interesse são calculados os valores genéticos estimados (VGEs) e as diferenças esperadas na progênie (DEP = VG/2). Há métodos estatísticos sofisticados para fornecer as Melhores Predições Lineares Não viesadas, ou “Best Linear Unbiased Prediction” - BLUP.

Grande parte das características de produção são quantitativas e controladas por muitos pares de genes com efeitos individuais pequenos e, os métodos de seleção baseados na informação fenotípica dos animais são efetivos na exploração desses poligenes e culminam no aumento da frequência das variantes (sejam eles de menor ou maior efeito) que explicam as características desejadas resultando em animais mais adequados a cada sistema de produção.

Os bons resultados das técnicas de inseminação artificial permitem a manutenção de um número menor de reprodutores e a rápida disseminação do material genético dos mesmos. Mais descendentes por animal resultam em estimativas mais acuradas dos valores genéticos. As avaliações genéticas culminam na predição dos méritos genéticos de cada animal que orienta a decisão sobre quais animais devem ser selecionados como pais da próxima geração. Com isso, no entanto, os animais com melhores avaliações serão excessivamente usados, podendo resultar em problemas de endogamia na população. Por isso, em longo prazo, entre as preocupações do melhoramento se encontram o controle da endogamia e a manutenção da variação genética.

A estimativa dos valores genéticos pode ser baseada em características do próprio animal ou em animais aparentados. O teste de progênie baseado em um grande número de filhos fornece estimativas mais acuradas dos valores genéticos em programas que não usam informação de marcadores moleculares. Ao escolher os pais da futura geração, a co-ascendência também deve ser levada em consideração, por estar diretamente relacionada com o aumento da endogamia, que deve permanecer abaixo de certos limites.

O mérito genético de um animal pode ser mais bem estimado usando a informação dos parentes. O método de avaliação genética que fornece estimativas dos valores genéticos com propriedades BLUP pondera a importância relativa dos parentes e do próprio indivíduo analisado. No entanto, por pressupor que as características são afetadas por uma grande quantidade de genes de efeito relativamente pequeno, além de efeitos não genéticos, o método que gera a predição BLUP não realiza um bom trabalho na exploração de genes de efeito maior. Neste contexto, é interessante a utilização de marcadores moleculares para a identificação destes genes. Existem abordagens experimentais que identificam marcadores genéticos localizados próximos aos genes de efeito maior, facilmente observável no fenótipo dos indivíduos e que

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podem melhorar a estimativa do valor genético de um animal. A exploração direta dos genes que conferem (mesmo que parcialmente) o mérito genético de um animal pode proporcionar maiores progressos genéticos.

De qualquer modo, as observações fenotípicas podem ser utilizadas para selecionar os animais (visto que parte das diferenças observadas em indivíduos pode ser devida a efeitos genéticos) e o progresso genético (aumento do valor genético médio) pode ser obtido sem o conhecimento dos genes envolvidos nas características de interesse.

Os princípios dos programas de melhoramento são: Fenótipos melhores devem provir de genótipos melhores, Genótipos melhores geram genótipos e fenótipos melhores. O progresso genético ou ganho genético, ou ainda, a resposta à seleção, depende da intensidade com que os pais são selecionados (quanto os indivíduos são melhores do que a média de sua geração), da acurácia da seleção dos pais e de quanto sua superioridade será transmitida (herdabilidade de cada característica), da velocidade de substituição de gerações (intervalo de gerações) e da variabilidade genética da característica.

Espera-se então que o fenótipo dos animais esteja correlacionado com o genótipo e, portanto, que os animais gerem melhores descendentes para as características selecionadas. No entanto, para algumas características esta relação é mais forte do que para outras. Isso depende da herdabilidade, estimada em função da variabilidade genética. Assim, quanto maior a herdabilidade, maior é a proporção do fenótipo que pode ser explicado pelo genótipo dos indivíduos.

Ao selecionar os melhores animais como pais leva-se em conta a intensidade de seleção, que é definida como o número de unidades de desvios-padrão que a média dos pais selecionados é superior à média dos animais considerados para a seleção. A intensidade de seleção permite predizer a performance do grupo selecionado. Vale citar que menos animais selecionados proporcionam maior intensidade de seleção. Assim, a proporção selecionada (número de animais selecionados como pais / número de animais considerados para seleção) é inversamente proporcional à intensidade de seleção. Também, se o tamanho da população é pequeno, as intensidades de seleção são levemente reduzidas. Por exemplo: o melhor entre 10 animais não será tão bom quanto os melhores 100 entre 1000.

A escolha dos pais está sujeita a critérios adicionais que teoricamente não fazem parte dos objetivos do programa de melhoramento. Desta forma, na prática nem sempre é fácil definir o critério de seleção com uma única característica, e com isso, outros critérios são selecionados por razões culturais e/ou comerciais como, por exemplo, a cor da pelagem. Isto reduz o número de candidatos à seleção e compromete o ganho genético das características mais

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importantes definidas no programa.Muitas vezes os candidatos à seleção são de grupos heterogêneos e

com isso nem sempre estão disponíveis para reprodução ao mesmo tempo, podendo ser de diferentes regiões ou fazendas e diferentes épocas ou gerações. Existem outros fatores, devido ao tipo de manejo, que também contribuem para criar diferenças não genéticas de produção entre os animais. Neste contexto, por exemplo, animais que produzem em estações desfavoráveis, e apresentam baixa performance, podem ser geneticamente iguais aos animais com boas performances em estações favoráveis. Por isso, as performances devem ser comparadas entre grupos de contemporâneos. Este viés pode ser corrigido pela expressão da performance dos animais como um desvio da média dos contemporâneos.

Ao escolher a manutenção dos melhores reprodutores em um dado rebanho, por conta da sobreposição de gerações, as estimativas dos valores genéticos obtidas por metodologias de avaliação que geram BLUP desses valores, são corrigidas para diferenças de anos (classes de idade) e para a tendência genética (é esperado que as gerações mais novas apresentem ganho genético em relação as mais velhas).

Em princípio, seria interessante selecionar a menor quantidade possível de animais de cada sexo, maximizando a intensidade de seleção. Sob este aspecto a taxa reprodutiva se torna uma restrição. O número de machos e fêmeas usados na reprodução deve ser suficiente ao menos para manter o tamanho do rebanho. Com o uso de inseminação artificial a intensidade de seleção pode ser aumentada, pois quanto mais descendentes por macho, menos machos serão selecionados. Por outro lado, há um limite inferior do número de pais que podem ser usados por conta do aumento de endogamia. O grau de endogamia é inversamente proporcional ao número de pais utilizados a cada geração.

O progresso genético pode ser obtido em uma base anual e este será tão mais rápido quanto menor for o intervalo entre gerações (média de idade dos pais quando a progênie nasce). Haverá mais ciclos de seleção em um dado período se reprodutores mais jovens forem usados, e assim a mudança genética será maior. Os programas de melhoramento devem, portanto, buscar intervalos entre gerações reduzidos. No entanto, a seleção de animais jovens pode implicar em baixa acurácia de seleção, pois estes animais geralmente têm menos informações disponíveis (por falta de medidas da própria performance, de pais, irmãos e meio-irmãos, e de teste de progênie). Os testes de progênie por sua vez podem levar tempo e aumentar o intervalo entre gerações. Uma alternativa é a inseminação da maior parte das fêmeas utilizando sêmen de reprodutores com estimativas mais acuradas e, em menor escala dos reprodutores mais jovens, com valores genéticos altos e acurácia menor.

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A seleção leva a perda de variabilidade e com isso a resposta à seleção (progresso genético) em gerações futuras é inferior à resposta inicial. Assim, é esperado que em um dado momento a característica melhorada alcance um limite máximo. Além disso, a endogamia deve ser controlada evitando maior incidência de defeitos genéticos. No entanto os esforços para limitar a endogamia resultam no aumento do tamanho efetivo da população (mais animais são escolhidos para reprodução), o que limita a taxa de progresso genético. Assim programas de melhoramento ideais buscam equilíbrio entre endogamia e progresso genético.

MARCADORES MOLECULARESO verdadeiro valor genético de cada animal é desconhecido para

as características de interesse econômico e os melhoristas recorrem às observações fenotípicas para fazer inferências sobre o mérito genético dos indivíduos. Em alguns poucos casos tal inferência é feita a partir de locos com genes de efeito maior. Para a localização de QTLs ou genes, podem-se usar estimativas de recombinação genética entre “pontos de referência” sobre os cromossomos, com o auxílio de marcadores moleculares (ou genéticos) que podem ser facilmente genotipados.

Existem diversos tipos de marcadores moleculares que tiveram maior ou menor importância ao longo do tempo. Estes marcadores foram listados por (Maheswaran, 2004). Entre os mais usados temos os microssatélites (Schlötterer, 2004). Os microssatélites foram muito utilizados na construção de mapas genéticos para as principais espécies de animais domésticos e são empregados em experimentos delineados para localizar QTLs. Os microssatélites são úteis também para verificar a ascendência dos animais em programas de melhoramento.

Microssatélites são regiões do DNA com número variável de repetições curtas de bases. Cada loco que constitui um microssatélite é reconhecido e identificado por primers adjacentes às repetições via PCR. Cada microssatélite pode produzir muitos alelos diferentes com diferentes números de repetição (comprimentos diferentes da região de repetição). Quanto mais alelos (microssatélite mais polimórfico), maior a probabilidade de ocorrer indivíduos heterozigotos e, maior a capacidade de observar associação entre o marcador e o fenótipo de interesse, devido à associação dos marcadores com o alelo favorável de um QTL.

Se um alelo desejável (G) está associado a um marcador (M) esta associação pode ser quebrada, em uma progênie futura, e com isso o marcador (M) pode se associar ao alelo indesejável (g). A fase de ligação depende da proximidade física entre o marcador e o QTL. Em outras palavras, a proporção da progênie em que a associação é quebrada, dada pela taxa de recombinação,

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varia de acordo com a proximidade entre o alelo de interesse e o marcador estudado. Quanto mais próximos, ou ligados, estiverem o alelo e o marcador, menor a ocorrência de recombinação entre eles.

Vale lembrar que nestes estudos, as informações disponíveis são os genótipos dos marcadores e os fenótipos dos animais. Na prática centenas de marcadores microssatélites são usados para conseguir razoável cobertura do genoma. A detecção de QTLs através de marcadores é baseada na análise de segregação de indivíduos heterozigotos. Os fenótipos da progênie são registrados e sua associação com os marcadores é estimada. É importante ter em mente que pode não ser possível distinguir entre um QTL de efeito maior, mas pouco ligado ou distante do marcador, de um QTL de efeito mais moderado, fortemente ligado ao marcador. Nesta situação ambos os QTLs podem resultar na mesma superioridade da progênie que carrega o marcador analisado. Outrossim, estes estudos podem apresentar problemas ao inferir sobre a significância dos resultados. Há o risco de declarar a presença de um QTL quando de fato ele não existe e, por outro lado, omitir um QTL importante devido a uma inferência conservadora.

Marcadores fortemente ligados a QTLs podem ser usados na seleção assistida por marcadores. Por outro lado, genes candidatos posicionais podem ser usados para testar e encontrar marcadores diretos. A maior vantagem destes métodos é a possibilidade de seu uso sem a necessidade de medidas das características ou registros de pedigree, apesar de que estas informações são importantes para monitorar os efeitos dos marcadores (ou dos genes) ao longo das gerações e entre raças, populações e sistemas de produção diferentes.

Em alguns casos o conhecimento prévio das bases fisiológicas e bioquímicas de um fenótipo leva a identificação direta da mutação responsável pelo fenótipo. Isso ocorre para características afetadas por um único par de genes (raras quando se fala em características de interesse econômico em animais domésticos). Nestes casos, o marcador é o próprio gene que é genotipado ou sequenciado para testes de associação com o fenótipo. Informações de espécies próximas ou relacionadas, sobre a associação direta de fenótipos diversos, têm aumentado o número de genes candidatos potenciais ao envolvimento com características de interesse em programas de melhoramento animal. Há de fato um grande número de genes candidatos potenciais que não necessariamente tem tido sucesso ou utilidade em programas de melhoramento, pois explicam apenas parte da variação genética e sua má utilização pode acarretar perdas no potencial de seleção. Por outro lado, estes genes podem ser “filtrados” quando mapeados a regiões próximas a marcadores que segregam junto com as características de interesse, isso diminui o numero de candidatos tornando os genes “candidatos posicionais”, além de potenciais.

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Existe ainda a possibilidade de identificar incorretamente um gene candidato como sendo um gene responsável pela característica de interesse devido ao desequilíbrio de ligação (proximidade que faz duas regiões do genoma segregarem junto) com o verdadeiro gene responsável. Isso destaca o valor do monitoramento do marcador em rebanhos ou condições distintas.

Os marcadores têm evoluído e a tendência é uma progressão natural de marcadores ligados para marcadores diretos (Maheswaran, 2004; Schlötterer, 2004). Outra categoria de marcadores identificados aos milhares tem mudado o horizonte do melhoramento genético. Trata-se dos polimorfismos de base única, ou SNPs, do inglês Single Nucleotide Polymorphism. Os projetos de sequenciamento de genomas (ver no próximo item) de animais domésticos e estudos de sequencias de interesse em populações distintas proporcionaram a identificação de um grande número de SNPs para os animais domésticos (Liu et al., 2009) permitindo a disponibilização pública de SNPs no bancos de dados dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Estes marcadores apresentam grande cobertura do genoma (muito maior que os marcadores anteriores como microssatélites) e estão atualmente organizados em painéis (lâminas) disponíveis para ensaio em larga escala (Matukumalli, 2009). A plataforma mais recente para genotipagem em bovinos (“Illumina BovineHD”) possui mais de 770 mil SNPs, com espaçamento médio de cerca de 3 kb (3000 pares de bases) entre os SNPs e possibilitam um monitoramento de todo o genoma segregando variantes de sequências genômicas envolvidas nas características de interesse.

SEQUENCIAMENTO GENÔMICOO sequenciamento genômico foi primeiramente realizado com

o projeto genoma humano. Este projeto teve início ao final da década de 80 tendo sido viabilizado após a automatização do método de sequenciamento de Frederick Sanger (método da terminação da cadeia), que permitiu a leitura computadorizada das sequencias de bases do DNA (Smith et al., 1986). Para ler a sequencia de bases do DNA genômico os cromossomos são fragmentados em pequenos pedaços e após a leitura os segmentos são remontados na ordem correta. Dois métodos foram empregados para o sequenciamento do genoma humano. Eles diferem no modo em que fragmentam o DNA genômico, montam a sequencia na ordem correta e se mapeiam ou não os cromossomos antes de sequenciar. São eles: o método “BAC-to-BAC” (Shizuya et al., 1992; Kelley et al., 1999) e o método “Shotgun Sequencing” (Venter et al., 1996; Venter et al., 1998). O primeiro é baseado no mapeamento prévio dos cromossomos antes do sequenciamento mais detalhado (base por base), o que facilita a montagem final da sequencia, mas apresenta velocidade lenta. O segundo possui maior velocidade, é menos custoso e laborioso, mas apresenta

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(e apresentou principalmente na época do seu surgimento) problemas de montagem de sequencia, especialmente em regiões repetitivas do DNA (Liu et al , 2009), uma vez que produz sequencias aleatórias sem mapeamento prévio. No sequenciamento “BAC-to-BAC” o DNA genômico é fragmentado em sequencias de 150.000 pares de bases e clonado em cromossomos artificiais de bactéria (“Bacterial Artificial Chromosome” - BAC). Os flancos destes clones são sequenciados ou mapeados por marcadores e os clones são mapeados nos cromossomos de origem e agrupados em ordem sequencial. Os clones BAC são então fragmentados em sequencias menores de 500 a 1.500 pares de bases, e clonados em plasmídeos apropriados, para sequenciamento detalhado, que proporciona a ordenação da sequencia interna do BAC. No sequenciamento “Shotgun Sequencing” o mapeamento físico prévio é dispensado e o DNA genômico é fragmentado diretamente em pequenos pedaços de 2.000 a 10.000 pares de bases. Estes fragmentos são clonados em plasmídeos apropriados e sequenciados para posterior montagem “in silico” da sequencia original. O projeto genoma humano culminou na montagem do genoma com o uso de informações geradas pelas duas técnicas, reunindo o mapeamento prévio do método “BAC-to-BAC” com a velocidade de sequenciamento do método de “Shotgun Sequencing”. Até os dias de hoje, com as novas tecnologias de sequenciamento (ver texto abaixo), há quem defenda que nenhum dos dois métodos quando usados separadamente são eficientes. Desta forma, o método “BAC-to-BAC” continua sendo usado para auxiliar na montagem final das sequencias em conjunto com o método de “Shotgun Sequencing” (Taudien et al., 2001). Em meados dos anos 2000, outros métodos de sequenciamento apareceram. São os chamados métodos de sequenciamento de nova geração ou “Next Generation Sequencing” (Ansorge, 2009; Liu et al., 2009). Estas técnicas permitiram um aumento massivo no número de sequencias gerado. O genoma humano, por exemplo, sequenciado em anos de trabalho, nestas novas plataformas pode ser sequenciado em alguns dias. Além disso, comparativamente os custos de sequenciamento também caíram drasticamente. As ferramentas computacionais de montagem dos genomas e conhecimento na área também evoluíram significativamente. Isto tornou possível a disponibilização pública de grande quantidade de sequencias de genomas inteiros, de sequencias de transcriptomas (conjunto de RNAs originados de tecidos de interesse) e de marcadores SNPs. Devido à facilidade de sequenciamento existem atualmente estudos nos quais genomas de indivíduos da mesma espécie são sequenciados para análises comparativas. Neste contexto, não parece que estamos muito longe de uma realidade na qual não se usem mais marcadores moleculares para estudos de genômica aplicados ao melhoramento, e sim o que será usada em substituição, será a informação da própria sequencia do genoma de cada animal alvo de estudo em programas de melhoramento.

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Animais domésticos como aves, suínos, equinos, ovinos e bovinos tiveram o genoma sequenciado (Bai et al., 2012). Desta forma as plataformas novas de sequenciamento abriram caminho para estudos que objetivam o esclarecimento do funcionamento do genoma em termos de suas características estruturais e permitiu o mapeamento de grande quantidade de marcadores SNP viabilizando a tecnologia de genotipagem em larga escala realizada em lâminas de alta densidade de SNPs ou “chips de SNP” (ver abaixo no item seleção genômica).

SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORESMarcadores podem ser importantes em programas de melhoramento

para garantir maior ganho genético em função de maior acurácia na escolha dos melhores genótipos. Isto não significa que só o uso destes marcadores promove o ganho genético almejado, pois apenas a parte da variação genética é explicada pelos marcadores. Neste contexto, é possível combinar as informações moleculares e quantitativas para obter melhores resultados no melhoramento.

A eficiência dos programas de melhoramento pode ser aumentada com a seleção de animais cada vez mais jovens resultando em maiores ganhos anuais. O conhecimento de genes específicos que sejam potencialmente bons pode ser bastante vantajoso para selecionar a idades mais baixas. A genética quantitativa utiliza a informação fenotípica para ajudar a identificar os animais com bons genes e a genética molecular objetiva localizar e explorar genes que tenham efeito na expressão de características quantitativas.

A maioria das características de importância econômica são quantitativas e controladas por um grande número de genes. No entanto, alguns genes podem ter um efeito mais acentuado sobre a característica em questão. Apesar de o termo QTL se referir a genes de qualquer efeito, na prática ele é aplicado a genes de efeito maior (grande o suficiente para serem detectados e mapeados). Assim a variação genética total é determinada pela variação dos poligenes em conjunto com o polimorfismo dos QTLs. Com isso, as informações dos QTLs aumentam a acurácia da estimativa dos valorers genéticos. Neste contexto, é desejável a combinação de informações de marcadores e do fenótipo.

Contudo, na seleção assistida por marcadores devem-se ponderar as duas fontes de informação. Por exemplo, para preferir um entre dois animais em uma situação na qual um animal possui um marcador desejado e o outro não o possui, mas se apresenta fenotipicamente melhor, é necessário levar em conta: o tamanho do efeito do QTL, a frequência do alelo (se estiver próxima de ser fixada não acrescentará muito ao progresso genético), a taxa de recombinação entre o alelo e o marcador (a probabilidade de um animal herdar o alelo junto

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com o marcador). Quando bem aplicada, a seleção assistida por marcadores do tipo microssatélites ou similares (considerados de baixa densidade), pode aumentar a resposta à seleção. Mais adiante, no item “Seleção genômica” será comentada a seleção realizada com auxílio de marcadores do tipo SNP.

SELEÇÃO GENÔMICA A escolha de animais geneticamente superiores para uma ou mais

características em uma população (raça, rebanho, grupamento genético), para serem pais da geração seguinte, tem se baseado em metodologias da genética quantitativa. Estas metodologias procuram predizer o valor genético dos animais em função de informações de desempenho do próprio animal e de seus parentes, estimando a contribuição dos componentes genético, ambiental e interações entre ambos na manifestação do fenótipo. Nesse processo surge a questão do balanço entre a capacidade de predição (acurácia) desses componentes e o tempo para alcançar o volume de informações fenotípicas necessário para se obter boa avaliação. Assim, quanto mais observações de desempenho de um animal e de seus parentes, maior a acurácia das predições. Além disso, para características que se expressam somente em um sexo (ex: produção de leite, idade ao primeiro parto, perímetro escrotal) ou que são avaliadas após o abate, é preciso aguardar que um touro jovem produza descendentes em quantidade suficiente para que se possa avaliar eficientemente seu potencial genético, aumentando o intervalo de gerações e reduzindo o ganho genético anual.

Desde que surgiram se tem preconizado que os marcadores moleculares podem auxiliar a seleção, contribuindo para aumentar a confiabilidade das predições de valores genéticos. Estudos demonstraram que era possível associar variações de desempenho a regiões do genoma, que se denominaram locos de caracteres quantitativos ou QTLs. Apesar de terem contribuído para o conhecimento, desenvolvimento de metodologias estatísticas e, principalmente, para a integração de pesquisas nas áreas de genética quantitativa e genética molecular, a aplicação desse conhecimento no melhoramento genético foi limitada pelo alto custo da análise de marcadores e pelo baixo poder de detecção desses QTL. Tipicamente, ao final de um projeto de mapeamento de QTL, só se conseguia identificar as regiões genômicas que tinham maior efeito individualmente sobre a característica, e a soma de todos os efeitos dos QTL mapeados representava pequena fração da variação total.

Posteriormente, com a análise de marcadores moleculares do tipo polimorfismos de única base (SNP Single Nucleotide Polymorphism), presentes em alta densidade no genoma (em bovinos, em média um SNP a cada 3 kb) e passíveis de análise simultânea em arranjos de milhares de marcadores (genotipagem em larga escala), os “chips de SNP” (com até 770 mil SNPs

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em chips para bovinos), é que se deixou de falar em seleção assistida por marcadores para se pensar em seleção genômica.

A seleção genômica depende da avaliação de desempenho dos animais da “população de treinamento” sob seleção para identificar as regiões genômicas associadas às características de interesse e estimar seus efeitos sobre a média da população. A associação das regiões genômicas as características de interesse com informações de SNPs é conhecida como GWAS, do inglês “Genome Wide Association Studies”. Uma vez determinados os parâmetros para os marcadores, diferentes métodos podem ser utilizados para integração dos processos de predição de DEP tradicional (informações quantitativas) e genômicas (informações moleculares) (Garrick, 2011).

Uma das contribuições da seleção genômica é o aumento da acurácia da predição do valor genético sem comprometimento do intervalo de gerações, incorporando informações de regiões do genoma (coberta densamente por SNPs) associadas às características de interesse para o melhoramento. Além disso, há uma tendência para a diminuição do uso contínuo de testes de progênie e de obtenção de informações de fenótipo, que apresentam difícil mensuração. Isto por que já é realidade estimar com acurácia o valor genético de um touro sem o teste de progênie do mesmo e apenas com informações de marcadores SNPs de alta densidade no genoma.

Outra possível contribuição é a redução dos “efeitos carona” da seleção em caracteres geneticamente correlacionados, mas não desejados. Exemplos desses efeitos são bem conhecidos no melhoramento animal, tal como o aumento da freqüência do gene responsável pela síndrome da carne pálida, macia e exsudativa em decorrência da seleção para musculosidade em suínos. À medida que se consegue identificar regiões genômicas que afetam individualmente cada uma das características correlacionadas, a informação pode ser utilizada para reduzir esse efeito. A seleção genômica permite ainda estimar efeitos não aditivos (epistasia, co-dominância, etc) e com isso pode trazer progressos genéticos em programas de melhoramento nos quais os ganhos chegaram ao máximo com a utilização de informações quantitativas.

As informações dos SNPs densamente distribuídos no genoma facilitam o monitoramento da manutenção da variabilidade preservando regiões genômicas que podem apresentar importância futura. Por último, com a associação entre os marcadores SNP e de regiões genômicas com os fenótipos estudados (premissa da seleção genômica) é possível mapear um alto número de genes candidatos posicionais, uma vez que os SNPs apresentam densa cobertura do genoma. Com a descoberta de genes envolvidos com os fenótipos é possível esclarecer o funcionamento de vias metabólicas desconhecidas podendo assim contribuir para a determinação de técnicas de manejo que visam aumentar a produtividade do rebanho.

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A acurácia da estimativa de parâmetros genéticos relacionados aos marcadores depende, entre outros fatores, do tamanho amostral e da herdabilidade da característica. Como no melhoramento tradicional, essas estimativas se alteram na medida em que a própria seleção promove mudanças na população. Assim, de tempos em tempos, há necessidade de refazer as estimativas incluindo indivíduos das gerações mais novas na “população de treinamento”, os quais precisam ter tanto informação de marcadores quanto de desempenho. A dependência de grande volume de registros fenotípicos pode ser um dos maiores desafios, como por exemplo, no caso da aplicação de seleção genômica em bovinos de corte, quando comparado à situação encontrada em bovinos leiteiros, em que a utilização de inseminação artificial é mais intensa, propiciando a avaliação mais acurada de touros em função do desempenho de suas progênies.

No Brasil há algumas iniciativas para o desenvolvimento e incorporação da genômica ao melhoramento de gado de corte. Desde 2007 a Embrapa financia um projeto multi-institucional no qual se pretende avaliar a variabilidade genética de representantes da raça Nelore para características de eficiência alimentar, qualidade da carne e temperamento. No projeto, que integra a rede de pesquisa Bifequali, três safras de progênies de 34 touros Nelore, escolhidos segundo critérios que propiciassem representar a máxima divergência genética (menor parentesco) e preço de sêmen compatível com a realidade do produtor, estão sendo avaliadas do nascimento até o abate. Ao final desse projeto 796 animais, incluindo os novilhos e seus progenitores (34 touros) foram mensurados e genotipados em larga escala em painéis de 770 mil SNPs. Os resultados são promissores, tendo sido possível identificar associação de dois genes, que não haviam sido estudados em bovinos, com a maciez da carne, além de identificar dezenas de SNPs associados à esse fenótipo (Tizioto et al., 2012, Regitano et al., 2012).

ASSINATURAS DE SELEÇÃOAlém da possibilidade de identificação de regiões genômicas

associadas com características de interesse por estudos de GWAS, nos quais são utilizadas informações fenotípicas e informações de marcadores SNP, a genotipagem de SNPs em larga escala permite a identificação de regiões do genoma que controlam características de interesse econômico e que estejam sob seleção através de estudos de assinatura de seleção. Vale destacar que diferentemente dos estudos de GWAS, a busca por assinaturas de seleção não necessita de informações de mensurações fenotípicas.

A seleção artificial é capaz de promover a fixação de fenótipos desejáveis na população em um curto período de tempo, quando comparada à seleção natural (Innan & Kim, 2008). Além disso, este tipo de seleção

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resulta em alterações no genoma, que podem ser detectadas, por exemplo, por diferenças nos padrões de homozigose dos indivíduos de uma população, permitindo a identificação de regiões do genoma que controlam características sob seleção. A domesticação das espécies de interesse zootécnico está diretamente relacionada à seleção fenotípica de características, que diferiram ao longo do tempo, de acordo com a necessidade e o objetivo dos criadores. Sabe-se que a seleção pode alterar a freqüência dos alelos de diversos genes que controlam as características de interesse e, consequentemente, de regiões neutras ligadas a eles. Para a busca de assinarura de seleção é necessária a análise estatística dos dados de genotipagem em larga escala de SNPs, avaliando principalmente, o rápido aumento relativo nas frequências alélicas dos locos adjacentes às mutações favoráveis que foram selecionadas ao longo do melhoramento da raça estudada (Qanbari et al., 2010). Em função do LD (desequilíbrio de Ligação), as mutações favoráveis tendem a ser transmitidas junto com os marcadores SNPs pelo efeito carona (Fay & Wu, 2000).

A identificação de regiões do genoma que controlam caracteres que estejam sob seleção, por meio da análise dos padrões dos dados genômicos (dados de genotipagem de SNPs), sem a necessidade de informações fenotípicas (como no caso de estudos de GWAS), auxilia na busca por esses genes (Simianer et al., 2010). De fato, a detecção de assinaturas de seleção delimita regiões do genoma funcionalmente importantes (Biswas & Akey, 2006) e permite a mineração de genes que tiveram papel importante nas mudanças genéticas recentes (Innan & Kim, 2008), auxiliando na anotação funcional dos genes que afetam as características produtivas (Wiener et al., 2003). Assim, a identificação das regiões que estão sob pressão de seleção artificial torna possível um melhor entendimento da evolução e da biologia de fenótipos específicos (Stella et al., 2010), podendo direcionar estudos para regiões ou grupos de genes específicos.

CONSIDERAÇÕES FINAISA definição de quais características serão incorporadas aos programas

de melhoramento genético deverá receber maior atenção em bovinos de corte, pois o mercado consumidor cada vez mais direcionará os caminhos da seleção. Assim, questões como qualidade do produto, bem estar animal e impacto ambiental da produção serão cada vez mais presentes na determinação dos critérios de seleção. Dessa forma, a avaliação de características fenotípicas relacionadas à qualidade do produto, temperamento dos animais e eficiência da produção, em termos de degradação da terra e emissão de poluentes vem sendo preconizada nos países do hemisfério norte, sugerindo mudança de cultura nos programas de melhoramento dirigidos para caracteres de fácil avaliação como é o caso do desenvolvimento ponderal (Garrick, 2011).

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Além das características mencionadas anteriormente, a seleção genômica deve ter impacto sobre características de resistência a doenças infecciosas e parasitárias e outros estresses ambientais, tais como a termotolerância.

Além dos métodos citados acima outras abordagens experimentais têm sido empregadas no estudo da biologia dos animais domésticos. Entre elas está o sequenciamento de RNA mensageiro nas plataformas de nova geração. Este método permite qualificar e quantificar os níveis de RNA mensageiro de um dado tecido de interesse (por exemplo, músculo em estudos de qualidade de carne), proporcionando uma visão panorâmica da expressão gênica diferencial ao nível transcricional (de expressão de RNA mensageiro) entre animais ou grupos de animais. O conjunto de RNA mensageiro de um dado tecido de interesse é chamado de transcriptoma. O sequenciamento do transcriptoma gera informações que são usadas no esclarecimento do funcionamento gênico por trás das características de interesse, além de permitir a descoberta de novos SNPs em regiões expressas (transcritas) do genoma (Auer & Doerge, 2010; Cánovas et al, 2010). Estudos de perfil proteômico (Peddinti et al., 2008; Ang et al., 2011) de tecidos ou tipos celulares de interesse (análise do proteoma) também podem ser utilizados para gerar informações a cerca da expressão gênica ao nível protéico, qualificando e quantificando proteínas.

Neste contexto, o desafio existente na fronteira do conhecimento nos dias atuais está em trabalhar conjuntamente com os dados que informam a respeito de estrutura do genoma e suas variações (oriundos de sequenciamento de DNA e painéis de SNPs), e dados de transcriptoma e proteoma (que informam sobre a expressão gênica e o funcionamento do genoma), associando estes dados com medidas fenotípicas, com objetivo de gerar conhecimento aplicado na Biotecnologia Animal.

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